Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЛИЗОГЕНИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ И ФАСОЛИ ИЗ ПОЧВ РУАНДЫ И СССР

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "НЕКОТОРЫЕ ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ЛИЗОГЕНИЯ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ И ФАСОЛИ ИЗ ПОЧВ РУАНДЫ И СССР"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ ,

На правах рукописи НЗИТАБАКУЗЕ ЖАН БОСКО

некоторые физиолого-бйохимические

свойства и лизогения клубеньковых

бактерий сои и фасоли из почв руанды и ссср

; (03.00.07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА —1977

• ^ • ' ' .'•'/? -/ <•' 1 _

Работа выполнена на кафедре микробиологии Московской с.-х. академии им. К- А. Тимирязева и в отделе общей вирусологии, актинофагии и ¡бактериофагии Института микробиологии ан ссср. ... ■■■.'...

Научные руководители: профессор-доктор биологических наук В. К. Шильникова, кандидат биологических наук ■' Л. Н. Москаленко. , /

'Официальные оппоненты: профессор доктор биологических наук Д. Г. Звягинцев, кандидат биологических наук В, И. Романов,

■ ;.; Ведущее предприятие—Всесоюзный научно-исследовательский институт биологических средств защиты растений и бактериальных препаратов.'-■ ,

Защита диссертации состоится в < часов на заседании специаллзировэнного биологического совета № 5 при Московском государственном универси-.' тете.' ■ . ■ :;

Ваш отзыв (в 2 экз.) просим направлять ло адресу: Москва, 117234, Ленинские горы,. МГУ, биологический' факультет, ".Ученый совет.

Автореферат разослан

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологи-. - ческого факультета. *

Ученый секретарь Совета

(Ю. Т.ДЬЯКОВ)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. К основным традиционным культурам Руанды, имеющим наибольшее значение в питании местного населения, наряду с бататами, относятся зернобобовые, такие, как фасоль, горох. Среди зернобобовых культур фасоль занимает особое место как повсеместно распространенная — в большинстве областей страны она культивируется дважды в год. Однако, несмотря на многовековое возделывание фасоли, ее урожайность остается крайне низкой и составляет в среднем немного больше 8 ц/га (Bull. Agrie., Rwanda № 1, 1976).

В последнее время все больше внимания в стране уделяется культуре сои, ¡питательность которой давно .известна. По данным отдельных проведенных опытов в Руанде, три иитрагини-защнн сои клубеньковыми бактериями из Бельгии и Аастра-лии можно получить [Прибавку урожая сои, в среднем до 130— 200% по сравнению .с ееинокулированным контролем. Однако этот агротехнический -прием ¡инокуляции 'бобовых растений клубеньковыми бактериями еще не ¡получил должного распространения в стране.

В связи с большой ролью, которую ¡призван сыграть «биологический» азот в земледелии Руанды, а та.кже его высокой экономичностью, важно как можно полнее (выяснить условия, способствующие усилению процесса симбиотической фиксации азота из атмосферы. Это и определило постановку 'наших опытов. В -своих исследованиях мы исходили из предпосылки того, что в ферралитных почвах Руанды распространены штаммы "клубеньковых бактерий разной степени эффективности, вирулентности, конкурентоспособности и фагоустойчиво-сти, что создает необходимость их всестороннего изучения.

Цель и задачи исследования. В работе исследованы физиолога-биохимические свойства ¡клубеньковых бактерий сои и фасоли из ферралитных почв Руанды в сравнении с ризобия-ми тех же растений из/красноземов Грузии а дерново-подзолистой почв Московской области. Основное внимание уделялось следующим

гг"!"""""'

Цмгтдош! 1эк*т tutamen' Ипшть* opa. гяшг,*.

|1Ш8Г» UVlI. А. Т-ЧГ'Н-Ш'

— изучению ризосфериой микрофлоры фасоли и сон как среды обитания клубеньковых бактерий, поскольку знание состава микроорганизмов в ризосфере .бобовых растений, закономерностей .их развития, характера взаимоотношения определенных физиологических групп микроорганизмов в ризосфере имеют,'Прежде всего, значение для осуществлен,и я на практике правильных агротехнических мероприятий, в частности, лрие-ма нитрагинизацик этих культур;

— изучению тонкой структуры и морфологии штаммов клубеньковых бактерий фасоли и сои разного географического происхождения с применением для этой цели трансмиссионной и сканирующей электронной микроскопии;

— определению реакции опытных (Культур ризобий на различные концентрации аопарагина с целью проверки «а-опара-гинового теста» (06Ьеге1псг е! а1„ 1970) как возможного простого критерия эффективности штаммов;

— определению цитокининной активности у исследуемых культур клубеньковых бактерий фасоли и соя для установления закономерностей синтеза цитокипинов штаммами разного географического происхождения и выявления возможной связи цитокининной активности с вирулентностью и симбиотиче-ской эффективностью;

— изучению лизогении у клубеньковых бактерий разного географического происхождения на примере НЬ, рЬаэео!!, поскольку производственная ценность культур рнзобий в значительной степени вав-и-сит от их лизогенного состояния, хотя последнее нередко недоучитывается;

— определению вирулентности и активности азотфиксации 'выделенных нами штаммов клубеньковых бактерий фасоли к соп в вегетационных опытах с целью подбора наиболее производственно ценных культур.

Научная новизна. Впервые разносторонне (на активность, вирулентность и лиз-огению при использовании разных тестов) изучены культуры клубеньковых бактерий фасоли и сои, выделенные из клубеньков соответствующих видов растений, выращенных на ферралитных почвах Руанды. Первым опытом оценки численности и качественного состава являются исследования микрофлоры .ферралитных лочв. Установлено, что рекомендуемый Добсрейнер с «оавт. (ОоЬеге)пег е! а1., 1970) аспарагниовый тест для предварительного отбора «чрезвычайно высокоэффективных» штаммов не дает четких результатов. Корреляции по степени активности неустойчивы, в ряде случаев отсутствуют. Показано, что способность к синтезу цито-кининов у клубеньковых бактерий фасоли и сои не связана с их эколого-географическим происхождением и не определяется степенью -вирулентности культуры, С помощью электронной м к кр ос кол и и "в пер в ы ё ~ в ы я в лен ьгя морфологически раз-

nue типы фагов в красноземах Грузии, дерново-подзолистый почвах Подмосковья и ферралптной почве Руанды. Впервые электронно микроскопически в клубеньковой ткани фасоли выявлено присутствие ризобиофага (К15/Ф2) при инокуляции им семя» фасоли в сочетании с чувствительной к нему культурой Ф2.

