Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации

Эпштейн, Виталий Наумович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации"

На правах рукописи

ЭПШТЕЙН Виталий Наумович

Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Института молекулярной генетики РАН (Москва)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

В.Г. Никифоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

С.В. Машко

кандидат химических наук

И.В. Демидюк

Ведущая организация:

Кафедра молекулярной биологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 14 октября 2003 г. на заседании диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ Генетика». Автореферат разослан « /¿)» 7~Л* г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук

£oog-ft

Общая характеристика работы

Актуальность темы. На протяжении последних 30 лет РНК-полимераза Е. coli является объектом пристального внимания в качестве модельной системы для изучения транскрипции. Этот большой мультисубьединичный фермент с молекулярной массой около 450 kDa состоит из четырех субъединиц кофермента (o^ßß1) обладающего каталитической активностью, а также а-субъединицы, необходимой для узнавания промоторных последовательностей ДНК и инициации синтеза РНК. В настоящее время получен большой объем информации о строении РНК-полимераз, основанной на расшифровке трехмерной структуры ферментов, как про-, так и эукариот. Надо отметить, тем не менее, что РНК-полимераза в составе кристалла фиксируется только в одном из возможных конформационных состояний, поэтому необходимо применение различных биохимических и генетических методов для выявления альтернативных конформаций фермента, физиологическое значение которых может быть исследовано исходя из природы комплекса, в котором они были получены.

Теоретически можно предположить два вида конформационной подвижности в транскрипционном комплексе - перемещение в пространстве частей нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) относительно фермента или изменение в структуре белка. Примером первого типа являются транслокация РНК-полимеразы по матрице и переход фермента в состояние транскрипционного ареста. Оба процесса сопровождаются движением нуклеиновых компонентов комплекса относительно РНК-полимеразы (Komissarova and Kashlev 1997). Внутримолекулярные перемещения белковой части транскрипционного комплекса также неоднократно постулировались (Krümmel and Chamberlin 1992), однако прямых доказательств движения такого рода не существовало. Определение трехмерной структуры РНК-полимеразы позволило предложить молекулярные основы для подобных процессов. Одним из примеров пластичности белка может служить изменение в строении «F-мостика» (Zhang et al., 1999; Gnatt et al., 2001). Несмотря на сходное строение прочих компонентов активного центра и высокую гомологичность данного участка белка среди различных РНК-полимераз, этот элемент вторичной структуры занимает два разных положения в составе эукариотаче-ского и прокариотического ферментов. Такая разница может отражать два альтернативных состояния активного центра, однако не исключено, что различие обусловлено видовым разнообразием структуры РНК-полимераз. Несомненный интерес привлекает также и процесс инициации синтеза РНК. Известно, что РНК-полимераза при переходе от инициации к элон-

гации меняет свои свойства, приобретая высокую устойчивость и процессивность, тогда как инициаторный комплекс относительно нестабилен. Таким образом, процесс ухода с промотора также сопровождается конформационным переходом. Появление кристаллических структур холоферментов бактериальных РНК-полимераз (Murakami et al., 2002a,b; Vassylyev et al., 2002) позволило установить некоторые молекулярные основы стабилизации фермента.

В нашей лаборатории на протяжении последних 10 лет для структурно-функциональных исследований использовался метод аффинной модификации белка, включающий ковалентные пришивки нуклеиновых кислот к РНК-полимеразе и последующее картирование точек контакта. Этот подход позволяет выявлять участки белка, входящие в состав функциональных доменов РНК-полимеразы в активных транскрипционных комплексах. В настоящей работе аффинная модификация белка была использована в сочетании с биохимическими и генетическими методами с последующим наложением результатов картирования на имеющиеся трехмерные кристаллические структуры фермента. Комплексный подход позволяет глубже понять многие механизмы лежащие в основе синтеза РНК и его регуляции, а также выявить ранее неизвестные (или только теоретически постулируемые) внутренние движения РНК-полимеразы.

Цель работы и задачи исследования. Целью работы являлось исследование структурных изменений в белковом и нуклеиновом компонентах тройного комплекса в районе активного центра РНК-полимеразы во время транскрипции и соотнесение их с функциональными свойствами исследуемых комплексов. В работе ставились следующие задачи:

1. С помощью метода аффинной модификации изучить подвижность З'-конца РНК продукта в активном центре фермента и определить амплитуду его движения.

2. Изучить процесс инициации с Т7 А2 промотора, выявить минимальный стабильный инициаторный комплекс и определить в нем положение 5'-конца РНК с помощью аффинной модификации.

Научная новизна и практическая ценность работы. В данной работе методом аффинной модификации удалось определить положение З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы. В зависимости от природы исследуемых комплексов оно было соотнесено с ранее постулированными состояниями фермента: активно транскрибирующим, посттрансло-кационным, арестованным и гипертранслокационным. Обнаружено новое состояние З'-конца РНК, в котором концевой нуклеотид вывернут относительно своей комплементарной пары в составе ДНК. Установлено, что две взаимоисключающие конформации «F-мостика»

существуют одновременно в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы Е. coli. Предложена модель регуляции транскрипции посредством конкуренции между входящим нуклеотидом, растущим концом РНК и компонентами «F-мостика». Используя направленный точечный мутагенез, получен ряд мутаций в консервативном районе G ß'-субъединицы. Выдвинута гипотеза об участии этого района в поддержании структуры «F-мостика».

Подробно изучена инициация синтеза РНК с Т7 А2 промотора, сопровождающаяся синтезом коротких стабильных РНК продуктов. На основании полученных данных предложена гипотеза инициации синтеза РНК с этого промотора по двум альтернативным путям.

Исследована фотопришивка антибиотика рифампицина к активному центру РНК-полимеразы и сделан вывод о подвижности сегмента ß-субъединицы, содержащего Hisl237. Движение этого сегмента белка может принимать участие в инициации синтеза РНК, стабилизируя и направляя вновь синтезируемый продукт.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 44 рисунка. Библиография включает в себя 182 названия, в том числе 5 русских и 177 иностранных.

Результаты и обсуждение

Глава 1. Изучение подвижности З'-конца РНК продукта в активном центре РНК-полимеразы Е. coli

Для изучения элементарного акта транскрипции необходимо знать расположение З'-конца РНК относительно каталитического иона магния, так как только при правильной ориентации З'-гидроксила возможно образование новой фосфодиэфирной связи. Разработанный в нашей лаборатории метод аффинной модификации белка позволил выявить ряд контактов З'-конца РНК еще до расшифровки трехмерной структуры РНК-полимеразы (Borukhov et al., 1991; Markovtsov et al., 1996), однако точная ориентация транскрипта относительно основных элементов активного центра оставалась неясной. Как было показано ранее (Markovtsov et al., 1996), З'-конец РНК может занимать разные положения в активном центре РНК-полимеразы в зависимости от свойств исследуемого комплекса, что указывает на подвижность РНК во время транскрипции. Необходимость движения (транслокации) нуклеинового остова (ДНК/РНК) относительно белка вытекает непосредственно из механизма синтеза РНК: каждый раз после присоединения очередного нуклеотида, ферменту необходимо продвинуться по матрице на 1 шаг вперед, для того чтобы освободить место для следующего субстрата. Таким образом, во время синтеза З'-конец РНК занимает поочередно два различных положения относительно каталитического иона магния (Рис. 1, В и Г). В претранслока-ционном состоянии З'-конец РНК располагается в нуклеотид-связывающем сайте (i+1 сайт) (Рис. 1, В). Такой комплекс образуется сразу после присоединения входящего нуклеотида и не способен к удлинению РНК, зато способен к пирофосфоролизу - реакции обратной синтезу РНК (Rozovskaya et al., 1982) и экзонуклеазному отщеплению концевого HywieoTHfla(Sosunov et al., 2003). Транслокация фермента на один шаг вперед приводит к освобождению i+1 сайта, и перемещению З'-конца РНК в продукт-связывающий сайт (i). Активный центр в данной конформации способен к присоединению нового нуклеотида, но не к пирофосфоролизу, и поэтому такое состояние называется активным (посттранслокацион-ным).

Вышеупомянутые движения нуклеотидного остова относительно РНК-полимеразы происходят во время транскрипции циклично и поступательно, однако они не являются единственно возможными. РНК-полимераза способна к перемещению по ДНК на большие расстояния, во время которых З'-конец РНК покидает активный центр (Komissarova and

Kashlev 1997; Nudler et al., 1997). Наиболее хорошо изученным случаем такого движения является сдвиг РНК-полимеразы против хода транскрипции (назад) (Рис. 1, А). Сдвинутый назад комплекс не способен ни к синтезу РНК, ни к пирофосфоролизу, но способен к эндонук-леазному расщеплению РНК, осуществляемому активным центром фермента. Известно также, что в таком комплексе З'-конец РНК не образует гетеродуплекса с ДНК. Теоретически РНК-полимераза может двигаться и вперед (Artsimovich and Landick 2000), при этом происходит гипертранслокация (Рис. 1, Д). Гипертранслокационный комплекс не способен ни к одной из вышеупомянутых реакций и постулирован для некоторых видов транскрипционных пауз.

Принимая во внимание все вышесказанное, была поставлена задача изучить положение З'-конца РНК в различных тройных комплексах и определить амплитуду его движения относительно активного центра РНК-полимеразы, соотнеся данные картирования пришивок полученных из З'-конца транскрипта с известными кристаллическими структурами.

Рис.1. Конформяпионные состояния активного центра РНК-полимеразы ДНК изображена черным цветом, РНК - серым, концевой нуклеотид представлен в виде и0н- < и ;+1 сайты активного центра - в виде окружностей. Черные стрелки указывают направления конформационных переходов между различными состояниями. Субстраты РНК-полимеразы - серого цвета. Наклонным шрифтом помечены состояния, ассоциированные с той или иной конформацией активного центра

Транскрипционные комплексы и реагенты, использованные в работе.

Инициаторный комплекс Ш/-С!Си. Обычно короткие РНК во время инициации не образуют стабильных комплексов с РНК-полимеразой и непригодны для аффинной модификации фермента. Для моделирования инициаторного комплекса использовали рифампицин-нуклеотидное соединение (Рис 2, А.1), которое, как было показано ранее (Мш1аеу ег а1., 1994), обеспечивает прочное связывание с РНК-полимеразой за счет своей рифампициновой части, тогда как нуклеотид располагается в активном центре. Второй нуклеотид, введенный

в состав растущей РНК, содержал радиоактивный фосфор, в то время как третий (и конечный) нуклеотид нес на себе реактивную группу.

Активный элонгационный комплекс ТЭК 21. Для изучения активного центра во время элонгации использовали тройной комплекс, содержащий РНК длиной в 21 нуклеотид (тройной элонгационный комплекс 21 [ТЭК 21] Рис 2, А.2). Исследуемый транскрипт синтезировали на Т7 А1 промоторном фрагменте, используя метод «шагания по ДНК» (КавЫеу et а1., 1993). Реактивный нуклеотид вводили на З'-конец РЖ, тогда как Р32 располагался в положениях +12, +14, +16.

Комплекс в состоянии транскрипционного ареста ТЭК 27. В качестве модели комплекса сдвинутого против хода транскрипции, был использован ТЭК 27 (Рис. 2, А.З), чья склонность к переходу в арестованное состояние была отмечена ранее (Магкол^эоу й а1., 1996).

Минимальный нуклеотидный остов (М.О.). Для того чтобы минимизировать движение против хода транскрипции был использован минимальный нуклеиновый остов - М.О. (Рис. 2, А. 4), примененный ранее для построения модели элонгационного комплекса (Коге-Ьеуа Л а1., 2000). В этой системе в силу отсутствия заднего ДНК дуплекса не происходит движения против хода транскрипции. При этом сохраняются основные свойства элонгаци-онных комплексов - высокая стабильность и способность к поддержанию продуктивного синтеза. М.О. был помечен по 5'-концу РНК радиоактивным фосфором, тогда как на З'-конец РНК был введен реактивный нуклеотид.

Используемые реагенты. Для изучения широкого круга контактов РНК с активным центром фермента в работе использовали два типа нуклеотидных производных: с реактивной группой на рибозе (реагенты I и II) и на основании (реагенты III, IV и V) [Рис. 2, Б]. Изотиоциа-новая группа соединения I обладает высокой избирательностью, образуя ковалентную связь только с лизиновыми остатками, тогда как бромоацетатная группа соединения II способна пришиваться к целому ряду полярных аминокислот, отдавая предпочтение цистеину, метио-нину и гистидину. В обоих случаях длина реактивной группы не превышает 3 ангстрем. Реагенты с модифицированным основанием отличаются друг от друга в первую очередь не селективностью, а размером реактивной группы. В то время как соединение III (тио-УТФ) после облучения пришивается к белку непосредственно основанием, реагенты IV и V осуществляют модификацию фермента соответственно на расстоянии до 8 и 12 ангстрем от положения С5 пиримидинового кольца. Соединения III и V являются неспецифичными фотореаген-

тами, тогда как соединение IV обладает специфичностью, аналогичной реагенту П. Необходимо отметить, что только фотореагенты могут быть эффективно использованы для картирования контактов из неактивного ТЭК 27, так как момент их пришивки контролируется временем облучения. Являясь искусственными субстратами, реагенты в силу наличия реактивных групп могут искажать геометрию активного центра, приводя к пришивкам из неестественных состояний. Тем не менее, соединения III - V включаются в растущую цепь РНК подобно немодифицированному УТФ. Этот факт указывает на то, что данные реагенты способны к образованию фосфодиэфирной связи и могут занимать в пространстве положения, характерные для нормального субстрата. Соединения I и II несут реактивную группу вместо З'-ОН и их включение в состав транскрипта останавливает синтез РНК, однако это не предотвращает обратной реакции (пирофосфоролиз), что также является указанием на нормальное расположение в активном центре.

1. Rif-GCU- Rif-NH-iCH^NH-pppGpCpX 3'

2. тэк21 - 5raucgagagggacacgcggaaxз'

3. тэк27 - 5'aucgagagggacacgcggaauagccax 3'

4. м.о. -s'eäjax3'

мэтра чпая нить ДНК

fjto.2 um

жеееЙ1ттаттАДАст5'.

j ACÄAtTTCA иемятрвчная вить ДНК

Рис.2. Комплексы и реагенты, использованные в работе. А - Нуклеиновые компоненты комплексов, использованных для картирования. I Rif-GCU - инициаторный комплекс; П ТЭК 21 - тройной элонгаци-онный комплекс 21 (получен на Т7 AI промоторе); ГО ТЭК 27 - тройной элонгашонный комплекс 27 (получен на Т7 AI промоторе); IV М.О. - минимальный нуклеиновый остов. Б- Структуры реагентов, использовавшихся для ковалентной модификации РНК-полимеразы

Пришивки З'-конца РНК к активному центру РНК-полимеразы из реагентов с реактивными группами на рнбозе,

В таблице 1 представлены результаты систематического картирования пришивок из З'-конца РНК. Картирование точек ковалентной модификации осуществлялось методом неполного расщепления белка (Grachev et al., 1989).

