Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий для инокуляции гороха в условиях Южного Урала

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Селекция высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий для инокуляции гороха в условиях Южного Урала"

РГ8 ОД л

№

2 9 [\с\\ ->'

всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии

расхн

На правах рукописи

КАШАЕВА Светлана Равилевна

СЕЛЕКЦИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫХ ШТАММОВ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ ДЛЯ ИНОКУЛЯЦИИ ГОРОХА В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО УРАЛА

Специальность: 03.00.07 — Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

Диссертационная работа выполнена в лаборатории почвоведения Института биологии Уфимского научного центра РАН.

Научные руководители — доктор биологических наук,

профессор Ф. X. Хазиев, кандидат биологических наук Б. Ф. Садыков.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук,

профессор В. К. Шильникова, кандидат биологических наук А. П. Кожемяков.

Ведущее учреждение — Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова.

Защита состоится .» января 1994 г. в_^ час на

заседании специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, Санкт-Петербург, Пушкин-6, шоссе Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан «__»_1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета кандидат биологических наук

А. Н. Зарецкан

ОГЭДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тот. Горох - одна 'из основных зернобобовых культур в пашей стране. Однако такой важный экологичошот целесообразный прием, как обработка семян клубеньковыми бактериями, в применении' к этой культуре часто оказывается малоэффективным. Причиной этого является, с одной стороны, недостаточная эффективность производственных штаммов бактерий, неприспособленность их к соответствуют» почвам и сортам гороха,а с другой стороны - широкая распространенность- в почвах спонтанных популяций нлееит1позагит, которые активно конкурируют с вносимыми штаммами, не всегда обеспечивая при этом эффективный симбиоз с растениями. •

В связи с этим целью нашей работы являлся поиск эффективных конкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий, перспективных для инокуляции гороха в почвенна-экологических условиях Пятого Урала, о также разработка метода быстрой оценка конкурентоспособности селекционных штаммов. •

Задачи изгаей работы состояли в следум^ом:'

1. Создать иолломяго штатов клубеньковых бактерий гороха №1к,оЪ1ит Хо^тшосгц-лп Ь1^аг ?1о*аа с учетом разных типов почв и сортов растения-хозяина.

2. Оценить сравнительную »{фоктивдость перспективных для инокуляции штаммов местной селекция и этэлоппнх штаммов в лабораторных и полевых условиях.

3. Определить флзиолого-биохимические показатели симбиоза п провести срзмштельннй ппалта этик донных с ©Ийктдатостыз селекционных штаммов..

4. Изучить- морфолого-культуралышо и серологические свойства

селекционных . штаммов к оценить конкурентоспособность перспективных . итшмов в полевых условиях по морфолого культурзльиим свойствам . ■

Научная новизна

Еяершо б Башкортостане создана коллекция из 108 штаммов Rhizobium leguminosaruu biovar viciae, выделенных ИЗ клубеньков районировашшх сортов гороха, возделываемых на различных почвах.

Установлена серологическая принадлежность штаммов клубеньковых бактерий'гороха мастных популяций к сэрогруппам эталонных штам1,юв 250а и 2400.

Выявлена сопряженность суммарного содержания подвижных углеводен в клубеньках с уровнем нитрогеназной активности клубеньков. Показано, что удельное содержание углеводов в клубеньках бсуслов-,. лено свойствами штамма, а не сортом растения-хозяина.

Для идентификации селекционных штаммов клубеньковых бактерий гороха при оценке их конкурентоспособности в половых условиях в качестве перспективного приема предложено использовать комплекс их морфолого-культуралыых признаков. Проведенная сравнительная оценка конкурентоспособности двумя методами: ' серологическим и новым методом - по мор£олого-культуралышм свойствам, подтверждает возможность приишения последнего.

Практическая значимость. В процессе селекционной работы с клубеньковыми бактериями, выделенными из местшх почв, обнаружены штаммы, инокуляция которыми обеспечивает большие прибавки урожая зерна и зеленей массы гороха по сравнении с производственными ытамнами. Показана возможность определения конкурентоспособности интродущгруемых в почву штаммов ризобий по их морфолого- культу-ральням свойствам.

Апробация раОатц. Результаты'работа докладившмсь ¡ta научных конференциях молодых учитх "Изучение и рациональное использование природных ресурсов" (Уфа, 1989, 1991), на ' республиканской научно-практической •• конференции . "Экологические проблему агропромышленного комплекса БЛССР (Уфа, 1989), на Seoсоюзном ' совещании "Проблем!! азота.в интенсивном земледелии" (Новосибирск, 1990), на I Всесоюзной научной конференции "Биология почв антропогенных ландшафтов" (Днепропетровск, 1991), на IV Всесоюзной научной конференции. . "Микроорганизмы в сельском хозяйство"' (Пущино, 1993.). ' .'

материалам работа опубликовано 10 работ, в

том число 4 стать«.

Диссертационная работа изложена на 144 страницах машинописного текста и состоит из введения,, обзора литературы, описания.материалов и методов, трех глав, в которых, излежош получегашо результата и их обсуждение, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 5-ю рисунками и 28-ю. таблицами. Библиография включает 206 источников, 78 из ник на русском языке.

Содержаще работы Материала и методы исследований. Исследования' проводили' в течение I988-1993 гг. в лаборатории почвоведения' и' группе биологической азотфцксоции УЩ РАН (г.Уфа').'

