Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ОСОБЕННОСТИ ФАГОВ И ЛИЗОГЕНИИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ ( RHIZOMUM JAPONIOUM )

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ОСОБЕННОСТИ ФАГОВ И ЛИЗОГЕНИИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ ( RHIZOMUM JAPONIOUM )"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи АНДРЕЕВА Ирина Николаевна

уда 57В.262.8 [81+64] - 941.131.086.3

ОСОБЕННОСТИ ФАГОВ И ЛИЗОГЕНИИ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ СОИ ( ЕМгвМш ЗароШсиш ),

Специальность 03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1965

работа выполнена в Отделе общей и сравнительной вирусологии Института Микробиологии АН СССР.

Научный руководитель -кандидат биологических неук А.Л.Лысенко

Официальные оппоненты:.

доктор биологических наук В.К.Шильникова доктор биологических наук В.К.Равин

Ведущее учреждение - Московский государственный университет им. Ш.В.Ломоносова, факультет почвоведения, кафедра биологии почв.

Автореферат разделан МСЬрунр 1985 г.

Защита диссертации состоится и « 1985 г.

в /У^часов на заседании Специализированного Совета Д 002.64.01 при Институте Микробиологии АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Приглашаем Вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании Специализированного Совета или прислать отзыв на автореферат по адресу: 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корт.2, Отзывы направлять в 2-х экземплярах, заверенных печатью»

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

Л.Н.Москаленко

Актуальность проблемы. Актуальность изучения фагов клубеньковых бактерий определяется их связью с практически важной группой микроорганизмов и влиянием на урожай бобовых культур, ■ .

Сельскохозяйственные бобовые растения имеют важное значение как источник полноценного белка. Благодаря симбиозу с. клубеньковыми бактериями, фиксирующими атмосферный азот, бобовые растения в значительной мере покрывают свои потребности в азотном питании, обогащают почву азотом, улучшая тем самым условия произрастания последующих культур.

Ведущее место среди зернобобовых занимает соя; в последнее время у нас в стране и за рубежом расширяют.посевы этой культуры. Интерес к изучению клубеньковых бактерий сои повышается наличием у многих штаммов этого вида системы рециклизации водорода, увеличивающей эффективность азотфиксации, и способностью, в определенных условиях, фиксировать азот в чистой культуре; последнее важно при изучении механизма симбиотичеекой азотфиксации.

Характеристика бактерий не будет полной без сведений об их фагах и особенностях лиэогении. Фаги клубеньковых бактерий представляют собой важный фактор, влияющий на урожай бобовых растений.'Особый интерес представляет изучение лиэогении клубеньковых бактерий в связи с их симбиотическими свойствами.

11ель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении свойств фагов и особенностей лизогении клубеньковых бактерий сои. Были поставлены следующие задачи:

- изучить морфологические свойства группы фагов, лидирующих клубеньковые бактерии сои ( морфологию вирионов и негативных колоний.)

- исследовать некоторые физико-химические свойства ДНК этих фагов

- экспериментально получить лиэогенные культуры клубеньковых бактерий сои, исследовать особенности их лизогенного состояния и сиыбио-тнческие свойства.

Научная новизна.: Данная работа - одно из первых исследований фагов ил изо гении клубеньковых бактерий сои. В работе приведены сведения о морфологии вирионов и негативных колоний 25 фагов У четырех из них впервые изучены некоторые физико-химические свойства ДНК. Впервые экспериментально получены лиэогенные культуры и изучены особенности лизогенного состояния клубеньковых бактерий сои. Впервые проведено изучение влияния лизогенизации культур этого вида на их сиибиотические свойства.

I ...» I и ..

с 7. Г с

- г -

Практическая ценность. Сведения о фагах важны для изучения как генетики клубеньковых бактерий« так И механизма синбиотической аэо»фиксации. Изучение фагов и лизогении у клубеньковых бактерий имеет большое значение и для разработки оптимальных условий производства и использования бактериальных удобрений.

Аптобапия. Материалы диссертации представлены на БсесовэноЯ конференции "Научные основы производства и применения нитрагина" ( Москва, 1991 ).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора-литературы, экспериментальной части, обсуздення, выводов и списка литературы. Материалы изложены на 145 страницах машинописного текста, диссертация содержит II рисунков и 13 таблиц. Список литературы включает 68 работ отечественных и 14В работ зарубежных' авторов.

4 Место проведения "работы. Работа проведена в Институте микробиологии АН СССР в отделе общей и сравнительной вирусологии ( заведующий отделом - проф. И.Г.Атабекон ). Вегетационные опыты были выполнены во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии ВАСХНИЛ.

Э.КСПЕР И ME НТАЛЬНАЯ Ч ACT Ь. "

Объекты и методы исследования.

Объектами исследования служили 25 фагов R.japon!cum , выделенных ранее Москаленко с соавт, ( 40). В работе использованы 30 культур Б. jap oui с или разного происхождения : все штаммы - для определения спектра литического действия и в качестве индикаторных при выявлении лиэогенного состояния, восемь культур проверены на лиэо-гению, три использованы для получения лиэогенных вариантов. В работе применяли жидкие и агаризованные среды: *79, Лайрда *б и лю-пиновую ( 40 ).

Культуры клубеньковых бактерий сои поддерживали на косяках с лшиновой рредой или средой JP79, выращивали при температуре 28°С, хранили при 4°С. Показателями чистоты служили характерный ВИД колоний при рассеве культур на агаризо ванных средах JP79 и люпнновой, характерный вид клеток при михроскопировании и отсутствие роста в МПБ.

Размножение и титрование фагов проводили двуслойный методом. Спектр литического действия фагов и фагочувствительность культур определяли нанесением фаголизатов на свежеприготовленные газоны тест - культур с последующей проверкой появляющихся зон лизиса на перевиваемость.

Морфологию вирионов изучали электронномикроскопически в препаратах фагов« очищенных дифференциальным центрифугированием и капельным диализом против дистиллированной воды. Препараты контрастировали раствором ФЕК или 1% раствором уранил ацетата ( 40 >.

Лизогенные варианты клубеньковых бактерий сои выделяли из вторичного роста в зонах лизиса культур» подученных под действием фагов, путем многократных последовательных рассевов с отбором клонов, устойчивыхj к фагу. У проверяемых на лизегению штаммов изучали способность к спонтанному и индуцированному ультрафиолетом освобождению фагов, наличие которых в культуральной жидкости выявлял» с помощью перекрестных испытаний на 30 тест - культурах и методом электронной микроскопии ( 40 ).

Антифаговые сыворотки получали по методу Fíesela С 171 ) с полным адыов&нтом Фрейнда, Иммунизацию кроликов проводили препаратами фагов, очищенных дифференциальным: центрифугированием, с титром 5,10 частиц/мл ( в 0,15 И MaCl ). Полученные сыворотки прогревали при 58°С в течение 30 минут и обрабатывали хлороформом. Для изучения серологических свойств фагов использовали реакцию нейтрализации ( Г )

Симбиотические свойства культур r. japtrnlcum и их лизвгенных вариантов исследовали в вегетационном опыте. Для характеристики азот-фикеирувщей активности культур R. ¡Japonicua определяли содержание общего азота в сухой зеленой массе инокулированных растений методом ыккрокьельдаля. 8 период вегетации растений проводили наблюдение за их ростом и образованием клубеньков через 5, 7 и 10 недель; урожай снимали через ТО недель. В эти же сроки отбирали пробы почвы и клубеньков для выявления фагов. Почвенные образцы суспендировали в стерильной воде. Присутствие фага выявляли накалыванием на свежеприготовленные газоны тест - культур и титрованием супернатаята почвенной взвеси, обработанной хлороформом. Для выделения фагов из клубеньков кусочки их ткани накладывали на свежеприготовленные газоны культур r. ¿apoaic\im » клубеньки предварительно стерилизовали этанолом и раствором сулемы и тщательно промывали стерильной водой, & случаях появления зон лизиса проверяли перевиваемость ли-> тического агента. Фаги выделяли из отдельных негативных колоний и

размножали.

Для выделения нуклеиновых киелет фаги ненцентрировали полиэти-ленгликолем ( 212 ) к очищали в градиенте хяериетего цезия ( использовали 4 слоя по 5 м, соответствующие плотностям 1,6; 1,52; 1,42; 1>33; центрифугировали при 25000 об/мин в течение 4 часов. Полоса фага располагалась в зоне между 1,42 и 1,52 >. Препараты фагов дка-лизовали Против трис-буфера ( рН 7,5 )• Фаги лиэировали добавлением до 20 мН Ла-ЭДТА и до 0,556 ДДС-На и прогревом при 50°С в течение 15 минут, после чего нуклеиновые кислоты денротеинизиревали хлороформом и диадизовали против 0,1 ССР; о степени очистки судили по спектральным характеристикам. Для выявления чувствительности к нук-леазам препараты нуклеиновых кислот обрабатывали панкреатической РШ-азой С 50 мкг/кл, ) и ДНК-аэой ( 50 мкг/мл; Ю-2 М ЧеС1г ) при 37°С ( 32 ). Аналогичным образом проводили"очистку и концентрирование фагов Сд и Л и выделение их ДНК, которые использовали в качестве реперных образцов. Нуклеотидный состав ДНК фагов определяли пе температуре плавления ( 154 ); одновременно по кривым плавления определяли гиперхромный эффект и интервал плавления. Гомологию ДНК оценивали методом оптической реассоциации ( 92 ). Гидролиз ДНК фагов эндонуклеазой ЕсоК I проводили при 37°С в течение 60 минут в инкубационной смеси, содержащей 0,1 М трис-Н01, 0,05 М НаС1, 5 мМ ИеС1г и 10 Ш ыеркаптозтанода, рН 7,5. Элентрофоретическое разделение фрагментов осуществляли в 0,7% агарозном геле при комнатной температуре и напряжении 20 В в течение 16 часов. Определение размеров фрагментов проводили с помощь» лазерного денситометра. Молекулярный

вес ДНК фагов определяли по сумме рестриктов.

*

Результаты исследований.

I. МврфОЛОГИЯ фагОВ Р.ДаропХсит.

В работе исследована морфология 25 фагов В.ЗароШсит.