Rif-GCU ТЭК 21 ТЭК27 M.O.

I Дикий Р'№П тип BlysNffi В'17888 ™!™и Р^РИГ"" Р'ацш-иьвадга ß апюш мютиеваие не карт»« пеане З'нет пришивки ЗИеМб икартюшно J' некзртиивам Й.Я]Ш-В88>1»1242

II дикий i'MetS32 тип В нет пришивки в ввмм$ ß' Metro ß кмак кекартюована $'МвИ32 «капипвм

ш ß' 7ЧШ ß №073 ß' 4KM8S ßmrnmi№(H активна ß'«M» 508ТВ1НИ8 ß пеню ареет ß'8^® ßqMimmcM У UM8S $51Шв>83М53

IV ß* Ю2Ш25 ß »»>Щ ß' 832-KS ß КШ6=Ш-!273 5'н8тщшцвшки )№ДО5>ШШЗ

V ß' 882-®25=747-814 ß «®ИИ5>Ж| ß'832-1B2S=747«4 ß'832-«J2S ßnmmibkh }'747Ш»832-Ш26

Табл. 1. Пришивки из З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы. Сверху указаны транскрипционные комплексы, использованные для картирования контактов в активном центре. Латинские цифры слева соответствуют реагентам (порядковые номера как на Рис. 2), введенным в состав исследуемых комплексов. Прочерк означает отсутствие данных. Знаки «больше» и равенства отображают относительную интенсивность пришивок в одной и той же субъединице. Результаты картирования контактов реагента 1П в ТЭК 21 и ТЭК 27 взяты из ранее опубликованной работы (Markovtsov et al., 1996).

Реагент I. Реагент I в составе инициаторного комплекса и М.О. ковалентно модифицирует преимущественно ß-субъединицу, тогда как в ТЭК 21 основная пришивка происходит в ß' -субъединицу. Картирование пришивки в ß-субъединице позволило поместить точку контакта между Met 951 и Metl066. Этот район содержит несколько лизинов, но только один из них -Lysl065 - находится в непосредственной близости от активного центра. Для того чтобы подтвердить ковалентную модификацию именно этого остатка, был использован препарат РНК-полимеразы полученный из штамма Е. coli, несущего 2 копии гроВ гена (кодирующего ß-субъединицу): одна в хромосоме, а другая - в плазмиде (Mustaev et al., 1991). ß-субъединица, кодируемая хромосомой (ß/m) содержала вставку 100 аминокислот в неконсервативной области. Эта инсерция не влияет на активность РНК-полимеразы. Субъединица, кодируемая плазмидной копией содержала только одну точечную мутацию, приводящую к \

замене Lysl065 на аргинин (не сшиваемая аминокислота). В случае если контакт формиру-

ется исключительно с ЬуэЮбб, пришивка должна происходить к а субъединица стандартного размера должна оставаться немеченой. Как видно из Рис. 3 А, и в инициаторном комплексе, и в М.О. пришивка локализуется преимущественно в медленно двигающейся хромосомной р-субъединицу (рйи), несмотря на то, что вследствие высокой экспрессии плазмидной копии гроВ гена, основная часть препарата РНК- полимеразы содержит кодируемый плазмидой полипептид. Вышеприведенные данные позволяют сделать вывод, что ЬуэЮбб в самом деле модифицируется реагентом I, расположенным на З'-конце РНК. Картирование минорной пришивки в мутантной р-субъединице (ЬуэЮббА^) в инициаторном комплексе показало, что контакт переместился в район 1230-1243, где единственным кандидатом на пришивку является Ьуз1242. Местом вторичного контакта в М.О. также является Ьу$1242, однако в этом случае наблюдался еще одна дополнительная пришивка с сегментом

Контакт реагента I с р-субъединицей в составе ТЭК21 картируется в районе 9511065. Принимая во внимание вышеприведенные данные, можно предположить, что и здесь местом пришивки служит Ьу81065.

Рис.3. Аффинная модификация каталитических субъединиц РНК-полимеразы Е. coli реагентами I и II. Субьединицы были разделены в 4% полиакриламидном геле и аутографированны. Сверху указаны комплексы и мутантные ферменты, использованные для картирования контактов РНК в активном центре. Слева отмечено положение ß и ß'-субъединиц, а справа - положение ß-субъединицы (ßirls), содержащей вставку в не-значащую область полипепгида. А - Контакты реагента I. Б - Контакты реагента II

Согласно ранее опубликованной работе (Mustaev et al., 1991) и модели тройного комплекса (Korzheva et al., 2000), Lysl065 располагается вблизи от 5-конца инициаторного нук-леотида (в i сайте), тогда как ковалентная модификация фермента в данной работе производилась из З'-конца РНК. Предположительно, в этом случае мы наблюдаем ранее постулированное гипертранслокационное состояние РНК-полимеразы (Artsimovich and Landick 2000), в результате которого З'-конец покидает активный центр и фермент перемещается на 1 шаг вперед по ходу транскрипции (Рис. 1, Д). В инициаторном комплексе пришивка могла обра-

1066-1085.

зоваться также на ранней стадии абортивного синтеза, поскольку короткие РНК прочно не удерживаются в составе холофермента. Вторичный контакт к Lysl242, нерегистрируемый при наличии основного объекта пришивки (Lysl065), происходит, скорее всего, также из ги-пертранслокационного состояния. Тем не менее, в этом случае необходимо предположить разрушение водородных связей концевого нуклеотида с матрицей, что позволяет его свободное вращение относительно фосфодиэфирной связи и тем самым дает возможность повернуться в сторону Lysl242 (подробно такой случай будет рассмотрен ниже). Вторичный контакт с сегментом 1066-1085 в М.О., вероятнее всего, также происходит с разрушением водородных связей, но при этом реактивный нуклеотид не покидает i сайта.

Картирование пришивки реагента I в ß'-субъединице выявило контакт с сегментом 747-814 в инициаторном комплексе. В ТЭК 21, помимо вышеупомянутого участка, наблюдается вторичный контакт в районе 932-1025, содержащем множество лизинов, однако он в 4 раза слабее, чем основная пришивка. В М.О. ковалентная модификация ß'-субъединицы отсутствует. Сегмент 747-814 содержит 3 лизина, но лишь Lys789 находится рядом с активным центром. Для уточнения контакта была сконструирована плазмида на основе вектора pT7ß' с мутацией, приводящей к замене Lys789 на аргинин. Эта аминокислота является природной заменой у многих организмов (в том числе Т. aquaticus). Мутантный фермент обладал свойствами РНК-полимеразы дикого типа и был использован для картирования контактов 3'-конца РНК. Как видно из Рис. 2 А, пришивка из инициаторного комплекса в ß'-субъединицу исчезла, что может служить подтверждением контакта именно с Lys789. Использование му-тантной РНК-полимеразы в составе ТЭК 21 привело к значительному снижению интенсивности мечения ß'-субъединицы. Исходя из того, что основной контакт в комплексе дикого типа располагается в сегменте 747-814, можно предположить, что и в данном случае пришивка происходит в Lys789, а минорный контакт соответствует сегменту 932-1025.

При рассмотрении модели тройного комплекса видно, что Lys789 повернут в сторону активного центра, занимая место входящего нуклеотида (Рис. 4 А, Б). Таким образом, ковалентная модификация данного остатка возможна из активного состояния, в котором З'-конец РНК располагается в ¡-сайте. Вторичный контакт в составе ТЭК 21 приходится на неконсервативный район РНК-полимеразы, отсутствующий у Т. aquaticus, и у Pol II дрожжей. Этот район входит в состав G-петли. Данный сегмент образует важную часть «стенки» отделяющей главный канал РНК-полимеразы от вторичного канала, который в свою очередь, как

считается (Zhang et al., 1999, Gnatt et al., 2000), служит местом выхода З'-конца транскрипта при сдвиге РНК-полимеразы против хода транскрипции, а также местом входа нуклеотидов. G-петля расположена слишком далеко от активного центра (более 20 ангстрем от каталитического иона Mg), поэтому контакт из активного состояния представляется маловероятным. Можно предположить, что часть молекул РНК-полимеразы в составе ТЭК 21 перемещается против хода транскрипции, что приводит к выходу З'-конца РНК в малый канал и образованию контакта с сегментом 932-1025.

Реагент II. Реагент II был использован ранее в нашей лаборатории (В. Марковцов, диссертация). Его контакты в инициаторном комплексе были картированы до единичной аминокислоты - Met932 р'-субъединицы, поскольку расщепление по данному остатку отсутствовало даже при исчерпывающей деградации полипептида с помощью CNBr. Для подтверждения результатов картирования был сконструирован мутант с заменой Met932 на лейцин (не сшиваемая аминокислота). Свойства полученного фермента не отличались от дикого типа. Ковалентная модификация р'-субъединицы в инициаторном комплексе мугантного фермента резко ослабла (Рис. 3 Б), зато появилась вторичная пришивка к р-субъединице. Картирование показало, что место контакта в Р'-субъединице переместилось в район 747814, тогда как пришивка к р-субъединице приходится на район 1066-1085. Исчезновение ковалентной модификации в районе Met932 подтверждает, что именно эта аминокислота является местом контакта с реагентом П. Картирование пришивки реагента II к р'-субъединице в составе ТЭК 21 и М.О. привело к результатам, аналогичным икициаторному комплексу, однако в отличие от Rif-GCU и ТЭК 21, пришивка из М.О. привела к модификации преимущественно р-субъединицы. Минорный контакт с р-субъединицей дикого типа в составе ТЭК 21 приходится на участок 951-1066. Пришивки реш ента II к р-субъединице в составе М.О. происходят в районах 653-685, 951-1065 и 1243-1273 (таблица 1).

Результаты картирования точки ковалентной модификации реагента II к Р'-субъединице дикого типа позволяют сделать вывод, что пришивка регистрирует перемещение РНК-полимеразы против хода транскрипции, так как точка модификации белка (Met932) находится во вторичном канале, около 20 ангстрем от каталитического иона магния. (Рис. 4 В и Г). Пришивка к сегменту 951-1066 р-субъединицы, как и в случае реагента I, скорее всего, происходят из гипертранслокационного состояния. Контакт с районами 653685 и 1243-1273 Р-субъединицы, с другой стороны, наиболее вероятен из активного состоя-

ния, но при условии разрушения водородных связей З'-концевой нуклеотидной пары и поворота реагента в сторону соответствующих сегментов белка.

Две конформации «F-мостика» в активном центре РНК-полимеразы. Активный центр РНК-полимеразы Т. aquaticus очень похож на активный центр Pol II дрожжей, как по аминокислотному составу, так и по своей третичной структуре, однако один компонент занимает в их составе разное положение - «F-мостик» (Рис. 4 А, Б и В, Г соответственно). Как было предложено ранее (Gnatt et al., 2001), данное различие может объясняться либо видовым разнообразием ферментов, либо тем, что кристаллы отражают разные кон-формационные состояния активного центра. «F-мостик» Т. aquaticus изогнут и Argl088 (гомолог Lys789) занимает место входящего нуклеотида в i+1 сайте фермента, «запирая» активный центр (Рис. 4 А, Б), тогда как в дрожжевой Pol II «F-мостик» образует почти идеальную прямую а-спираль, оставляя место для вхождения нового субстрата (Рис. 4 В, Г)- Особенно интересным представляется движение Lys789 (и его гомологов), чье положение меняется наиболее сильно в зависимости от состояния «F-мостика». В изогнутой конформации Lys789 повернут непосредственно в сторону активного центра и доступен для контакта с 3'-концевым нуклеотидом. С другой стороны, в прямой конформации Lys789 развернут в сторону противоположную активному центру и закрыт прочими компонентами «стенки», становясь недоступным для ковалентной модификации. Возможность контакта З'-конца РНК с Lys789, таким образом, можно назвать характерным признаком изогнутого состояния «F-мостика». Другим характерным признаком, но уже для прямой конформации «F-мостика», является взаимодействие З'-конца транскрипта с Met932. В этой конформации Met932 повернут во вторичный канал и доступен для образования пришивки, в то время как при изгибе а-спирали эта аминокислота разворачивается в сторону главного канала и изолируется от контактов с РНК компонентами «стенки», а также передним ДНК дуплексом. Поскольку нами был выявлен как контакт характерный для изогнутой конформации «F-мостика» (с Lys789), так и контакт характерный для прямой конформации (с Met932), мы делаем вывод, что прямое и изогнутое положения «F-мостика» существуют в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы. При этом мы не исключаем некое третье состояние, в котором и Met932, и Lys789 доступны для образования пришивок. На основании полученных данных была выдвинута модель регуляции работы активного центра. Согласно этой модели, «F-мостик» РНК-полимеразы играет роль «турникета», запирающего нуклеотид-связывающий

сайт в изогнутой конформации и открывающего его в прямой конформации. Запирание происходит за счет заполнения ¡+1 сайта остатком Ьув789 в изогнутом состоянии «И-мостика» и вытеснения матричного нуклеотида из ¡+1 сайта пептидным остовом в 790 и 791 положениях. Закрытое состояние тормозит дальнейший рост РНК, не позволяя новому субстрату войти в активный центр, и одновременно препятствует обратной реакции, так как З'-конец РНК не может вернуться в ¡+1 сайт.

Д Вторичный канал

«1-МОС I ПК»

P'Lys789

V J4t932 \. -

" Вторичный канал

G-петля- P'Met932

ф \ / P'Lys789 pLysl065

Щ№7

Главный канал ^ ДНК

В Вторичный канал

f P'Mct932 «F-моечик»

РНК

ДНК

B'Lvs789- ^ Ч

«F-мостик»

Главный канал

Г Вторичный канал • • •

P'Met932 • ^С-иетли

\ ф • . РНК (аборт.)

J f V •..

Щ-, Г' Mg ■

J8p* , " PI,K

p Lys789 «1- -мостик»

Главный канал

Рис.4. Структура «F-мостика» в активном центре РНК-полимераэы. А и Б - структура активного центра РНК-шишмеразы Т. aquaticus, В и Г - структура активного центра РНК-полимеразы II S. cerevesiae. «F-мостик», консервативные районы G, ДНК и РНК обозначены разными оттенками серого цвета. Ион магния изображен как сфера. Met 932, Lys789 и LysI065 показаны на всех панелях в объемном виде. Абортивная РНК на панели Г смоделирована во вторичном канале и обозначена как РНК (аборт.). Предполагаемое месторасположение неструктурированной части G-петлн на панелях Б и Г отображено бельм пунктиром.