Основным объектом исследований билакультура гороха и . производственные штЗмми Rhizobíum legiunínosarum', полученные из Национальной-коллекции }uiy6enh)toi4ix бактерий ВНИИСХМ (250а, 24ба, 2406, 2600, 31, 4(1071), а также наделенные. "нами штаммы R.ie^imittosarum biovrsr

Лабораторные опыты проводили в песчаной культуре о питательной смесью Гельригеля (0,1 н.азота) в сосудах емкостью 260 см3. Инокуляцию проростков гороха проводили водной суспензией 3-сугошшх культур йЛееилапссагигп ( титр « Ш"5 клеток на семя). Растения выращивали в лшшюстате. Повторность всех опытов-4-кратная. Оценивали по 16 растений в каждом варианте, учитывая количество и массу клубеньков на каждом растении, , нитрогеназную активность, массу надаомной части 25-дновных растений. Контрольный вариант бил инокулирован эталонным штаммом 250а.

Полевые опыты проводили на микроделянках площадью I м2 на серой лесной почве и черноземе выщелоченном. Эффективность инокуляции изучали на разных сортах гороха' (титр бактерий бил не менее 10° клеток на Дг ризоторфина). В фазе конца бутонизации гороха с каждого варианта опыта отбирали по 24 растения, у которых оценивали нитрогеназную активность ацетиленовым методом, количество и- массу клубеньков, массу надземной чести растений, а также в отдельных опытах - дыхание клубеньков (по выделению сог), содержание углеводов в клубеньках фенолсернокислотным методом (Садовникова, Щербухин, . 1975), количество выделяемого клубеньками водорода газохроматографичес-ким методом. Эффективность инокуляции определяли по урожаю зерна и надземной части растений гороха, в отдельных опытах оценивали содержание азота в зерно. Повторность опытов 4-кратная.

Штаммы ризобий выделяли из крупных розовых клубеньков растений гороха по.общепринятой методике (Методические рекомендации по получении новнх штаммов клубеньковых бактерий и оценка их эффективности, 197Э). Для роста бактерий использовали бобовый агар. Морфолога-культуральные свойства ризобий изучали на модифицяро-

ванной среде УЕМ-агяр с глюкозой. На-основе этой среды готовили другие тестовые среда: с добавлением трифонилтетразолия хлористого (20 ррш) или с добавлением красителя конго красного (25'ррт). Использовали ' также среда, в которой глюкоза была заменена янтарной кислотой с добавлением бромтимола блау.

' Определение сэрогрупп селекционных; шташов клубеньковых бактерий гороха проводили по методике, разработанной во ВНМИСХМ (Васильева, 1985). Принадлежность изучаемых штаммов к серогрушгам стандартннх штаммов 250п и 2406 (антисыворотки получены во ВНШСХМ) определяли методом реакции преципитации в агаре.

Для статистической обработки данных использовали стандартные методы дисперсионного и корреляционного анализа ( Лэкии, 1980). База датшх по морФолого-культуралъным признакам.ризобий создавалась и обрабатывалась но персоналы™ компьютере типа IBM с помощью программы "Demiurg" для работы с информациошшми базам!! данных,написанной на языке Clipper (автор программы Т.Х.Юмагузш). Результаты исследования-и их'Обсуждение

I. Создание коллекции местных, штаммов ризобий гороха и

оценка их эффективности Выделение ризобий производили разными способами (см. схематический рис.1). В результате была набрана коллекция из 108 штаммов клубеньковых бактерий, имевших различное происховдение по типам почв и сортам растения-хозяина.

Часть шташов коллекции (31 штамм) мы не подвергали предварительному отбору в микровегвтациошшх опытах, в сразу же изучали эффект от инокуляции ими гороха сорта Мрендек на серой лесной почве в полевых условиях.- Таким образом, ш имели

возможность выяснить,проявится ли сортовая специфичность штаммов ризобий и адаптированность их к однородным почвам.

Результата этого спита (см.табл.1) показали, что половина штаммов, выделенных из одноименного сорта и почвы, способствовала достоверному повышению урожая гороха. Что касается штаммов.,

Коллекция клубеньковых бактерий гороха (108 штаммов)

Способы

из клубешжов! растений 1п з!Ли

получения

из клубеньков растений ш vit.ro, зараженных различными почвам»! -

Источник | происхождения

из клубеньков растений 1п 711го, зараженных смесями изолятов клубеньков

сорта гороха: Чиамияокий-242 Ирендек Труженик Уфа-75;

почва: чернозем типичный

I Работа со

■Оценка штампов, нэ подвергавшихся отбору на сортовую специфичность и адапткшван-ность к однородным • почвам (полевой опыт). См.таСл.1

сорта гороха: '1и!шшсюш-242 Ирендек;

почвы: серые лесные, черноземы

сорта гороха:

Адагуыский

Альфа;

почвы; серая лесная, чернозем типичный

штаммами

коллекции

отЗорштаммов в микровз-гетационшх опытах (стерилыше и. нестерильные

условия)__

$

Т1роверка~э$фективности селекционных штаммов в полевых условиях (табл.2)

Рис.1 Источники происхождения штаммов местной коллекции клубеньковых бактерий гороха и направления селекционной работы с ними