Практическая ценность. Из клубеньков растений фасоли и сон, выращенных на ферралитпой почве ¡Руанды, выделены высокоактивные, высоковнрулентные и лизогенные культуры клубеньковых бактерий. По исследованным признакам наиболее ¡пригодным для эколого-географических условий Руанды оказались штаммы Rh. japonicum CRI, Rh. phaseoli R6. Штамм Rh. phaseoli R19 оказался высокоактивным, вирулентным и дефектнолизогенным, что дает основание рекомендовать его в производство. Сведения о цитокининной активности, отношении к асп а ратину, ультраструктуре и лизогешш клубеньковых бактерий вносят определенный вклад в развитие представлений о взаимозависимости данных признаков, а также об их связи с симбиотической эффективностью и вирулентностью у клубеньковых бактерий.

Апробация работы. Результаты работы докладывались и обсуждались на заседаниях .кафедры микробиологии ТСХА, Отдела общей вирусологии, бактериофагии и актннофагии Института микробиологии АН СССР, на научной конференции ТСХА в нюне 1976 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 статьи, находится в печати 1 (Известия ТСХА).

Объем работы. Диссертация состоит из 125 страниц машинописного текста, 22 таблиц, И рисунков. Описок использованной литературы содержит 258 наименований, нз них 106 на русском языке и 152 па языках иностранных авторов.

Объекты и методы исследовании

Объектами исследовании служили чистые культуры Rh. phaseoli и Rh. japonicum, .выделенные нами из клубеньков соответствующих видов растений-хозяев,'выращенных на ферралитной почве республики Руанды, красноземной и дерново-подзолистой почвах СССР в условиях вегетационных опытов. В ряде опытов попользовали также музейные штаммы из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии.

-Вегетационные опыты проводили, пользуясь руководством 3. И. Жур-бицкого (1968), семена стерилизовали по Натману (Nutman, 1945) крепкой серной кислотой в течение 5 мин. и проращивали в стерильных чашках Петри при 28Х в термостате.

Семенной материал — Phaseolus vulgaris L., сорт Лат-

пня 800 И Hispida maxima L., сорт северный 4, ультраскороспелый, амурской селекции.

Из клубеньков растений выделено 24 штамма Rh. japoni-cum (16 штаммов из краснозема, 5— из дерново-подзолистой и 3 — из ферралитной ;почв) и 21 штамм Rh. phaseoli (соответственно 12, 3, 6). Штаммы обозначали [Порядковым номером, ставя перед соответствующей цифрой буквы, означающие почву, из которой они выделены: К — краснозем, ДП — дерново-подзолистая гпочва, R— ферралитная почва Руанды. Для штаммов клубеньковых бактерий сои дополнительно ставилась буква «С» — соя (CK, СДП, CR). Фаги, обнаруженные с помощью электронной микроскопии в культуральной жидкости лизогенных культур, обозначали номером лизогенной культуры. Фаги, размноженные на индикаторных 'культурах, обозначали дробью, в числителе которой ставили номер лизоген-ной культуры, в знаменателе — индикаторного штамма.

Выделение клубеньковых бактерий в чистую культуру проводили по методу В, П. Израильского (1933). Культуры хранили на скошенном бобовом агаре или среде № 79 Ковальского (Kowalski et al., 1963).

Микробиологический анализ почв проводили по общепринятым методам: учет бактерий на МПА, ажтиномицетов на КАА, грибов — на подкисленном (pH 5,0) сусло-агаре (CA), бациллы на МПА + СА в соотношении 1 : 1 (посев из пастеризованной суспензии); анаэробных азотфиксаторов рода Clostridium методом /предельных разведений на среде С. Н. Вино-градского с добавлением нейтральрота (1 :40000), азотобактера на среде Эшби (pH 7,0) методом раскладывания комочков лочвы, Beijerinckia — тем же методом, но при pH среды— 5,0; клубеньковые бактерии на среде Эшби с кристаллическим фиолетовым (I : 100 000). Ризосферный эффект растений сои и фасоли изучали на образцах красноземной и дерново-подзолистой почв, взятых из вегетационных сосудов сразу же после снятия опытных растений. В случае ферралитной почвы анализы -проводили только в почве до .постановки вегетационного опыта.

Цитоморфология клеток клубеньковых бактерий изучалась методом сканирующей микроскопии и на ультратонких срезах методом трансмиссионной электронной микроскопии. Целые «летки просматривали в сканирующем (растровом) микроскопе JEOL (JSM-50A), тонкие срезы в электронном микроскопе JEM-7.

Реакцию клубеньковых бактерий на D, L-аспарагин изучали по методу Педроза с соавт. (Pedrosa et al., 1972) в присутствии ашарагина в концентрациях 100, 200, 400, 800, 1600 мг/л. Культуры выращивали на качалке при 23° С в .пробирках, содержащих 10 мл среды, в течение 4 дней в случае 4

ризобий фасоли и S — .клубеньковых бактерий сои- Степень роста определяли спектрофотометрически на нефелометре при длине волны=540 нм. Процент подавления или стимуляции роста аспарагином в концентрации 400 мг/л по сравнению с ростом на среде со 100 мг/л аспарагина определяли по формуле:

Д.м-Д^ ,х100т Дюо

где Дюо и Д400 — показания ФЭКа при концентрации аспара-гина 100 и 400 мг/л в среде.

Изучение цитокининной активности культур клубеньковых 4 бактерий проводили методом биотеста по О. Н. Кулаевой (1973), Клубеньковые бактерии фасоли л сои выращивали в жидкой бобовой среде соответственно 6 и 8 дней на качалке при 28°С. Культурадьную жидкость исследуемых культур обрабатывали в делительной воронке этиловым эфиром с уксусной кислотой, а затем испытывали на цитокинияную активность путем нанесения на выбитые из листьев ячменя диски в чашках Петри. После пяти суток инкубации на рассеянном свету из дисков экстрагировали хлорофилл в 96°-ном этаноле. Определяли хлорофилл количественно на спектрометре Хитачи (Hitachi). Концентрацию хлорофилла вычисляли по формуле Винтерманс и Де Моте (Шлык, 1968) в смеси без разведения.