G рик-

Главный канал х ДНК

Предполагается, что изгиб «F-мостика» осуществляется за счет бокового остатка Met932, чье перемещение из малого канала вглубь «стенки» вытесняет наружу Lys789 и производит излом а-спирали «F-мостика». Две вышеупомянутые аминокислоты обмениваются между собой контактами с располагающимися рядом аминокислотами, что обеспечивает переход «F-мостика» из одной конформации в другую. Таким образом, регулируя равновесие между открытым и закрытым состоянием активного центра, РНК-полимераза может менять темп синтеза РНК, регулируя скорость элонгации.

Пришивки З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы с помощью реагентов с реактивными группами расположенными на основании.

Реагент III. Результаты картирования контактов реагента III (Табл. 1) вполне согласуются с трехмерной кристаллической структурой активного центра (Korzheva et al., 2001). Тем не менее, для объяснения ковалентной модификации инвариантного мотива NADFDGD (консервативный район D ß'-субъединицы), который принимает непосредственное участие в координации каталитического иона магния (Рис 5), необходимо допустить разрушение водородных связей З'-концевого нуклеотида с матрицей и его поворота почти на 180° («выворачивание» нуклеотида - Рис. 1 Б). Такая пришивка способна происходить как из i, так и из i+1 сайтов. РНК-полимераза при этом не переходит в транскрипционный арест и, в случае восстановления вышеупомянутых водородных связей, может продолжить синтез. Контакт из активного ТЭК 27 в мотив PSRM ß-субъединицы (1091-1107), с другой стороны, не может происходить из активно транскрибируемого состояния, так как этот участок белка находится на расстоянии 18 ангстрем от каталитического иона магния (Рис. 5). Представляется очевидным, что РНК-полимераза во время образования этой пришивки уже частично переместилась против хода транскрипции (назад) и З'-конец РНК покинул активный центр, но, в отличие арестованного ТЭК 27, не слишком далеко. В случае арестованного комплекса контакт перемещается еще дальше - во вторичный канал (участок 932-1025 консервативного района G ß'-субъединицы). Различие между двумя пришивками, вероятнее всего, зависит от обратимости сдвига РНК-полимеразы против хода транскрипции: в первом случае З'-конец РНК легко может вернуться в активный ценггр, тогда как во втором случае такое перемещение ведет к транскрипционному аресту.

Пришивка реагента П1 в составе М.О., в котором латеральное движение РНК-полимеразы сильно ограниченно, также происходит в NADFDGD мотив ß'-субъединицы и

одновременно в сегменты 636-653 и 515-559 ß-субъединицы. Все эти контакты могут быть объяснены выворачиванием З'-концевого нуклеотида непосредственно из активного центра (Рис. 5). Пришивка реагента III в инициаторном комплексе происходит к «F-мостику» ß'-субъединицы и к району 1243-1273 ß-субъединицы (GEME мотив). Если в первом случае ковалентная модификация могла произойти из активного состояния, аналогично реагенту I, то во втором случае контакт невозможен без полного разрушения гетеродуплекса. Вероятно, такая пришивка отражает одну из стадий абортивного синтеза РНК, когда короткие олиго-нуклеотиды покидают тройной комплекс.

Рис. 5. Структур» активного центра РНК-полимеразы. Сегменты, с которыми З'-конец РНК осуществляет конгакш, приведены в виде «проволочной» модели (КоггЬеуа е1 а1., 2000) и обозначены либо по характерной вторичной структуре (в- петля, «Р-мостик»), либо по присутствующему в них консервативному мотиву (КАОИ, СЕМЕ, АЖА, или РБИМ). Неконсервативные участки Р-субьединицы не приведены, в то время как ОДОПХЮ мотив обозначен, но не приведен в ввде модели. Индивидуальные аминокислотные остатки, чьи контакты с З'-концом РНК точно установлены или наиболее вероятны подписаны. Каталитический ион магния изображен как черный круг. Показаны только первые 4 пары ген: родуплекса, З'-конец занимает нуклеотид-связывающий сайт.

Реагенты IV и V. Реагенты IV и V, содержащие реактивные группы в 8 ангстрем и больше, образуют контакты преимущественно с одними и теми же районами фермента (Табл. 1). В инициаторном комплексе это в основном мотив АЫЯА (653-685) р-субъединицы, а также район 559-636 и СЕМЕ мотив (1263-1273). Первые два сегмента находятся вблизи от активного центра и вполне могут быть ковалентно модифицированы данными реагентами при выворачивании З'-концевого нуклеотида (Рис. 5). Даже СЕМЕ мотив, недостижимый из активного состояния для контакта с основанием реагента III, может быть пришит оттуда к реагентам IV и V. Нельзя, впрочем, исключить ковалентной модификации

вышеупомянутых сегментов на ранних стадиях выхода абортивного продукта из активного центра. Наличие контактов реагентов IV и V с участком 932-1025 Р'-субъединицы, лежащего уже во вторичном канале, подтверждает данный вывод. Ковалентная модификация реагентом V района 747-814 Р'-субъединицы происходит из активного состояния Отсутствие пришивки реагента IV к этому сегменту связано либо с наличием легко алкилируемых аминокислот расположенных в других пришиваемых районах РНК-полимеразы, либо в связи со стерическими ограничениями наложенными на соединение IV.

Пришивки реагентов IV и V в составе ТЭК 21, в сущности, повторяют таковые полученные в инициаторном комплексе (см. Табл. 1). В отличие от соединения V реагент IV не образует контакта с сегментом 559-636 в составе ТЭК 21 и М.О., что, скорее всего, является следствием большей дистанции между этим районом белка и каталитическим ионом магния по сравнению с мотивом АМ1А. Тем не менее, принимая во внимания увеличенную длину реактивной группы, соединение V все же может дотянуться до данного участка белка, не покидая активного центра, при условии выворачивания З'-концевого нуклеотида. Пришивка во вторичном канале (932-1025 Р'-субъединицы) в составе ТЭК 21 отражает сдвиг полимеразы против хода транскрипции. Таким образом, вторичный канал является не только воротами для входа нукпеотидов, но и местом выхода олигонуклеотидов при абортивном синтезе и 3'-конца транскрипта во время сдвига РНК-полимеразы против хода транскрипции. Надо также отметить, что реагент IV из-за наличия атома йода в составе реактивной группы образует боле прочные водородные связи с ДНК, что препятствует движению РНК-полимеразы против хода транскрипции. Действительно, в составе ТЭК 21 реагент IV пришивается преимущественно к р-субъединице (нет сдвига назад), тогда как реагент V в этом же комплексе образует мажорный контакт с участком 932-1025 Р'-субъединицы, который является характерным для комплекса сдвинутого против хода транскрипции. Пришивка реагента V в составе арестованного ТЭК 27 иллюстрирует случай максимальной латеральной подвижности РНК-полимеразы. Контакт в этом комплексе приходится исключительно на вторичный канал (932-1025 р'-субъединицы), так как З'-конец РНК в арестованном комплексе необратимо покидает активный центр.

М.О. обладает наименьшей продольной подвижностью, и это приводит, как видно из таблицы 1 к исчезновению ковалентной модификации реагентом IV Р'-субъединицы, а реагент V образует очень слабую пришивку с вторичным каналом (район 932-1025

р'-субъединицы), но сильную с «F-мостиком» (район 747-814 Р'-субъединицы). Пришивки обоих реагентов к мотиву ANRA в составе М.О. сохраняются. Реагент IV в составе М.О. формирует слабый контакт с мотивом GEME, тогда как реагент V наряду с ковалентной модификацией сегмента 559-636, образует новую минорную пришивку с районом 1066-1086 Р-субъединицы, также находящуюся в зоне досягаемости реактивной группы реагента без перемещения нуклеотида за пределы активного центра.

Мутации в консервативном районе G Р'-субъединицы.

Консервативные районы G и G' Р'-субъединицы представляют собой две антипараллельные а-спирали, связанные друг с другом G-петлей. Вместе с С-концевой частью «F-мостика» они образуют так называемую «стенку», отделяющую главный канал РНК-полимер азы от вторичного (Zhang et al., 1999). Наличие многочисленных водородных связей и гидрофобных контактов между аминокислотными остатками вышеупомянутых элементов позволяет взглянуть на «стенку», как на интегрированную систему, часть которой располагается поблизости от каталитического центра, а часть - на поверхности РНК-полимеразы. В данной работе с помощью точечного мутагенеза был получен ряд аминокислотных замен в консервативном районе G Р'-субъединицы: Arg933Ser, Thr934Ala и Phe935Ser. Наиболее подробно были изучены свойства РНК-полимеразы Thr934Ala, которая в наибольшей степени отличались от фермента дикого типа.

При низких концентрациях нуклеотидов (5цМ) РНК-полимераза Thr934Ala остается в районе промотора, продолжая синтезировать абортивные продукты, однако значительное повышение концентрации субстратов (до 250 цМ) помогает ферменту перейти к продуктивной элонгации (Рис. 6 А). Оказалось, что РНК-полимераза Thr934Ala неспособна к эффективному использованию AUC РНК-праймера во время инициации транскрипции, что не позволяет синтезировать длинную РНК стандартным методом «шагания». Тем не менее, используя набор всех четырех субстратов, один из которых (радиоактивный УТФ) находился в низкой концентрации, на Т7 А1 промоторном фрагменте была получена смесь трех транскрипционных комплексов: ТЭК20, ТЭК 26 и ТЭК 32 (Рис 6 Б). Подобным образом, но за меньшее время инкубации, были созданы аналогичные комплексы белка дикого типа. В опытах по добавлению НТФ к этим комплексам было обнаружено, что скорость элонгации ферментом Thr934Ala во много раз ниже скорости элонгации РНК-полимеразы дикого типа. Даже многократное увеличение концентрации нуклеотидов (с 5 цМ до 0.25 шМ) не позволи-

ло их полностью выровнять (Рис 6 Б). Не только прямая, но и обратная реакция (пирофосфо-ролиз) у мутантной РНК-полимеразы ТЬг934А1а была значительно замедлена (Рис. 6 В).

тзд4а

ИМИЗй

ШКК\

1Ш

Пг

¡Фермент 1Т934А1 Д.ТГ 7¥7 р] + +

Ври«

ЕПИСЕОВЕ

20-и—

i 2345678910 111213141516

123 45 6 78

ц сайт 1+1 сайт

I с«*г 1+1 сайт

1 2 3 4 5 6

Рис. 6. Свойства РНК-полимеразы ТЬг934А1а. А - Уход с промотора. Синтез производили с использованием СрА РНК-праймера (100 цМ) и НТФ указанной концентрации 7 минут 37°С. Радиоактивный УТФ использовался во всех случаях в 1 цМ концентрации. Абортивные продукты отмечены слева. Продукты разделены в 23% ПААГ. Б - Измерение скорости элонгации. К смеси комплексов ТЭК 20, ТЭК 26 и ТЭК 32 (их положение указано слева) были добавлены нуклеотиды в приведенной концентрации и инкубированы указанное на рисунке время при температуре 22°С. Продукты разделены в 15% ПААГ. В - Измерение скорости пирофосфоролиза. ТЭК 20, ТЭК 26 и ТЭК 32 были смешаны с 2 тМ пирофосфатом (РР0 и инкубированы на 37°С указанное время. Приведена только нижняя часть аутограммы. Продукты разделены в 23% ПААГ. Г - Схема свободнорадикального гидролиза РНК в активном центре. N - нуклеозид, рег+ - ион железа в активном центре, ОН* - свободные радикалы. Места расщепления цепи РНК показаны стрелками, две половины активного центра 0 и ¡+1 сайты) отмечены под схемой. 1 -Прегранслокационное состояние; П - активное состояние. Д - Свободнорадикальное расщепление транскрштга из активного центра РНК-полимеразы. Элонгационные комплексы (ТЭК 20, ТЭК 26 и ТЭК 32) были отмьгты транскрипционным буфером, не содержащим ионов магния, и ссшь трехвалентного железа была добавлена в реакционную смесь. Расщепление осуществляли за указанное время при 22°С. Продукты гидролиза РНК отмечены справа (Ре2*), а исходные комплексы - слева. Продукты разделены в 15% ПААГ. Е - Профиль пришивки реагента I к р- и Р'-субьединицам РНК-полимеразы дикого типа и Т11г934А1а в инициаторном комплексе. Положение субъединиц на графике отмечены - р и Р'. По оси ординат отложена относительная интенсивность сшивок. I - пришивка фермента дикого типа, П - пришивка РНК-полимеразы ТЬг934А1а.

Как видно из трехмерной структуры РНК-полимеразы (Рис. 4), в-район (З'-субъе-диницы непосредственно подпирает «Б-мостик», поэтому нарушения в его структуре могут

привести к изменению в равновесии между «открытым» и «закрытым» состояниями активного центра РНК- полимеразы. Поскольку по нашей модели за i+1 сайт конкурируют боковая цепь Lys789 в изогнутом «F-мостике», а также З'-конец РНК и входящий нуклеотид, то сдвиг равновесия в сторону «закрытого» состояния должен привести к замедлению как прямой, так и обратной реакции. Очевидно, что повышение концентрации субстратов, может сдвинуть равновесие в соответствующую сторону, что и наблюдается в экспериментах по измерению скорости элонгации и пирофосфоролиза. Медленный

уход с промотора, по всей видимости, связан с общим замедлением синтеза РНК, что приводит к увеличению количества абортивных продуктов. Таким образом, если в мутантной РНК-полимеразе «закрытое» состояние действительно преобладает по сравнению с ферментом дикого типа, то можно ожидать у мутанта перемещения 3'-конца транскрипта преимущественно в i сайт.

Для локализации положения З'-конца РНК в активном центре фермента Thr934AIa, каталитический ион магния был замещен ионом железа. Находясь в активном центре Fe2+ не только позволяет продолжать транскрипцию, но и приводит к образованию свободных гид-роксильных радикалов, вызывающих расщепление близлежащих пептидных и фосфоди-эфирных связей (Zaychikov et al., 1996). В силу небольшого радиуса действия радикалов, отщепление концевых нуклеотидов может произойти только в случае, если З'-конец РНК занимает ¡+1сайт (Рис. 6 Г) или если РНК-полимераза сдвигается против хода транскрипции. На рисунке 6 Д видно, что РНК мутантного фермента остается неповрежденной, тогда как транскрипт РНК-полимеразы дикого типа подвержен деградации. Отсутствие свободноради-кального расщепления РНК в активном центре мутанта Thr934AIa подтверждает то, что З'-конец РНК, в самом деле, находится преимущественно в i сайте. Эксперимент по пришивке ферментов к реагенту I также указывает на сдвиг равновесия в сторону «закрытого» состояния активного центра, так как в мутантной РНК-полимеразе наблюдается усиление мечения р'-субъединицы в сравнении с р-субъединицей (Рис. 6 Е), поскольку такая пришивка характерна для «закрытого» состояния и отражает изгиб «F-мостика».