имевших иное пршсховдение, лишь каждый третий штамм, полученный из другой почвы,и каждой пятый штамм, выделенный из другого сорта гороха, оказались эффективными. Кроме того, выявлен интересный факт. Штаммы .выделенные из зернового сорта гороха Чишминский-242, способствовал! повышению в значительной степени именно массы

зерна и на укосно-кормовом сорте гороха Ирендек. Штамма, выделенные из сорта Ирендек, в большей море обеспечили увеличение именно биомассы растений. Это наблюдение наводит на мысль о существовании параллельной селекции макро- и микросимбионтон, которую необходимо учитывать при подборе штаммов для инокуляции. Большая часть штаммов коллекции "прошла" все этапы

• Таблица I

Эффективность инокуляции'гороха сорта Ирендек на сорой лесной почво штаммами ризоОий, имевшими различное происхождение

Источник происхождения штаммов Общее количество штаммов, шт. Количество штаммов, способствовавших достоверному увеличению биомассы растений по сравнению с контролем Средний процент прибавок урожая

шт. - % общей биомассы рост зерна

Сорт Ирендок сорта чгаши-ЛСКИЙ-242, Уфа-75, Труженик 13 18 7 4 . Ь4 22 1У,1±Ь,6 8,4±3,Э* 22,7±Э,Г ' 46,4+10,3*

"Серая лесная почва Чернозем "8 ' 23 : о....... 7' ЬО 30 1а,а±а,7 Э,8±6,7 32 г2 ±15,£ 28,4±И ,6

'Данные по сорту Чишмииский

селекционной, работы. После двухкратной проверни симбиотических свойств штаммов (нитрогеназная активность, вирулентность, способность увеличивать массу инокулированных растений) в стерильных, а затем и в нестерильных условиях лабораторных опытов было обнаружено 8 перспективных штаммов для инокуляции гороха сортов Чииминский и Ирендек и 6 итдадов для инокуляции гороха сортов Адагумский и Труженик.

В табл.2 представлены данные по эффективности эталонных

штаммов НМиоМш 1е£шп1поаагшп и штаммов из коллекции ВШИСХМ, а также штаммов местной селекции, обеспечивавших . достоверное увеличение урожая гороха .в полевых условиях. Результаты полевых опытов показали, что для сорта гороха Чшшинский-242 перспективными были штаиш 4(1071), '2506, 245а. из коллекции клубеньковых бактерий ШШСХМ, для сорта Ирендак эффективными оказались штага,щ I, 12, 32, 101 мостной коллекции ризобий гороха.

На сорте гороха Труженик аффективным был штамп И 53, а на сорте

• . " ■ , • Таблица 2

Эффективность гюрсгоктиышх и аталошшх штаммов клубеньковых бактерий гороха

штаммов

250а 2406 2506 4(1071) 31

12 32 101 250а

И 53

ха, на котором ИС~ питнвался штамм

'Чишвнсний"

Иронд-эк

Ч1ШШНСКИ.Й

Ирендек

ЧЙШМИНСКИЙ

Ирендек .

"Чкимшский

Иреядек

Чишишжйй

Ирондек

Чишмииский

ирёндек

ТдагумсгаЖ Труженик Адагумский Труженик

праве- 1С ншиокулкрованшм контролем

гг.. > 7 мдр'г.о ия Т1— пп ггг.

по

дения эксперимента

1989

Т990" 1991

1990

1991

1990 19Э1 19.90

1991 1990 1ЭЭ1

1993

массе зерна

*

-12,Б 10,7 3,4 .

5,3 -9,7 16,7 * -1,2 24,0 * 5,1

12.7 18,6

~23',0 18,6 * 61,5 * 2,3

30.8 4,7

53,8 * -4,7 23,0 -16,3

тео;от-

4,0 -3,1 14,2 *

массе над-■земной части растений

"Т2ТБ— 10,4 * -9,7 -6,7 1.1 "4,6 41.7 * 0,4

37.3 * 11,9 * 25,0 * 36.в *

~227ГГ -5,9

11.4 -•1.0

2,3

9.7 *' 4,5

-16,6

6.8 * -3,9

содержанию азота (белка) в зерне

~5ТГГ 14,9 6,5

4.4

6.5 -1.8

2,7 2,3 7.7

- 4.4 -10,3

- 6,2

1.1

1,0

0,9 2 Л

Различною сравнению с контролем без инокуляции существенны

*

*

Адагумский - штамм- 235-2, способствовавшй повышению урока я •зерна в 2,6 раза. .Гамм образом, пззвашшэ штаммы могут рекомендоваться для инокуляция производственных посевов гороха в условиях Южного Урала.

2. Поиск критериев эффективности симбиоза в

В селекционной работе очень ваяшм является поиск доступных й надежных критериев эффективности азотфиксацйи. В связи с этим в опыте по инокуляции гороха двух сортов Чтг.мт:скпЪ-242 и Ирендек восемью штаммами местной селекции и оталош-ым штаммом 250а были измерены, помимо азотфсссащга, текла показатели, связанные с энергетической эффективностью симбиоза, как гидрогепазная активность, дыхание клубеньков, общее содержание в них водорастворимых углеводов, а также масса надземной части растений и масса клубеньков. Все эти показатели оценивали в период предположительно максимальной активности азозфнксацяи в конца бутонизации гороха я выборочно в 3-х вариантах инокуляции и в контроле снимали характеристики симбиоза в динамике: в фэзах на ала бутонизации, в конце бутонизации и в начале цветения гороха (р;го.2).