Изучение ризобий на лизогению проводили методами электронной микроскопии и перекрестных испытаний (Fisk, 1942). Электронно микроскопические исследования проводили с целью выявления присутствия фаговых частиц в культуре опытных штаммов. В случае перекрестных испытаний супер-натант односуточных жидких культур испытывали на газонах индикаторных штаммов. При появлении зон лизиса или угнетения роста тест-культур наличие фага подтверждалось пере-виваемостью логического агента.

Для выявления лизогенного состояния были также использованы разные индуцирующие агенты: митомнцнн С, облучение УФ-лучалш, термоиндукция и ванкомицин (антибиотик) для выявления -возможности образования вирулентных мутантов умеренных фатов опытных культур.

Размножали и титровали фаги двухслойным методом (Gratia, 1936) на плотной среде № 79 Ковальского. Спектр литической активности определяли путем нанесения 1—2 капель фаголизата на газоны индикаторных штаммов.

Фаги исследовали электронномикроскопически в микроскопе JEM-7. Препараты для электронного микроскопа готовили из сконцентрированных фаголизатов методом дифференциального центрифугирования (Раутенштейн с соавт., 1971),

дополнительно очищали по методу А. С. Тихонепко (Î968) и контрастировали 0,5%-иым уранилацетатом или 2%-ным раствором фосфори©вольфрамовой кислоты.

Вирулентность клубеньковых бактерий фасоли и сои определяли по скорости образования ими клубеньков на корнях соответствующих видов бобовых растений. Растения, иноку-лированные 2—3-суточными культурами ризобий, выращивали в широких »пробирках на агаризованной среде С. А. Ковров-Певой (1933) до визуального образования клубеньков.

Эффективность сим биотической азотфиксации клубеньковых бактерий фасоли и сои изучали в вегетационных о-пытах на чистом кварцевом песке. Б лесок вносили соли по Д. Н. Прянишникову с добавлением микроэлементов. Азот вносили в форме NH4NCu в количестве 0,2 нормы (16,8 мг/кг песка).

Для инокуляции сои и фасоли отбирали штаммы, которые наиболее отличались ло изученным нами признакам: реакции па аспарагин, способности продуцировать цитокинины, лизо-геини, с целью выявления возможности связей между этими признаками и эффективностью азотфиксации у исследуемых штаммов,

Схема вегетационных опытов (для сои): I — контроль (без инокуляции); 2— инокуляция штаммом СК21; 3 — штаммом СК22; 4 — штаммом СК23; 5 — штаммом СДП4; 6 —штаммом CR1; 7 — штаммом CR4; 8 — штаммом CR7, В опытах с фасолью были включены варианты с [применением бактериофага К15/Ф2, активного'Против Rh. phaseolj Ф2. Этот фаг был выделен нами у культур Rh. phaseoli в ходе изучения опытных штаммов клубеньковых бактерий фасоли на лизогению. Схема опыта {для-фасоли): I —контроль (без инокуляции); 2—инокуляция штаммом К15; 3 — штаммом Ф2 (индикаторный); 4 — смесью штаммов К15 + Ф2 (1 : 1); 5 — смесью фага К15/Ф2+.штамм Ф2 (1 : 1); 6 — штаммом KJ0; 7 — штаммом KI6; 8 — штаммом ДП5; 9 — штаммом R6; 10 — штаммом R9; il—штаммом R19; 12 — штаммом R22. Растения выращивали до полного созревания бобов. По окончании опытов учитывали урожай зеленой массы, бобов и корней, а также определяли общий азот микрометодом Кьельдаля, белковый азот в бобах по Барнштейну.

В опытах с фасолью в вариантах с ¡применением бактериофага Rh, phaseoli, кроме того, определен титр бактериофага в ризосфере и .клубеньках, количество клубеньковых бактерий и сделаны лрепараты ультратонких срезов клубеньков для электронной микроскоп пи методом, описанным В. К, Шиль-никовой (1975). Данные учета урожая сои и фасоли обработаны математически методом дисперсионного анализа (Доспехов, 1965).

Результаты исследовании и их обсуждение.

Цигоморфология клубеньковых бактерий фасоли 1

Ультраструктура клеток ризобий фасоли все еще недостаточно изучена в динамике (Мишустин, Шильникова, 1973). Особенно слабо исследовано строение клеток методом сканирующей микроскопии (Old, Nicolson, 1975).

Мы ставили задачу попытаться выявить характер влияки-я резко-различных условий тючвенной среды на анатомическое строение клубеньковых бактерий фасоли, по аналогии с исследованиями И. Б. Павловой (1967) некоторых географических разновидностей патогенных грамотрицательных бактерий.

Результаты исследований показали, что независимо от географического происхождения выделенные клубеньковые бактерии в чистой культуре характеризуются особенностями, типичными для грамотрицательных бактерий. В молодом возрасте (до 4—5 суток) .клетки размножаются преимущественно бинарным делением путем перетяжки. Позднее (7—9 суток) они переходят к лочкованию. Следует отметить, что в 5—9-су-точных культурах некоторых штаммов ризобий фасоли (штаммы R22, К16) в значительных количествах наряду с палочковидными встречались и бактероидные формы. Для чистых культур явление столь раннего перехода клеток в бактероид-ную форму нехарактерно, и, очевидно, в данном случае проявляются индивидуальные особенности штаммов.

Реакция клубеньковых бактерий сон и фасоли на D, L-аспарагнн и эффективность бобово-ризобиального симбиоза "

В качестве критерия ускоренного отбора высокоэффективных штаммов Rh. japonicum в последние годы предложен тест-метод по чувствительности к аспарагину (Dobereiner et af., 1970; Pedrosa et al., 1972). По мнению данных авторов, высокоэффективные штаммы Rh. japonkum («необычайно эффективные» по их терминологии) обладали повышенной чувствительностью к аспарагину и резко шдзвлялись им в концентрации 400 мг/л :в среде. Исключительная простота метода привлекла наше внимание. Полученные нами данные (табл. 1) показывают, что аспарагин в разных концентрациях в среде по-разному влияет на рост клубеньковых бактерий. Как правило, аспарагин в концентрациях 100 и 200 мг/л стимулировал рост опытных штаммов по сравнению с их ростом на среде без аогарагина, в концентрациях 800 и особенно 1600 мг/л тормозил развитие ризобий до почти полного прекращения роста.