Из всего выше перечисленного можно сделать вывод, что замена Thr на Ala в позиции 934 р'-субьединицы приводит к сдвигу равновесия активного центра РНК-полимеразы в сторону «закрытого» состояния.

Глава 2. Абортивная и продуктивная инициация транскрипции

Инициация транскрипции - это многостадийный процесс, начинающийся с узнавания промотора холоферментом, вслед за которым происходит плавление двуцепочечной ДНК в районе старта транскрипции, а затем начинается синтез РНК (McCIure 1985). Тем не менее, далеко не каждый акт инициации синтеза сопровождается переходом к элонгации, по крайней мере, in vitro. В большинстве случаев РНК-полимераза синтезирует короткие РНК продукты, выпадающие из тройного комплекса, и затем вновь возобновляет синтез РНК без диссоциации с промотра. Такой процесс называется абортивной инициацией (McCIure et al., 1978). До недавних пор было неясно, что же приводит к переходу к продуктивной элонгации. Расшифровка трехмерной структуры холофермента РНК-полимеразы позволила предложить модель абортивного синтеза (Vassylyev et al., 2002, Murakami et al., 2002 a, b). Согласно этой модели линкерный домен ст-субъединицы располагается в главном канале РНК-полимеразы, конкурируя с растущим 5'-концом РНК. Предполагается, что столкновение транскрипта с данным участком а-субъединицы приводит либо к вытеснению линкерного домена с последующим уходом РНК-полимеразы с промотора, либо к отделению олигонук-леотида и образованию абортивного продукта. При достижении РНК в длину 9-10 нуклеоти-дов происходит полное вытеснение с-субъединицы и стабилизация транскрипционного комплекса. Тем не менее, существует ряд данных, указывающих на то, что абортивный синтез не обязательно связан с длиной новосинтезированой РНК, а может представлять особый транскрипционный путь, когда некоторая фракция фермента производит только абортивные продукты, а другая фракция сразу переходит к продуктивной элонгации (Kubori and Shimamoto 1996). Задачей данной части работы было определение минимального размера РНК в стабильном тройном комплексе с последующим картированием контактов 5'-конца наименьшей стабильной РНК.

Абортивная и продуктивная инициация на Т7 А2 промоторе и обнаружение фракции стабильных ТЭК, содержащих короткие РНК.

Для изучения минимальных стабильных тройных комплексов был использован метод транскрипции с помощью РНК-полимеразы иммобилизованной HaNi-NTA смоле. Промывая транскрипционным буфером пробы с инициирующей РНК-полимеразой, можно избавиться от абортивных продуктов и наблюдать только за стабильными тройными комплексами, а, изучая общую смесь - следить также и за абортивными олигонуклеотидами.

Начальная транскрибирумая последовательность Т7 А2 промотора -(+1)ОС11АООиААС. При инициации синтеза с вСи РНК праймера в присутствии ГТФ и радиоактивного АТФ, транскрипция не продвигается далее +6 положения, тогда как добавление УТФ в транскрипционную смесь позволяет синтезировать все продукты вплоть до 9-нт. РНК. Как видно из рисунка 7 А (дорожки 1 и 2), почти все ТК, содержащие 9-нт, РНК и большая часть комплексов с 8-нт. РНК стабильны, тогда как ТК с 7- и тем более 6-нт. транскриптами представлены в основном абортивной фракцией. Надо отметить, тем не менее, что определенная часть этих коротких продуктов не диссоциирует из состава тройного комплекса (30% для 7-нт. и 10% для 6-нт. за 10 минут). Это противоречит общепринятой теории о нестабильности тройных комплексов, содержащих короткие транскрипты во время инициации. Вышеупомянутые РНК способны к удлинению согласно последовательности матрицы: УТФ удлиняет 6-нт. РНК до 7-нт.. РНК (Рис. 7 А дорожка 3), а АТФ удлиняет 7- и 8-нт. РНК до 9-нт. РНК (Рис. 7 А дорожка 4). Это означает, что данные олигонуклеотиды остаются в комплексе с РНК-полимеразой и не являются абортивными продуктами налипшими на смолу. Можно предположить, что короткие РНК являются продуктами эндонуклеотического расщепления или пирофосфоролиза более длинных транскриптов. Тем не менее, даже при образовании ТК 6 в отсутствии более длинных РНК продуктов происходит накопление фракции стабильных транскрипционных комплексов (Рис. 7 Б). Стабильные ТК, содержащие короткие РНК, устойчивы в высокой ионной силе и при низкой температуре, что характерно для элонгационных, а не инициаторных комплексов (Рис. 7 В). Хотя наиболее коротким транскриптом прочно ассоциированным с РНК-полимеразой оказалась 6-нт. РНК (Рис. 7 А дорожка 1), возможно образование стабильных ТК содержащих и

более короткие продукты. РНК в составе ТК 6 при обработке пирофосфатом способна к укорочению вплоть до 4-нт. РНК (Рис. 7 Г)> Этот олигонуклеотид также остается прочно ассоциированным с РНК-полимеразой. Данный эксперимент указывает на то, что стабилизировавшийся ТК не теряет своей устойчивости даже при последующем укорочении транскрипта. ТК 4 сохраняет каталитическую активность и удлиняет РНК до 6-нт. при добавлении соответствующего субстрата (Рис. 7 Д дорожка 3). Следует отметить, что радиоактивная метка находится в 4-ом положении, поэтому в случае укорочения РНК до 3-нт., полученный олигонуклеотид становится немеченым, что не позволяет следить за его стабильностью. Отсутствие исчерпывающего пирофосфоролиза в случае 6-нт. РНК (Рис. 7 Г, дорожка 2) позволяет предположить, что часть молекул могла перейти в состояние транскрипционного ареста.

Действительно, во время инкубации ТК 6 при 37°С происходит накопление 5-, а затем 4-нт. РНК. Процесс ускоряется в несколько раз при добавлении фактора йгеА (Рис. 7 Е). ТК 4 и ТК 5, так же, как и исходный ТК 6 оказались стабильны в высокой ионной силе и при низкой температуре, но в меньшей степени (Рис. 7 Г, дорожки 2-6).

АЕ

9- иг. 8-мт. 7-кг. 6-иг. 5-иг.

12 3 4

1 2

1 2 3 4 5

рр| — +

ЫаС1 — +

Время (мин) 0 3 5 10 20

рр. —

Ш — - +

йШЛШШЙШКШ

6-ИТ.

•♦5- от.*-4- ит.

ОгеА -

Время (мин) 0 5 10 20 40 5 10

1 2 3

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6

Рис. 7. Инициаторные тронные комплексы, содержащие короткие стабильные РНК. А — Стабильные и абортивные РНК продукты. Комплекс РНК-полимеразы и Т7 А2 промоторного фрагмента был иммобилизован на смоле, проинкубирован 10 минут при 22°С в присутствии РНК праймера (ЗрСри (10 цМ), ГТФ, УТФ (25 рМ) и АТФ [аР32]. РНК продукты, оставшиеся на смоле после пятикратной промывки транскрипционным буфером, обозначены как «смола», а не промытые транскрипционные комплексы -как «смесь». Нуклеотиды, добавленные к промытым ТК, приведены сверху, полученные продукты помечены слева. Б - 6-нт. РНК продукт. Реакцию проводили, как на панели А, но в отсутствии УТФ, что предотвращает образование РНК длинней 6-нт. В - Измерение стабильности ТК с короткими РНК продуктами. Полученная в эксперименте на панели 1 смесь ТК была проинкубирована разное время на 0°С в транскрипционном буфере с 1 М ЫаС1, после чего была отмыта 4 раза. Г - Пирофосфоролиз коротких РНК и измерение стабильности полученных продуктов. Стабильный ТК б был проинкубирован 5 минут с 2 тМ пирофосфатом на 37°С, отмьгг транс-крипционным буфером, и полученные комплексы были проинкубированы в буфере с 1 М №С1 при 0°С указанное время, после чего вновь отмыты 5 раз холодным транскрипционным буфером. Д - Элонгация 4-нт. РНК. ТК 4 был получен из ТК 6 (дорожка 1) путем пи-рофосфоролиза (дорожка 2) и затем к нему был добавлен ГТФ (25 цМ) на 5 минут при 22°С (дорожка 3). Е - Эндонуклеотическое расщепление РНК в составе стабильных коротких ТК. ТК б был инкубирован на 22°С в течение указанного времени либо в отсутствии факторов (дорожки 1-5) либо в присутствии 1 рМ ОгеА (дорожки 6-7). Во всех случаях использовался 30% ПААГ.

Опираясь на полученные данные, была предложена модель, согласно которой РНК-полимераза синтезирует нестабильные РНК продукты на Т7 А2 промоторе до тех пор, пока транскрипт не достигнет длины в 6 нуклеотидов. Вслед за этим ТК 6 может или стабилизи-

роватъся (перейти в элонгацию), или продолжить синтез нестабильных РНК. Та часть молекул, которая перешла на продуктивный путь, уже не может вернуться к синтезу абортивных продуктов до завершения транскрипционного цикла, однако способна к переходу в арестованное состояние с последующим эндонуклеотическим расщеплением РНК.

Контакты 5'-конца коротких стабильных РНК в тройном комплексе.

Для картирования контактов 5'-конца б-нт. РНК был использован бСи праймер несущий в своем составе азидную группировку на 5'-концевом фосфате, которая способна образовывать фотоиндуцированную пришивку к белку. В результате облучения ТК б кова-лентной модификации подверглись Р'-, р- и а-субъединицы. Картирование места пришивки к р-субъединице выявило контакт с сегментом 515-559, тогда как к Р'-субъединице - с сегментом 298-330. Пришивка к сг-субъединице располагается в сегменте 510-561, что соответствует линкерному домену. Картирование контакта 5'-конца стабильной 4-нт. РНК, полученной укорочением 6-нт., выявило идентичный набор пришивок. В элонгационном комплексе пришивки из РНК, полученные с помощью реактивных групп расположенных на расстоянии 8-9 нуклеотидов от каталитического центра, локализуются с теми же самыми сегментами Р'- и р-субъединиц, с которыми контактирует 5'-конец транскрипта в ТК 6 (Коге-Ьеуа е1 а1., 2000). 8-нуклеотидная РНК значительно длинее транскрипта в составе ТК 6. Надо отметить, что сегмент 515-559 р-субъединицы принимает участие в формировании свода главного канала в районе ДНК:РНК гетеродуплекса и может контактировать с 5'-концом РНК на большом протяжении, тогда как сегмент 298-330 Р'-субъединицы образует элемент вторичной структуры «шип», которому приписывается значительная роль в поддержании стабильности тройного комплекса в элонгации (Кигпеёе1оу й а1 2002). Таким образом, можно предположить, что стабильность РНК в составе инициаторного тройного комплекса обеспечивается контактами с «шипом» аналогичным таковым в элонгационном тройном комплексе. Примечательно, что даже при укорочении РНК до 4-нт., стабильность тройного комплекса сохраняется, как и взаимодействие 5'-конца РНК с «шипом», что, по всей видимости, указывает на перемещение «шипа» вслед за 5'-концом РНК. Такое движение теоретически возможно, так как «шип» представляет собой довольно изолированный структурный сегмент РНК-полимеразы, а наличие свободного пространства вокруг «шипа» устраняет возможные стерические затруднения для его перемещения в сторону активного центра. В заключение можно отметить, что стабильность ТК определяется одними и теми же элемен-

тами структуры вне зависимости от формы РНК-полимеразы (холофермент или корфер-мент). Наличие контакта 6-нт. РНК с а-субъединицей подтверждает данную мысль.

Глава 3. Движение консервативного Hisl237 (3-субъединицы во время инициации синтеза РНК

Место связывания антибиотика рифампицина (Rif) расположено поблизости от активного центра в канале содержащем РНЮДНК гетеродуплекс. Для изучения возможных контактов антибиотика с компонентами активного центра было использовано соединение, в котором Rif ковалентно связан с инициаторным нуклеотидом (в данном случае ГТФ) через подвижный линкер (Mustaev et al., 1993). Комплекс РНК-полимеразы с Rif-pppG и Т7 А2 промоторным фрагментом облучали 30 минут при длине волны 308 пш. Вслед за этим для мечения пришитого белка к смеси добавили радиоактивный нуклеотид (ЦТФ), включающийся в РНК. Схема эксперимента приведена на Рис. 8 А. Как видно из рисунка 8 Б (дорожка 2), ковалентной модификации подвергается только р-субъединица.

Известно, что нуклеиновая компонента Rif-pppG не поглощает при длине волны 308 пш, поэтому можно предполагать, что к РНК-полимеразе пришивается преимущественно рифампицин. Принимая во внимание, что амидная связь между Rif и pppG неустойчива при низких значениях рН, полученная пришивка была подвергнута кислотному гидролизу. Как видно из Рис. 8 Б (дорожка 3), после обработки кислотой (рН=2, 30 минут) р-субъединица подверглась демодификации. Это указывает на то, что в данном случае пришивка происходит из Rif, а не ГТФ .

Картирование точки контакта рифампицина с р-субъединицей выявило район 12321243 (Рис 8 В), расположенный согласно известной трехмерной структуре (Campbell et al., 2001) в 10 ангстремах от Rif. Из двух участков молекулы Rif, способных к поглощению квантов света при длине волны 308 nm (Рис. 8 Г). АНСА мостик находится ближе всего к картированному сегменту, но расстояние между ними все равно слишком велико для прямого взаимодействия (Рис 8 Д). Для объяснения данной пришивки необходимо предположить либо перемещение Rif в сторону активного центра, либо движение района 1232-1243 в сторону антибиотика. В пользу второй гипотезы говорит несколько фактов: во-первых, время полужизни комплекса Rif с РНК-полимеразой при комнатной температуре составляет несколько часов, что значительно превышает время облучения (30 минут); во-вторых, участок белка, содержащий картированный сегмент, представляет собой незафиксированную в про

—и* + U¥ н* ♦ ИГ

■'msi*

J1 нгс,н*сн3

в 1 2 3 4

Потенциально сшнкавмма участки рифаипнцнна

ауэ.

ЦНК + — №(ц

Сигма + _

CNBr — 1 + — 1 + _ j ф

AatpooH

51 653,6811' 685 70-f 741 768 800,805/J 951

1066-J. ■

1085-i -21,™ 1107,U19rf

1170-1 Г^* _

12321 -.-¿sSr VfeS^SiL

1243......