Характер кривых изменения . шитрогенззяой активности клубеньков растений двух сортов гороха, шгокулированннх различил®! штаммами (см.рис.2,а), показал, что азотфпссирукщая активность резко возросла в фазах от начала бутонизация до конца бутонизация во всех вариантах опита. Но не для всех птакмов ЛМгоМш) она являлась максимальной в этот период. У - отдельных втаммов активность азотфиксации продолязла расти я в период начала цветения растений. Следует отметать, что у птамла 12 па обоих сортах гороха увеличение активности озотфпссации происходило параллельно с нарастанием массы клубоньков, -а у птамма 101 и в

Масса сирых

клубеньков.

г/рас

0,7 ■

0,6 ■

0,5

.0,4

0,3

0,2 5

0,1

0

Чшшинский

Азотфиксирущая

активность,

мкмоль

<У »4/раст./ч, ■

1,75 1.50{-1,25 1 ,оо-0,750,50 0,25-

Чшшинский

о,оа г-

0,06- • /

0,04 . %

0,02

0 I

I

II

йрендек

III

■'с*' ■

XI

III

Азотфиксирущая

активность,

мкмоль

с н^/раст./ч .

Ирендек

II

III

II

III

4,00 ■3,50 +3.00 2,50 -2,00 -1,50 -1,00.

" Ъ,08 •-0,06 0,04 -0,02 - 0,00

Содержание углеводов в клубеньках, мг/г сырнх клубеньков

3,5 >,0 42,5

г. о

1,5 1 1,0 0,5 О

Читинский

Ирендек

II

ш ■ :

II

III

Рис.2. Изменение массы клубеньков (а ), азотфиксирующей активности (6 ), содержания углеводов в клубеньках ( в ) двух сортов гороха в различных фазах: начала бутонизации (I), конца бутонизации (II), начала цветения (III) - пря инокуляции... селекционными штаммами ризобий:®-птамм/4 V- - -штамм 30; „ ~ шташ/04 * - контроль без инокуляции (полевой опыт на серой лесной почве)

контрольном варианте на сорте Ирендек повышалась именно удельная активность нитрогеназы (см.рис.2,6).

Сравнивая данные по урокаю штудированных растений с результатами измерения "симбиотических характеристик . штаммов <табл.3), мы обнаружили, что в ряде случаев .снижение шщ увеличение урожая как будто на согласуется с работой симбиоткческого аппарата растений. Поскольку максимум азотфиксирующеЯ активности не всегда совпадал во времени у разных штаммов клубеньковых бактерий, ' понятна причина отсутствия корреляции штроганазшй активности клубеньков' с конечной продуктивностью растений. Также вероятно, что- положительное влитие клубеньковых бактерий на рост растения-хозяина связано не только с их способностью к езотфиксациа. Одам увеличением симбдатически связанного азота трудно объяснить такие значительные прибавки урожая зерна растений гороха, инокулированшх, к . примеру, шгашоы 235-2 "на сорте Труженик (см.табл.2). В адом опкте контрастные по симСиотическпм свойствам штамш 12 и 101 на сорте Ирондек (см. табл. 3) в одинаковой степени способствовали повышению урожая зерна на 61 и 53Ж соответственно. В случае штамма 12 это объясняется высокими показателями работы симоиотической системы. А для штамма 101, где эти показатели были на уровне контроля, увеличение урожая зерна, вероятно, мошо объяснить каким-то стимулирующим эффектом иноку-ляционного штамма на рост растений за счет действия физиологически активных веществ - феномен, известный для БМгоЫит.

Возможно, причина отсутствия корреляции между нитрогенаэной активностью и Еффективноотью штаммов заключается в том, что не

Таблица 3. Влияние штаммов клубеньковых бактерий 'но фнзнолого-Сиохимическиа и/биомотричэскио показатели симбиоза Л) горох сорта Чшшшский

Л шг^ммов Нитрого-назнап активность, смоль раст./ч Дыхание клубонь-ков, мг смоль со/ раст./ч Выделение водорода, мкмоль V раст./ч Масса сырых" клубеньков, г/раст. Масса мадзомной части сухих растений, г/рост. (фаза оу- ТО!ШЗОЦ. ) Урожай, г/рост

3 е В а над-зом. част, рост.