Среди клубеньковых бактерий сон наиболее чувствительны

Таблица I

Реакция культур Ют. ]оротсит и ЯН. рЬаьеоН на Д, Ь-аспарагин

№ Показания ФЭКа (ДМо) конц. аспарагмна, мг/л)

штамма КОНТРОЛЬ (без аспа-рзгина) 100 200 400 800 5600

0,06 0,19 0,16 0,11 0,12 0,03 —42,1

0,13 0,19 0,15 0,19 0,12 0,05 0,0

0,07 0,22 0,15 0,05 0,04 0,01 —63,6

0,17 0,19 0,18 0,14 0,14 0,02 —26,3

0,06 0,10 0,08 0,06 0,06 0,04 —40,0

ода 0,22 0,1 У 0,12 0,10 0,0 —45,4

0,09 0,21 0,14 0,09 0,01 0,0 —57,1

0,09 0,19 0,13 0,05 0,01 0,0 —75,0

0,09 0,24 0,76 0,10 0,0 0,0 —58,3

0.05 0,07 0,11 0,28 0,20 0,01 +300,0

0,09 0.14 0,12 0,26 0,01 0,0 +80,0

0,12 0,26 0,18 0,20 0,0 0,0 —23,0

0,14 0,16 0,18 0,24 0,П 0,13 +50,0

0,15 0,19 0,17 0,15 0,14 0,05 -21,1

0.13 0,14 0,17 0,08 0,07 0,05 —42,8

0,11 0,17 0,18 0,17 0,09 0,03 0,0

0,08 0,17 0,21 0,09 0,03 0,01 —47,1

0,07 0,19 0,14 0,09 0,0 0,0 —52,6

0,15 0,27 0,19 0.18 0,12 0,04 —33,3

0,13 0,23 0.16 0,03 0,02 0,01 —86,9

0,12 0,21 0,14 0,03 0,02 0,01 —85,7

0,10 0,20 0,17 0,06 0,04 0,02 —69,0

0.08 0,17 0,21 0,15 0,07 0,04 —11,7

о,оа 0,16 0,17 0,21 0,07 0,01 +21,0

0,08 0,18 0,14 0,12 0,14 0,04 —2а,2

0,07 0,11 0.09 0,05 0,04 0.02 —36,0

0,09 0,23 0,14 0,09 0,03 0,01 -62,0

0,08 0,17 0,21 0,15 0,07 0,04 —11,7

0,12 0,21 0,18 0,06 0,03 0,01 —71,4

0,10 0,20 0,18 0,06 0,03 0,02 —67,5

0.11 0,22 0,19 0,06 0,02 0,01 —72,7

0,09 0,18 0,16 0,15 0,05 0,03 —18,9

0,10 0,26 0,15 0,14 0,11 0,09 —49,0

0,15 0,18 0,19 0,14 0,13 0,04 —27,0

0,13 0,16 0,17 0,23 0,11 0,02 + 51,0

0,08 0,22 0,16 0,08 0,04 0,01 —62,0

0,06 0,2 0,14 0,09 0.03 0,0 —76,0

0,08 0,19 0,18 0,07 0,04 0,02 —68,0

0,09 0,18 0,16 0,06 0,03 0,01 — 17,8

0,12 0,21 0,18 0,07 0,03 0,01 —66,6

* Имеется в виду степень развития (%) культур на среде с 400 мг,Гл аспарагина по сравнению с развитием на среде с 100 мг/л; определение по

формуле: - .Д'^Д1"». х 100; Лих

+ стимуляция роста,

— подавление роста. .....

к асларагину в концентрации 400 мг/л штаммы CRI и CR4 (из почвы Руанды) и штамм СК21 (из краснозема Грузии). Развитие некоторых штаммов Rh. japonicum, в частности штамма СК23, стимулировалось в присутствии 400 мг/л аспа-

Таблица 2

Эффективность разных штаммов клубеньковых бактерий сои (НСРо.55=9,24; т%~4,15) и фасоли (НСР0.и=18,4; ш% =7,3) (вегетационный опыт)

Вариант опыта Общий вес сухой массы растений Общий азот в % Белковый азот, % Содержанке белка в % % к контролю

£ О О и * а CÉ! И В О а, о а 1- £ Си О ^ надзем-i ная 1 масса зерно

Растения сои

(контроль) 30,6 100 1,09 0,67 3,51 2,34 14,6 100

Бактеризация 222,6

штаммом СК21 59,6 194,4 1,7! i,29 5,94 5,20 32,5

» СК22 56,4 184,3 1,68 0,98 5,91 5,73 35,8 245,2

® СК23 51,7 182,0 1,57 0,78 5,88 4,79 29,9 204,8

» СДП4 40,5 132,4 1,43 0,84 6,16 5,79 36,2 247,9

» CR1 66,8 218,3 1,57 1,17 6,16 5,86 36.6 250,7

» CR4 53,8 175,8 1,71 0,89 5,66 5,60 35,0 239,7

s CR7 53,8 175,8 1,74 1,59 5,74 5,29* 33,0 226,0

Растения фасоли

(контроль) 21,97 i 00 1,90 1,02 1,33 1,18 7,1 100

Бактеризация

штаммом К15 49,19 223,9 1,97 1,26 3,12 2,58 15,5 218,3

» Ф2 44,55 202,8 1,64 1,22 3,7'$ 2,60 15,6 219,7

Внесены К15+

-(■Ф2 (1 : 1) 53,16 241,9 1,67 1,22 3,29 2,76 16,6 233,8

Внесены штамм

Ф2 + фаг

К15/Ф2 (1 : t) 50,0 227,6 0,98 0,95 2,88 2,09 12,5 176,0

Бактеризация

штаммом КЮ 55,17 251,1 1,46 1,05 3,36 2,81 16,9 238,0

» К16 55,61 253,1 2,46 1,22 3,18 2,86 17,2 242,3

» ДП5 59,86 272,5 1,78 1,П 3,05 2,69 16,1 226,8

» R6 49,68 226,1 1,99 1,04 3,44 3,25 19,5 274,6

» m 57,49 261,7 1,99 1,11 3,28 2,74 16,5 232,4

» R19 61,0 277,6 1,92 1,29 3,44 3,25 19,5 274,6

» R22 57,69 262,6 1,85 1,22 3,18 3,08 18,5 260,6

рагина до 300%. Однако, как и у всех других штаммов, их рост почти полностью прекращался -при концентрации ашара-гина 1600 мг/л. Остальные штаммы проявили к 400 мг/л. асларагина разную реакцию. Такую же разнообразную реак-

цию к аспарагину в дозе 400 мг/л наблюдал» у штаммов клубеньковых бактерий фасоли, среди которых наиболее чувствительными оказались штаммы R6, К16, КЮ и R9; положительно реагировал на присутствие в среде 400 мг/л аспа-рагина штамм R2 (рост его повышался на 50% по сравнению с ростом на среде со 100 ж/л аспарагина).