1 2 3 4 5 6 7

Рис. 8. Фотопришивка рифампицина к РНК-полииеразе. А - схема эксперимента. РНК-полимераза -заштрихованный многоугольник, активный центр и место связывания рифампицина отмечены выемками. Рифампицин показан как овал, соединенный с инициаторным нуклеотидом (pppG) линией. Пришивка обозначена в виде линии с точкой, а радиоактивный фосфор - звездочкой. Б - Пришивка рифампицина к РНК-полимеразе. Ковалентная модификация осуществлялась 30 минут при 22°С по схеме, приведенной на панели A (+UV). -UV означает отсутствие облучения, Н* - кислотный гидролиз пришивки, Rif - обработку РНК-полимеразы рифампицином до начала эксперимента. 4% ПААГ. В - Картирование пришивки рифампицина к р-субъединице РНК-полимеразы. Расщепление производилось по метиониновым остаткам (CNBr). Пришивка осуществлялась либо с холоферментом в присутствии ДНК - дорожки 1 и 2, либо с корферментом в присутствии ДНК (с последующим добавлением ст-субъединипы) - дорожки 3 и 4, либо с изолированным корферментом (ст-субъединица и ДНК добавлены позже)—дорожки 5 и 6. Дорожка 7 - контрольное расщепление р-субьединицы помеченной по Hisl237. Слева отмечено положение продуктов протеолиза по соответствующим метиониновым остаткам. Расположение немеченого продукта показано пунктиром. 8-16% ПААГ Г - Строение рифампицина. Участки способные к поглощению квантов света при длине волны 308 nm окрашены в серый цвет. Д - Кристаллическая структура окрестностей активного центра РНК-полимеразы Т. acuatiqus вместе с рифампицином (Campbell et al., 2001) Гомологичные районы р-субъединицы, содержащие кластер мутаций устойчивости к рифампицину отмечены на рисунке, порядковые номера аминокислот соответствуют таковым у Е. coh. Ион Mg2+ отображен как сфера. Наименьшее расстояние между рифампицином и His 123 7 отображено на рисунке стрелкой (в ангстремах). «Мостик» между инициаторным нуклеотидом и рифампицином был смоделирован.

странстве белковую петлю, которая теоретически способна к некоторому движению. Известно также, что His 1237, расположенный в районе 1232 и 1243, способен пришиваться к инициаторному субстрату и такой транскрипт удлиняется до 9 нуклеотидов (Mustaev et al.,1993). Это в свою очередь говорит о возможности движения Hisl237, хотя не исключено и выпетливание РНК. Еще одним указанием на подвижность района 1232-1243 являются пришивки 5'- конца РНК-праймеров к Hisl237 из позиций -3 - -5 относительно старта транскрипции (М. Козлов, диссертация). Пришиваемая группа в этом случае согласно известной модели тройного комплекса (Korzheva et al., 2000) должна располагаться в окрестностях кластера мутаций устойчивости к рифампицину, но не рядом с районом 1232-1243. Принимая во внимание совокупность всех вышеперечисленных данных, представляется наиболее вероятным движение сегмента, содержащего His1237, а не Rif относительно активного центра. Можно предположить, что во время инициации транскрипции консервативный Hisl237 образует контакт с 5'-концом РНК и сопровождает его по мере роста продукта до участка РНК-полимеразы, контактирующего с Rif (Р 515-685), играя роль «направляющего рельса».

Движение сегмента 1232-1243, таким образом, может быть частично ответственно за нестабильность коротких РНК в тройных инициациаторных комплексах. Надо также заметить, что участок 1232-1243 способен к движению не зависимо от формы фермента, так как пришивка Rif к нему происходит как в присутствии, так и в отсутствии сигмы субъединицы и/или ДНК (Рис. 8 В, дорожки 3-6).

Результаты, представленные в данной работе, показывают, что РНК-полимераза является весьма пластичным ферментом. Движения как нуклеиновой, так и белковой части транскрипционного комплекса играют значительную роль в синтезе РНК и регуляции этого процесса. Таким образом, с помощью внутримолекулярных перестроек РНК-полимераза способна не только к движению по матрице, но и к восприятию сигналов извне и передачи их активному центру.

Выводы:

1. С помощью метода аффинной модификации зарегистрированы перемещения З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы между пост- и претранслокационными состояниями. Показано, что в случае разрушения водородных связей между З'-конецевым нуклеоти-дом и ДНК, этот нуклеотид может вращаться вокруг фосфодиэфирной связи не покидая активного центра.

2. Установлено, что З'-конец РНК при перемещении РНК-полимеразы против хода транскрипции выходит во вторичный канал РНК-полимеразы. Абортивные продукты покидают РНК-полимеразу во время инициации также через вторичный канал. Выявлено ранее постулированное гипертранслоцированное состояние, во время которого З'-конец РНК оставляет активный центр и перемещается в главный канал.

3. Показано, что две альтернативные конформации «Р-мостика» существуют в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы. Предложено новое - «закрытое» - состояние активного центра, в котором Ьув789 Р'-субъединицы блокирует вхождение очередного нук-леотида в активный центр и останавливает синтез РНК. Изменение в структуре «Р-мостика» может регулировать скорость транскрипции.

4. Установлено, что консервативный район в р'-субъединицы играет важную роль в поддержании структуры «стенки», отделяющей главный канал от вторичного, и влияет на конформацию «Р-мостика».

5. При достижении РНК длины в 6 нуклеотидов во время инициации с Т7 А2 промотора, происходит стабилизация части тройных комплексов. Стабильные инициаторные тройные комплексы способны к эффективному удлинению, пирофосфоролизу и эндонуклеотиче-скому расщеплению РНК. Инициаторные тройные комплексы, полученные в результате пи-рофосфоролиза 6-нт. РНК и содержащие 4-нт. транскрипт, также проявляют высокую стабильность.

6. Контакты 5'-конца транскрипта в стабильном тройном комплексе, содержащем 6-нт. РЖ, совпадают с контактами, придающими стабильность элонгационным комплексам, что указывает на общий механизм стабилизации РНК-полимеразы в инициации и элонгации. При укорочении транскрипта до 4-нт. стабилизирующие контакты не разрушаются, что в свою очередь предполагает перемещение в пространстве элемента вторичной структуры «шип» вслед за 5'-концом РНК.

7. Фотопришивка антибиотика рифампицина к району His 1237 Р-субъединицы указывает на возможность движения этого района белка от активного центра вдоль главного канала. Предложена модель, согласно которой во время инициации Hisl237 сопровождает растущий 5-конец РНК от активного центра до участка фермента контактирующего с рифампицином.

Список работ,

опубликованных по теме диссертации

Epshtein V., Mustaev A., Markovtsov V., Bereshchenko O., Nikiforov V., Goldfarb A. 2002. Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell., 10: 623-634.

Yuzenkova J., Delgado M., Nechaev S., Savalia D., Epshtein V., Artsimovitch I., Mooney R.A., Landick R., Farias R.N., Salomon R., Severinov K. 2002. Mutations of bacterial RNA polymerase leading to resistance to microcin j25. J Biol Chem., 277: 50867-50875

Epshtein V., Mustaev A., Goldfarb A 1998. Studies of the pre- and posttranslocational states of RNA product in Escherichia coli RNA polymerase initiating complex. Keystone symposium "Transcriptional mechanisms". 21-26 February, Taos, USA.

Принято к исполнению 08/09/2003 Заказ №355

Исполнено 10/09/2003 Тираж: 100 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 \vww.autoreferat ги

»14244

©о?

Т4ЯТ

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Эпштейн, Виталий Наумович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Часть I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Введение.

Глава 1. Общие свойства РНК-полимеразы, транскрипционный цикл и модели тройного элонгационного комплекса.

1.1 Стадии транскрипционного цикла.

1.2 Энзиматические реакции, катализируемые РНК-полимеразой, и состояния активного центра.

1.3 Модели, описывающие структуру РНК-полимеразы.

1.1.1 Модель вон Хиппеля.

1.1.2 Модель Чамберлена.

1.1.3 Интегрированная модель РНК-полимеразы.

Глава 2. Кристаллическая структура корфермента РНК-полимеразы.

2.1 Общая архитектура РНК-полимеразы.

2.2 Элементы структуры РНК-полимеразы.

2.3 Особенности строения эукариотической РНК-полимеразы.

Глава 3. Взаимосвязь между структурными элементами молекулы РНК-полимеразы и ее функциями.

3.1 Стабильность элонгационного комплекса РНК-полимеразы.

3.2 Контакты РНК-полимеразы с нуклеиновыми компонентами элонгационного комплекса.

3.3 Структурная основа терминации синтеза РНК.

3.4 Вторичный канал.

3.5 Транслокация РНК-полимеразы вдоль ДНК матрицы.

Глава 4. Кристаллическая структура холофермента РНК-полимеразы.

4.1 Доменная организация ст-субъединицы.

4.2 Взаимодействие ст-субъединицы с корферментом.

4.3 Изменение структуры корфермента вызываемое присоединением ст-субъединицы.

4.4 Структурные основы инициации синтеза РНК.

4.5 Абортивный синтез РНК и структура холофермента.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации"

1.1. Транскрипционные комплексы и реагенты, использовавшиеся в работе.61

1.2. Стратегия картирования мест пришивок и белковые маркеры, использованные в работе.65

1.3. Пришивки З'-конца РНК из реагентов с реактивными группами на рибозе.71

1.4. Две конформации «F-мостика» активного центра РНК-полимеразы.81

1.5. Пришивки З'-конца РНК к активному центру РНК-полимеразы из реагентов с реактивными группами на основании.84

1.6. Мутации в консервативном районе G Р'-субъединицы.99

Глава 2. Абортивная и продуктивная инициация транскрипции.109

Введение.109 т 2.1 Абортивная и продуктивная инициация на Т7 А2 промоторе.110

2.2 Контакты 5'-конца коротких стабильных РНК в тройном комплексе.114

Глава 3. Движение консервативного Hisl237 р-субъединицы во время инициации синтеза РНК.117

Введение.117

3.1 Фото пришивка рифампицина в активном центре РНК-полимеразы.118 Р 3

ВЫВОДЫ.124

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.126

БЛАГОДАРНОСТИ.126

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.127 ч 4

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

CAPS - З-(циклогегсиламино) 1-пропансульфат dNTP - дезоксирибонуклеозидтрифосфат DTT —дитиотреитол щ EDTA - этилендиаминтетраацетат

HEPES- 4-(2-гидроксиэтил)-пиперазин-1-этан-серная кислота IPTG - изопропил-Р-тио-Б-галактопиранозид МпТБ марганцевый транскрипционный буфер PMSF - метилфенилсульфонилфторид SDS - додецилсульфат натрия TEMED - 1,2-Бис-(диметиламино)-этан TNCBA - тио-нитро-бензойная кислота ► АТФ — аденозин трифосфат

БМ - буфер с мочевиной ГДФ - гуанозин дифосфат ГТФ — гуанозин трифосфат М.О - минимальный нуклеотидный остов нт. - нуклеотидов НТФ - рибонуклеозидтрифосфат ▼ об/мин - оборотов в минуту

О.Е. — оптическая единица п.н. - пар нуклеотидов ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР - полимеразная цепная реакция ПЭ - промоторный элемент щ СБ - стоп буфер

ТБ - транскрипционный буфер

ТК - тройной комплекс

ТРИС - Трис-(гидроксиметил)-аминометан

ТЭК - тройной элонгационный комплекс

УТФ - уридин трифосфат ЦТФ - цитозин трифосфат 9 Р Г

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

На протяжении последних 30 лет РНК-полимераза Е. coli является объектом пристального внимания в качестве модельной системы для изучения транскрипции. Этот большой мультисубъединичный фермент с молекулярной массой около 450 kDa состоит из четырех субъединиц корфермента (агрр') обладающего каталитической активностью, а также а-субъединицы, необходимой для узнавания промоторных последова-тельностей ДНК и инициации синтеза РНК. В настоящее время получен большой объем информации о строении РНК-полимераз, основанной на расшифровке трехмерной структуры ферментов, как про-, так и эукариот. Надо отметить, тем не менее, что РНК-полимераза в составе кристалла фиксируется только в одном из возможных конфор-мационных состояний, поэтому необходимо применение различных биохимических и генетических методов для выявления альтернативных конформаций фермента, физиологическое значение которых может быть исследовано исходя из природы комплекса, в котором они были получены.

Теоретически можно предположить два вида конформационной подвижности в транскрипционном комплексе - перемещение в пространстве частей нуклеиновых кислот (ДНК или РНК) относительно фермента или изменение в структуре белка. Примером первого типа являются транслокация РНК-полимеразы по матрице и переход фермента в состояние транскрипционного ареста. Оба процесса сопровождаются движением нуклеиновых компонентов комплекса относительно РНК-полимеразы (Komissarova and Kashlev 1997, Nudler et al., 1997). Внутримолекулярные перемещения белковой части транскрипционного комплекса также неоднократно постулировались (Krummel and Chamberlin 1992), однако прямых доказательств движения такого рода не существовало. Определение трехмерной структуры РНК-полимеразы позволило предложить молекулярные основы для подобных процессов. Одним из примеров пластичности белка может служить изменение в строении «F-мостика» (Zhang et al., 1999; Gnatt et al., 2001). Несмотря на сходное строение прочих компонентов активного центра и высокую гомологичность данного участка белка среди различных РНК-полимераз, этот элемент вторичной структуры занимает два разных положения в составе эукариотического и прокариотического ферментов. Такая разница может отражать два альтернативных состояния активного центра, однако не исключено, что различие обусловлено видовым разнообразием структуры РНК-полимераз. Несомненный интерес привлекает также и процесс инициации синтеза РНК. Известно, что РНК-полимераза при переходе от инициации к элонгации меняет свои свойства, приобретая высокую устойчивость и процессивность, тогда как инициациаторный комплекс относительно нестабилен. Таким образом, процесс ухода с промотора также сопровождается конформационным переходом. Появление кристаллических структур холоферментов бактериальных РНК-полимераз (Murakami et al., 2002а,b; Vassylyev et al., 2002) позволило установить некоторые молекулярные основы стабилизации фермента.

Цель работы и задачи исследования

Целью работы являлось исследование структурных изменений в белковом и нуклеиновом компонентах тройного комплекса в районе активного центра РНК-полимеразы во время транскрипции и соотнесение их с функциональными свойствами исследуемых комплексов. В работе ставились следующие задачи:

Научная новизна и практическая ценность работы

В данной работе методом аффинной модификации удалось определить положение З'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы. В зависимости от природы исследуемых комплексов оно было соотнесено с ранее постулированными состояниями фермента: активно транскрибирующим, постгранслокационным, арестованным и гипертранслокационным. Обнаружено новое состояние З'-конца РНК, в котором концевой нуклеотид вывернут относительно своей комплементарной пары в составе ДНК. Установлено, что две взаимоисключающие конформации «F-мостика» существуют одновременно в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы Е. coli. Предложена модель регуляции транскрипции посредством конкуренции между входящим нуклеотидом, растущим концом РНК и компонентами «F-мостика». Используя направленный точечный мутагенез, получен ряд мутаций в консервативном районе G (З'-субъединицы. Выдвинута гипотеза об участии этого района в поддержании структуры «F-мостика».