По строении вирионов изученные фаги распределяются в две группы. У фагов одной группы - правильные гексагональной Форш головки диаметром 60 - 70 нм и короткие отростки ( длиной окало 20 нм ). баги с частицами такой морфологии относятся к III группе по классификации А.С.Тихонемко ( 59 ) или к группе С по классификации Бредоги ( 61 ). Фаги другой группы имеет продолговатые гексагональные головки разме-

pdM 60х7Ь ни и гибкие отростки длиной 150 км с несокращающимися чехлами - 1У морфологическая группа ( по Тихоненко ) или группа В С по Бредли ). Из 25 исследованных фагов K.japonicum 15 принадлежат к III, 10 - к 1У группе.

По морфологии негативных колоний, образуемых на газонах чувствительных культур, изученные фаги подразделяются на три группы. У фагов первой группы негативные колонии мутные, диаметром 5-7 мм, при длительной инкубации увеличиваются до £0 мм. У некоторых фагов при этом появляется четкий кольцеобразный рисунок из чередующихся зон разной мутности. Негативные колонии фагов этой группы обозначены, соответственно, как типы I и 1к. Негативные колонии фагов другой группы почти прозрачные с четким краем диаметром I -4 мм. При продолжительной инкубации размер их не меняется; такие негативные колонии обозначены как тип 2. Фаги третьей группы образуют негатив-' ные колонии с прозрачной центральной частью, окруженной зоной угнетения роста культуры; их диаметр - от 4 до 8 мм. Негативные колонии такой морфологии обозначены как тип 3.

Большинство изученных фагов, относящихся к III морфологической группе, образуют негативные колонии типа I и 1к; два фага этой морфологической группы образуют негативные колонии типа 2. Все фаги, относящиеся к 1У морфологической группе, образуют негативные колонии типа 3.

Для дальнейшей работы отобраны 7 фагов, различающихся по морфологии вирионов, негативных колоний и спектру литического действия, изученного ранее Москаленко с соавт, ( 40 ).

2. Лизогения В.japonicum.

На лизогения было проверено 8 штаммов клубеньковых бактерий сои. С помощью общепринятых методов ( перекрестные испытания с подбором индикаторных культур и злекгронномикроскопический анализ культураль-йлс жидкостей ) были предприняты попытки обнаружить спонтанное и индуцированное ультрафиолетом освобождение ими фагов. Показать лизогенное состояние проверенных культур использованными методами не удалось. Однако, отсутствие свободного фага в культу- -ральной жидкости еще не свидетельствует о том, что культура не ли-зогенна. Отрицательные результаты, полученные при проверке на лизо-гению, могут 5ыть связаны не с отсутствием таковой, а с особенностями лиэогенного состояния культур ( 40 ).

В связи с тем,чтолиэогению у природных культур В. Japonlcuo выявить не удается, представляло интерес получить лиэогенные штаммы экспериментально и изучить особенности их лизогенного состояния. Для получения лизогенных-вариантов были использованы три штамма R,japон!oumи 7 активных против них фагов.

Основными признаками лизогенного состояния микробной культуры служат стабильная резистентность к суперинфекцик гомологичным фагом и способность части клеток лизироваться с освобождением фаговых частиц.

Результата изучения полученных вариантов культур R.japonicum представлены в таблице I.

Отобранные - клоны стабильно сохраняли резистентность к гомологичным'фагам и спонтанно продуцировали фаг.

Варианты культур 605а и 60ба, полученные под действием фага CI5, в условиях проведенных опытов периодически спонтанно освобождали фаг и не индуцировались ультрафиолетом.

Вариант культуры 623а, полученный под действием фага CII-2, также освобождал фаг периодически и не индуцировался ультрафиолетом. В культуральной жидкости вариантов культуры 623а, полученных под действием фагов СТО, CIT-I, С20 и С26, фаг был обнаружен во всех опытах* Облучение культур ультрафиолетом увеличивало его титр. В отличие от остальных, вариант культуры 623а, полученный под действием фага С4, в условиях проведенных опытов не освобождал зрелый фаг. Однако, при электроннемикроскопическом исследовании в культуральной • жидкости этого варианта фаговые частицы.были обнаружены. . ~

Полученные результаты показывают, что отобранные фагоустойчи-вые варианты культур R.japonicumлизогенкы. Для выявления особен-, ноетей лизогенного состояния этих культур представляло интерес изучить свойства освобождаемых ими фагов и сравнить их со свойствами фагов, использованных для лиэогенизации. Учитывая возможность модифицирующего влияния индикаторной культуры,, фаги, освобождаемые лизо-генными вариантами, изучали без последующего размножения. Фаги .. Сравнивали по морфологии вирионов, негативных колоний к спектру ли-тнческого действия С таблица 2 ).

По морфологии частиц освобождаемые культурами фаги, в основном, Идентичны исходным. В культуральной жидкости вариантов 605а(С15>, 606a{CI5), 623а(CIO), 623a(CII-I), 623а(С20) и 623а<С26> обнаружены фаги с правильными гексагональными головками С 60 - 70 нм ) и короткими ( около 20 нм ) отростками, относящиеся к III морфологической груше. Культура 623atCII-2) продуцирует Фаг ХУ морфологической

Выявление лиэогении у вариантов культур й. ¡¡ароШсшп 605а, 60ба и 623а, полученных под действием семи фагов

Варианты Чувст-ВИТ-. к инфиц. фагу Освобождение фага Чувств.

к-во опытов из них с положит, результ. титр фага ( част/мл ) к освобождае-

спонтанно индукция УФ мому фагу

б05а(С15) - 10 2 2,7.10с 5,0.10 1,4.102 4^0.105 -

605а ' + ю • 0 фаг не ( свобождает

60ба<С15> - 10 2 "вь мм * • оо ео-т 4,0Л(£ 4*2.10 -

606а + 10 0 фаг не с своболдает

623а(С10) - 10 10 4,8. Ю9 4,5,10Ю - ,

б23а(СТ1-1) - 10 10 1,1.10ю 8,9.10Ю -

623а(С11-2) - 10 2 2,9.10? 1,7. Ю7 3,4.10? 1,8.10 +

623а(С20> - 10 10 5,9.Ю10 8.5Л010

623а С С26). - 10 го З.ЗЛО10 1,1 ло11 -

б23а(С4) - 10 (10) 0 0

623а 1 + 10 0 фаг не < ювоболщает

Условные обозначения:

"+" - культура чувствительна к фагу - культура резистентна к фагу

Сравнительная характеристика фагов, использованных для лизогенизации к освобождаемых лизогенными вариантами культур й-Зарогйсит.

Фаги, использованные для лизогениэации Фаги, освобождаемые лизогенными вариантами культур 11,!|ароп1сш

Фаг морфол. тип ВИ-риона тип негативных колоний спектр литич. действия (х) Яизогенный вариант морфол, тип ви-риона тип негативных колоний сяекгр лнгич. действия

С15 III I 603а,бСба,606а 6Сба(С15) 606а(С15) III III I I 603а,605а,606а, 623а,625а,629а И

СЮ Ш 1к 623а ,629а 623а(СЮ) 1Н 1к 623а,629а

СН-1 1П 1к 62Эа,С29а 623а(СП-1) III 1к 623а,629а

СИ-2 1У 3 623а,629а 623а(С11-2) 1У 3 623а,629а

С20 III 2 622а,623а,624а, 629a.648a.CR-I, б23а(С20) III 1к * 623а,629а

саб III 2 623а(С26) III 1к 623а,629а

С4 1У 3 623а,629а,646а, Ск-1. СДП-З, СК-21,ш-23 623а(С4) дефет иШ фаг (623а,629а1

(х) - изучен Москаленко и др. ( 40 )

группы С частицы с продолговатыми гексагональными головками размером 60x75 ни и длинными гибкими отростками с несокращаяцнмися чехлами ).

Фаги, освобождаемые культурами 6С5а(СТ5) и 60ба{С15), идентичны исходному фагу С15 по морфологии вирионов и негативных колоний, но отличаются по спектру литического действия. Фаги иа культур 623а(С 10) и 623а(СИ-1) по морфологическим и литичесхим свойствам идентичны исходным. Фаг, выделяемый культурой 623а(СП-2), отличается от исходного только способностью лизировать о с во Создающую его культуру и представляет собой, по-видимому, вирулентный мутант лизо-генизировавшего культуру фага. Фаги, освобождаемые культурами 623а (С20) и б23а(С26), отличаются от фагов С20 и С26 по морфологии негативных колоний и спектру литического действия. Выявленные отличия фагов, освобождаемых культурами, От фагов, использованных для их ли-зогекиэации, могут быть следствием модифицирующего влияния этих культур.

Культура 623а(С4} постоянно Спонтанно продуцирует фаговые частицы, существенно отличающиеся от частиц фага С4. Они имеют головки-правильной формы диаметром 40 нм и отростки длиной 260 нм с сокращающимися чехлами и базальтами зубцами, тогда как исходный $ки С4 имеет продолговатую головку и гибкий отросток с несокращающимся чехлом. Фаговые частицы, освобождаемые культурой б23а(С4) не размножаются ни на одной из проверенных культур К.Зарои!сит ; на газонах культур 623а и 629а культуральная жидкость этого варианта вызывает появление слабых не перевивающихся зон угнетения роста культуры. <1о--видкмому, вариант 623а(С4) продуцирует дефектные фаговые частицу. Вероятно, исходная культура 623а содержит профаг, ответственный за образование дефектного фага, индукция которого может быть вызвана лизогенизацней фагом С4. Освобождение культурой 623а(С4) полноценных фаговых частиц в проведенных опытах не отмечалось.

Изучение экспериментально полученных лиэогенных культур д.^аро-Щсшп показало, что они различаются по характеру и уровню индукции фаговых частиц, обнаруживая тем самум различия своего лизогенного состояния. Отрицательные результаты, полученные при выявлении лизо-гении у природных штаммов й.Зароо1йит общепринятыми методами, обусловлены не отсутствием таковой, а особенностями их лизогенного состояния.

3. Влияние лиэогенизации на свойства клубеньковых бактерий.сои.

Дополнительная генетическая информация, внесенная в клетку при лиэогенизации, влияет на ее свойства. Изменение свойств культуры может отразиться на ее поведении как в условиях симбиоза с растением, так и в почвенной популяции, В последнем случае немаловажную роль играет способность культуры освобождать фаг, а также ее чувствительность'к специфичным фагам, содержащимся в почве. В связи с этим было проведено сравнительное изучение культур R.japoaieum до и после лиэогенизации. Исследовано изменение фагочувствительное-ти лизогенных вариантов, их способность освобождать фаг в условиях симбиоза и влияние лизогениэации на симбиотические свойства.

В таблице 3 приведены данные по фагочувствительности культур R.^apoaicum' и их лиэогенизированных вариантов.

Культуры 605а и 606а чувствительны к фагам СХЗ - С19, выделенным из одного почвенного образца (40 ) и сходным по морфологии И литической активности. После лиэогенизации одним из них - фагом CI5 - обе культуры утратили чувствительность ко всем фагам этой группы. По отношению к остальным фагам лизогенные варианты сохранили резистентность, свойственную исходным культурам.

Культура 623а чувствительна к 14 и устойчива к 7 фагам. Все лизогенные варианты этой культуры сохранили устойчивость к фагам CI3 - CI9 и чувствительность к фагам C2I-I и C2I-2, В отличие от исходной культуры все они приобрели устойчивость к фагам CII-2, С20 и-С26. По отношению к другим фагам лизогенные варианты различаются между собой.

Все лизогенные варианты приобрели резистентность к лиэогенизиро-вавшему и некоторый другим фагам. Дополнительное приобретение чувствительности к фагам, не активным против исходной культуры, не отмечалось.

В результате лиэогенизации клетка приобретает иммунитет к суперинфекции гомологичным и родственным ему гоиоиммунным фагам. Изменение чувствительности к неродственным фагам представляет собой * одно из проявлений лизогенноП конверсии. В работе не проводилось специальных исследований по выяснению причин приобретения культурами фагорезистентности. Однако, следует отметить, что при лиэогенизации культуры 623а происходит потеря чувствительности к фагам, отличающимся от лизогенизировавягих по морфологии частиц, т.е. заведомо не родственным. Варианты, лизогенные по фагам III морфологической

Чувствительность культур Я.^аропАсш и их лиэогенных вариантов к фага«, оделенных № почвы.

Культура

623а ■

623а(СЮ)

623а{СП'-1)

еззассго) юшсаы

б23а(С4) 623а(СИ-2)

605а

605а(С15) 606а

606а(С15)

Сб С7 СЮ

чувствительность к фатам

С11С4|С5 С24-2! С251 СП-1! СИ-2 С20 С2б!С21-1 С21-2

+ + + +

4 +

+

С13 С14 С15 С16 С17 С18 С19

Условные обозначения:

V - культура чувствительна я фагу - культура резистентна к фагу

— í£. —

группы, стали резистентны к фагам 1У морфологической группы: культура 623а(СЮ) - к фагам CI 1-2 и С25, культура 623a(CII-I) - к фагам CI, CII-2 и С25, культуры б23а(С20) и 623а(С2б) - к фагу СП-2, Варианты, лизогенные по фагам, СП-2 и С4 ( 1У морфологическая группа ) приобрели устойчивость к фагам III морфологической группы, активным против исходной культуры 623а: вариант 623а(СИ-2) - к фагам С20 и С26, вариант 623аÍG4) - к,фатам СИ-I, С20 и С26. Таким образом, лиэогенизация культуры 623а всеми изученными фагами - С4, СЮ, CII-I, CII-2, С20 и С2б - вероятно, вызывает ее конверсию.

Особый интерес представляет изучение влияния лизогенизации культур R. ЗароШсчм на их способность к симбиотической азотфиксации, Симбиотическую активность клубеньковых бактерий сои изучали в вегетационных опытах. Растения сои инокулировали двумя культурами к. Japonieum и пятью лизогенными вариантами. Азотфиксирующую активность оценивали по весу сухой зеленой массы инокулированных растений и содержанию в них общего азота. Результаты опытов представлены в таблице 4.

Лиэогенизация изученных культур R. japonic™ не привела к потере способности образовывать азотфиксирующий симбиоз с растениями сои.

Лизогенизация культуры 605а фагом CI5'вызывает некоторое снижение азотфиксируюцей активности, что выражается в меньшем содержании азота в зеленой массе растений, инокулированных вариантом 605а(С15) по сравнению с исходной культурой.

При изучении лизогенизации культуры 623а не отмечено снижения симбиотической активности. Содержание азота в зеленой массе растений, инокулированных л изо генными вариантами 623а(СИ-1) и 623a(CII-2) было даже несколько выше по сравнению с растениями, инокулированными исходной культурой.

Полученные результаты представляют значительный интерес, поскольку до настоящего времени изучению влияния фагев и лизогенизации на симбиотические свойства клубеньковых бактерий не уделяется должного внимания. Принято считать, что под влиянием фагов у клубеньковых бактерий образуются малоактивные и неактивные варианты ( 6, 13, 22, 24, 50, 122 ). Наши данные и результаты, полученные ранее Варнет С *75 ) и Ковальским ( 125 ) показывают, что лизогенизация не оказывает существенного отрицательного действия на симбиотические свойства клубеньковых бактерий. Это указывает на возможность отбора фагоустойчивых вариантов клубеньковых бактерий, сохраняющих симбиотическую активность на уровне исходных культур, а, возможно, и превос-

Таблица 4.

Аэотфиксирующая активность культур В,japон!cum.

Варианты Вес сухой зеленой массы Содержание общего азота

ГГ * % мг/сосуд

Контроль без 25,4 "юо 2,0 508,0

инокуляции

Инокуляция

культурами:

605а 27,0 106,3 2,65 715,5 .

б0ба(С15) 27,8 109,5 1,90 528,2

623а 26,6 104,7 2,86 760,8

623а(С26) 27,0 106,3 2,97 801,9

623a(CII-I) 27,4 107,8 3,66 1002,8

623а(СИ-2) 30,4 119,7 3,67 1115,7

ходящих их.

В проведенных опытах изучалась так«« способность культур е. Jeponlcum продуцировать фаг в условиях симбиоза.

В почве ризосфер« и клубеньках растений, инокулнрованных культурой 605а и ее лизогенным .вариантом, выявить фаг не удалось.

Фаги были обнаружены во всех образцах почвы ризосферы и клубеньках растений, инокулированных культурой 623а и всеми ее лизоген-ныыи вариантами. Следует подчеркнуть, что фаг был выделен и в опытах с исходной культурой 623а, которая в лабораторных условиях фаги не освобождала ( 40 ), Культура 623а, внесенная в стерильную почву без растений также ввделяла фаг. Фаг, продуцируемый культурой 623а. активен по отношению к своей культуре и, следовательно, представляет собой вирулентный мутант содержащегося в ней умеренного фага. Выделенный фаг обозначен 623т.

Фаг 623v принадлежит к III морфологической группе: его вирионы имеют правильные гексагональные головки диаметром еколе 65 нм и отростки длиной 20 нм. Этот фаг лизирует культуры 623а и 629а; на газонах чувствительных культур образует негативные колонии с концен-

трическим рисунком из зон разной мутности типа Ir.

Все фаги, -обнаруженные в почве ризосферы и в клубеньках растений, инокулированных лиэогенизированными вариантами культуры 623а, по морфологическим и литическнм свойствам идентичны фагу 623т и в некоторых случаях существенно отличаются от фагов, использованных для лиэогенизации ( см. табл.2 ). На основании этого можно предположить, что лизогениэированные варианты культуры 623а в условиях вегетационного опыта освобождали один и тот же фаг, содержавшийся в культуре 623а до ее экспериментальной лизогенизации.

Проведенные исследования показали, что культура R.japoaicum 623а лизогенна и содержит по крайней мере два профага. Один, ответственный за образование дефектного фага, был выявлен в лабораторных условиях при изучении лизогенизации культуры 623а фагом С4; другой, ответственный за образование вирулентного фага 623v , был выявлен в условиях вегетационного опыта. Таким образом, под действием фагов, выделенных из почвы, экспериментально были получены суперлизогени-зированные варианты культуры 623а.

Обращает на себя внимание, что фаги, выделяемые в лабораторных опытах вариантами 623а(СЮ), 623а(СП-1), 623а(С20) и 623а(С26), по морфологии и литкчесхой активности идентичны фагу 623v . Причем фаги, освобождаемые вариантами б23а(С20) и 623а(С26), отличаются от исходных фагов по морфологии негативных колоний и спектру литнческого 'действия. Не исключено поэтому, что лизогенизация культуры 623а фагами С20 и С26, как и в случае с фагом С4, способствует индукции одного из ее профагов. Однако сравнения морфологии негативных колоний И спектра литического действия не достаточно для уверенного вывода об идентичности или различии фагов. В связи с этим были изучены серологические свойства некоторых фагов.

4. Серологическое изучение фагов R.japonicum.

Проведено сравнительное изучение серологических свойств фагов, использованных для лиэогенизации клубеньковых бактерий сои, фагов, освобождаемых лиэогениэированными вариантами-культуры ^623а в лабораторных условиях, и фага 623 ▼ . Антисыворотки ( АС ) были получены к фагам СЮ и CII-2, различающимся по морфологии вирионов, и к фагу 623 V. Антигенные свойства фагов изучали в реакции нейтрализации.

Результаты изучения кинетики нейтрализации фагов R.japonicum тремя полученными антисыворотками приведены на рисунках I, 2 и 3.

Фаги С4, CII-2, СТ5, С20 и С26.существенно отличающиеся от фагов

з

s

¡i "¡0 ¿S si ¿¡яи*)

Рис.1 Кинетика нейтрализации фагов R.jeponicxia . антисывороткой AC(CIO)

-АС в разведении 1:1000

---АС в разведении 1:4000

а го £Í tú

Рис.2 Кинетика нейтрализации фагов R.japonlcum антисывороткой АС(623т )

-- АС в разведении 1:2500

---АС в разведении 1:4000

-¿

s it & га £$ Рис.3 Кинетика ней1

Кинетика нейтрализации фагов К. ¡japonlcum антисывороткой ACÍCII-2 в разведении 1:250

Условные обозначения фагов:

1 - фаг СЮ. 5 - фаг CI5 а - фаг, освобождаемый культурой б23а(С10)_

2 - фаг СИ—I б - фаг С4 '' ¡ ¡ X 1С "Г-:' ВДйо)

3 - фаг С20 7 - фаг CII-2 г - ®6)

4 - фаг С26 б - фаг 623v ' Д - " - - - - б23а(СП-2)

СЮ и 623 по морфологии и литической активности, не инактивируются сыворотками ACCCIO) и АС(623т ). Фаги CI0.CII-I И 623т , сходные по морфологическим и литичесхим свойствам, родственны и серологически. Кинетика нейтрализации этих фагов сывороткой АС(СЮ) в разведении 1:1000-идентична. Кривые нейтрализации фагов СИ—I и 623? сывороткой AC(623v ) в разведении 1:2500 сходны, от них отличается кривая нейтрализации этой сывороткой фага СЮ. Использование сывороток в больших разведениях позволяет выявить некоторое различие между фагами CXI-I и 623т . Константы инактивации сывороткой АС(623т ) составляют: для фага 623т - 665+22,8; для фага CII-I - 647+7,5 и для фага СЮ - 487+14,6.

