Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция высокоэффективных штаммов RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BIOVAR VICIAE и анализ их взаимодействия с различными сортами гороха

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Селекция высокоэффективных штаммов RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM BIOVAR VICIAE и анализ их взаимодействия с различными сортами гороха"

Р\'6 ОД

\ / и*«»

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

РАСХН

На правах рукописи

ФЕСЕНКО Алексей Николаевич

СЕЛЕКЦИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ШТЛЛШОВ кшговшм ЬЕОиМИЧОБАКиМ ВЮУАД У1С1АЕ И АНАЛИЗ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С РАЗЛИЧНЫМИ СОРТАМИ ГОРОХА

Специальность: 03.00.07 —• Микробиология

АВТОРЕ Ф I: Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1993

Диссертационная работа выполнена а лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Б. В. Симаров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

К. В. Квитко; кандидат биологических наук Л. И. Пароменская.

Ведущее учреждение — Российский государственный педагогический упизерситет имени Герцена.

Защита диссертации состоится « 4 » ОлонЛ 1993 ¡.

в ЧО час. на заседании Специализированного совета К.020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург—Пушкин-8, шоссе Подбельского, Я.

С диссертацией можно ознакомиться и библиотеке института.

Автореферат разослан « » 1993 г.

Учений секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. Горох - ведущая зернобобовая культура России, занимающая около 3 млн га. Для ряда регионов России (Нечерноземная зона, Западная и Восточная Сибирь, Урал и др.) это практически единственный источник богатого белкой зерна местного производства. К сожалеют, нитрагийизация, являющаяся важным приемом повышения урожайности и Питательной ценности других бобовых культур, на горохе малоэффективна (Кохемяков, Доросинский, 1989). Это обусловлено рядом причин: недостаточной эффективностью имеющихся производственных штаммов, широким распространение« "спонтанных" клубеньковых бактерий гороха, конкурирующих со штаммами-ино-лянтами за образование клубеньков, невысокие потенциалом азотфик-сации имеющихся сортов гороха.

В связи с этим целью настоящей работы было совершенствование методов аналитической селекции й.1е|5ит1повагт* и выделение высокоэффективных конкурентоспособных штампов клубеньковых бактерий, комплементарных к перспективным сортвм гороха.

Задачи нашей работа состояли в следующем:

1. изучить симбиотические свойства штаммов R.legminoëaгm, выделенных из почв Орловской и Ленинградской областей, с целью выявления связи происхождения штаммов с их симбиотической активностью, *

2. отработать прямые и косвенные методы определения конкурентоспособности штаммов В. вагшп,

3. проанализировать взаимосвязь симбиотических признаков К.1е-£шя1позягит с целью выявления наилучших крйтериев для селекции аффективных штаммов этих бактерий,

4. изучить сортовую специфичность эффективных штаммов !Ыеци-тИюввгт и проанализировать вклады генотипов микро- и мэкросиыбит онта, а также внешних условий, в определение симбиотических признаков растений гороха,

5. выделить штаммы клубеньковых бактерий, пригодные для инокуляции перспективных сортов гороха в производственных условиях, а также сорта гороха, высокоотзывчивые на инокуляцию.

Научная новизна. Проанализирован вклад генотипов партнеров и внешних условия в определение симбиотических признаков гороха.

Показано, что эффективность симбиоза в большей мере зависит от генотипа макросимбионта, чем азотфиксирущая активность бакте-

* здесь и далее для краткости используется традиционная таксономия рода ЯМгоЫчт): RЛegllmlnoEarшn - клубеньковые бактерии гороха.

рий б клубеньках. Установлено, что зерновая продуктивность в основной определяется генотипом растений , тогда как генотип ризобий оказывает достоверно больнее влияние на удельное содержащие азота в зерне.

Установлено, что наилучшим критерием Е^Фективности клубенько-Ш1 бактерий гороха в вегетационных опытах, является накопление аьота ь растениях, которое с большей степеш зависит от генотипа ризобий, чей масса растений гороха.

Разработан прямой метод опродедышя конкурентоспособности активных шташюв риэ&бий гороха по внешнему ввду клубеньков при сов-исстаой кнокуляцци с неактиьиш итешои-те стером 50.

Практическая значимость, Выделены 9 перспективных, штаммов, достоверно пошшащих урожай зерна гороха 4,8 - 10,05?) и накопление в ыиа азота (на 7,3 - 12,5%). Штамм 52, депонированный в коллекции и Мл с.-х. иикрооиологни под номером 1076, признан по результата 3-лотнего нзучашл в Географической сети опытов с нитрагином иерспежтпышы для производственного использования.

Выделан сорт'Зуор, сочетающий высокую отзывчивость на инокуляции (прибавка урохая зерна - 7,8%) с высокой урожайностью.

Вцдынк неактивный итаии 50 (депонированный в коллекции ВНИИ с.-х. микробиологии иод комаром 1075), пригодный для экспресс-анализа конкурентоспособности ризобий гороха как косвенным (по продуктивности растений), так и прямим (по внешнему>веду клубеньков) методами

Предложена схьма аналитической селекции эффективных штатов клубеньковых бактерий гороха.

Апробация работы. Основные* материалы диссертации доложены на б Всесоюзном Бйхоескоы коллоквиуме (г. Кобулети, 1988 г.), на 2 Всесоюзной конференции СОИСАФ (г. Калуга, 1991 г.), на 8 Восточно-Европейской симпозиуме "Ы1Лго§еп£1х-92" (г. Саратов, 1992 г.).

Публикации. По материалам работы опубликовано 4 статьи. •

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, состоящей из 4 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 126 страницах машинописного текста, содержат 33 таблицы и 10 рисунков. Список литературы включает 145 наименований, в том числа 76 иностранных работ.

Материалы и метода исследований.

Исследования проводили в 1985-1991 гг в лабораториях микробиологии ВНИИ зернобобовых и крупяшх культур (г.Орел) я генетики и селекции микроорганизмов ВИНИ С.-х. микробиологии (г.Санкт-Петербург ).

Объектом исследований бита производственный штаммы клубеньковых бактерий гороха, получетше из коллекции БШШСХМ (245а, 250а), а также выделенные нами штаммы R.legiwilnosar-un.

Вегетационные опытн проводили по общепринятой методике (Жур-^ бицкий, 1968). Повторность опытов 3-4-кратная. Семена при посеве иноку лировали суспензиями испытуемых штаммов, выращенных на бобовом агаре, из расчета 1,2 х 10б клэток/семя. Эффективность штаммов определяли по урожаю сухой надземной массы растений и накоплению в ней азота.

Полевые опиты проводили по общепринятой методике (Доспехов, 1968). Размещение делянок рендоиизированнов, повторность 4-кратная, учетная площадь делянок 22 м2. При посеве семена инокулирова-ли суспензиями испытуемых, штаммов ризобий, выращенных на бобовом агаре, из расчета 1,0-1,6 х 10ь клеток на семя. Эффективность симбиоза определяли по урожаю зерна гороха и накоплению в нем азота. Удельное содержание азота в сухой массе И зерне гороха определяли по методу Кьеяьдалп.

Штаммы ризобий выделяли из крупных розовых клубеньков гороха, вики и кормовых бобов по общепринятой методике (Методические рекомендации по получении новых штаммов клубеньковых бактерий и оценке их эффективности, 1979). Антибиотикоустойчивыв мутанты ризобий получали путем высева суспензии клеток (1,2-1,5 х 106 кл/мл) на чашки Петри с бобовым агаром, в который добавляли- 500 ихг/иг, стрептомицина или 60 мкг/мл рифампицина.

Конкурентную способность исследуемых таймов определяли резистентным методом с использованием стрепгомицшустойчивых мутантов,' а также методом совместной инокуляции с неактивным штаммом-тестером (Ainarger, 1901).

Аэотфиксирующую активность растений- определяли по скорости редукции ацетилена (Hardy е.а., 1968).

Для статистической обработки данных использовали стандартные метода дисперсионного и корреляционного, анализа, анализа парамет-

ров генеральной совокупности, а такхе ^критерий Стьюдента и критерия знаков (Лакин, 1930).

Результата исследований и обсуждение.

1. Анализ юшбиотических свойств клубеньковых бактерий гороха в вегетационных опытах.