Исследована фотопришивка антибиотика рифампицина к активному центру РНК-полимеразы и сделан вывод о подвижности сегмента (3-субъединицы, содержащего His 1237. Движение этого сегмента белка может принимать участие в инициации синтеза РНК, стабилизируя и направляя вновь синтезируемый продукт.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста, включая 4 таблицы и 44 рисунка. Библиография включает в себя 182 названия, в том числе 5 русских и 177 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Эпштейн, Виталий Наумович

Выводы:

1. С помощью метода аффинной модификации зарегистрированы перемещения 3'-конца РНК в активном центре РНК-полимеразы между пост- и претранслокационными состояниями. Показано, что в случае разрушения водородных связей между З'-конецевым нуклеотидом и ДНК, этот нуклеотид может вращаться вокруг фосфодиэфирной связи не покидая активного центра.

3. Показано, что две альтернативные конформации «F-мостика» существуют в одной и той же популяции молекул РНК-полимеразы. Предложено новое - «закрытое» -состояние активного центра, в котором Lys789 Р'-субъединицы блокирует вхождение очередного нуклеотида в активный центр и останавливает синтез РНК. Изменение в структуре «F-мостика» может регулировать скорость транскрипции.

4. Установлено, что консервативный район G Р'-субъединицы играет важную роль в поддержании структуры «стенки», отделяющей главный канал от вторичного, и влияет на конформацию «F-мостика».

5. При достижении РНК длины в 6 нуклеотидов во время инициации с Т7 А2 промотора, происходит стабилизация части тройных комплексов. Стабильные инициаторные тройные комплексы способны к эффективному удлинению, пирофосфоролизу и эндонуклеотическому расщеплению РНК. Инициаторные тройные комплексы, полученные в результате пирофосфоролиза 6-нт. РНК и содержащие 4-нт. транскрипт, также проявляют высокую стабильность.

6. Контакты 5'-конца транскрипта в стабильном тройном комплексе, содержащем 6-нт. РНК, совпадают с контактами, придающими стабильность элонгационным комплексам, что указывает на общий механизм стабилизации РНК-полимеразы в инициации и элонгации. При укорочении транскрипта до 4-нт. стабилизирующие контакты не разрушаются, что в свою очередь предполагает перемещение в пространстве элемента вторичной структуры «шип» вслед за 5'-концом РНК.

7. Фотопришивка антибиотика рифампицина к району Hisl237 Р-субъединицы указывает на возможность движения этого района белка от активного центра вдоль главного канала. Предложена модель, согласно которой во время инициации His 1237 сопровождает растущий 5'-конец РНК от активного центра до участка фермента контактирующего с рифампицином.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Epshtein V., Mustaev A., Markovtsov V., Bereshchenko О., Nikiforov V., Goldfarb A. 2002. Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell., 10: 623-634.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я благодарю моего научного руководителя В.Г. Никифорова за неоценимую помощь в подготовке диссертации, а так же сотрудников лаборатории А.Д. Гольдфарба за содействие в овладевании метода ковалентной модификации белков. Хочу выразить особенную признательность А.А. Мустаеву за плодотворные дискуссии, методическую помощь и реактивные нуклеотиды без которых данная работа была бы невозможна. Я благодарю Н.В. Коржеву за предоставленный препарат РНК-полимеразы pAlal263Cys и К. Северинова за препарат РНК-полимеразы с фрагментированной р-субъединицей. Я также благодарю Ж.М. Горленко, И.А. Басс и А.В. Кульбач и некого за деятельную помощь в подготовке диссертации к защите.

Заключение

Несмотря на наличие кристаллических структур высокого разрешения, можно предположить, что выявлены далеко не все подвижные и функционально важные элементы РНК-полимеразы. Известно, к примеру, что РНК, сшитая с His 1237 (Е. coli) в активном центре РНК-полимеразы, может быть удлинена вплоть до размера в 9 нуклеотидов (Mustaev et al., 1993). Этот факт, в свою очередь, указывает на вероятную подвижность данной компоненты каталитического центра в инициации. Тем не менее, вышеупомянутый сегмент занимает сходное положение во всех известных кристаллических структурах. Такое несоответствие между биохимическими и кристаллографическими данными может быть объяснено наличием особой конформации фермента, характерной для инициации и, по всей видимости, энергетически нестабильной. Косвенным указанием на существование множественных конформационных состояний в элонгации служат опыты по измерению скорости включения в состав РНК неправильного (не соответствующего матрице) нуклеотида (Erie et al., 1993; Erie 2002). Согласно кинетическим данным существует, по крайней мере, два состояния: активированное, когда РНК-полимераза работает наиболее интенсивно, и неактивное, при котором синтез идет гораздо медленнее. Остается неясным, какие структурные изменения претерпевает РНК-полимераза при переходе от одного состояния к другому, и какие элементы структуры отвечают за этот переход. Представляется очевидным, что большинство переходных состояний фермента энергетически нестабильны и не могут быть выявлены кристаллографическими методами. Комбинация генетических и биохимических подходов может служить важным инструментом, позволяющим глубже изучить работу РНК-полимеразы и ее отдельных компонентов.

Часть II. Материалы и методы

1. Бактериальные штаммы

В работе использовали штаммы Е. coli: К-12 XLl-Blue [endAl, hsdR17 (rK- mK+), supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, dlac (F' proAB, lacIqZ, dM15, TnlO)]; RL 721, содержащий (3'-субъединицу с олигогистидиновым якорем, кодируемую хромосомной копией гена гроС (из лаборатории Роберта Лэндика, США) и AG2005, содержащий индуцируемый ген Т7 РНК-полимеразы, расположенный под контролем лактозного промотора и индуцируемый IPTG.

2. Плазмиды

В работе использовали следующие плазмиды: pLacIK (предоставлена И. Басс), рТ7(3' (Zalenskaya et al., 1990), рХТ7р (Zalenskaya et al., 1990), pT7a6His (Tang et al., 1996).

3. Питательные среды и антибиотики

Для выращивания бактериальных культур применяли среду LB. Твердые среды были получены на основе среды LB с добавлением 1.5% агара.

Использовали следующие концентрации антибиотиков: ампициллина - 100 мкг/мл, канамицина - 50 мкг/мл.

Индукция генов находящихся под контролем позднего промотора фага Т7 осуществляли путем добавления IPTG до 1 шМ концентрации. В этом случае происходила активация хромосомной копии Т7 РНК-полимеразы (ген - DE3), расположенной вслед за lac-промотором, что в свою очередь приводило к экспрессии генов под контролем фаговых промоторов.

4. Трансформация бактерий

Трансформация бактерий осуществляли методом электропорации по методике фирмы BioRad: 3 мл ночной культуры бактерий пересевали в 500 мл свежей среды LB и выращивали на соответствующем антибиотике до СЮбоо=0-5, после чего центрифугировали 5000 об/мин 5 минут, клеточный осадок ресуспендировали в 10% растворе глицерина и центрифугировали при тех же самых условиях. Осадок смешивали с 250 мл 10% глицерина и подвергали центрифугированию как раньше. Процедуру повторяли с 10 мл 10% глицерина, а затем с 5 мл 10% глицерина. Полученную клеточную массу ресуспендировали в 1 мл. 10% глицерина, распределяли по 40 мкл аликвотам и замораживали для дальнейшего использования. Все операции производили на льду, а раствор глицерина использовался стерильный и был предварительно охлажден.

Суспензию клеток в 10% глицерине помещали в охлажденную кювету для электропорации с зазором в 4 мм, и на нее подавалось напряжение в 2500 вольт с помощью электропоратора BioRad. Вслед за подачей импульса клеточную суспензию смешивали с 1 мл среды LB и инкубировали 1 час при 37°С, после чего растирали на чашках, содержащих LB агар и соответствующие антибиотики.

5. Выделение плазмидной ДНК

Выделение плазмидной ДНК осуществлялось методом щелочного лизиса. 10 мл ночной культуры центрифугировали 5 минут при 5000 об/мин, осадок ресуспендировали в 0.5 мл раствора А (50 шМ глюкоза, 25 шМ Трис-HCl рН=7.9, 10 шМ ЭДТА) и смешивали с 1 мл лизирующего раствора (1% SDS, 0.2 М NaOH). После инкубации в течение 1 минуты при комнатной температуре, смесь нейтрализовали 20 минут 0.75 мл 3 М ацетата натрия рН=4.8 и затем центрифугировали 10 минут при 10000 об/мин. Полученный супернатант смешивали с 0.5 мл 50% полиэтиленгликоля и оставляли на 20 минут. Центрифугирование повторяли в течение 10 минут и отбирали осадок, который растворяли в 200 мкл воды. К раствору добавляли 150 мкл 14 М LiCl и после 5 минут инкубации смесь центрифугировали 2 минуты при 14000 об/мин. Супернатант осаждали 3 объемами этанола 15 минут при -70°С, центрифугировали как раньше. Осадок промывали еще раз 70% этанолом, подсушивали и растворяли в 50 мкл воды. Все процедуры, кроме указанных, производились на льду, при необходимости перед лизисом добавляли РНКазу А.

6. Использование ферментов в молекулярном клонировании

При получении мутаций и клонировании ДНК фрагментов применяли эндонуклеазы, лигазу фага Т4, (3-агаразу (производства «New England Biolabs», США). Реакции проводили в условиях и буферах, рекомендованных производителем.

7. Амплификация фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Полимеразную цепную реакцию осуществляли с применением Deep Vent ДНК полимеразы (New England Biolabs) в буфере производителя, содержащем также 250 цМ раствор дезоксинуклеотидов. На 100 мкл реакционной смеси использовали 150 pmol каждого праймера, 25-100 нг ДНК и 2-4 единицы ДНК полимеразы. 30 циклов реакции амплификации ДНК осуществляли на ПЦР-амплификаторе (Perkin Elmer). Профиль цикла был следующим: 45 секунд денатурации при 94°С, 45 секунд отжига праймеров при 60°С, 1 минута полимеризации ДНК при 72°С. Для амплификации с использованием «мегапраймера» время денатурации было увеличено до 1 минуты, а для амплификации промоторной ДНК все стадии были сокращены до 30 секунд.

ДНК продукт очищали от праймеров и не включенных нуклеотидов путем электрофореза в легкоплавкой агарозе.

8. Сайт специфический мутагенез гена гроС

Для получения точечных замен в составе Р'-субъединицы использовалаи полимеразную цепную реакцию. Мутации в консервативном районе G производили путем амплификации фрагмента ДНК гена гроС между уникальными сайтами рестрикции Msc I и BstX I с использованием олигонуклеотидных праймеров (Таблица II. 1) производства Oligos Etc (США). Полученные ДНК фрагменты подвергли расщеплению по вышеупомянутым рестриктным сайтам и клонировали в плазмиду рТ7Р' вместо соответствующего фрагмента гена гроС. Полученной смесью трансформировали штамм Е. coli К-12 XLl-Blue, который не содержит гена, кодирующего РНК-полимеразу фага Т7. Для создания мутации Lys789Arg вначале получали мутантный «мегапраймер» путем амплификации фрагмента ДНК гена гроС между консервативным районом F и уникальным сайтом рестрикции Sal I (Таблица II 1). «Мегапраймер» очищали с помощью легкоплавкой агарозы и использовали во второй полимеразной цепной реакции вместе с праймером, содержащим уникальный сайт, узнаваемый рестриктазой BssH II (Таблица II 1). Полученный ДНК фрагмент подвергли обработке рестриктазами BssH II и Sal I и клонировали между соответствующими рестриктными сайтами гена гроС в плазмиде рТ7Р' взамен естественного участка ДНК. Трансформировали полученные конструкции в штамм Е. coli К-12 XLl-Blue. Наличие или отсутствие мутации определяли путем идентификации последовательности ДНК по методу Сэнгера. I

5' ТСТ CTG CAT GCG CGC GTT AAA 3' BssH II

5' ТТТ AAC CGC GTC GAC AGA 3' Sal I

5' GCA CTG AGA ACT GCG AAC 3" Lys789Arg

5' gac ctg gcg CGTGGCCAC АТС АТС aac aag 3' Msc I

5' aga tgc cgc aCCACCGATGTGGaa cgt acg Tat <

5' aga tgc cgc ACCACCGATGTGGAA cgt acg cag <

5' aga tgc cgc ACCACCGATGTGGAA cgt act cat <

5 ' aga tgc cgc PJOCACCGATGTGGAA cgc acg cat (

5' aga tgc cgc RCCACCGATGTGGGA cgt acg cat <

III

5' CGG ATA AGT AGA CAG CCT GAT AAG 3' Матричная нитъТ7 A2

5 ' CGG TTG ACG CTG СТА GTG TTA CC 3 ' Неметричкю кип T7 A2

5' CGC CAG GGT ТТТ CCC AGT CAC GAC 3' Нсматричная нить T7A1

5' AG С GGA TAA CAA TTT CAC ACAGGA 3' Матричная нить T7 Al

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Эпштейн, Виталий Наумович, Москва

1. Allison LA, Moyle М, Shales М, Ingles CJ, (1985) "Extensive homology among the largest subunits of eukaryotic and prokaryotic RNA polymerases." Cell, V.42, p. 599-610.

2. Altmann CR, Solow-Cordero DE, Chamberlin MJ. (1994) RNA cleavage and chain elongation by Escherichia coli DNA-dependent RNA polymerase in a binary enzyme.RNA complex. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 91, p. 3784-3788.

3. Archambault J, Lacroute F, Ruet A, Friesen JD. (1992) Genetic interaction between transcription elongation factor TFIIS and RNA polymerase II. Mol Cell Biol. V. 9, p. 41424152.

4. Archambault J, Friesen JD. (1993) Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III. Microbiol Rev. V. 57, p. 703-724.

5. Arndt KM, Chamberlin MJ. (1990) RNA chain elongation by Escherichia coli RNA polymerase. Factors affecting the stability of elongating ternary complexes. J Mol Biol. V. 213 p. 79-108.

6. Arthur TM, Anthony LC, Burgess RR. (2000) Mutational analysis of beta '260-309, a sigma 70 binding site located on Escherichia coli core RNA polymerase. J Biol Chem. V. 275, p. 23113-23119.

7. Artsimovitch I, Landick R. (2000) Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 97, p. 7090-7095.

8. Baikalov I, Schroder I, Kaczor-Grzeskowiak M, Grzeskowiak K, Gunsalus RP, Dickerson RE. (1996) Structure of the Escherichia coli response regulator NarL. Biochemistry. V. 35, p. 11053-11061.