Сыворотка АСССП-2) инактивирует только гомологичный фаг и не активна против других фагов, в том числе и морфологически сходного с ним фага 04.

Таким образом, изученные фаги, различающиеся по морфологическим к литическим свойствам, серологически не родственны. В реакции нейтрализации выявилось также различие фагов, сходных по'этим свойствам. Это позволило использовать реакцию нейтрализации для сравнения фагов, выделяемых лизогенизированными вариантами культуры 623а С рисЛ, 2, а ).

Вирулентный фаг, освобождаемый культурой 623а (СИ-2), по кинетике нейтрализации идентичен фагу CII-2, использованному для лиэогенизации. *Это подтверждает ранее высказанное предположение, что вариант 623а(СН-2) освобождает вирулентный мутант лизогенизировавше- . го культуру фага ( рис.3 )

Фаги, освобождаемые лизо генными вариантами 623а(СЮ), б23а(СП-Д б23а(С20)и б23а(С26),по результатам реакции нейтрализации идентичны мехщу собой и сходны с фагом 623 т . Причем, если фаг, освобождаемый вариантом 623а(СН-1) близкородственен фагу CII-I, то фаг, освобождаемый вариантом 623а(С10> заметно отличается от исходного: константы их инактивации сывороткой АС(623т), соответственно, 671+11,7 и 487+14,6. Фаги,выделяемые культурами 623а(С20) и 623а(С26), по антигенным детерминантам, участвующим в реакции нейтрализации, идентичны фагу 623т и не родственны лиэо авизировавшим культуру фагам С20 и С26. Таким образом, фаг, освобождаемый культурой б23а(СЮ), отличается от исходного только серологически, а фаги, освобождаемые культурами 623а(С20) и 623&ÍC26) - по морфологическим, литическим и серологическим свойствам.

Сравнительное изучение фагов, освобождаемых лизоге«иэированными вариантами культуры 623а в лабораторных опытах, подтвердили сделанное ранее предположение о лизогенности этой культуры. Варианты 623а(С4), 623а(С20), 623а(С26) и, возможно, 623а(С10) в лабораторных условиях пР°ДУЦируют не те фаги, которыми они были экспериментально лизогенизированьг. Вероятно, дополнительная лизогенизация культуры H.Japoaicujn 623а некоторыми фагами способствует индукции профагов, содержащихся в клетках исходной культуры. При этом суперлизогенизи-рующие фаги не освобождаются, что можно рассматривать как особенность лиэогенного состояния этой культуры.

5. Некоторые свойства ДНК фагов R. ¡¡apon! cu®.

Состав частиц фагов K.jepooicum не изучен. В литературе отсутствуют сведения о свойствах нуклеиновых кислот фагов этой группы клубеньковых бактерий, В данной работе были изучены некоторые свойства-нуклеиновых кислот четырех фагов R.Japooicim - 623 v , CIO, CII-Î и CI5 - которые удалось солучить,в препаративных количествах.

В состав изученных фагов входит двуспиральная ДНК, о чем свидетельствует устойчивость фаговых нуклеиновых кислот к действию РНКазы и чувствительность к ДНКаэе, узхий интервал температурного перехода ( 2,7 - 4,7°) и значительный гиперхромный эффект ( 29 - 34¡S Ï.

Анализ кривых плавления ДНК ( таблица 5 ) показал, что фаги С!0, CII-I и 623т имеют близкое содержание Гй-nap и узкий интервал плав- • леиия, последнее свидетельствует о кваэислучайном распределении AT и ГЦ-пар по молекуле ДНК. Для ДНК фага CI5 характерен несколько более широкий интервал плавления, его величина указывает на неоднородность в распределении нуклеотидов.

В таблице 5 приведены результаты оценки уровня гомологии ДНК фагов CIO* CII-I, 623т и С15 методом оптической реассоциадии. Уровень гомологии ДНК фагов СП-I и 623v составляет более 90%. ДНК фага СЮ. имеет 735& общих полинуклеотидньгх последовательностей с ДНК фага CII-I, использованного для сравнения. Полученные результаты свидетельствуют о генетическом родстве фагов CIO, Cil—I и 623v . ДНК фага CI5 не обнаруживает заметной гомологии с ДНК фага CII-I, что указывает на отсутствие генетического родства фага CI5 с фагами СЮ, СП—I и б23 v.

ДНК фагов СЮ, CII-I и -623т чувствительны к действию зндонух-леазы Есой I . Регультаты реетрикционного анализа, представленные в таблице 6, подтверждают сходство этих-фагов. EcoR I расщепляет ДНК фагов СП—I и 623* на 7 фрагментов; ДНК'фага СЮ - на Ю. Фаги CII-I

Таблица 5

Физико-химические свойства ДНК группы фагов И* ;)е.роп.1сит.

Фаг ыол,% гиперхромный эффект " ¿Л гомологии в ДНК, % по отношению . к СП-1

С11-1 58,4 + 0,5 33 2,7 ТОО

623т 58,2 + 0,1 32 2,9 94

СЮ 57,6 + 0,2 34 3,2 73

С15 56,5 + 0,6 29 4,7 5

А 50, + 0,4 36 6,2 5

Сд 44,5 + 0,3 36 3,1 5

Таблица б

Рестрикция фаговой ДНК эндонуклеазой ЕсоН I.

Фаг кол-во образующихся фрагментов Мол.вес фрагментов ( дальтон х Ю6 ) Мол.вес ДНК фага (дальтон х 10^)

623т 7 5,98; 2,С2; 4,43; 3,32; 2,65; 1*45; 1,20 21,15

СП-1 7 6,48; 2,10; 5,98; 3,32; 2,72; 1,95; 1,20 23,75

СЮ 10 5,98; 2*72; I тЗЗ» 4,43; 3,57; 3,32; 2,54;,1,95; 1,75 1,20; 28,79

Л 6 4,7; 3,7; 3,5; 3,С; 30*,7 '

- 1У -

И 623 т сходны по пяти образующимся фрагментам, фаг СЮ сходен по шести фрагментам с фагом 623 т , из них по пяти - с фагом СИ—I.

Молекулярные - веса ДНК фагов, оцененные по сумме образующихся рестриктов, составляют 20 - 30 . 10® Д. У фагов CII-I и 623v , по Сравнению с фагом СЮ, по-видимому» утрачена часть генома.

ВЫВОДЫ

Т. Проведено изучение ряда свойств фагов R. japonicum. Двадцать пять изученных фагов то морфологии вирионов относятся к двум морфологическим группам ( III к 1У по классификации А.С.Тихоненко ). Выявлено три типа негативных колоний. Фаги, сходные по морфологии вирионов, но различающиеся по морфологии негативных колоний И спектру литического действия, серологически не родственны.

2. Впервые ввделены и исследованы нуклеиновые кислоты фагов -R. Зарои!cum . Четыре изученных фага содержат двуспиральную ДЩ слабо выраженного ГЦ - типа ( 56,5 - 56,4 мол.% ). ДНК трех из них характеризуются квазислучайным распределением нунлеотидньк пар по молекуле ДНК; ДНК четвертого фага свойственна неоднородность в распределении нуклеотедов. ' - '

3. Проверены на лизогению б культур R.japoaicum. Лиэо^енное состояние этих культур в лабораторных условиях выявить не удалось.

' 4, Показана возможность экспериментальной лизогенизации хуль-тур R.japoDioua . Лизогенные варианте трех культур, полученные под действием семи фагов, различаются по особенностям лизогенного состояния, что обнаруживается по характеру и уровню индукции фаговых частиц. Лизопенное состояние изученных вариантов культур R.Japonicum по-раэному проявляется в лабораторных условиях и в условиях симбиоза с соей.

5. Обнаружено, что культура в.japonicum 623а - лизогенна и содержит не менее двух профагов, один из которых ответственен за образование фага 623* , другой - дефектного фага, выявленного злектронномикроскопически.■Суперлиэогениэация культуры 623а некоторыми фагами способствует их индукции, В условиях симбиоза культура 623а и ее лизогенизированные варианты освобождают фаг 623т .

Фаг 623 т генетически родственен двум фагам, ранее выделенным из почвы.

6. Впервые изучено влияние лизогенизации на свойства клубеньковых бактерий сои.

.Показано, что в результате лизогениэации культуры приобрели резистентность не только к гомологичный, но и к ряду других фагов.

7. Лизогенизация двух культур Е.3&роп1сиш пятью фагами не привела к утрате способности фиксировать азот в симбиозе с растениями сои. В отдельных случаях отмечается некоторое увеличение урожая при инокуляции растений лизогенизированными вариантами по сравнению с исходной культурой.

Автор выражает глубокую благодари!ость заслуженному деятелю науки, доктору биологических наук, профессору Я.И.PayтенштеЙну и старшему научному сотруднику, кандидату биологических наук , Л.Н.Москаленко за ценные консультации и помощь при выполнения работы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации;

1. Раутенштейн Я.И., Москаленко Л.Н., Андреева И.Н. Теоретическое и практическое.значение лиэогении клубеньковых бактерий. Тез.докл. Есес.конф. " Научные основы производства и применения л нитрагина. 20 - 21 янв. 1981 г, " М., 1981, с. 8 -_9.

2. Андреева И.Н., Москаленко Л.Н. О морфологии частиц и негативных колоний бактериофагов клубеньковых бактерий,сои- Микробиология, 1982, т. 51, № 3, с. 522 - 526.

3. Андреева И.Н., Москаленко Л.Н. 0 некоторых особенностях экспериментально подученных лизогенных культур R-japonicura. Микробиология, 1982, т. 51, * 5, с. 832 - 837.

4. Андреева И.К., Беляев Д.Л., Лысенко A.M. Сравнительное изучение фагов . R.japonicum . Серология и некоторые характеристики их ДНК. Сельскохозяйственная биология, 1985 С в печати ),.

5. Андреева И.Н., Москаленко Л.Н., Князева В.Л. 0 некоторых свойствах культур R.japonicua » Известия АН СССР, 1985 ( в печати ).

Ь 1^05801 Заказ А-98 Тираж 100

Полиграфический комбинат им.К.Якуба Государственного комитета ТАССР до делам издательств полиграфия л книжной торговли г.Казань,ул.Баумана,19