Для проведения целенаправленного отбора эффективных штаммов И. 1е^ии1повагш из природных популяций необходимо знать, в какой мере почвенно-ывшатичеише условия и генотип растения-хозяина влияют на симбиотическув зффективность выделяемых штаммов. С этой целью мы изучили в вегетационных опытах симбиотические свойства большой группы штаммов КЛе^Шоеагиш, выделенных из почв Орловской и Ленинградской областей и из клубеньков различных растений-хозяев, входящих в грушу перекрестной инокуляции гороха.

Установлено, что штаммы ЙДе£ит1по8агит, выделенные из сильнокислых вновь освоенных почв Ленинградской области, по эффективности симбиоза с горохом значительно уступают штаммам, выделенным из более богатых слабокислых окультуренных почв Орловской области (табл.1). Различий в эффективности штаммов, выделенных из клубеньков различных бобовых растений из почв Орловской области, выявить не удалось. Так из 294 штаммов, выделенных из клубеньков гороха, производственный нтамм 250а по массе инокулированных растений достоверно превзошло 3,1-1,013» из 33 шт¡¡шов, выделенных из клубеньков вики - 9,1-5,013: из 52 штаммов, выделенных из кормовых бобов - 5,8^3,2455. По величине общего накопления азота'в растениях доля

Таблица 1. Эффективность симбиоза с горохом штаммов НДе^гйпавагшп, выделенных из различных регионов России.

Происхоадение Виде- % штаммов, которые достоверно пре-

штаиыов лено аышают штамм 250а по

вггам- -

нов нигроге- массе накоплению

казной растений азота в ■ активности , растениях

Орловская область 379 13,3-1,74 4,0±1,01 9,0±1,47

Ленинградская область 22 0 0 0

Штаммы из смеси почв во. 6,3-2,72 8,8-3,17 18,7±4,3б

Всего изучено штаммов 481 11,4±1,45 4,6-0,96 10,2*1,38

штаммов, достоверно превосходящих штамм 250а, составила 8,8^1,65%, 15,2-6,25% и 5,8-3,24%, соответственно.

Всего за 1995-1989 гг мы выделили и проверили в вегетационных опытах 481 штамм R.Зegumlnoвarшn. Штаммы, обеспечившие достоверное повышение эффективности симбиоза, били подвергнуты повторной 2-16-кратной проверке в вегетационных опытах. В результате было выявлено 23 перспективных штамма КЛе^ш^поэагит, достоверно превосходя. пщх по эффективности симбиоза с горохом штамм 250а. При этом ■ оказалось, что средняя прибавка накопления азота в растениях, иноку-лироваиных этими штаммами, достоверна выше, чем средняя прибавка по массе растений (33,8^2,34Ж и 27,0-2,05%, "соответственно). Таким образом, селекция R.leglжi.noвarш на способность повышать накопление азота в растениях гороха значительно более результативна, чем отбор на способность увеличивать растительную биомассу.

Для обеспечения максимальной эффективности аналитической селекции клубеньковых бактерий большое значение имеет выбор критериев симбиотической активности ризобий, в наибольшей мере определявшие их генотипом. ОднофакторныЯ дисперсионный гнализ результатов проведенных опытов показал, что генотип ризобий контролирует 39, 36 и 271 общего варьирования нитрогеяззной активности, накопления азота в растениях и массы растений, соответственно. К сожалении, нитрогеназная активность» в наибольшей мере определяемая генотипом бактерий, недостаточно четко коррелирует с эффективностью штаммов (г= 0,21^0,047). Таким образом, этот показатель не может быть использован в качестве единственного критерия симбиотической эффективности штаммов ризобий гороха в вегетационных опытах.

2. Анализ симбиотических свойств ризобий гороха в полевых опытах.

Эффективность перспективных штаммов й. 1е£Ш>1повапш была изучена наш в 9 полевых мелкоделяночных огытах. В результате проделанной работы выделено 9 штаммов, оказывающих достоверное положительное влияние на урожай зерна гороха и накопление в нем азота (табл.2). При этом выяснилось, что в полевых опытах, так же как и в вегетационных, селекция ризобий на способность увеличивать накопление азота в зерне более результативна, чем отбор на способность повышать урожай зерна гороха (табл.2). Штаммы 52 и 417 были дополнительно проверены в производственных опытах (табл.3), в которых они обеспечили повышение урожая зерна гороха на 16,6-50,02

и 272, соответственно. /

Важнейшим условней результативности первичного этапа селекции эффективных штаммов ризобий является достаточно высокая степень соответствия между способностью клубеньковых бактерий увеличивать массу растений в вегетационных ¿лытах и их влиянием на зерновую продуктивность растения-хозяина в полевых условиях. Сопоставление эффективности изученных штаммов И. 1е£ит1повагит в вегетационных и полевых опытах показало, что между результатами вегетационных и полевых экспериментов имеется достаточно высокая положительная корреляция (табл.4). При этом важно отметить, что наиболее надежным критерием для отбора эффективных штаммов клубеньковых бактерий на первом этапе селекции является накопление азота в растениях гороха, поскольку именно этот показатель в наибольшей степени коррелирует с эффективностью штаммов в полевых условиях (табл.4). Это

Таблица 2. Эффективность перспективных штаммов клубеньковых бактерий гороха в полевых опытах.

ШтаммПроведено опытов1Средняя прибавка (%) по

урожаю зерна накоплению азота в зерне

3 4(3) 5,8* 7,3*

6 3(2) 10,0* 11,3*

12 4(1) . 6,7* 7,3*

20 4(1) 6,1* 10,0*

25 3(1) 7,5 9,8*

52 5(3) 7,8* • "9,5* '

77 2 • 4,8 12,5*

338 2(1) 9,0* 5,8*

417 3 5,2* 4,9

в среднем по 9 эффективным штаммам 7,0-0,58 8,7-0,85

250а 8 0,2 0,7

245а 7 0,3 0,5

N60 7(2) 2,9 3,6

"прибавка достоверна при Р^<0,05

1в скобках указано количество опытов, в которых штамм обеспечил достоверное повышение урожая зерна и (или) накопления в нем азота.

Таблица 3. Влияние штамма 417 на урожайность гороха сорта Зубр в производственных условиях (опытное поле ВНИИЗБК, 1991 г).

Штамм Посевная площадь, га Урожай зерна, ц/га Прибавка от инокуляции Ц/га • I

417 0,5 27,3 5,8 +27,0

250а • . 0,8 22,5 1,0 . +4,7

Контроль б/и 0,5 21,5 -

Таблица 4. Коэффициенты корреляции показателей симбиотической эффективности ризобий гороха в вегетационных н полевых опытах.

Прибавки в вегетационных опытах • пег ур зерн Прибавки в полевых опытах ожаю по накоплению а азота в зерне

по иассе растений 0,38 0,41*

по накоплению азота 0,57 ** 0,61**

в растениях

корреляция статистически достоверна при: *Р0<0,05; **Р0<0,01.

согласуется с приведенными выше данными о преимущественном влиянии генотипа ризобий на накопление азота в растениях гороха.

Дисперсионный анализ полевых опытов показал, что вклад генотипа ризобий в общее варьирование урожая Зерна, общего накопления и удельного содержания азота в зерне составил 9, 15 и 252, соответственно. Таким образом, основным критерием эффективности ИЛе-й1зт1повагига в пойевых опытах должно служить их влияние на накопление азота в урожае. В качестве дополнительного критерия эффективности клубеньковых бактерий гороха в полевых опытах может быть использована масса растений гороха в фазе 7-8 листьев, которая в значительной мере определяется генотипом ризобий (контролирующим 232 общего варьирования этого признака) и достоверно коррелирует о урожаем зерна гороха (генеральный коэффициент корреляции р=0,47^ 0,107). Нитрогеназная активность бактерий в клубеньках не коррелирует с зерновой продуктивностью растений гороха в полевых условиях.

-83. Использование различных методов определения конкурентоспособности в селекции клубеньковых бактерий гороха.

Обязательным этапом в селекции высокоэффективных штаммов ри-зобий является оценка их конкурентоспособности. Одним из широко применяемых экспресс-методов определения этого признака является метод смешанной инокуляции с неактивным штаммом-тестером.

В ходе проверки собранной нами коллекции штаммов КЛецилйпо-вагшп в вегетационных опытах мы выделили неактивный штамм 50 и провели серию опытов с целью проверки его пригодности в качестве тестера для определения конкурентоспособности . активных штаммов клубеньковых бактерий гороха. В результате проведенных исследований было установлено, что использование штамма 50 позволяет оценить конкурентоспособность эффективных штаммов как косвенным (по продуктивности растений), так и прямым способом (по внешнему виду клубеньков). Предложенный нами прямой метод определения конкурентоспособности основан на том, что неактивный штамм 50 образует на корнях гороха мелкие светло-зеленые клубеньки, четко отличающиеся по внешнему виду от крупных красных клубеньков, образуемых эффективными штаммами, что позволяет определить Их конкурентоспособность путем подсчета клубеньков различных типов. Определение конкурентоспособности перспективного нтзмма 52 и производственного штамма 250а по продуктивности растений, по внешнему виду клубеньков, а также резистентным методом выявило достаточно высокую степень совпадения полученных результатов (табл.5). Это позволило нам начать массовое экспресс-тестирование конкурентноспособности эффективных штаммов И Ле£1Ш11повагит. В результате Проверки 52 штаммов ризобий гороха мы выделили 32 штамма, сочетающих высокую эффективность с высокой конкурентоспособностью.

Таблица 5. Сравнение различных способов определения конкурентоспособности ризобий гороха в вегетационных опытах.

Штамм Конкурентоспособность штаммов .(%)'■ определена

резистентным методом1 Ааархе по внешнему виду

методой клубеньков гороха

52 86,1 ±2,4» 8*М 73,4*6,25

250а 46,3-4',б9> 1'3',2 19,2*5,57

о

Для оценки конкурентоспособности ризобий гороха в полевых условиях мы применили резистентный метод. При сравнении конкурентоспособности различных типов антибиотикоустойчивых мутантов ризобий гороха установлено, что стрептоыицинустойчивые мутанты высокоэффективного штамма 52 более конкурентоспособны, чем рифампицинус-тойчивые (средняя конкурентоспособность этих групп мутантов составила 43,1 и 27,3%, соответственно). Таким образом, для оценки конкурентоспособности Я.legшninosarшn в полевых опытах удобнее использовать стрептомицинустойчивые мутанты этих бактерий.

4. Специфичность взаимодействия перспективных штаммов ИЛеет-т!повагш с различными сортами гороха в вегетационных опытах.

Основной целью селекции эффективных штаммов К Ле^игаЗ-ПОвагит является выделение штаммов, образующих эффективный симбиоз с широким набором генетически неродственных сортов гороха, используемых в производственных условиях. В связи с этим мы изучили в 5 независимых вегетационных опытах эффективность симбиоза II перспективных штаммов И Ле£ит1повагап с 7 сортами гороха различного типа использования. В результате проведенных исследований были выделены штаммы 20 и 52, образующие эффективный симбиоз с рядом широко возделываемых в России сортов гороха (табл.6).

При проведении селекции растений и бактерий на повышение эффективности бобово-ризобиального симбиоза большое значение имеет изучение относительного вклада их генотипов в определение симбио-тических признаков. С этой целью мы по результатам дисперсионного анализа проведенных опытов вычислили относительный вклад генотипов сортов гороха и штаммов ризобий в общее варьирование показателей активности симбиоза, условно принимаемое за 100%.

Анализ полученных данных (рисЛ) показал, что вклад генотипов сортов растений в определение показателей эффективности симбиоза (масса растений и накопление в ней азота) более чем вдвое превосходит вклад генотипов штаммов ризобий. В то же время роль партнеров в определении азотфиксирующей активности клубеньков приблизительно одинакова. Таким образом, эффективность образуемого симбиоза, по-видимому, более жестко контролируется генотипом растений, чем азотфиксирущая активность бактерий в клубеньках.

Взаимодействие "сорт-штамм" в проведенных опытах оказало на эффективность симбиоза значительно меньшее влияние, чем аддитивные

Таблица 6. Сортовая специфичность перспективных штаммов клубень- ' ковых бактерии гороха.