Б большинстве случаев клубеньковые бактерии сои и фасоли из почвы Руанды были более 'чувствительными к аспарагину в дозе 400 мг/л среды. В дальнейшем при определении эффективности симбнотической азотфиксацин мы нспользо-валивали в качестве ипокуляктов всс штаммы рнзобий, оказавшиеся чувствительными к аспарагину в концентрации 400 мг/л, а также некоторые штаммы (в частности, штамм СК23), нечувствительные к аспарагину при указанной концентрации.

Как видно из табл. 2, все исследованные штаммы в той или иной степени повышали урожай опытных растений и содержание.азота в хозяйственно ценных органах (зерне). Урожай общей массы растений сои увеличился на 32—118%, а накопление -белка в бобах повысилось на 105—151%. В частности, это наблюдалось у растений сои, шюкулированных чувствительным к аспарагину штаммом CR1. Следует отметить, что штамм СК23, хотя и обеспечил высокий урожаи сои, все же показатели содержания белка в бобово-ризобиальном симбиозе, вызванном этим штаммом, были наименьшие по сравнению с остальными штаммами, в особенности высокочувствительными к аспарагину штаммами, как, например, штамм CRI.

Примерно такие же результаты получены в опытах с бактеризованными растениями фасоли (табл. 2). Наибольшее накопление белка в зерне фасоли обусловила бактеризация штаммами Rh. phaseolí R6, RI9 и R22 из гферралнтной почвы. Необходимо отметить, что штамм R6 отличается высокой чувствительностью к аспарагину (табл. 1), синтезирует большое количество цитокининов н высоковирулентен. Аналогичную характеристику имеет штамм RI9, за исключением реакции на аспарапш, к которому он проявил низкую чувствительность (угнетение роста на 18% против 76% для штамма R6).

Создается впечатление, что асиарагиновый тсст не дает возможности отобрать «чрезвычайно высокоэффективные» штаммы, как это рекомендовали ранее (Dobereiner et al., 1970; Pedrosa et al., 1972). Корреляции но степени активности обоих показателей неустойчивы. Более того, в ряде случаев они отсутствуют, io

Синтез ци токи нин о в клубеньковыми бактериями сон и фасоли и вирулентность ризобий

По мнению ряда авторов (Giannattasio, Coppola, 1969; Phillips Torrey, 1970, 1972), способность клубеньковых бактерий продуцировать цитокинины может играть роль в формировании клубеньков на корнях бобовых растений и в конечном итоге определять эффективность бобово-ризобиального симбиоза.

В связи с этим представляло интерес испытать на цито-кннинную активность штаммы клубеньковых бактерий сои и фасоли с целью выявления возможной связи между происхождением культур, их способностью к биосинтезу цитокини-нов, вирулентностью и эффективностью сим биотической азот-фиксации.

Результаты определения хлорофилла в биотесте показали (табл. 3), что большинство изученных культур ризобий обладает способностью синтезировать кннины, но с разной степенью интенсивности. Среди исследованных ризобий наибольшей киншшой активностью обладали штаммы СК10, CK2I и СК22 из красноземной почвы. Однако из этих же почв была выделена и культура СК26, обладающая низкой

Влняне экстрактов культуральяых жидкостей клубеньковых бактерий сон и фасоли на содержание хлорофилла в дисках из листьев ячменя

Таблица 3

Содержание

общего хлорофилла

Содержание

общего хлорофилла

Варианты опыта

Варианты опыта

Вода (контроль) 0.3337 100

кинетнн — 0,2 мг/л 0,7292 218,5

Rh. japonktim СК4 0,9895 296,5 » СК10 1,0701 320.7 » СК21 1,0805 323.8

0,4 мг/л 1,1555 346,3

» 3,0 мг/л 1.5818 474,0

» СК22 0,9295 278,5

» СК26 0,4433 132,8

» СДП4 0,5306 160,6

» СДП6 0,8762 2§2,6

Штамм Rh, phaseoli К-10 0,4485 134,4

» К-15 0,273$ $2,0

» ДП5 0,3233 96.8

» R2 0,2923 87,6

» R3 0,3782 113.3

» R6 0,9621 288,3

» R9 0,3663 ¡09,7

» R!9 0,6231 186.7

» R22 0,4107 123.1

K-J6 0,3937 Ц7.9

» CR4 0,3885 1164 » CR7 0,9088 272,3

CRI 0,2790 83,6

способностью к синтезу хининов. То же самое можно отметить в отношении ризобий сои из дерново-подзолистой и фер-ралитной почв. Среди клубеньковых бактерий фасоли наибольшей продукцией кининов характеризуются культуры из почв Руанды (R6; R19); вместе с тем из этой же почвы была выделена культура R2, не обладающая указанной способностью.

Наиболее вирулентными среди клубеньковых бактерий сои оказались штаммы СК26, СКЮ, СДП4, CR4 и CR7, которые образовали видимые клубеньки на растениях сои уже на 7—9-е сутки после заражения. Клубеньковые бактерии фасоли проявили разную вирулентность в отношении растения-хозяина. Самые вирулентные из них {штаммы R19, К10, К16, R2, R3 и R22) сформировали клубеньки на 12—13-е сутки, маловнрулентные— на 21-й день после инокуляции.

Таким образом, по географическому признаку различий в степени вирулентности штаммов не отмечалось. Следует отметить, что штаммы клубеньковых бактерий сои СК10, СК21 и CR7, у которых выявлена наибольшая кииинная активность, :но вирулентности не отличались от таких, как CR1 и CR4, которые мало или совсем не проявили кининиой активности в наших опытах. То же можно сказать в отношении клубеньковых бактерий фасоли.