9. Bar-Nahum G, Nudler E. (2001) Isolation and characterization of sigma (70)-retaining transcription elongation complexes from Escherichia coli. Cell. V. 106, p. 443-451.

10. Bartlett MS, Gaal T, Ross W, Gourse RL. (1998) RNA polymerase mutants that destabilize RNA polymerase-promoter complexes alter NTP-sensing by rrn PI promoters. J Mol Biol. V. 279, p. 331-345.

11. Bartolomei MS, Corden JL. (1987) Localization of an alpha-amanitin resistance mutation in the gene encoding the largest subunit of mouse RNA polymerase II. Mol Cell Biol. V.7, p. 586-594.

12. Borukhov S, Lee J, Goldfarb A. (1991) Mapping of a contact for the RNA 3' terminus in the largest subunit of RNA polymerase. J Biol Chem. V. 266, p. 23932-23935.

13. Borukhov S, Polyakov A, Nikiforov V, Goldfarb A. (1992) GreA protein: a transcription elongation factor from Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A V. 89, p. 8899-8902.

14. Borukhov S, Goldfarb A. (1993) Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr Purif. V.6, p. 503-511.

15. Borukhov S, Sagitov V, Goldfarb A. (1993) Transcript cleavage factors from E. coli. Cell. V. 72, p. 459-466.

16. Bouche, J. P., Zechel, K., and Kornberg, A (1975) "DnaG gene product, a rifampicin-resistant RNA polymerase, initiates the conversion of a single-stranded coliphage DNA to its duplex replicative form." J. Biol. Chem, V.250, p. 5995-6001.

17. Buckle M, Pemberton IK, Jacquet MA, Buc H. (1999) The kinetics of sigma subunit directed promoter recognition by E. coli RNA polymerase. J Mol Biol. V. 285, p. 955-964.

18. Burgess RR. (1969) "Separation and characterization of the subunits of ribonucleic acid polymerase." J Biol Chem, V. 244, p. 6168-6176.

19. Burmeister M, Monaco AP, Gillard EF, van Oramen GJ, Affara NA, Ferguson-Smith MA, Kunkel LM, Lehrach H. (1988) A 10-megabase physical map of human Xp21, including the Duchenne muscular dystrophy gene. Genomics.V. 3, p. 189-202.

20. Bushnell DA, Cramer P, Kornberg RD. (2002) Structural basis of transcription: alpha-amanitin-RNA polymerase II cocrystal at 2.8 A resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 99, p.1218-1222.

21. Callaci S, Heyduk E, Heyduk T. (1999) Core RNA polymerase from E. coli induces a major change in the domain arrangement of the sigma 70 subunit. Mol Cell. V. 3, p. 229-238.

22. Campbell EA, Darst SA. (2000) The anti-sigma factor SpoIIAB forms a 2:1 complex with sigma (F), contacting multiple conserved regions of the sigma factor. J Mol Biol. V. 300, p. 17-28.

23. Campbell EA, Korzheva N, Mustaev A, Murakami K, Nair S, Goldfarb A, Darst SA. (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial rna polymerase. Cell. V. 104, p. 901-912.

24. Campbell EA, Muzzin O, Chlenov M, Sun JL, Olson CA, Weinman O, Trester-Zedlitz ML, Darst SA. (2002) Structure of the bacterial RNA polymerase promoter specificity sigma subunit. Mol Cell. V. 9, p. 527-539.

25. Carpousis AJ, Gralla JD. (1980) Cycling of ribonucleic acid polymerase to produce oligonucleotides during initiation in vitro at the lac UV5 promoter. Biochemistry. V. 19, p. 3245-3253.

26. Chamberlin MJ. (1974) "The selectivity of transcription. "Annu Rev Biochem, V. 43, p. 721775.

27. Chamberlin MJ. (1995) New models for the mechanism of transcription elongation and its regulation. Harvey Lect. V. 88, p. 1-21.

28. Chen YF, Helmann JD. (1995) The Bacillus subtilis flagellar regulatory protein sigma D: overproduction, domain analysis and DNA-binding properties. J Mol Biol. V. 249, p. 743753.

29. Cheng SW, Lynch EC, Leason KR, Court DL, Shapiro В A, Friedman DI. (1991) Functional importance of sequence in the stem-loop of a transcription terminator. Science. V. 254, p. 1205-1207.

30. Cheong JH, Yi M, Lin Y, Murakami S. (1995) Human RPB5, a subunit shared by eukaryotic nuclear RNA polymerases, binds human hepatitis В virus X protein and may play a role in X transactivation. EMBO J. V. 14, p. 143-150.

31. Cooke R. The mechanism of muscle contraction. CRC Crit Rev Biochem. 1986, V. 21, p. 53118.

32. Cowing DW, Mecsas J, Record MT Jr, Gross CA. (1989) Intermediates in the formation of the open complex by RNA polymerase holoenzyme containing the sigma factor sigma 32 at the groE promoter. J Mol Biol. V. 210, p. 521-530.

33. Cramer P, Bushnell DA, Fu J, Gnatt AL, Maier-Davis B, Thompson NE, Burgess RR, Edwards AM, David PR, Kornberg RD. (2000) Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. V. 288, p. 640-649.

34. Cramer P, Bushnell DA, Kornberg RD. (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science. V. 292, p. 1863-1876.

35. Delgado, M. A., Rintoul, M. R., Farias, R. N. and Salomon, R. A. (2001) J. Bacteriol. V. 183, p. 4543-4550.

36. Daniels D, Zuber P, Losick R. (1990) Two amino acids in an RNA polymerase sigma factor involved in the recognition of adjacent base pairs in the -10 region of a cognate promoter. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 87, p. 8075-8079.

37. Darst SA, Kubalek EW, Kornberg RD. (1989) Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. V. 340, p. 730-732.

38. Darst SA, Edwards AM, Kubalek EW, Kornberg RD. (1991) Three-dimensional structure of yeast RNA polymerase II at 16 A resolution. Cell. V. 66, p. 121-128.

39. Darst SA, Polyakov A, Richter C, Zhang G. (1998a) Insights into Escherichia coli RNA polymerase structure from a combination of x-ray and electron crystallography. J Struct Biol. V. 124, p. 115-122.

40. Darst SA, Polyakov A, Richter C, Zhang G. (1998b) Structural studies of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. V. 63, p. 269-276.

41. Dombroski AJ, Walter WA, Record MT Jr, Siegele DA, Gross CA. (1992) Polypeptides containing highly conserved regions of transcription initiation factor sigma 70 exhibit specificity of binding to promoter DNA. Cell. V. 70, p. 501-512.

42. Dorjsuren D, Lin Y, Wei W, Yamashita T, Nomura T, Hayashi N, Murakami S. (1998) RMP, a novel RNA polymerase II subunit 5-interacting protein, counteracts transactivation by hepatitis В virus X protein. Mol Cell Biol. V. 18, p. 7546-7555.

43. Erie DA, Hajiseyedjavadi O, Young MC, von Hippel PH. (1993) Multiple RNA polymerase conformations and GreA: control of the fidelity of transcription. Science. V. 262, p. 867-873.

44. Erie D. (2002) The many conformational states of RNA polymerase elongation complexes and their roles in the regulation of transcription. Biochim Biophys Acta. V. 1577, p. 224-239.

45. Farnham,P.J. and Piatt,T. (1981) Rho-independent termination: dyad symmetry in DNA causes RNA polymerase to pause during transcription in vitro. Nucleic Acids Res., V. 9, p. 563-577.

46. Fenton MS, Lee SJ, Gralla JD. (2000) Escherichia coli promoter opening and -10 recognition: mutational analysis of sigma70. EMBO J. V. 19, p. 1130-1137.

47. Furter-Graves EM, Furter R, Hall BD. (1991) SHI, a new yeast gene affecting the spacing between TATA and transcription initiation sites. Mol Cell Biol. V. 11, p. 4121-4127.

48. Furter-Graves EM, Hall BD, Furter R. (1994) Role of a small RNA pol II subunit in TATA to transcription start site spacing. Nucleic Acids Res. V. 22, p. 4932-4936.

49. Gardella T, Moyle H, Susskind MM. (1989) A mutant Escherichia coli sigma 70 subunit of RNA polymerase with altered promoter specificity. J Mol Biol. V. 206, p. 579-590.

50. Грачев M.A., Мустаев A.A., Колычева Т.Н. (1985) Идентификация гистидинового остатка в активном центре Escherichia coli РНК-полимеразы. Док. Акад. Наук СССР. Т. 281, стр. 723-727.

51. Geiselmann J, Wang Y, Seifried SE, von Hippel PH. (1993) A physical model for the translocation and helicase activities of Escherichia coli transcription termination protein Rho. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 90, p. 7754-7758.

52. Gnatt AL, Cramer P, Fu J, Bushnell DA, Kornberg RD. (2001) Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science. V. 292, p. 1876-1882.

53. Gotta SL, Miller OL Jr, French SL. (1991) rRNA transcription rate in Escherichia coli. J Bacteriol. V. 173, p. 6647-6649.

54. Gralla JD, Carpousis AJ, Stefano JE. (1980) Productive and abortive initiation of transcription in vitro at the lac UV5 promoter. Biochemistry. V. 25, p. 5864-5869

55. Gribskov M, Burgess RR. (1986) Sigma factors from E. coli, B. subtilis, phage SP01, and phage T4 are homologous proteins. Nucleic Acids Res. V. 14, p. 6745-6763.

56. Gross C.A., Lonetto M., Losick R. (1992) Bacterial sigma factors. In transcription regulation, K. Yamamoto and S. McKnight, eds. (Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory).

57. Guajardo R, Sousa R. (1997) A model for the mechanism of polymerase translocation. J Mol Biol. V. 265, p.8-19.

58. Gusarov,I. and Nudler,E. (1999) The mechanism of intrinsic transcription termination. Mol. Cell, V. 3, p. 495-504.

59. Hansen UM, McClure WR. (1980) Role of the sigma subunit of Escherichia coli RNA polymerase in initiation. II. Release of sigma from ternary complexes. J Biol Chem. V. 255, p. 9564-9570.

60. Hawley DK, McClure WR. (1982) Mechanism of activation of transcription initiation from the lambda PRM promoter. J Mol Biol V. 157, p. 493-525

61. Heyduk T, Heyduk E, Severinov K, Tang H, Ebright RH. (1996) Determinants of RNA polymerase alpha subunit for interaction with beta, beta', and sigma subunits: hydroxyl-radical protein footprinting. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 93, p. 10162-10166.

62. Hsu LM, Vo NV, Chamberlin MJ. (1995) Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB stimulate promoter escape and gene expression in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 92, p. 11588-11592.

63. Huang X, Lopez de Saro FJ, Helmann JD. (1997) sigma factor mutations affecting the sequence-selective interaction of RNA polymerase with -10 region single-stranded DNA. Nucleic Acids Res. V. 25, p. 2603-2609.

64. Ishihama A. (1981) Subunit of assembly of Escherichia coli RNA polymerase. Adv Biophys, V. 14, p.1-35.

65. Ishihama A. (2000) Functional modulation of Escherichia coli RNA polymerase. Annu Rev Microbiol. V. 54, p. 499-518.

66. Janin J, Miller S, Chothia C. (1988) Surface, subunit interfaces and interior of oligomeric proteins. J Mol Biol. V. 204, p. 155-164.

67. Jokerst RS, Weeks JR, Zehring WA, Greenleaf AL. (1989) Analysis of the gene encoding the largest subunit of RNA polymerase II in Drosophila. Mol Gen Genet. V. 215, p. 266-275.

68. Jones CH, Moran CP Jr. (1992) Mutant sigma factor blocks transition between promoter binding and initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 89, p. 1958-1962.

69. Joo DM, Ng N, Calendar R. (1997) A sigma32 mutant with a single amino acid change in the highly conserved region 2.2 exhibits reduced core RNA polymerase affinity. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 94, p. 4907-4912.

70. Joyce CM, and Steitz ТА (1994) Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu Rev Biochem, V. 63, p. 777-822

71. Juang YL, Helmann JD. (1994) A promoter melting region in the primary sigma factor of Bacillus subtilis. Identification of functionally important aromatic amino acids. J Mol Biol. V. 235, p. 1470-1488.

72. Kashlev M, Martin E, Polyakov A, Severinov K, Nikiforov V, Goldfarb A. (1993) Histidine-tagged RNA polymerase: dissection of the transcription cycle using immobilized enzyme. Gene. V. 130, p. 9-14.

73. Kassavetis GA, Geiduschek EP. (1993) RNA polymerase marching backward. V. 259, p.944-945.

74. Keilty S, Rosenberg M. (1987) Constitutive function of a positively regulated promoter reveals new sequences essential for activity. J Biol Chem. V. 262, p. 6389-6395.

75. Kenney TJ, Moran CP Jr. (1991) Genetic evidence for interaction of sigma A with two promoters in Bacillus subtilis. J Bacteriol. V. 173, p. 3282-3290.

76. Kimura M, Ishiguro A, Ishihama A. (1997) RNA polymerase II subunits 2, 3, and 11 form a core subassembly with DNA binding activity. J Biol Chem. V. 272, p. 25851-25855.

77. Komissarova N, Kashlev M. (1997 a) Transcriptional arrest: Escherichia coli RNA polymerase translocates backward, leaving the 3' end of the RNA intact and extruded. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 94, p. 1755-1760.

78. Komissarova N, Kashlev M. (1997 b) RNA polymerase switches between inactivated and activated states By translocating back and forth along the DNA and the RNA.J Biol Chem. V. 272, p. 15329-15338.

79. Kong XP, Onrust R, O'Donnell M, Kuriyan J. (1992) Three-dimensional structure of the beta subunit of E. coli DNA polymerase III holoenzyme: a sliding DNA clamp. Cell. V. 69, p. 425-437.

80. Korzheva N, Mustaev A, Nudler E, Nikiforov V, Goldfarb A. (1998) Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. V. 63, p. 337-345.

81. Korzheva N, Mustaev A, Kozlov M, Malhotra A, Nikiforov V, Goldfarb A, Darst SA. (2000) A structural model of transcription elongation. Science. V. 289, p. 619-625.

82. Krummel B, Chamberlin MJ (1989 ) RNA chain initiation by Escherichia coli RNA polymerase. Structural transitions of the enzyme in early ternary complexes. Biochemistry, V. 28, p. 7829-7842.

83. Kubori T, Shimamoto N. (1996) A branched pathway in the early stage of transcription by Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol. V. 256, p. 449-457.

84. Kumar A, Malloch RA, Fujita N, Smillie DA, Ishihama A, Hayward RS. (1993) The minus 35-recognition region of Escherichia coli sigma 70 is inessential for initiation of transcription at an "extended minus 10" promoter. J Mol Biol. V. 232, p. 406-418.