1 0,8 14,2 0,52 0,30 1,62 2,1 4,9

12 1,6- 23,1 0,83 0,44 2,05 1.6 5.0

15 .2,6- 35,7 0,24 0,79 1,81 1,6 4.а

17 1 ,2 22,0 0,41 0,46 1,50 1 .2 4.7

ИЧ-18 0,5 5.0 0,03 0,15 1,75 1.7 5,1

30 0,7 5,8 ■ • 0,89 0,11 1.75 1.4 4.9

32 0,7 . 8,2 0.93 ' 0,22 1,65 1.3 5.5

101 0.9 7,1 1,39" 0,13 1,73 1.9 •4.7

250а 0,7 6,6 0,95 0.13 1,07 1.0 4.9

Контроль" баз «популяции 0,9 5,9 1.17 0,16 1,58 1.5 • 5,2

„„ о . оэ 0,8 3,4 0.58 0.13 0,29 0,6 0,4

Б) горох сорте Иренлек

1 1.29 8.9 0,07 0,25 1 ,43 1,6 5,4

12 4,06 18,0 0,16 0.40 1,37 2,1 4,9

15 3,В2 20,8 0,04 0,57 1 ,32 1,5 4,4

17 1,44' 9,7 0,14 ' 0,20 "1,45 1,0 4,5

ич-1 о 0,43 3,7 0,38 0,12 1,32- 1,7 4,6

30 2,47 5,2 1.13 ' 0,12 1 ,38 1,4 4,2

за 0,87 5,4 0,39 0,17- 1,32.. 1.7 4,5

101 0,61 3,9' 0,40 0,12 ■ ■ 1 -Л ''. 2,0 4,6

250а 1,02 3,3 0,66 0,13 1.58 1,6 4,7

Контроль без инокуляции 0,82 3,7 0,54 0,10 1.12^ 1.3 4,4

НОР,,«,, 2,30 3,1 0,48 0,12 0,22 0,6 0.3

и *

всегда высокий уровень - азотфиксации-. обеспечивает формирование большого урока я шгакулировашшх растения. Особенно наглядно- ото проявилось а вариантах инокуляции гороха сорта Крендек штатами 12 и 15, имевших высоки? показатели снмбиотической активности . (см> табл.3). Однако итачм 15 обеспечил гораздо меньшее увеличение урожая зерно, чем этого можно было ожидать от сформировдвшегося симоиотичоско1'0 аппарата. -Отметим, что масса клубеньков растений в этом варианте .была дико вше, а 1штрогоназная активность - несколько ниже по "сравнению со штаммом 12, что обусловило более низкую удельную нитрагоназиую активность в клубеньках, образованных штаммом 15. ■ Одновременно более висо]сиЯ уровень дыхания клубеньков вызвал снижение эффективности азотфмксации (С1Н_|/С02) у растений этого варианта (см.; табл.4), Видимо, .должен существовать опроде-лештй. оптимум- массы клубеньков,тгри котором существовал бы баланс между процессами азотфиксации- и фотосинтеза, но допускаодий непроизводительной траты энергии растениями.

С другой сторош, известно, что для продуктивности 830Т-фиксацгат, помимо .свойств штамма бактерий, определяющее значение имеет способность растения-хозяина обеспечить процесс связывания молекулярного азота достаточным количеством энергетических веществ, Показателем которых может являться общее содержание водорастворимых углеводов в клубеньках. 'Отметим, что при инокуляции растений штатом 15 • удельное .содержание углеводов было достоверно.ниже, чем при инокуляции штаммом 12. Возможно, это также явилось причиной в какой-то мере холостой работы такого мощного симбиотического аппарата, образованного штаммом 15, который оказался в конечная итоге менее эффективным по сравнению со штаммом 12.

. Выявлено такжо, что во всех шюкулировагащх варианта*- . клубеньки содерхали больше углеводов, чем в контроле.. Исключение составляет вариант . инокуляции штаммом 30 на обоих сортах и штаммом ич-18 и 250а на сорте Ирондек, где различия с контролем были несудэстЕсшш. При рассмотрении изменения этого показателя в динамшсе (см. рис.2,в) обнаруживается, что количественное содержание углеводов у "сильных" штатов (судя по варианту инокуляции штаммом 12) на протяжении все го'периода измерений оставалось высоким и изменялось мало. Это указывает на высокую скорость поступления и интенсивность потребления зпэргосодерзтздх продуктов на процессы азотфш<сации и связывания фиксированного азота.

Корреляционный анализ по содержащие углеводов в. клубеньках ■ между различными штаммами на двух сортах гороха дал очень высокий Коэффициент корреляции 0,97. Это позволяет сдолать вывод о том, что показатель удельного содержания углеводов в клубеньках -признак скорее' штаммовый, чем обусловленный сортом растения-хозяина.

По результатам измерения гидрогеназной активности не обнаружено четкой зависимости между этим показателем и ■ __ эффективностью испытываемых штаммов.

Таким образом, в нашей работе был проведай сравнительный анализ физиолого-биохимичеиенх показателей симбиоза с продуктивностью инокулированшх растений. Часто наблюдаемое многими исследователями отсутствие корреляции мевду уровнем нитрогеназной активности и продуктивность«) инокулировашшх растений может объясняться несколькими причинами. Во-первых, максимум взотфикевции не приходится на одинаковый период у растений, инокулировашшх разными штаммами. Во-вторых, высокий

> Таблица 4

Влшнш атпммог» клуоонькошх Спкторий на удельную нитрогепозную октншю-оть.йнургетичоснуп эффективность взотфиксации и содержание углеводов и клубеньках двух сортов гороха

ЧДОМШ .•кий-гЖГ" И жидок

# штаммов удодишн нитрого-назиил ' активность, мкмоль сА/г. ЫуООШг-ког. онорго-. тпчеокоя эффективность ' пзатфик-СОЦИИ, : С.Н/СО, содержала угле садов в клу-Соньках, мг/г сирых клубоиь-коа удельная нитроге-нааная активность , мкмоль с,й4/г. клубеньков энергетическая »'.{фекти-вность ааотфик-сяшш, о.усо, содержание углеводов в клубеньках, мг/г сырых клубеньков

1 0,06 Э.Ы '&.16 0.14

12 3,64 0,07 3.05 8,46 0,23 2,89

15 3,31 0.07 3.24 6,70 0.19 2,62

17 2,69 0,05 3.98 . 5,14 0.15 2,79-

ИЧ-10 э,'эа 0,10 2,70 3.56 0,12 2,14

30 6,74 1,12: 1.99 20,58 0,4В 2,07

32 3,34 0,09 2.80 5,12 0,16 2,54

101 6,98 0,13 2,27 5,08 0,16 1,89

850а 5,76 0,11 2,40 7.85 0.27 - 2,24

Контроль Оиз инокуляции 5,40 0,15 1,97 8,90 0,22 2,08

1.ЯГ" 0,04 '0.05' ' . 7.66 0,17 , 0,21

уровень озотфиксашга но всогдо является анергетическк выгодным

для растения,. Показателями энергетической эффективности озолфиксощш могут служить удельная . нитрогенаэная активность, удельное содоржашо углеводов в клубеньках и отношение уровня нитрогеназной активности к уровню дыхания клубеньков. Установлено также, что удельное содержание углеводов в клубеньках обусловлено в большей мере симбиотичесюши свойствами штамма, чем сортом растения-хозяина.

3. Изучение серологических свойств коллекциошшх штаммов R.leguп^inoвaггш)

Общепринятым методом оценки конкурентоспособности штаммов

ризобий является серологический могод.При изучонии

серологических свойств 39 коллекциошшх штаммов- било обнаружено 6 штаммов, относящихся к серогруппам штамма 2-106, н I штамм - к серогруште штамма 250а.

Для оценки серологической принадлежности рцаобий спонтанной почвенной популяции била взята для - инокуляции в микровегетацношюм опыте смешанная суспензия серой лесной и черноземной почв. В результате оценки серологических свойств полученных изолятов было обнаружено, что всего два клубенька из 34 тестированных при серологическом анализе были, образованы • -клубеньковыми бактериями, принадлежащими к сорогруппо штамма 2406. к антнсыворотке штамма 250а дуг проципптации обнаружено не было.

• Необходимо отметить, что 7 коллекционных: штаимоп, которые были отнесены к иэвостшм серогруппам, но отличались хорошими симОиотичоскими свойствами ' й- подлежали выбраковке. Среди высокоактивных и конкурентоспособных штаммов ризобий нашей коллекции не было ни одного, -который относился бн к известным серогруппам штаммов 2406 и 250а. Следовательно', для них необходим поиск других. серогрупп или использование ишх способов оценки конкурентоспособности.

4. Разработка метода определения конкурентоспособности йлр(5шп1г108агша по морфолого-культуральшм свойствам При изучении морфолого-культуралышх свойств коллекциошшх штаммов ИЛе^итЬюБагит на основной среда УЕМ-агар было обнаружено, что некоторые штаммы имеют хорошо выраженные морфологические отличия. Например, по консистенции колоний встречаются штаммы сухие и слизистые; по цвету на основной среде

о

обнаружены итамму, образущио прозрачные,'кремоше, белые и слегка желтоватые но леи uní, при этом отмочено в них наличие или отсутствие непрозрачных вкраплений. Часть коллекционных штаммов было способна-восстанавливать .ТГХ, приобретая при отом розовую, краснуь или малиновую окраску колоний. На сроде с ' добавленном конго красного отдельные ditummu по-разному поглощали краситель. Соответственно наблюдалась разная окраска колоний. Все эти признаки ми изучали на колониях, обрпзопанщх при посово суспензий штаммов репликатором на тостоилэ .среды. Морфолого-культуральные свойства отопчали на 5-о сутки роста в термостате при' 28°С и заносили в базу дашшх в вида цифрового кода.

В лабораторных условиях били поставлены микровегетациошше огшты с цольв ' сопоставления ...морфолого-культуралышх свойств колоний, выросших из суспензии коллекционных культур, и колоний, получоншх при -раздавливании клубеньков- растений гороха, ипокулированшх эпти коллокционпыми штаммами.■ Результаты этих опытов показали большую сходимость изучешшх признаков, что позволяет сделать вывод о возможности использования данного методгР для -оценки конкурентоспособности штампов клубеньковых бактерия. Кроме того, была проведено сравнительная оценка конкурентоспособности ризобий- двумя методами: серологическим и по морфологическим свойствам. Испытывали штамм 250а на фоне ■ спонтанной почвенной популяции в условиях мшеровегетвциошюго опита. Оба метода-показали, что конкурентоспособность штамма 250а в данных условиях оказалась равной 47-50%.

Мы поставили цель определить . конкурентоспособность селекционных штаммов по их морфологическим свойствам. ,лри_ инокуляции гороха в полевых условиях в опытах 1990.и 1993 гг. Для

инокуляции отбирали активные штампы риаооий • с ярко гшрамшшми морфологическими свойствам;!, которые отмочены знаком в

табл.Б. Надо отметить, что использование репликатора позволило нам Орать для анализа по 100 клубеньков с каждого варианте. Анализ ризобий мастной покулинии, выделенных из клубеньков двух сортов гороха Чишминский и Ировдок,. показал,что разные сорта гороха при росте на одной и той жо почве инфицируются несколько различающейся по мор!х>логйчвским свойствам изолятов .популяцией клубеньковых бактерий. Об этом наглядно свидетельствуют данные, представленные в. табл.Б.

Сопоставляя морфо лого-культура льшо свойства изолятов, ВЫД9Л9ШШХ из клубеньков ристаний контрольного варианта . и вариантов обработок селекционными штаммами, ■ мы ■ определили конкурентоспособность ' инокуляционшх штаммов по признаком, присущим этим штаммам, но отсутствующим у бактерий местной популяции."

Результаты оценки конкурентоспособности и эффективности штаммов ПМгоМит 1е{*щ]1по8агит представлены в табл. 6. Корреляционный анализ изучаемых- факторов выявил довольно тесную взаимосвязь между показателями конкурентоспособности и эффективности: коэффициент корреляции составил 0,71. Однако на всегда высококонкуронтный штамм способен обеспечить эффективный симбиоз. Например, штамм 12 на сорте Чишминский при уровно конкурентоспособности 62$ существенно не повлиял на увеличение урожая шюкулировашшх растений. Одной из причин этого являются более низкие характеристики энергетической эффективности этого штамма по сравнению с аналогичными показателями на сорте Ирендек^

Таблица 5

\ • Нарнпнга Количество изоллтон,^

обработок контроль шт. 12 шт. за шт 101 контроль 250а 235-2 И 53

лого-кулЬ\

туралышо сьойстиа Ко} 1С и ити ш цГгГ ко - ч* Г ч и ч и ч и Труженик

доний на основ-

ной сроду

су?. ¡19 56 32 0 I те 20 16 0 I 2 0 2

шлусухие ■ 06 36 05 •57 40 45 40 • 0 13 7 15 13

с-П^зисп;^ В 31 18 •36 45 ' '27 45 100 85 •91 "85. •85

Цвот колоний на

основной среде

кремопие 07 67 19 13 99 *' 6« 99"100 6 ■25 2 '7

Ос-лич 59 33 10 Г 0 •30 0 0 82 69 '74 '77

жолтомчтас ' 0 0 71' 70 I 0 I 0 7 26 23 15

Структура коло- 1

ний па осн.сродо

однородная - - - - 79 60 •84. ' '85

зернистая ' 20 •39 16 15

Профиль КОЛОНИЙ

но осноин.сродо

ПЛ01ЖИЙ 99 •100 87 •96

внпукдьй I 0 13 . 4

Цвот колония на

среде с П'Х

шюкопаотшо 61 '19 15 25 32 10 33 10 16 50 69 •75

ро^он);" ш 2-Р 14 6 64 36 0 0 30 22 17 •17

кр'Н'.шм п 2/2 Г,?, •70 0 22 0 3 ' 4 0 I 4

ММЛ.ПК'-иМ 1>] . 0 4 0 0 • 29 07 •86 49 ',33 '13 4

Ц!ЧТ КОЛОНИЙ И!)

среде с конго

ирпоним

неогшяшоннно 0 4 4 0 0 • .35- 0 0 68 • 44 •47 •аз

37 96 18' ■40 97 02 97* 100 27 50 '45 63

кр^лше 0 0 7 40 •0 0 0 • 0 3 4 4 4

малпноьце 0 0 1 . 0 0 0 0 0 I 2 5 0

иячниотне 0 0 65 •60 0 а 0 0 • 0 0 0 0

Цвот полоний на

среде с янтарной

кислотой »-Оромти-

мол Олау

золение - 49 32 25 4

белио - 32 50 *48 50

Оолдаоленые - - - - - - - 10 •18 28 19

Отсутствие_роста конкурентоспособность, Я - - - - -- - - 0 0 0 '27

6260 7Г~ -70 0 29-31 49-86 гв-21 1216 27

Примвчашю: *ч-сорт Чшминский-242; **и-сорг Ирендек; '- свойства, присущие штвмму в чистой культуре.

Таблица 6

Сравнение вЗфективности и конкурентоспособности штаммов Hnlzobliun legrnilnosarum bv. vlctae

Штамм Сорт гороха Конкурентоспособность, % Величина прибавки массы зерно по сравнению с контролем,t

30 Чишинский 0. - 6,7

235-2 Труженик 14 4,0

250 а - Труженик 20

И 53 Труженик 27 14,2*

30 Ирендек 30 J'l

101 Чишминский 50 2G,7

12 Мрондек 60 61,5

12 Чишминский С2 6.7,

101 Ирендок 80 бз,а*

* - Прибавка но сравнению с контролем достоверна при Р=0,Э5

Итак, в наших исследованиях показана возможность исподьаова-ния 'хорощо выраженных морфодого-культуралышх признаков колоний штаммов ffiilzoblum leguminosarum в качестве естественных маркеров для оценки их конкурентоспособности. В лабораторных экспериментах была показана высокая сходимость результатов ксшсурентоспособнос-ти штамма 250а двумя методами ¡серологическим и по морфолого-куль-

туральным признакам. Выявлена, связь эффективности инокулированнах штаммов с их конкурентоспособностью.,

Вывода

Г. Создана коллекция из 108 штаммов RMzoblun leguminosarum biovar viciae, выделенных из клубеньков растений in situ и путем заражения гороха суспензиями- различных почв Башкортостана.

I.I. Оба метода выделения ризосий оказались перспективными при отборе высокоэффективных штеммов.

■ 1.2. Показано, что штаммы клу&знькошх бактерии, выделенные и у клубешкол укосно-кбрмоного сорта Ирендек', способствовали в. большой степени уноли'юшш биомассы . растений, а „ штаммы, ьндолоннь'о и и клубеньков растений ' продовольственного сорта Чишинский, гшпапи шгогаенир урожая .зорна.

2. Результаты лабораторных и половых экспериментов выявили-порспокгигчш" штаммы клубеньковых, бактерий гороха: дли' инокуляции сорта Ир'фщчс ■ штзмми 1,12,32,101, для сорта Лдтгумокнй - штамм 235-2, для сорта Труженик - штамм И 53. Обработка гороха этими штаммами ёпосолствовшга Оильинм прибег,кам урожая зерна и биомассы растений, чем'инокуляция йгплошшм штаммом 2б0з.

3. ¡)ро)-|/лен сряшктолышй анализ физиолого--биохимических показателей симбиоза с ^['¡окгнпцостьп селекционных штаммов.

ЭЛ. Установлена сопряженность суммарного- содержания подвижных: углотадов'■ в клубеньках . с уровнем .иитрогоназной. активности.'. ■ • •

-3.2. Показано',что_ удельное содержание углеводов в

клубеньках- 'обусловлено свойствами штамма, а не сортом

, -

растхнтя-хозяина. " ■ -.- . .

4. Изучен» серологитескио свойство коллекционных штаммов ОДгоЫит 1еяит1по8агив.•'Из 39 тестированных штаммов 6 принадлежали' ссрогруппе' штамма ?Л0б и только. I" штамм - серогрупда штамма ' 260а. ' '

-5. На основе .УИ-сроды разработаны тестовые". ■ среды, позволяющие - .использовать 'Хорошо..' " лиражешше

морфолого-культуральние признаки. делений '¡памгздг клуоенькошх бактерий-. гороха' в качество есл-е-стронцых маркеров ■ для- оценки их кошуреитоопособнос'ш'в полевых угуюкиях.

По материалам диссертации оиубликоигмм. слодоюрм- работ«: •

1. Катаева O.P. .Садиков В.Ф. ■ ■ штнммоп кг.уб^цькоьих бактерий, перспективных дли инокул/штг горох я //Тоа. докл. науч. конф. Уфа : К1Щ УрО ЛИ СССР, 10,%. -0Л47.

2. Садиков Б.Ф., Назнрова Ф.К., ШнкЛачв Ф.Р., Прошмувдья Л.А., Катаева С. Р. £иологическая пзогДОко&цкя как гюомомшя альтернатива азотннм . удобрениям //'Газ. Республ. науЧ!Ю-практ.коиф.-;Уфа,1ЭсЗЭ. -С.27.

3. Садыкоп Б.Ф.,. Катаева С. Р., Пропаду «¿я . Л. А., .¡(а;чфон'1 Ф.И.

' СимбиотиЧоская и асеоцйаташая эдоштксация : Штода ис.учоим.-и

пути активизации У/Тчз.докл.Bceco*:;ii.совещании, -(Ьпгсибирок,

- 1990. -О .TÎ>j-I98. . . .

4. Катаева O.P. Инокуляция клубонькоьши бактериям.! гороха ла рааких типах почв //Тез Л Всесонзн.научн.конФ.Люпропотровск, 1991. •

5. Кашаена O.P., Садиков В'.Ф. Принципы сслокиум штаммов клубенькошх бактерия itiUzobium ii.gimlno£inrnm //Основные направления биотехнологии в ■ рошьпии народнохозяйственных задач. Уфа, 1991. -C.I6-2b.

6. Катаева С.р., Садчков Б.Ф. Влияние штаммов клубеньковых бактерий с различными симбиотическаки сшйствоми на урожай гороха '//Экология и биотехнология сзотфи'ксирующях почке иных микроорганизмов: Труда ВНЖХУ. -С.-Ш, 199Г, -Г.61, -С.42-50.

7. Катаева С.Р. Разработка экспросс-иотода. для оценки конкурентоспособности штаммов клубеньковых бактерий // Тез.научн.конф. Уфа:'БЩ УрО АН СССР, 1991. -С.99.

8. Валеева Л.В., Саднков Б.Ф., Катаева O.P. Энергетическая эффективность азотфиксации ' и конкурентоспособности'

клубеньковых бактерий гороха и сои //Микроорганизмы в сельском хозяйстве: IV Всосоюон.научи.конф.-Пудано, 1992. -С.25. Э. Кашаэва O.P. Использование морфолого-культуральннх . - различий штаммов . клубеньковых бактерий гороха для ' оценки на конкурентоспособность // Виол.науки. -1992. ' -N 11-12. -С.82-86.

10 .Садиков Б.Ф. .КашэеваС.Р. Использование, морфолога-культураль- . них свойств колоний шташов Rhizoblum legumlnosarum для оценки их конкурентоспособности //Микробиология.- 1992. - Т.62, N5,-С.924-928.

Подшсино ч йеч-яти 19.11.:!3г. фо^ат I/I6

Eytmrn писчая l'r I. Печать .плоская. Уч.-п~д.л. 1,0.' Тщ'л* 1С, an. cn!"i3 i;? //if

y.'HiccîfÇin тупогс':-.ия 2 Мишьггп-лпи печати a ш^юрмацнп Реслубгп'л; Бг.>: -бч-ъгт •«.. '^U.-.-r.j • гл.J.U^i>rc'ï,12-