Итак, в наших исследованиях не было обнаружено корреляции между способностью штамма продуцировать цито-кинины и его вирулентностью. Поскольку в одной и той же почвенной разности встречались клубеньковые бактерии, обладающие различной кининиой активностью или даже не способные к синтезу этих веществ, мы полагаем, что решающее значение здесь имеют индивидуальные особенности штамма, по не географический фактор и не характеристика вирулентности штамма,

Лизогения клубеньковых бактерий фасоли

Для изучения лизогении у клубеньковых бактерий фасоли были использованы 18 штаммов разного географического происхождения; 3 штамма, выделенные из ферралитной почвы, 12—из красноземов и 3—из дерново-подзолистой почвы. Они проверялись на лизогению методами электронной микроскопии и перекрестных испытаний как возможно лизо-генные и как индикаторные. В качестве индикаторных культур дополнительно было использовано еще 1-5 культур Rh, phaseoli, И культур Rh, trifolii и 4 культуры Rh, legu-minosarum из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной .микробиологи и,

Электронномикроскаиическое изучение культуральной . 12

жидкости клубеньковых бактерий фасоли .показало, что у 9 штаммов (К1, К5, К9, К15, К16, ДП5, ДП6, Я9, К19) имеются фаговые частицы. У большинства из этих культур фаг был обнаружен как до индукции, так и после нее.

Наибольшее количество фаговых частиц мы наблюдали в индуцированных препаратах штаммов К1, К9, К15 и К16. По морфологии фаговые частицы опытных штаммов можно разделить на 3 группы, соответствующие типам почв, из которых были выделены ис-следуемые культуры: 1 —фаги в культурах, выделенных из краснозема, имеют правильную

__ О

гексагональную форму головки диаметром около 500 Л. Ото

росток (длиной около 1300 А) заканчивается четко выраженной базальной пластинкой с 6 зубцами. Чехол отростка не сокращается; 2 — в двух из трех штаммов (ДП5 и ДП6), выделенных из дерново-подзолистой почвы, имеются такие же

О

частицы, но отросток длиной около 1000 А немного отличается: базальную пластинку на его конце выявить не удалось; 3 — в двух культурах (К9, К19), выделенных из ферралитной почвы, были обнаружены частицы с очень мелкой головкой

о

правильной формы (около 300 А) и большим сложноустроен-

О

ным отростком. Длина отростка — около 2500 А, чехол сло-ербен к сокращению. У всех наблюдаемых частиц чехол отростка находился в сокращенном состоянии. Частицы подобной морфологии описаны 1976; Раутенштейн, Москаленко, 1970) как дефектные, не способные размножаться на чувствительных культурах.

В культуре К19 наряду с этими частицами присутствовали фаговые частицы еще одного морфологического типа, отличающиеся от всех вышеописанных частиц. Их гексаго-

о

иальной формы головка имеет диаметр около 600 А и гиб-

о

кий отросток длиной около 2300 А.

Таким образом, культуры ризобий из разных почв отличаются по морфологии фаговых частиц. По-видимому, это связано с тем, что в различных почвах распространены разные экологические разновидности Г?И. рЬаБеоН.

В перекрестных опытах на газонах некоторых индикатор-пых культур были отмечены зоны лизиса или угнетения роста, но выделить фаг из них, как правило, не удавалось. Отдельные штаммы, в культуральной жидкости которых электронномикроскопически было обнаружено значительное количество фаговых частиц, были подвергнуты комбинированной индукции митомицином С, нагреванием и облучением УФ-лучами, после чего культуральные жидкости были испытаны на различных штаммах р^авеоН. В результате

только в одном случае (из зоны лизиса, образовавшейся при нанесении культуральной жидкости штамма KI5 на газон музейной культуры Ф2) был выделен фаг К15/Ф2.

С целью выяснить возможности образования вирулентных мутантов умеренных фагов в лизогеиных культурах изучаемых клубеньковых бактерий фасоли, были .поставлены опыты с воздействием на них ванкомицина в концентрациях 50 и 100 мкг/мл. Такие мутанты были -получены под воздействием ванкомицина у Вас. thuringiensis var. Galleria (Раутенштейн с соавт., 1972) и Act. Orientals (Раутенштейн, Де-нпщ, 1970). В наших опытах, однако, индуцирования вирулентных мутантов умеренных фагов, содержащихся в лизо-генных культурах фасоли, под действием ванкомицина не наблюдалось.

Как уже отмечалось выше, в результате применения комбинированной индукции был получен фаг К15/Ф2 на газоне индикаторной культуры Rh. phaseoli Ф.2. Частицы фага К15/Ф2 морфологически резко отличаются от частиц фага, обнаруженных в культуральной жидкости Rh. phaseoli К15 (фаг KI5). Оли .представляют собой головку правильной

О

гексагональной формы диаметром 500—550 А и имеют короткий отросток (выступ), который не всегда бывает виден.

Возникает вопрос, почему в культуральной жидкости К15 был обнаружен один фаг, а на индикаторной культуре Ф2 размножился другой. Можно предположить, что культура К15 .полилизогенная и один из ее фагов удалось обнаружить в электронном микроскопе. Возможно также, что индикаторная культура Ф2 лизогенная и в условиях перекрестного опыта под действием нанесенной на нее культуральной жидкости штамма К15 выделяет вирулентный фаг, который и размножается на своей культуре Ф2. Это вполне вероятно. Такое явлсиие было описано у некоторых культур Rhizobium sp. и у Вас, thuringiensis (Раутенштейн с соавт., 1974). Таким образом, источником фага К15/Ф2 могла быть лизоген-нная культура К15 или индикаторная культура Ф2.

Чтобы выяснить истинное происхождение фага К15/Ф2, была проведена серия опытов по выделению фага (или фагов) нз культуры К15; в качестве индикаторных культур были ислользованы культуры других видов Rhizobium; из культуры Ф2, подвергнутой комбинированной индукции, а также пассированной через почву в опытах с обогащением.

Попытки выделить фаг из культуры Rh. phaseoli К15 на культурах других видов (4 штамма Rh. leguminosarum—горох— и 11 культур Rh, trifolii) оказались безуспешными. На газонах почти всех испытуемых клубеньковых бактерий появились зоны лизиса, однако перезиваемости из зон лизиса 14

не было. Следовательно, появление этих зон было вызвано не фа-гом, а другими антимикробными агентами. При определении спектра литического действия фаг К/15Ф2, в отличие от фага К15, оказался активным против ряда культур Ш1. рИааеоН. Как видно из табл. 4, фаг К15/Ф-2 лизировпл 6 из 13 испытуемых культур ИЬ, рЬаэеоП. Такой широкий спектр литического действия, а также способность лнзировать свою культуру характерны для вирулентных мутантов умеренных фагов.

Таблица 4

Спектр литического действия фага К15/Ф2 в отношении культур Rh. phaseoli

Индикаторные Действие фага Индикаторные Действие фага

культуры К15/Ф2 культуры К15/Ф2

Ф2 . + KI5

Ф9А + KJ0 _

680 + KI6 _

686 + cm _

ДП5 + R2 _

RI9 + R9 _

ДПЗ —

Условные обозначения: + зомя лизиса есть,

— зона лизиса отсутствует.

В опытах с обогащением почвы возможна индукция вирулентных мутантов умеренных фагов из культур, используемых для обогащения (Раутенштейн, Москаленко, 1970; Pay-тенштейн, Ретин-ская, 1966). В наших опытах с культурой Ф2, вносимой в образцы красноземной и дер ново-подзол и стой почвы, из почвенной болтушки были выделены фаги на 4-х индикаторных культурах Rh. phaseoli Ф2, ДП5, К10 и R9, Из контрольных вариантов опытов, в которые культура Ф2 не вносилась, фаги выделить не удалось.

Полученные данные подтверждают, что культура Ф2 лн-зогениая и способна в определенных условиях к образованию вирулентного мутанта своего умеренного фага. Таким образом, появление фага К15/Ф2 является результатом индукции вирулентного мутанта умеренного фага в лизогенной культуре Ф2, л од действием культуральной жидкости К) 5. Аналогичные результаты получили Л. Н. Маранц с соант. (1973) в опытах с Rh. meliloti.

В результате .проведенных опытов выявлено, что лилогс-ния среди представителей вида Rh. phaseoli также распространена, как и среди других видов Rhizohium. Однако, в отличие от клубеньковых бактерий люцерны, характерной особенностью клубеньковых бактерий фасол,и является то, что

J 5

подобрать чувствительна культуры к фа?ам, содержащимся в лизогенных штаммах, как правило, не удается.

Рассмотрим результаты совместной инокуляции семян фасоли клубеньковыми -бактериямл и ризобиофагом, активным против последних. Совместная инокуляция .фасоли штаммом Ф2 с ризобиофагом К.15/Ф2 (табл. 2) не влияла на . рост и развитие опытных растений, но снизила содержание азота в зерне на 20% по сравнению с вариантом, зараженным только культурой ризобий Ф2 без внесения фага. Содержание белкового азота также снизилось при внесении ризобиофага.

При инокуляции фасоли смесью штаммов Ю5 из лизоген-ной культуры и индикаторного штамма ИИ. ¡^ЬаэеоН Ф2 отмечалось повышение урожая зеленой массы по сравнению с вариантами, где использовались штаммы в отдельности. Однако явного преимущества в накоплении азота не наблюдалось.

Проведенные фенологические наблюдения за развитием растений не выявили каких-либо особых отклонений у растений, инокулированных штаммом Ф2 совместно с фагом К15/Ф2. Характер развития корневой системы у растений фасоли в случае инокуляции штаммом Ф2 совместно с фагом К15/Ф2 был вполне нормальным, клубеньки, как и в других вариантах, образовались в достаточном количестве. Однако последние были слаборозовыми и располагались преимущественно в .нижней части корневой системы.

Определение численности клубеньковых бактерий в момент снятия опыта {табл. 5) показало, что в ризосфере фасоли количество клубеньковых бактерий снизилось на 2—3 порядка по сравнению с первоначально внесенным количеством

Таблица 5

Численность клубеньковых бактерий фасоли и риз об и оф а га в ризосфере и клубеньках фасолм

Количество Количество фага

Вариант опыта клубеньковых бактерий в ризосфере в ризосфере в клубеньках

Контроль......... . Инокуляция штаммом К15 , . . » Ф2 . . , » штаммами К15 + Ф2 (1:1)........... Внесены штамм Ф2 и фаг К15/Ф2 (1:1).......... 7,7- ш' 1,2- 108 2,5 ■ 103 9,2 * 10е 0 0 0 0 2< 10а 0 0 0 0 1,5- Ю4

О—фаг не обнаружен; исходный титр клубеньковых бактерий; 1.10* клеток/мл; исходный титр фата— 1.10® частиц/мл.

этих культур (-— 1.1 Оа мл). Исключение составил вариант1 с культурой Ф2, титр которой сохранился на урэдне 1,2.10" клеток.

Количественное определение бактериофага в ризосфере н клубеньках фасол,и выявило его присутствие только там, куда он был внесен, причем в значительном количестве. Это свидетельствует о том, что бактериофаги ризобий хорошо приживаются .в ризосфере бобовых растений.

Наличие фага в клубеньках зараженных им растений фасоли подтвердили электронно макроскопические исследования тонких срезов клубеньковой ткани. Морфологически обнаруженные фаговые частицы в клубеньках фасоли идентичны частицам внесенного фата К15/Ф2, которые, как показали более поздние исследования, происходят из индикаторной культуры Ш1, рИазеоП Ф2. Эти данные могут служить косвенным доказательством лизогенного состояния культуры Ф2 и указывают на возможность выделения фага из клубеньков, тщательно простерилизовапных с поверхности, что ранее считалось невозможным (Доросипский, 1941). Ни ь одном из исследований по данному вопросу подобных электроииограмм клубеньковой тканм ранее не было получено.

Тот факт, что совместная инокуляция фасоли с чувствительной к нему культурой клубеньковых бактерий снизила содержание азота и белка примерно на 20% по сравнению с инокуляцией ллзогенными штаммами К15 и Ф2, свидетельствует о том, что отрицательно влияют на бобовые растения фаги, находящиеся вне клубенька. Возможно, взаимодействие клубеньковых бактерий с фагом происходит в период, предшествующий инфицированию ими корневой системы бобовых, в результате чего образуются, очевидно, малоактивные варианты. исходных бактерий. Отсюда следует практический вывод о необходимости установления присутствия в почве ризо-биофагов, активных против вносимых с нитрагином штаммов ризобий. Применение фагорезистентных штаммов, особенно на участках под посевами многократно инокулированных бобовых, может предотвратить нежелаемое снижение качества урожая, поскольку на таких участках, где уже имеются многочисленные клубеньковые бактерии, могут встречаться в изобилии и ризобиофагн с широким спектром литического действия.

Выводы

1. Из клубеньков растений фасоли и сон, выращенных па ферралитной почве Руанды, красноземе Грузни и дерново-подзолистой почве Московской области, выделены высокоактивные высоковирулентные и лизогашые культуры клубеньковых бактерий. Из 42 выделенных и изученных шгаммов клу-

бепьковых бактерий сои и фасоли наивысшей симбиотической активностью, вирулентностью, способностью к синтезу цито-кипинов и наибольшей чувствительностью к аспарагину характеризовались штаммы Rh. japonicum CRI, СК22, Rh. phaseoli R6 и K10, Фагоносительства в клетках двух последних культур не обнаружено. Штамм Rh. phaseoli RJ9 оказался высокоактивным, вирулентным и дефектиолизогенным, что может служить основанием для рекомендации его в производство,

2. Разные штаммы клубеньковых бактерий сои и фасоли неодинаково чувствительны к аспарагину. Наибольшей чувствительностью к 400 мг/л аспарагина обладали штаммы Rh, japonicum CRI (высокоактивный), CR4 (среднеахтивный) и СК21 (малоактивный), а также Rh. phaseoli R6 и R22 (высокоактивные), КЮ и К16 (среднеактивные).

В большинстве случаев клубеньковые бактерии сои и фасоли из ферралитной почвы Руанды были более чувствительны к аспарагину в дозе 400 мг/л среды. Использование в качестве критерия эффективности аспаратипового теста для предварительного отбора «чрезвычайно высокоэффективных» штаммов (по Dôbereîner et al., 1970; Pedrosa et al., 1972) не дало четких результатов. Корреляции по степени активности обоих показателей неустойчивы, в ряде случаев отсутствуют.

3. При исследовании цитокининной активности у 20 штаммов Rfi. japonicum tu Rh. phaseoli, выделенных из почв Республики Руанды и СССР, установлено, что большинство изученных штаммов (14 из 20) в чистой культуре обладало цитокининной активностью в пределах 0,2—0,4 мг/л кинетина. Наивысшей цитокининной активностью обладали штаммы CR7 и СК10 (высоковирулентные), а также штаммы СК21, СК22, R6 (маловирулентные). Способность синтезировать цитокяни-ны не связана с географическим происхождением штаммов и не определяется степенью их вирулентности.

4. Различий в ультратонком строении клеток клубеньковых бактерий фасоли разного географического происхождения (почвы Руанды и СССР), разной степени активности, вирулентности и фагоч ув стайте л ы гост и в чистой культуре не выявлено.

5. Электронномикроскопически установлено истинно лизо-генное состояние у 9 из 18 культур клубеньковых бактерий фасоли: штаммов R19 (высокоактивный и вирулентный), R9, К16 (среднеактивные, маловирулентные), К15 и ДП5 (малоактивные, маловирулентные), а также КI, К5, К9 и ДП6 (на активность и вирулентность не проверялись).

6. По морфологическим признакам обнаруженные в электронном микроскопе фаги разделяются на 3 группы: 1 — в культурах из красноземной почвы Грузии (К.1, К5, К9, KI5 и

к 16) доминируют фаговые частицы правильной гексагональной формы с хорошо выраженной базальной пластинкой; 2— в культурах из дерново-подзолистой .почвы Подмосковья (ДП5, ДП6) распространены подобные фаговые частицы, но без базальной пластинки; 3—в культурах из ферралитнон почвы Руанды, в отличие от других, обнаружены дефектные фаговые частицы.

7. В перекрестных испытаниях на лизогению выделить и размножить фаги из исследуемых культур рЬазеоН как на клубеньковых бактериях фасоли, так л на культурах других видов ТШгоЪшт не удалось. Только в одном случае при нанесении культуральной жидкости индуцированной культуры К15 на газоне РИ, рЬазеоН Ф2 был выделен н размножен фаг К15/Ф2, морфологически резко отличающийся от фага, содержащегося в лизогенной культуре К15.

8. Сравнительное изучение фагов К15/Ф2, а также лизогсл-ных культур К15 и Ф2 показало, что по происхождению фаг К15/Ф2, вероятно, является вирулентным мутантом умеренного фага лизогенной индикаторной культуры Ф2. Отсюда следует заключение, что при исследовании на лизогению клубеньковых бактерий, а также других микроорганизмов следует обращать внимание на возможность индуцирования индикаторных штаммов, поскольку последнее может привести к ошибочным выводам.

9. В вегетационных опытах при совместной инокуляции семян фасоли рлзобиофагом К.15/Ф2 с чувствительной к нему культурой Ф2 содержание азота и белка в растениях снизилось примерно на 20% по сравнению с инокуляцией только лизогенным штаммом Ф2, Это объясняется влиянием активного ризобиофага в клубеньках фасоли, присутствие которого нами подтверждено электронномикроскапически на тонких срезах клубеньковой ткани.

Список статей, опубликованных по теме диссертации

1. Естественное заражение фасоли и сои клубеньковыми бактериями в красноземных и дерново-гподзолистых почвах. Доклады ТСХА, 1976, вып. 218, 132—140 (соавт. В. К. Шиль-никова).

2. Лизогения клубеньковых бактерий фасоли, выделенных из почв Руанды и СССР. Известия ТСХА, 1977, № 3 {соавт, Л. Н. Москаленко, Я- И. Раутенштейн, В. К. Шильникова).

3. Цитокининная активность клубеньковых бактерий фасоли и сои из разных почвенно-климатических зон {соавт. В. Г, Марьенко, В. К. Шильникова) (в печати).

Объем ] 'Д п. л.

Заказ 612.

Тираж 150

Типография Московской с.-х. академии им. К. А. Тимирязева 125008, Москва А-8, Тимирязевская'ул., <54