Штамм ' Прибавка урожая сухой массы растений (?) при

инокуляция сортов гороха

Ульянов- ' Смарагд Орловчанин Среднее по ский 68 штаммам

3 20,6 16, е 28,0* 21,7*

19 18,5 18,0 31,0* 22,5*

20 24,8* 18,5* 29,5* 24,3*

52 28,1* 21,0* 38,5* • 29,2*

М500 46,9* 8,2 10,0 21,7*

Среднее по сортам 27,8 16,5 27,4 -

Контроль б/и,

г/сосуд £135 4,28 4,00

'прибавка к контролю без инокуляции достоверна (Р0<0,05) Значения НСР05 составили (г/сосуд): по фактору "сорт" - 0,318; по фактору "штамм" - 0,449; для взаимодействия "сорт-штамм" - 0,778.

действия генотипов партнеров (рисЛ), что свидетельствует о возможности подбора, штаммов R.legtlralnoвaгшl, вступающих в эффективный симбиоз с широким спектром генетически неродственных сортов гороха, хотя и не исключает необходимости учета специфичности, проявляемой этими сортами при взаимодействии с различными штаммами рм-зобий. .

5. Анализ влияния генотипов партнеров и внешних условий на эффективность симбиоза.

Для сопоставления влияния генотипов партнеров и внешних условий на симбиотические признаки гороха в вегетационных и полевых опытах мы применили следующий подход! результаты тех опытов, где одинаковые комбинации штаммов испытывались на одной и том же сорте гороха, мы обработали методом двухфакторного дисперсионного анализа, принимая за первый фактор условия проведения опытов, а за второй - генотип ризобий. Аналогичным образом ми обработали данные полевых опытов по изучению симбиотической активности 12 перспективных сортов гороха (1989-1991 гт).

Анализ полученных данных показал (рис.2), что наибольшее влияние на эффективность симбиоза в проведенных опытах оказали уело-

Рисунок I. Влияние генотипов партнеров на симбиотические признаки гороха в вегетационных опытах.

А М N

58,4%

1,855

22,455

17,45$

48,9%

5,4% 14.955

30,855

46,255

8,8% 13,455

31,655

- сорта

- взаимодействие "сорт-штамм"

- штаммы

"неконтр.Олиру емые " факторы

А - нитрогеназная (С2Н2-редуктазная) активность! М - сухая масса растений; N - общее накопление азота в растениях.

вия выращивания инокулированных растений (определяющие 53,3-64,055 общего варьирования показателей эффективности симбиоза в вегетационных опытах и 69,1-80,555 их варьирования в полевых опытах).

Поскольку вегетационные опыты ш проводили по единой методике, различия между ними в основной сводились к различиям в интенсивности солнечной радиации и температуры воздуха в период вегетации растений. Изучение влияния метеоусловий на эффективность инокуляции гороха в вегетационных опытах показало, что суша эффективных температур и продолжительность солнечного сияния за период вегетации растений проявляют достоверную положительную корреляцию с эффективностью симбиоза (табл.7).

Сопоставление влияния генотипов микро- и иакросимбионтов на эффективность симбиоза показало (рис.2), что штаммы ризобий оказывали наибольшее влияние на удельное содержание азота в зерне гороха

Рисунок 2. Вклад генотипов симбионтов и условий вегетации растений в определение сиыбиотических признаков горохе.

М

N(общий)

Штаммы ризобий (17 вегетационных опытов)

Штаммы ризобий (9"полевых опытов)

Сорта растений (3 полевых опыта)

24,2% 64,055

11.8% 17,5%

80,5%

2,0« 3,0%

69,1%

27,9%

- генотип симбионта и его' взаимодействие с внешними условиями

- "неконтролируемые" . факторы

24,1% 53,3%

22,6% 26,2%

61,3%

12,5% 3,9%

68,4%

27,7%

7—>—:

41,9% 25,5%

33<6% 43,1%

33,7%

23,2%

52,0% 48,0%

- внешние условия

М - масса растений (зерна) в вегетационных (полевых) опытах; М(об-щий) - общее накопление азота в растениях (зерне) в вегетационных (полевых) опытах; А - нитрогеназная активность растений (удельное содержание азота в зерне) в вегетационных (полевых) опытах.

Таблица 7. Влияние метеорологических условий в период вегетации гороха на эффективность штаыиа 250а в вегетационных опытах.

Величина прибавки от Коэффициенты корреляции, полученные

инокуляции (по отноше- при сопоставлении признаков с

нию к контролю б/и) -

суммой зффектив- продолжительностью ных температур солнечного сияния

по массе растений +0,560** +0,511*

по накоплению азота +0,557** +0,421 в растениях

Корреляция статистически значима при: *Р0<0,05; **"Р0<0,01.

(определяли 23,2% общего ьарьирования этого признака), тогда как их роль в определении урожая зерна была незначительной (2% общего варьирования). Генотипы сортов гороха, напротив, играли существенную роль в определении уроная зерна, но не влияли на содержание в не« азота (рис.2).

Заключение.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что для повышения эффективности бобово-ризобиального симбиоза необходимо проведение координированной селекции растения-хозяина и клубеньковых .бактерий, включающей селекцию активных штаммов й. lGgurai.no с агит, фиксирующих максимальное количество атмосферного азота, и отбор сортов гороха, способных наиболее полно реализовать фиксированный бактериями азот в форме урожая зерна. На основании выявленных закономерностей предлагается схема аналитической селекции эффективных штаммов ризобий гороха (рис.3), включающая выделение штаммов ПЛе^штШюБагшп из природных популяций ризобий, изучение их эффективности и конкурентоспособности в вегетационных и полевых опытах (в качестве основного критерия эффективности штаммов на первых этапах селекции используется их влияние на накопление азота в урожае ), а также анализ сортовой специфичности перспективных штаммов в полевых опытах, что позволит не только отобрать "полиспецифичные" штаммы ризобий, но и выявить сорта гороха, проявляющие высокую отзывчивость на инокуляцию данными штаммами.

Рисунок 3. Селекция высокоэффективных штаммов К. 1 е,етп11по еатот.

1-й этап. Выделение 300-400 штаммов ризобий из клубеньков гороха, вики и кормовых бобов.

2-кратная проверка эффективности выделенных штаммов в вегетационных опытах ни 1-2 иирокорайонированных сортах гороха. Отбраковка малоэффективных штаммов.

2-й этап. Экспресс-тестирование ' ' Дополнительная 2-3-кратная

конкурентоспособности проверка эффективности

перспективных штаммов перспективных штаммов в

в вегетационных опытах вегетационных опытах на

(методом Дмарже и по 2-3 широкорайонированных

внешнему виду клубеньков) сортах гороха.

Отбор высокоэффективных конкурентоспособных штаммов.

3-й-этап. 3-кратная проверка эффективности перспективных штаммов в полевых опытах. Отбор высокоэффективных штаммов.

4-й этап. /нализ сортовой специ- Анализ конкурентоспособ-

фичности перспективны ности перспективных

штаммов в полевых опы- штаммов в полевых опытах

тах (3-кратная проверка) (прямыми методами)

Отбор "полмспецифичных" высококонкурентоспособных штаммов.

Производственные и конкурсные^испытания. ишоды.

1.' В вегетационных опытах изучена эффективность 481 штамма К.1е£ип>1поеагш1. Штаммы ЙЛеяшйповагш, выделенше из слабокислых окультуренных почв Орловской области, более эффективны в симбиозе с горохом, чем штаммы, выделенные из сильнокислнх вновь освоенных почв Ленинградской области.

2. Выявлены 9 высокоэффективных штаммов, достоверно повышающих урожай зерна гороха (на 4,8-И0,0%) и накопление в нем азота (на 7,3-12,5%), в том числе штаммы 52 и 417,повышающие в произ-

ьодственных условиях урожай зерна гороха на 16,6-50,0% и 27,0%, соответственно.

Способность ризобий увеличивать накопление азота в растениях ь вегетационных опытах достоверно коррелирует с их способностью повитать зерновую продуктивность гороха а полевых опытах.

3. Азотфиксирумцая активность ризобий недостаточно четко коррелирует с их снмбиотической эффективностью (величина коэффициента корреляции между азотфиксирущей активностью штаммов Г1.1о£ит1пова-гиш н их эффективностью в вегетационных и полевых опытах равна 0,21^0,047 и 0,13-0,104, соответственно), что свидетельствует о нецелесообразности использования ее в качестве единственного критерия эффективности штаммов В. 1еёил11побагш.

4. Генотип клубеньковых бактерий оказывает достоверно большее влияние на накопление азота в растениях гороха, чем на их массу (в вегетационных опытах определяет 36% и 2755 общего варьирования этих признаков, соответственно). В полевых опытах штаммы Н.1е£ит1-повагит контролируют 257, общего варьирования величины удельного содержания азота в зерне и лишь 955 варьирования массы зерна.

5. Эффективность симбиоза гороха с клубеньковыми бактериями в значительной мера зависит от условий вегетации растений.,В вегетационных опытах выявлена корреляция эффективности симбиоза с продолжительностью солнечного сияния и суммой эффективных температур в период вегетации растений (г=0,51±0,203 и 0,56^0,196, соответственно ).

6. Анализ взаимодействия 7 сортов гороха и 11 штаммов йЛеци-ш1поБагиш в 5 независимых вегетационных опытах показал, что вклад генотипов макросимбионта в определение урожая сухой массы инокули-ровашшх растений и накопления в ней азота выше, чем вклад генотипов. шкросимбионта. В определении азотфиксирующей активности клубеньков,' образуемых на корнях гороха, роль симбиотических партнеров одинакова. Фактор взаимодействия "сорт-штамм"' играет значительно меньшую роль в определении симбиотических признаков, чем аддитивные действия генотипов партнеров

7. Выявлен неэффективный штамм 50, с использованием которого проанализирована конкурентоспособность 52 активных штаммов пИповагит и выявлена группа из 32 штаммов (в том числе высокоэффективный штамм 52), достоверно превосходящих по конкурентоспособ-

ности производственный штамм 250а. Установлено, что стрептомицин-устойчивые мутанты R.legumlnosarum более конкурентоспособны, чем рифашшцинустойчивые, и могут быть использованы для изучения конкурентоспособности перспективных штаммов клубеньковых бактерий гороха в полевых условиях.

8. В результате анализа сиибиотической активности 12 сортов гороха в полевых опытах выявлен сорт Зубр, сочетающий высокую отзывчивость на инокуляцию (прибавка урожая зерна - 7,8%) с высокой урожайностью (я среднем зв 3 годэ - 47,9 ц/гв). В проведенных опытах генотипы сортов гороха контролировали 27,9% варьирования массы зерна, но не влияли на содержание в нем азота.

9. Предложена схема селекции эффективных штаммов R.legumitio-вагит, включающая отбор высоконкурентоспособных штаммов ризобий, фиксирующих наибольшее количество атмосферного азота в вегетационных и полевых опытах, и подбор рортов гороха, способных с высокой эффективностью использовать фиксируемый бактериями азот для увеличения урожая зерна.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Орлова И.Ф., Фесенко А.Н., Орлов В.П. Оценка конкурентоспособности Rhizobium leguminosarum (Р1вш). Доклады ВАСХНИЛ, 1991, N II, С.27-32.

2. Орлова Й.Ф., Фесенко А.Н. Эффективность штаммов клубеньковых бактерий гороха в вегетационных и полевых опытах. Тезисы докладов 2 конференции СОИСАФ, 1991, с.45-46.

3. Provoroy N., Saimnasarov t., Tanrlverdiev Т., Ревепко А.,

Simarov В. Comparative lnruts oí plant, and bacterial genotypes

into determination oí efficiency in legume-rhizobium symbiosis, th * Proceedings oí the 8 Eastern Europe symposium on biological

nitrogen fixation NITROGEUFIX-92. Saratov, 22-26 September 1992.

4. Фесенко A.H., Орлова И.Ф. Полиморфизм местных популяций Rhizobium leguminosarum Орловской области. Бюл. НТИ ВНИИ зернобобовых и крупяных Культур, 1993, N 40, с.38-41.

РШ.Кт.вда.Зак.ЗОХ.Т^.ГСО. 2,а .01.93.