85. Kuriyan J, O'Donnell M. (1993) Sliding clamps of DNA polymerases. J Mol Biol. V. 234, p. 915-925.

86. Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. V. 227, p. 680-685.

87. Landick R. (1997) RNA polymerase slides home: pause and termination site recognition. Cell. V. 88, p. 741-744.

88. Levin JR, Krummel B, Chamberlin MJ. (1987) Isolation and properties of transcribing ternary complexes of Escherichia coli RNA polymerase positioned at a single template base. J Mol Biol. V. 196, p. 85-100.

89. Lo Conte L, Chothia C, Janin J. (1999) The atomic structure of protein-protein recognition sites. J Mol Biol. V. 285, p. 2177-2198.

90. Lynn SP, Kasper LM, Gardner JF. (1988) Contributions of RNA secondary structure and length of the thymidine tract to transcription termination at the thr operon attenuator. J Biol Chem. V. 263, p. 472-479.

91. Malhotra A, Severinova E, Darst SA. (1996) Crystal structure of a sigma 70 subunit fragment from E. coli RNA polymerase. Cell. V. 87, p. 127-136.

92. Markovtsov V, Mustaev A, Goldfarb A. (1996) Protein-RNA interactions in the active center of transcription elongation complex. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 93, p. 3221-3226.

93. Marr MT, Roberts JW. (1997) Promoter recognition as measured by binding of polymerase to nontemplate strand oligonucleotide. Science. V. 276, p. 1258-1260.

94. Masai H, Arai K. (1996) Mechanisms of primer RNA synthesis and D-loop/R-loop-dependent DNA replication in Escherichia coli. Biochimie. V. 78, p. 1109-1117.

95. McClure WR, Cech CL. (1978) On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. J Biol Chem. V. 253, p. 8949-8956.

96. McClure WR, Cech CL, Johnston DE. (1978) A steady state assay for the RNA polymerase initiation reaction. J Biol Chem. V. 253, p. 8941-8948.

97. McClure WR. (1985) Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem. V. 54, p. 171-204.

98. McHenry CS. (1991) DNA polymerase III holoenzyme. Components, structure, and mechanism of a true replicative complex. J Biol Chem. V. 266, p. 19127-19130.

99. Mecsas J, Cowing DW, Gross С A. (1991) Development of RNA polymerase-promoter contacts during open complex formation. J Mol Biol. V. 220, p. 585-597.

100. Miyao T, Woychik NA. (1998) RNA polymerase subunit RPB5 plays a role in transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci U S A V. 95, p. 15281-15286.

101. Mooney R. A., Artsimovitch I., and Landick R. (1998) Information Processing by RNA Polymerase: Recognition of Regulatory Signals during RNA Chain Elongation V. 180, p.r 3265-3275.

102. Muller CW, Rey FA, Sodeoka M, Verdine GL, Harrison SC. (1995) Structure of the NF-kappa В p50 homodimer bound to DNA. Nature. V. 373, p. 311-317.

103. Murakami KS, Masuda S, Darst SA. (2002a) Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science. V. 296, p. 1280-1284.

104. Murakami KS, Masuda S, Campbell EA, Muzzin O, Darst SA. (2002b) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science. V. 296, p. 1285-1290.г

105. Mustaev A, Kashlev M, Lee JY, Polyakov A, Lebedev A, Zalenskaya K, Grachev M, Goldfarb A, Nikiforov V. (1991) Mapping of the priming substrate contacts in the active center of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. V. 266, p. 23927-23931.

106. Mustaev A, Kashlev M, Zaychikov E, Grachev M, Goldfarb A. (1993) Active center4 rearrangement in RNA polymerase initiation complex. J Biol Chem. V. 268, p. 19185-19187.

107. Mustaev A, Zaychikov E, Severinov K, Kashlev M, Polyakov A, Nikiforov V, Goldfarb A. (1994) Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 91, p. 12036-12040.

108. Nagai H, Shimamoto N. (1997) Regions of the Escherichia coli primary sigma factor sigma70 that are involved in interaction with RNA polymerase core enzyme. Genes Cells. V. 2, p. 725-734.

109. Naryshkin N, Revyakin A, Kim Y, Mekler V, Ebright RH. (2000) Structural organization of the RNA polymerase-promoter open complex. Cell. V. 101, p. 601-611.

110. Nudler E, Avetissova E, Markovtsov V, Goldfarb A. (1996) Transcription processivity: protein-DNA interactions holding together the elongation complex. Science. V. 273, p. 211217.

111. Nudler E, Mustaev A, Lukhtanov E, Goldfarb A. (1997) The RNA-DNA hybrid maintains the register of transcription by preventing backtracking of RNA polymerase. Cell. V. 89, p. 33-41.

112. O'Donnell M, Kuriyan J, Kong XP, Stukenberg PT, Onrust R. (1992) The sliding clamp of DNA polymerase III holoenzyme encircles DNA. Mol Biol Cell. V. 3, p. 953-957.

113. Orlova M, Newlands J, Das A, Goldfarb A, Borukhov S. (1995) Intrinsic transcript cleavage activity of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 92, p. 4596-4600.

114. Peskin CS, Odell GM, Oster GF. (1993) Cellular motions and thermal fluctuations: the Brownian ratchet. Biophys J. V. 65, p. 316-324.

115. Polyakov A, Severinova E, Darst SA. (1995) Three-dimensional structure of E. coli core RNA polymerase: promoter binding and elongation conformations of the enzyme. Cell. V. 83, p. 365-373.

116. Polyakov A, Richter C, Malhotra A, Koulich D, Borukhov S, Darst SA. (1998) Visualization of the binding site for the transcript cleavage factor GreB on Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol. V. 281, p. 465-473.

117. Reeder TC, Hawley DK. (1996) Promoter proximal sequences modulate RNA polymerase II elongation by a novel mechanism. Cell V. 87, p. 767-777.

118. Rees WA, Keller RW, Vesenka JP, Yang G, Bustamante C. (1993) Evidence of DNA bending in transcription complexes imaged by scanning force microscopy. Science. V. 260, p. 1646-1649.

119. Rhodius VA, Busby SJ. (1998) Positive activation of gene expression. Curr Opin Microbiol. V. 2, p. 152-159.

120. Rice GA, Kane CM, Chamberlin MJ. (1991) Footprinting analysis of mammalian RNA polymerase II along its transcript: an alternative view of transcription elongation. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 88, p. 4245-4249.

121. Riva M, Carles C, Sentenac A, Grachev MA, Mustaev AA, Zaychikov EF. (1990) Mapping the active site of yeast RNA polymerase В (II). J Biol Chem. V. 265, p. 1649816503.

122. Roberts J.W. (1969) Termination factor for RNA synthesis. Nature. V. 224, p. 11681174.

123. Ross W, Gosink KK, Salomon J, Igarashi K, Zou C, Ishihama A, Severinov K, Gourse RL. (1993) A third recognition element in bacterial promoters: DNA binding by the alpha subunit of RNA polymerase. Science. V. 262, p. 1407-1413.

124. Rowen L. and Kornberg A., (1978) "Primase, the dnaG protein of Escherichia coli. An enzyme which starts DNA chains." J. Biol. Chem, V. 253, p. 758-764.

125. Розовская Т.А., Чечник А.А., Бибилашвили P.С. (1981a) Реакция пирофосфоролиза, катализируемая РНК-полимеразой Escherichia coli. Молекулярная Биология. Т. 15, стр. 636.

126. Розовская Т.А., Чечник А.А., Тарусова Н.Б., Бибилашвили Р.С., Хомутов P.M. (19816) Аналоги пирофосфата в реакции пирофосфоролиза, катализируемой РНК-полимеразой Escherichia coli. Молекулярная Биология. Т. 15, стр. 1205.

127. Rozovskaya ТА, Chenchik АА, Beabealashvilli RSh. (1982) Processive pyrophosphorolysis of RNA by Escherichia coli RNA polymerase. FEBS Lett. V. 137, p. 100-104.

128. Schickor P, Metzger W, Werel W, Lederer H, Heumann H. (1990) Topography of intermediates in transcription initiation of E.coli. EMBO J. V. 9, p. 2215-2220.

129. Schultz P, Celia H, Riva M, Sentenac A, Oudet P. (1993) Three-dimensional model of yeast RNA polymerase I determined by electron microscopy of two-dimensional crystals. EMBO J. V. 12, p. 2601-2607.

130. Sen R, Nagai H, Hernandez VJ, Shimamoto N. (1998) Reduction in abortive transcription from the lambdaPR promoter by mutations in region 3 of the sigma70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. V. 273, p. 9872-9877.

131. Sen R, Nagai H, Shimamoto N. (2001) Conformational switching of Escherichia coli RNA polymerase-promoter binary complex is facilitated by elongation factor GreA and GreB. Genes Cells. V.5, p. 389-401.

132. Sensi P. (1983) History of the development of rifampin. Rev Infect Dis. V. 3, p. 402406.

133. Severinov K, Fenyo D, Severinova E, Mustaev A, Chait ВТ, Goldfarb A, Darst SA.1994) The sigma subunit conserved region 3 is part of "5'-face" of active center of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. V. 269, p. 20826-20828.

134. Severinov K, Markov D, Severinova E, Nikiforov V, Landick R, Darst SA, Goldfarb A.1995) Streptolydigin-resistant mutants in an evolutionarily conserved region of the beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem V. 270, p. 23926-23929.

135. Severinova E, Severinov K, Fenyo D, Marr M, Brody EN, Roberts JW, Chait ВТ, Darst SA. (1996) Domain organization of the Escherichia coli RNA polymerase sigma 70 subunit. J Mol Biol. Nov V. 263, p. 637-647.

136. Sharp MM, Chan CL, Lu CZ, Marr MT, Nechaev S, Merritt EW, Severinov K, Roberts JW, Gross CA. (1999) The interface of sigma with core RNA polymerase is extensive, conserved, and functionally specialized. Genes Dev. V. 13, p. 3015-3026.

137. Siebenlist U, Gilbert W. (1980) Contacts between Escherichia coli RNA polymerase and an early promoter of phage T7. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 77 p. 122-126.

138. Siegele DA, Hu JC, Walter WA, Gross CA. (1989) Altered promoter recognition by mutant forms of the sigma 70 subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol. V. 206, p. 591-603.

139. Smiley BL, Lupski JR, Svec PS, McMacken R, Godson GN., (1982) "Sequences of the Escherichia coli dnaG primase gene and regulation of its expression." Proc Natl Acad Sci U S A. V. 79, p. 4550-4554.

140. Sosunov V, Sosunova E, Mustaev A, Bass I, Nikiforov V, Goldfarb A. (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J. V. 22, p. 2234-2244.

141. Спирин A. C., (2002) РНК-полимераза как молекулярная машина. Молекулярная Биология. Т.36, стр. 208-215.

142. Stragier Р, Parsot С, Bouvier J. (1985) Two functional domains conserved in major and alternate bacterial sigma factors. FEBS Lett. V. 187, p. 11-15.

143. Straney DC, Crothers DM. (1987) A stressed intermediate in the formation of stably initiated RNA chains at the Escherichia coli lac UV5 promoter. J Mol Biol. V. 193, p. 267278.

144. Sweetser D, Nonet M, Young RA. (1987) "Prokaryotic and eukaryotic RNA polymerases have homologous core subunits." Proc Natl Acad Sci U S A, V. 84, p. 1192-1196.

145. Tang H, Severinov К, Goldfarb A, Ebright RH. (1995) Rapid RNA polymerase genetics: one-day, no-column preparation of reconstituted recombinant Escherichia coli RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 92, p. 4902-4906.

146. Uptain SM, Kane CM, Chamberlin MJ. (1997) Basic mechanisms of transcript elongation and its regulation. Annu Rev Biochem. V. 66, p. 117-172.

147. Vassylyev DG, Sekine S, Laptenko O, Lee J, Vassylyeva MN, Borukhov S, Yokoyama S. (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature. V. 417, p. 712-719.

148. Vuthoori S, Bowers CW, McCracken A, Dombroski AJ, Hinton DM. (2001) Domain 1.1 of the sigma(70) subunit of Escherichia coli RNA polymerase modulates the formation of stable polymerase/promoter complexes. J Mol Biol. V. 309, p. 561-572.

149. Waldburger C, Gardella T, Wong R, Susskind MM. (1990) Changes in conserved region 2 of Escherichia coli sigma 70 affecting promoter recognition. J Mol Biol. V. 215, p. 267276.

150. Wang MD, Schnitzer MJ, Yin H, Landick R, Gelles J, Block SM. (1998) Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. V. 282, p. 902-907.

151. Weilbaecher R, Hebron C, Feng G, Landick R. Termination-altering amino acid substitutions in the beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase identify regions involved in RNA chain elongation. Genes Dev. (1994) V. 23, p. 2913-2927.

152. Wilson,K.S. and von Hippel,P.H. (1995) Transcription termination at intrinsicv terminators: The role of the RNA hairpin. Proc. Natl Acad. Sci. USA, V. 92, p. 8793-8797

153. Wu FY, Yarbrough LR, Wu CW. (1976) Conformational transition of Escherichia coli RNA polymerase induced by the interaction of sigma subunit with core enzyme. Biochemistry. V. 15, p. 3254-3258.

154. Wu J, Awrey DE, Edwards AM, Archambault J, Friesen JD. (1996) In vitro characterization of mutant yeast RNA polymerase II with reduced binding for elongationfactor TFIIS. Proc Natl Acad Sci U S A. V. 93, p. 11552-11557.

155. Yager TD, von Hippel PH. (1991) A thermodynamic analysis of RNA transcriptelongation and termination in Escherichia coli. Biochemistry. V. 30, p. 1097-1118.

156. Young В A, Gruber TM, Gross CA. (2002) Views of transcription initiation. Cell. V. 109, p. 417-420.

157. Zalenskaya K, Lee J, Gujuluva CN, Shin YK, Slutsky M, Goldfarb A. (1990) Recombinant RNA polymerase: inducible overexpression, purification and assembly of Escherichia coli rpo gene products. Gene. V. 89, p. 7-12.

158. Zaychikov E, Martin E, Denissova L, Kozlov M, Markovtsov V, Kashlev M, Heumann H, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (1996) Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science. V. 273, p. 107-109.

159. Zhang G, Campbell EA, Minakhin L, Richter C, Severinov K, Darst SA. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Cell. V. 98, p. 811-824.

160. Zuber P, Healy J, Carter HL 3rd, Cutting S, Moran CP Jr, Losick R. (1989) Mutation changing the specificity of an RNA polymerase sigma factor. J Mol Biol. V. 206, p. 605-614.

Информация о работе

Эпштейн, Виталий Наумович
кандидата биологических наук
Москва, 2003
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение подвижности транскрипционных комплексов методом аффинной модификации - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы