Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В.А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

КУКАРИН Александр Вячеславович

Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в Институте Молекулярной Биологии им. В.А. Энгельгардта РАН ^Москва) и в Медицинском центре государственного университета штата Нью-Йорк (Бруклин, США)

Официальные опоненты:

доктор химических наук, профессор Громова Е.С.

доктор химических наук, профессор Костров C.B.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А.Овчинниковэ РАН

Защита состоится » С^Х^М 2003 г. в часов на заседании диссертационного совета Д002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул.Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан «*!$ » tMjtfiS^X 20031

Учёный секретарь Диссертационного кандидат химических наук

А.М. Крицын

Актуальность темы. Изучение механизмов экспрессии генетической информации является одним из наиболее актуальных направлений в современной молекулярной биологии. Нарушения процессов экспрессии приводят к снижению жизнеспособности (болезням) или легальны. По данной тематике проводятся широкие исследования в мировых научных центрах. Первый этап экспрессии генов, транскрипция, осуществляется ДНК-зависимыми РНК полимеразами (РНКП), которые присутствуют у всех известных клеточных организмов и многих вирусов. Общепринято разделять РНКП на две группы: многосубъединичные и односубъединичные. Сложные многосубъединичные РНКП характерны для клеточных организмов, односубъединичные кодируются геномами некоторых вирусов и бактериофагов. Бактериофаг Т7 ЕвсЬегШа со// кодирует собственную РНКП для экспрессии средних и поздних генов. Этот белок, молекулярной массой 98 кДа, содержит одну полипептидную цепь, в отличие от многосубъединичных ферментов клеточных организмов. В то же время РНК полимераза фага Т7 обладает всеми функциями, необходимыми для полноценного синтеза РНК. Совпадение этапов транскрипции, сходство организации транскрипционных комплексов и наличие функционально гомологичных элементов в структурах РНК полимераз у всех организмов позволяют говорить о единообразии механизма транскрипции в природе. Универсальность транскрипционного аппарата наряду с относительно простым устройством фаговых РНК полимераз позволили ферменту фага Т7 занять уникальное место среди классических моделей для изучения транскрипции. Там, где результаты исследований многосубъединичных полимераз оказываются трудно интерпретируемыми, изучение 77 РНКП позволяет выявить основные детали протекания транскрипционного цикла и понять принципы транскрипционного механизма в целом.

В транскрипционном цикле различают три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На первой стадии транскрипции РНК полимераза узнаёт специфическую последовательность промотора. После связывания фермента происходит разделение цепей ДНК на инициаторном участке и начинается синтез РНК транскрипта. После нескольких

циклов продуцирования абортивных продуктов происходит переход к элонгации. На этой стадии происходит удлинение РНК до тех пор, пока фермент не встретит сигнал терминации, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса и высвобождению готового РНК- продукта. Последние исследования позволили сделать качественный скачок в проблеме понимания процесса элонгации. В то же время наибольший интерес, как менее изученные, представляют стадии инициации и терминации.

Цели работы и задачи исследования. Целями данной работы являлось разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК полимеразы фага Т7 и выяснение принципа действия терминатора из гена предшественника гормона паращитовидной железы человека (ПТГ)- В процессе исследований решались следующие задачи (а) определение влияния связывания фермента с ДНК на эффективность инициации; (б) определение минимальной длины связывающего участка одноцепочечного промотора, при которой происходит инициация; (в) выявление возможных иных функций участка связывания; (г) моделирование взаимодействия фермента с одноцепочечным промотором при добавлении двуцепочечного олигонуклеотида, содержащего участок связывания промотора; (д) определение последовательности ДНК, необходимой для функционирования ПТГ терминатора; (е) выявление структуры ДНК, необходимой для функционирования ПТГ терминатора.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что участок связывания промотора несёт другую важную функцию, помимо связывающей - активацию полимеразы в транскрипционно-компетентное состояние. Продемонстрирована ранее не описанная возможность физического разделения участков связывания и инициации для промотора Т7 РНКП. Впервые показано, что Т7 РНКП инициирует синтез РНК на одноцепочечной ДНК, содержащей промотор.

Впервые определена минимальная нуклеотидная последовательность нового типа терминационного сигнала РНК полимеразы бактериофага Т7 (АТСТСТТ в нематричной цепи). При мутации в любом из положений этого консенсуса терминации не происходит.

Впервые продемонстрировано, что для терминации абсолютно необходимо наличие нематричной цепи в районе терминатора, иными словами двуспиральности ДНК. Даже при незначительных нарушениях непрерывности нематричной цепи (разрыва с отсутствием одного нуклеотида) перед терминатором эффективность терминации значительно снижается.

Полученные результаты позволяют составить представление о действии участка связывания промотора в процессе инициации транскрипции РНК полимеразы бактериофага Т7, а также терминации на сайтспецифическом терминаторе из гена предшественника паратироидного гормона человека. Эти новые факты вносят важный вклад в представления об инициации и терминации транскрипции.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 75 страницах машинописного текста и содержит 24 рисунка и таблицу. Библиография включает в себя 63 названия, в том числе 2 отечественных и 61 зарубежное.

Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были представлены на следующих научных конференциях:

1. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, 1998.

2. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, 2000.

3. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, 2002.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Разделение связывающей и иниииаторной функций промотора РНК полимеразы фага Т7.

Так же, как и промоторы других РНК полимераз, промотор РНК полимеразы фага Т7 состоит из двух функциональных частей: участка связывания (от -17 до -5 относительно старта транскрипции) и инициаторного участка, расположенного ниже по цепи ДНК (от -4 до +6). Связывающий участок обеспечивает специфическое узнавание последовательности промотора ферментом, в то время как в районе инициаторного участка происходит разъединение цепей ДНК для обеспечения начального этапа синтеза РНК.

Различные исследования указывают на независимое функционирование участка связывания и инициаторного участка и, следовательно, возможность их физического разделения при сохранении функциональности промотора. Так, фрагмент ДНК, содержащий только участок связывания, характеризуется большей эффективностью связывания с РНК полимеразой, чем полная последовательность промотора. Нарушение двуспиральной структуры ДНК на участке связывания промотора приводит к резкому снижению эффективности связывания РНК полимеразы. В частности, при удалении нематричной цепи происходит полная потеря связывания. В то же время, удаление нематричной цепи в районе инициаторного участка, что приводит к образованию частично однонитевого промотора, не приводит к потере промотором инициаторной функции. РНК полимераза эффективно инициирует транскрипцию с адекватной точностью на подобном искусственно «расплавленном» промоторе, как и при инициации на нормальном двуцепочечном промоторе. По данным рентгено-структурного анализа комплекса РНК полимеразы фага Т7 с промотором, а также инициаторного комплекса, где осуществлён синтез трёх первых нуклеозидов РНК- продукта, два участка промотора взаимодействуют с удалёнными друг от друга структурными элементами фермента. Кроме того, описаны структурные изменения, нарушающие связь между участками промотора, но не препятствующие инициации:

например, введение безнуклеозидных связей в фосфатный остов ДНК матричной цепи в последовательности инициаторного участка, разрыв связи сахарофосфатного остова, либо даже удаление части матричной цепи. Исходя из этих фактов было сделано предположение, что участки промотора можно функционально разделить. Для достижения этой цели можно наследовать инициацию на однонитевой матрице. РНК полимераза фага Т7 не может использовать одноцепочечную промоторную ДНК в качестве матрицы, так как фермент обладает низкой аффинностью к однонитевой ДНК промотора. В то же время считается, что основная функция участка связывания промотора состоит в пространственном сближении полимеразы с инициаторным участком. Однако, участок связывания не выполняет этой функции в одноцепочечном виде. Если функцию сближения передать независимому участку ДНК и взаимодействующему с ним белку, то возможно Т7 РНК полимераза сможет инициировать на однонитевой матрице.

Приближения РНК полимеразы к однонитевому промотору при помощи ДНК связывающего домена белка ваИ не достаточно для инициации транскрипции

Для увеличения аффинности полимеразы к одноцепочечной ДНК был использован химерный белок Са14-Т7, в котором к Г^- концу Т7 РНК полимеразы присоединены 148 аминокислотных остатков И-концевого домена ДНК- связывающего белка СаИ БассЬаготусеБ сегеуШае. Сродство ДНК- связывающего домена белка йа14 к участку узнавания значительно превышает аффинность РНК-полимеразы к промотору. Наличие этого независимого ДНК- связывающего домена и соответствующего участка узнавания в матрице позволяет приблизить РНК полимеразу к промотору. Таким образом, представляется возможность проверить, имеет ли участок связывания промотора другие функции, так как связывание Са14-Т7 с матрицей происходит за счёт независимого от 17 РНКП домена (рис.1).

АКЗЗ

-У6'

- - < » - - t MR4

* * * * t- MRS*

- - - - * » M31

- » - - » - GAL4-T7 РНКП

1 2 3 4 5 6 7 8 Досожка

<Щ| —РНКШматрица

_MR5*/MR4/MJ1

— MRS*/M31

*»♦ т — MR5*/MR4

щ * щш ът —-MR5*

17 П.О. 43 кг

Рис. 1. Связывание химерного фермента с матрицей, содержащей участок узнавания Gal4 и одноцепочечный промотор. А: Структура матрицы (ДНК представлена линиями) для связывания с Gal4-T7 РНКП. Синтетический олигонуклеотид MJ1 (участки связывания и инициации промотора обозначены заполненным и пустым прямоугольником соответственно) отжигали с другими для получения матриц. Для связывания с матричной нитью MJ1 использовали олигонуклеотиды MR4 и MR5, формирующие специфический сайт узнавания белком Gal4 (обозначено штриховкой) или двунитевой олигонуклеотид- шпильку АКЗЗ, содержащий участок связывания промотора (УС) (обозначено заполнением). Б: Подтверждение сборки матриц и их связывания с Gal4-T7 РНКП путём изменения электрофоретической подвижности радиоактивно меченных олигонуклеотидов в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях.

Для проведения экспериментов были сконструированы синтетические олигонукпеотидные матрицы. Комплиментарные участки олигонуклеотидов MR4 и MR5 при отжиге образуют двуспиральный участок ДНК, представляющий собой специфическую последовательность узнавания белка Gal4. В свою очередь, 5'-конец MR5 комплиментарен олигонуклеотиду МЛ, содержащему промотор. В результате отжига этих трёх олигонуклеотидов образуется однонитевая матрица, содержащая промотор и взаимодействующая с Gal4 (рис. 1А). В качестве контроля использовалась аналогичная матрица с олигонуклеотидом SCB44, не содержащим последовательности промотора, в

отличие от МЛ. Сборка матрицы и её связывание с химерным белком продемонстрированы при помощи задержки в полиакриламидном геле (рис. 1Б).

-17 -4 +6

-77

ваМ

__

ваМ

д

УС

+10

нм/м /мл

/мл /мл

:АК22/МЛ :АК22/МЛ

а б В г Д е Матрица

1 2 3 4 5 6 Дорожка

—10 нт

IАК22/МЛ

Рис. 2. Транскрипционная активность химерного фермента на одноцепочечной ДНК. А: Структура матриц (а - е), использованных в реакции транскрипции. Присутствие промоторной последовательности в матрице обозначено вверху при помощи заполненного и пустого прямоугольников, соответствующих участкам связывания и инициации сооветственно). Б: Разделение продуктов транскрипции Са14-Т7 РНКП на соответствующих матрицах в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

ба14-Т7 РНКП связывается с матрицей, как и предполагалось (рис. 1Б, 8), однако это связывание не обеспечивает транскрипцию (рис. 2Б, 2). Отсутствие транскрипции на однонитевом промоторе, связанном с полимеразой при помощи Са14, нельзя объяснить ингибированием промотора в результате связывания с химерным белком, поскольку фермент проявляет транскрипционную активность при восстановлении двуспиральности промотора (рис. 2А, д; 2Б, 5).

Принимая во внимание, что нарушение двуспиральной структуры участка связывания играет важную роль, участок связывания 6а14 был заменён на участок связывания промотора (рис. 2А, в). При этом происходит восстановление функциональности промотора (рис. 2Б, 3) и спектр продуктов транскрипции практически идентичен таковому на двуцепочечном промоторе (рис. 2А, г; 2Б, 4). Участок связывания промотора, присоединённый к двунитевой матрице, не увеличивает транскрипционную активность данной матрицы (рис. 2Б, б).

Таким образом, участок связывания промотора обеспечивает транскрипцию в отличие от участка узнавания Gal4. Отсюда можно предположить, что участок связывания, помимо участия в сближении РНКП с промотором, приводит фермент в транскрипционно- активное состояние.

Двуцепочечный олигонуклеотид. имеющий последовательность участка связывания

промотора, активирует транскрипцию На однонитевой матрице

Для проверки вышеизложенного предположения участок связывания промотора, представленный двуцепочечным олигонуклеотидом- шпилькой RC12, добавляли в реакцию транскрипции к химерной РНК полимеразе (X), связанной с матрицей при помощи Gal4, in trans (рис. ЗБ, 1). Олигонуклеотид RC12 образует стабильную шпильку, содержащую консенсусную последовательность промотора от -17 до -5, фланкированную б п.о. со стороны «вверх по цепи»; контрольный олигонуклеотид RC13 обладает сходной структурой и стабильностью при случайном выборе последовательности.

Добавление в реакцию двуцепочечного олигонуклеотида с последовательностью, идентичной участку связывания промотора, обеспечивает инициацию на одноцепочечном промоторе (рис. ЗБ, 2 и 4), в том числе и в отсутствие участка узнавания Gal4 (рис. ЗБ, 6 и 8). Более того, присутствие в реакции RC12 in trans приводит РНК полимеразу дикого типа в транскрипционно-компетентное состояние как при наличии участка узнавания Gal4 (рис. ЗБ, 1 и 3), так и в его отсутствие (рис. ЗБ, 5 и 7). Добавление для контроля олигонуклеотида со

случайной последовательностью, не имеющей отношения к участку связывания промотора, не давало подобного эффекта (рис. ЗБ, 9 и 10). Также были протестированы сходные двуцепочечные олигонуклеотиды, несущие точечные замены в последовательности промотора (в частности - 8С), при этом ни один из них не оказал эффекта активации на транскрипцию Т7 РНКП.

УС

6 нт (

RC12

RC13

-17 -5 AG - -34.6 ккал/моль

Gal4

Матрица

_ - + + - - + + _ RC12

- - _ _ - - - _ + ■ RC13

17 X Т7 X Т7 X Т7 X Т7 X РНКП

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Дорожка

AG = -31.5 ккал/моль -17 -4 +6

i

МЛ

Рис. 3. Изолированный участок связывания промотора активирует транскрипцию in trans на одноцепочечной ДНК. А: В реакцию транскрипции на матрицах а и б добавляли самокомплиментарные синтетические олигонуклиотиды RC12 и RC13, образующие стабильные шпильки (AG указаны). RC12 содержит последовательность участка связывания промотора (обозначена заполненным прямоугольником), RC13 имеет случайную последовательность. Б: Разделение продуктов транскрипции Gal4-T7 РНКП (М) и Т7 РНКП (Т7) на соответствующих матрицах в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Присутствие RC12 и RC13 в реакционной смеси обозначено знаками "+" и

Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации

Описанные матрицы содержат полную последовательность промотора от -17 до +6. Чтобы выявить минимальную последовательность промотора, необходимую для проявления

различные участки промоторной последовательности были удалены или в последовательность промотора были введены случайные замены (рис. 4). Укорачивание 3-конца олигонуклеотидной матрицы до -24 нт (рис. 4Б, 2), или замена части последовательности от -24 до -17 (рис. 4Б, 3) не влияли на активацию транскрипции по сравнению с исходной матрицей МЛ.

-17 +6

а

б в г д е ж з и

□ Б

! +10 нм/м •

-1- АК22/АК18

а б в г Д е ж 3 И и Матрица

_ + + + + + + + + _ ЙС12

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Дорожка

т мм т «и

-15 -12

'-15

• 10 нт

Рис. 4. Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации. А: Структура матриц (а - и), использованных в реакции транскрипции. Присутствие промоторной последовательности в составе матрицы обозначено вверху. Изменение исходной последовательности ДНК представлено прерывистой линией (матрицы в, г и д),. Б: Разделение продуктов транскрипции Са14-Т7 РНКП на соответствующих матрицах в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Эффективность активации транскрипции снижается при замещении нуклеотидов в области промотора на случайные, начиная с -15 (рис. 4Б, 4). Наличие интактного участка

связывания промотора необходимо, но не достаточно. Прилегающая последовательность ДНК выше промотора также играет важную роль (рис. 4Б, 3 и 6).

Модель активации транскрипции участком связывания промотора от Ьгаю

-23 -5

Рис. 5. Схема модели активации транскрипции участком связывания промотора ¡п trans. Т7 РНК полимераза (овал) взаимодействует с самокомплиментарным олигонуклеотидом- шпилькой RC12, содержащим участок связывания промотора и однонитевой матрицей (М), образуя промежуточный комплекс; дальнейшее развитие событий может происходить тремя альтернативными путями (объяснение в тексте).

Известно, что в отсутствие нематричной цепи аффинность Т7 РНКП к промотору чрезвычайно низка. Таким образом, активация транскрипции на такой матрице должна быть следствием, хотя бы частично, увеличения способности связывать и удерживать ДНК-матрицу. Одним из возможных объяснений для описанных выше наблюдений является реорганизация фермента после взаимодействия со связывающим участком промотора, позволяющая связывание одноцепочечной матрицы с обязательным её попаданием в

реорганизация фермента после взаимодействия со связывающим участком промотора, позволяющая связывание одноцепочечной матрицы с обязательным её попаданием в активный центр. Можно предположить, что Т7 РНКП взаимодействует с участком связывания короткий промежуток времени, в то же время, аффинность полимеразы к изолированному участку связывания выше, чем к интактному промотору. Последнее наблюдение (наряду с далее представленными данными) предполагает высокую стабильность подобного бинарного комплекса полимеразы с участком связывания, который затем связывается с одноцепочечной матрицей (рис. 5).

Далее возможны три альтернативных варианта развития событий. Возможно, что образованный тройной комплекс является транскрипционно-компетентным вследствие кооперативного взаимодействия между участками промотора. Подобное объяснение находится в противоречии с наблюдением, что матрица также должна содержать последовательность участка связывания для проявления феномена активации. Другое объяснение предполагает отжиг нематричной составляющей двуцепочечного олигонуклеотида с одноцепочечным промоторным участком матрицы в составе комплекса. В результате этого процесса возможно возникновение двуцепочечного участка связывания промотора на матрице, что образует частично однонитевой промотор (модель отжига). В третьем варианте однонитевая матрица вытесняет Ю2 из связывающего участка фермента, занимая этот район белка, а также активный центр (вытеснительная модель). Образованный комплекс может обладать чертами инициаторного комплекса. Таким образом, полимераза связывается с одной молекулой ДНК, а инициация транскрипции происходит на другой молекуле.

Предварительные данные указывают на небольшую верятность варианта отжига. Так, предсказанная свободная энергия денатурации стабильной двунитевой структуры олигонуклеотида-шпильки составляет -34,6 ккал/моль. Учитывая, что гибридизация шпильки на себя протекает по внутримолекулярному механизму, вероятность гибридизации шпильки с матрицей мала, так как происходит путём взаимодействия между двумя

основании только этих данных невозможно сделать заключение о невозможности отжига в составе тройного комплекса с РНК полимеразой, поскольку присутствие фермента может способствовать гибридизации.

Для исключения альтернативных вариантов напрямую был применён метод изменения электрофореретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле (рис.6).

А В

Ю2 (НМ) 0 1051 1 I 2 5 I 101 25 I 5011001 матрица (нМ) 0 1051 1 I 2 | 5 I 10 1 25 1 501100

Дорожка 1 | 2 | 3 | 4 5 | 6 1 7 | 8 | 9 | Дорожка 1|2|з|4|5|б|7|8|9

матрица —

связанный

|*а2 —

§0 16 $

—О И

3

ко 12 £

дОМ

Я««

ЙС12 (нМ)

ЯС12(доли) РНК (счёт)

Я

£ юг

матрица (нМ)

К

гаюо с

Рис. 6. Одионитевая матрица вытесняет участок связывания из комплекса с ферментом. А, Б: Радиоактивно-меченную матрицу МЛ (50 нМ) и Т7 РНК полимеразу (100 нМ) инкубировали в присутствии олигонуклеотида шпильки, содержащего участок связывания промотора (1*С12). При возрастании концентрации олигонуклеотида шпильки количество матрицы в комплексе с полимеразой увеличивается. В, Г: Радиоактивно-меченный участок связывания (50 нМ) и РНК полимеразу инкубировали с возрастающими концентрациями однонитевой матрицы (МЛ). При возрастании концентрации матрицы количество олигонуклеотида шпильки, содержащего участок связывания промотора, в комплексе с полимеразой уменьшается. В то же время эффективность транскрипции растёт.

количество олигонуклеотида шпильки, содержащего участок связывания промотора, в комплексе с полимеразой уменьшается. В то же время эффективность транскрипции растёт.

Все три модели предполагают, что при добавлении олигонуклеотида-шпильки связывание одноцепочечной матрицы полимеразой" возрастёт. Предсказанный эффект можно наблюдать с увеличением концентрации ЯС12 при постоянной концентрации РНКП и одноцепочечной матрицы (рис. 6А, Б).

Согласно двум из представленных моделей - кооперативного взаимодействия и отжига - добавление матрицы не должно влиять на связывание ЯС12. В отличие от них модель вытеснения предсказывает снижение количества 1*С12, связанного с полимеразой, при возрастании концентрации одноцепочечной матрицы, что показано на рис. 6В, Г. В отсутствие одноцепочечной матрицы наблюдается связывание радиоактивно-меченного ЛС12 с полимеразой (6В, 1). Увеличение концентрации матрицы приводит к высвобождению радиоактивности из комплекса с полимеразой (6Г, 2-9). В то же время наблюдается рост транскрипционной активности, что можно наблюдать при добавлении в реакцию трифосфатов и последующим разделением в 20% денатурирующем геле (данные представлены на графике 6Д, заполненные квадраты). Эти наблюдения противоречат моделям кооперативных взаимодействий и отжига, но согласуются с моделью вытеснения.

Из вышеизложенного можно сделать заключение, что участок связывания промотора отвечает не только за связывание полимеразы с промотором, но также приводит полимеразу в транскрипционно-активное состояние, действуя в соответствии с моделью вытеснения.

Глава 2. Характеристика терминаиионного сигнала из гена предшественника

прогормона парашитовидной железы человека.

Описано множество разнообразных сигнальных последовательностей ДНК, влияющих на процесс транскрипции. Среди них различные по силе промоторы, регуляторные участки

связывания специфических белков-регуляторов, сайты пауз, на которых РНК полимераза временно останавливает синтез РНК- продукта, а также терминаторы, на которых происходит высвобождение РНК из транскрипционного комплекса.

Наиболее изученными являются терминаторы, образущие шпилькоподобные структуры в РНК во время транскрипции. Другие сигнальные последовательности, в том числе вызывающие паузы, арест а также терминацию без образования шпилькоподобных структур в РНК изучены менее подробно. Известны два класса терминаторов, на которых происходит диссоциация элонгационного комплекса Т7 РНК полимеразы. Терминатор Тф из района поздних генов фага Т7 представляет собой типичный терминатор класса I. Последовательность ДНК этого терминатора определяет возможность формирования стабильной шпилькоподобной структуры в РНК во время транскрипции, после которой следует несколько А:Т пар. При транскрипции этого участка РНК- продукт образует наименее стабильные связи с матричной цепью ДНК. В результате существенно облегчается диссоциация РНК из тройного комплекса с ферментом и ДНК- матрицей. Эти черты характерны также для шпилькообразующих терминаторов бактериальной РНК полимеразы Escherichia coli, некоторые из которых распознаются РНК полимеразой фага Т7. Для таких терминаторов характерна сходная вторичная структура при отсутствии гомологии в последовательности (за исключением А:Т богатого участка следующего непосредственно за прямыми повторами образующими шпильку).

В отличие от терминаторов типа I, для терминатора II типа, обнаруженного в гене предшественника гормона паращитовидной железы человека, невозможно предсказать образование шпилькоподобной вторичной структуры в РНК. Кроме того, этот терминатор теряет функциональность при удалении нематричной цепи ДНК. Для данного сигнала характерна гомология последовательности (ATCTGTT в нематричной цепи). Эта же последовательность была обнаружена в терминаторе гттВ Т1 £ coli, в межгенном участке кДНК вируса везикулярного стоматита, в области разрешения конкатемеров фагового генома Т7 во время репликации, в ДНК аденовирусов, а также ДНК фага X. Некоторые из

этих последовательностей вызывают терминацию лишь в присутствии лизоцима фага Т7 (снижающего эффективность транскрипции Т7 РНКП), или при транскрипции чувствительными к лизоциму мутантными ферментами. Описаны мутантные РНКП, не способные к терминации на последовательностях II класса, в то же время не потерявшие функциональности на терминаторах I класса, из чего следует отличие механизмов протекания процесса терминации на последовательностях, относящихся к различным классам. Распознавание II типа терминаторов РНК полимеразой необходимо для нормального протекания жизненного цикла бактериофага Т7. В частности, мутация РНК полимеразы, приводящая к потере распознавания терминатора II типа в области разрешения конкатемеров генома Т7, вызывает нарушение обработки и упаковки фаговой ДНК.

Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ПТГ терминаторе

В работе Макдоналд было показано, что ПТГ терминатор содержится в участке ДНК размером 31 п. о. В нашей работе было проведено точное картирование путём делеционного анализа этого участка, в результате которого последовательность терминатора была локализована на участке от 15 до 4 п. о. перед точкой терминации. Данный участок содержит последовательность из 10 п. о. (САТСТСТТГГ по нематричной цепи), необходимую для эффективной терминации. Поиск гомологичных последовательностей по базам данных выявил идентичную последовательность из 7 п. о. (подчёркнуто) в ДНК бактериофага Т7, ТЗ, 5Р6, а также в геномах некоторых вирусов. Вследствие анализа гомологии возникло предположение о важности последовательности для терминации. Для проверки этой гипотезы консенсусную последовательность подвергли мутагенезу с заменами в каждом положении в составе консенсуса на все возможные варианты. Результаты эксперимента представлены на рис. 7 и в таблице.

с А т С Т G

К т А G G С т G А С G А т А G С С т А

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 И 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 7. Влияние точечного мутагенеза последовательности ПТГ терминатора на эффективность терминации. Разделение продуктов транскрипции 77 РНКП на плазмидных матрицах с точечными заменами в составе ГПТ терминатора в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Дорожка 1 соответствует исходной последовательности терминатора (CATCTGTTTT). Точечные мутации исходной последовательности в соответствующих положениях обозначены жирным шрифтом в дорожках 2-19. Справа обозначены полноразмерный продукт ПП и две зоны терминации (минорная Т1 и основная Т2).

Нумерация в таблице соответствует нумерации дорожек на рис. 7, последовательность плазмиды pDL75 содержит последовательность ГПТ терминатора, точечные мутации этой последовательности в других плазмидах выделены жирным шрифтом. Эффективность терминации расчитана из суммы выхода продуктов терминации на обоих сайтах терминации (Т1 и Т2) относительно полноразмерного продукта.

Любые замены оснований в консенсусе приводили к потере функциональности терминатора. Следовательно, при терминации на ПТГ терминаторе последовательность ДНК играет первостепенную роль. В эксперименте не проводились замены четырёх тимидиновых остатков, поскольку их необходимость для терминации была продемонстрирована ранее в работе Mead и сотр.

Таблица. Влияние точечных мутаций на терминацию на ГПТ терминаторе

№ Плазмида Последовательность Эффективность терминации

1 рйЬ75 САТСТСГТТТ 0.28

2 р01_76 ТАТСТСТТТТ 0.29

3 Р01.77 ААТСТСТТТТ 0.14

4 рР1-78 вАТСТбТТТТ <0.01

5 рОТ1 свтстстттт <0.01

6 рЭТ2 сстстстттт 0.11

7 ФТЗ сттстсгттт <0.01

8 рОТ4 САвСТСТТТТ <0.01

9 рОТ5 СААСТСТТТТ <0.01

10 рОТб САССТйТТТТ <0.01

11 рОТ7 САТвТСТТТТ <0.01

12 рОТ8 САТАТСГТТТ <0.01

13 рОТ9 САТТТЗТТТТ <0.01

14 рОТЮ САТСАСТТТТ <0.01

15 РОТ11 САТСвСТТТТ 0.08

16 РОТ12 САТСССТТТТ <0.01

17 РОТ13 САТСТСТТТТ <0.01

18 РОТ14 САТСТТТТТТ <0.01

19 РОТ15 САТСТАТТТТ <0.01

Обе цепи двойной спирали ДНК необходимы для функционирования ПТГ терминатора При транскрипции на частично-однонитевых матрицах (участок связывания промотора должен быть двуцепочечным, см. главу 1) с ПТГ терминатором и без него количество полноразмерного продукта заметно снижено в первом случае (рис. 8,3).

Несмотря на отсутствие чётко-выраженной терминации в области сайта Т1, можно наблюдать диффузную зону, наличие которой позволяет объяснить, почему выход полноразмерного РНК продукта значительно ниже при наличии ГПТ терминатора, чем в его отсутствие (рис. 3, 4). Кроме того, картина продукции абортивного синтеза не отличается при транскрипции на обеих частично-одноцепочечных матрицах. Вышеизложенное позволяет предположить наличие сайта задержки Т7 РНКП (паузы) во время транскрипции, причём этот сайт функционален и при транскрипции на одноцепочечной ДНК. Присутствие фагового лизоцима стимулирует терминацию на некоторых терминаторах типа II, однако этот эффект не проявляется в случае одноцепочечного ПТГ терминатора, что также

указывает на важность нематричнои цепи для терминации.

-24

+28 +37

+56

1 2

3

4

н

Т172

ВН120 ВН135

ВН122 ВН123

ВН147 ВН135

ВН147 ВН123

ПП-

72-Т1-

12 3 4

-шшШшшшШЁ

ЩЩЩт

й*г

Рис. 8. Влияние структуры матрицы на терминацию на ПТГ терминаторе. Слева: синтетические олигонуклеотиды, комплиментарные друг другу, отжигали для получения матриц. Последовательность ПТГ терминатора (НАТСТСГПТ) обозначена чёрными прямоугольниками. Справа: продукты транскрипции на соответствующих матрицах (номера дорожек соответствуют нумерации матриц) разделены в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Для изучения влияния нематричной цепи на терминацию были использованы искусственные матрицы с различными нарушениями двуспиральносги ДНК (рис. 9).

В результате экспериментов были сделаны следующие заключения: для терминации РНКП на ПТГ терминаторе необходимо наличие терминационной последовательности в обеих цепях, так как присутствие терминационного сигнала только в одной цепи не обеспечивает эффективной терминации (рис. 9, 3 и 4). В то же время наличие ПТГ терминатора в матричной цепи в виде неспаренного участка приводило к уменьшению выхода полноразмерного продукта и появлению диффузной зоны в области продуктов терминации, в соответствии с предыдущими результатами (рис. 8). Таким образом, продемонстрирована необходимость наличия сигнала в матричной цепи и двуцепочечности

ДНК при терминации на ГПТ терминаторе.

+28 +37 +56

+28 +37 +56

Рис. 9. Влияние дефектов нематричной цепи на терминацию. Вверху: синтетические матрицы приготовлены так же, как и на предыдущем рисунке. Неспаренные участки обозначены изогнутыми линиями. Границы участков соответствуют обозначенным цифрами положениям от начала транскрипции. Нематричная цепь отсутствует у матриц б и 7 после указанных положений. Матрицы 8-10 содержат различные по длине разрывы сахарофосфатного остова ДНК. Матрицы 10 и 11 содержат некомплиментарные ответвления ДНК на 5' или 3' конце после или перед разрывом нематричной цепи. Внизу: продукты транскрипции на представленных матрицах (номера дорожек соответствуют нумерации матриц) разделены в 20% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях.

Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТГ терминатором негативно отражаются на его Функциональности

Различные наблюдения указывали на важность отделения РНК от ДНК во время транскрипции для функционирования ПТГ терминатора. В частности, при транскрипции на однонитевой матрице терминации не происходит. Икеда и Ричардсон предположили, что у протеолитически модифицированной трипсином Т7 РНКП (не терминирует на ГПТ), дефект может быть в разделении ДНК:РНК гибрида. Кроме этого, Мид и сотр. обнаружили приблизительно 10-кратное уменьшение продуктивности терминации на негативно суперскрученной матрице по сравнению с линейной матрицей. Он предположил, что стабильность двуспиральной структуры ДНК (что может действовать на вытеснение РНК-продукта) влияет на эффективность терминации. Восстановление структуры ДНК при схлопывании транскрипционного расплетания (пузыря) после прохождения РНКП может влиять на вытеснение РНК - продукта из гибрида, или предотвращать возможный отжиг РНК обратно на ДНК после их разделения. Таким образом, в отсутствие гомологичной нематричной цепи, можно предположить, что на гетеродуплексном участке не происходит отделения РНК, вследствие чего образуется протяжённый ДНК:РНК гибрид. Чтобы проверить справедливость вышеизложенной гипотезы, были произведены эксперименты на матрицах с разрывами в нематричной цепи, а также с гетеродуплексными участками, расположенными выше ПТГ терминатора. Как продемонстрировано на рис. 9, наличие разрыва (дорожка 5), или гетеродуплексного участка выше ПТГ терминатора приводит к потере узнавания сигнала полимеразой даже если сигнал присутствует в обеих цепях ДНК. Это особенно ярко проявляется в случае основного сайта терминации (Т2). В то же время разрыв фосфатного остова ДНК в нематричной цепи (дорожка 9), как и наличие неспаренных концов ДНК, обрамляющих этот разрыв, оказывает гораздо меньший эффект на терминацию (дорожка 10, 11). Это демонстрирует необходимость более существенных изменений в структуре спирали ДНК для нарушения функциональности терминатора. Отсутствие нематричной цепи после сигнала терминации уменьшает выход продукта

терминации на основном сайте терминации Т2, при этом терминация по прежнему возможна на сайте Т1 (дорожка б, 7). В этих случаях ДНК двуспиральна в случае Т1, в то время как на участке Т2 нематричная цепь отсутствует (дорожка 6), либо продолжается лишь непосредственно до точки терминации. Вышеизложенные данные подтверждают необходимость двунитевой структуры ДНК для эффективной терминации на участке 72, а также ПТГ последовательности выше по цепи.

выводы

1. Продемонстрировано, что участок связывания промотора РНК-полимеразы фага 77 выполняет две функции: обеспечивает привлечение фермента к ДНК и активацию РНК-полимеразы фага 77 в инициационно-компетентное состояние.

2. Показано, что РНК полимераза фага 77 приобретает способность к инициации транскрипции на одноцепочечном промоторе при добавлении в реакцию двуцепочечного олигонуклеотида, содержащего последовательность участка связывания промотора.

3. Показано, что активация полимеразы невозможна при наличии мутаций на участке связывания промотора в составе одноцепочечной матричной цепи.

4. Предложена модель взаимодействия полимеразы с одноцепочечным промотором на начальной стадии инициации.

5. Продемонстрировано, что последовательность ПТГ терминатора (АТСГСТТ) узнаётся РНК полимеразой фага 77 специфически. Мутации в составе этого консенсуса нарушают функционирование терминатора.

6. Продемонстрирована необходимость непрерывности двойной спирали ДНК для терминации на ГПТ терминаторе в районе терминатора и перед ним. Показано, что присутствие фагового лизоцима не стимулирует терминацию на ПТГ терминаторе в виде одноцепочечной ДНК. Отличие принципа взаимодействия полимеразы с данным терминатором от шпилькообразующих терминаторов позволяет отнести ПТГ терминатор к отдельному классу II.

СПИСОК РАБОТ,

опубликованных автором по теме диссертации:

1. He B., Kukarin A., Temiakov D., Chin-Bow S.T., Lyakhov D.L., Rong M., Durbin R.K. and McAllister W.T. (1998). Characterization of an unusual," sequence-specific termination signal for T7 RNA polymerase. J. Biol. Chem. 273: 18802-11.

2. Kukarin A.. Rong M. and McAllister W.T.,(2003). Exposure of T7 RNA polymerase to the isolated binding region of the promoter allows transcription from a single stranded template. J. Bioi. Chem/. 278: 2419-24.

4. Kukarin A- He B., Temiakov D., Chin-Bow S.T., Lyakhov D.L., Rong M., Durbin R.K. and McAllister W.T. (1998). Sequence-specific termination by T7 RNA polymerase. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, p. 59.

5. Kukarin A.. Rong M. and McAllister W.T. (2000). Uncoupling the binding and initiation functions of the T7 promoter. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, p. 57.

6. Kukarin A.. Rong M., Gartenstein H. and McAllister W.T (2002). Exposure of T7 RNA polymerase to the isolated binding region of the promoter leads to reorganization of the enzyme, allowing it to bind and initiate transcription from a single stranded template. Molecular Genetics of Bacteria & Phages, Cold Spring Harbor, p. 48.

Отпечатано в копицентре «Учебная полиграфия» Москва, Ленинские горы, МГУ, 1 Гуманитарный корпус. www.stprint.ru e-mail: zaka2@stprint.n1 тел 939-3338 Заказ № 371, тираж 100 шт. Подписано в печать 17.09.2003

^ooJ-A H7Q.S »147?í

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кукарин, Александр Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Краткие сведения о ДНК зависимой РНК полимеразе бактериофага Т7 Escherichia coli.

2. Этапы транскрипционного цикла.

2.1 Инициация.

2.2 Элонгация.

2.3 Терминация.

3. Терминационные последовательности РНК полимеразы бактериофага Т7.

3.1 Терминационные последовательности первого класса (образующие стабильные шпилькообразные структуры).

3.1.1 Влияние контекста последовательности матрицы перед терминаторами первого класса.

3.1.2 Влияние стабильности шпильки.

3.1.3 Влияние А:Т богатого участка, расположенного после шпильки.

3.2 Терминационные последовательности второго класса.

3.2.1 Роль нематричной цепи в процессе терминации.

3.2.2 Роль последовательности ДНК в терминации на сигналах второго класса.

3.2.3 Влияние контекста последовательности матрицы на терминацию второго класса.

3.2.4 Последовательность консенсуса является сайтом паузы Т7 РНК полимеразы

3.2.5 Роль А:Т богатой последовательности, расположенной после консенсуса, в терминации.

4. Мутантные ферменты со сниженной эффективностью терминации на ГПТ.

5. РНК полимеразы родственных бактериофагов узнают терминационные последовательности второго класса.

6. Модель терминации на шпилькообразующем терминаторе.

7. Кинетическая модель терминации.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7.

1.1 Приближения РНК-полимеразы к однонитевому промотору при помощи ДНК связывающего домена белка Gal4 не достаточно для инициации транскрипции.

1.2 Двуцепочечный олигонуклеотид, имеющий последовательность участка связывания промотора, активирует транскрипцию на однонитевой матрице.

1.3 Одноцепочечная ДНК должна содержать полную последовательность промотора для проявления эффекта активации.

1.4 Модель активации транскрипции участком связывания промотора in trans.

1.5 Удаление интеркалирующей петли не приводит к транскрипции на однонитевой матрице.

2. Характеризация терминационного сигнала из гена предшественника прогормона паращитовидной железы человека.

2.1 Влияние точечных мутаций на эффективность терминации на ПТТ терминаторе.

2.2 Обе цепи двойной спирали ДНК необходимы для функционирования ПТГ терминатора.

2.3 Нарушения двуспиральности ДНК перед ПТТ терминатором негативно отражаются на его функциональности.

ВЫВОДЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Бактериальные штаммы.

Плазмиды.

Питательные среды.

Приготовление компетентных клеток и трансформация бактерий.

Выделение плазмидной ДНК.

Использование ферментов в процедурах клонирования.

Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях.

Анализ первичной последовательности ДНК.

Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных гелях.

Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях.

Транскрипция in vitro.

Приготовление транскрипционных матриц из синтетических ДНК олигонуклеотидов. 63 Получение точечных мутаций при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза

Метод разделения ДНК в неденатурирующих условиях.

Метод изменения электрофоретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле.

Выделение Т7 РНК полимеразы с использованием аффинной хроматографии.

Выделение Т7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии.

Выделение GAL4-T7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизма транскрипции на примере этапов транскрипционного цикла РНК полимеразы бактериофага Т7 Escherichia coli"

Изучение механизмов экспрессии генетической информации является одним из наиболее актуальных направлений в современной молекулярной биологии. Нарушения процессов экспрессии приводят к снижению жизнеспособности (болезням) или летальны. По данной тематике проводятся широкие исследования в мировых научных центрах. Первый этап экспрессии генов, транскрипция, осуществляется ДНК-зависимыми РНК полимеразами (РНКП), которые присутствуют у всех известных клеточных организмов и многих вирусов.Общепринято разделять РНКП на две группы: многосубъединичные и односубъединичные.Сложные многосубъединичные РНКП характерны для клеточных организмов, односубъединичные кодируются геномами некоторых вирусов и бактериофагов.Бактериофаг Т7 Escherichia coli кодирует собственную РНКП для экспрессии средних и поздних генов. Этот белок, молекулярной массой 98 кДа, содержит одну полипептидную цепь, в отличие от мультисубъединичных ферментов клеточных организмов. В то же время РНК полимераза фага Т7 обладает всеми функциями, необходимыми для полноценного синтеза РНК (Sousa, 1996; McAllister, 1997). Совпадение этапов транскрипции, сходство организации транскрипционных комплексов и наличие функционально гомологичных элементов в структурах РНК полимераз у всех организмов позволяют говорить о единообразии механизма транскрипции в природе. Универсальность транскрипционного аппарата наряду с относительно простым устройством фаговых РНК полимераз позволили ферменту фага Т7 занять уникальное место среди классических моделей для изучения транскрипции. Там, где результаты исследований многосубъединичных полимераз оказываются трудноинтерпретируемыми, изучение Т7 РНКП позволяет выявить основные детали протекания транскрипционного цикла и понять принципы транскрипционного механизма в целом.В транскрипционном цикле различают три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию. На первой стадии транскрипции РНК полимераза узнаёт специфическую I. jt.Й последовательность промотора. После связывания фермента происходит разделение цепей ДНК на инициаторном участке и начинается синтез РНК-транскрипта. После нескольких циклов синтеза абортивных продуктов происходит переход к элонгации. На этой стадии происходит удлиннение РНК до тех пор, пока фермент не встретит сигнал терминации, что приводит к диссоциации транскрипционного комплекса и высвобождению готового РНКпродукта. Последние исследования позволили сделать качественный скачок в проблеме понимания процесса элонгации. В то же время наибольший интерес, как менее изученные, представляют стадии инициации и терминации.Целями данной работы являлось разделение связывающей и инициаторной функций промотора РНК-полимеразы фага Т7 и выяснение принципа действия ПТГ терминатора. В процессе исследований решались следующие задачи (а) определение влияния связывания фермента с ДНК на эффективность инициации; (б) определение минимальной длины связывающего участка одноцепочечного промотора при которой происходит инициация; (в) выявление возможных иных функций участка связывания; (г) моделирование взаимодействия фермента с одноцепочечным промотором при добавлении двухцепочечного олигонуклеотида, содержащего участок связывания промотора; (д) определение последовательности ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора; (е) выявление структуры ДНК необходимой для функционирования ПТГ терминатора.Впервые показано, что участок связывания промотора несёт другую важную функцию, помимо связывающей - активацию полимеразы в транскрипционно-компетентное состояние.Продемонстрирована ранее не описанная возможность физического разделения участков связывания и инициации для промотора Т7 РНКП. Впервые показано, что Т7 РНКП инициирует синтез РНК на одноцепочечной ДНК, содержащей промотор.Впервые определена минимальная нуклеотидная последовательность нового типа терминационного сигнала РНК полимеразы бактериофага Т7 (ATCTGTT в нематричной цепи). При мутации в любом из положений этого консенсуса терминации не происходит.Впервые продемонстрировано, что для терминации абсолютно необходимо наличие i i^ нематричной цепи в районе терминатора, иными словами двуспиральности ДНК. Даже при незначительных нарушениях непрерывности нематричной цепи (разрыва с отсутствием одного нуклеотида) перед терминатором эффективность терминации значительно снижается.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Кукарин, Александр Вячеславович

1. Продемонстрировано, что участок связывания промотора РНК-полимеразы фага Т7 выполняет две функции: обеспечивает привлечение фермента к ДНК и активацию РНК-полимеразы фага Т7 в инициационно-компетентное состояние.2. Показано, что РНК полимераза фага Т7 приобретает способность к инициации транскрипции на одноцепочечном промоторе при добавлении в реакцию двуцепочечного олигонуклеотида, содержащего последовательность участка связывания промотора.3. Показано, что активация полимеразы невозможна при наличии мутаций на участке связывания промотора в составе одноцепочечной матричной цепи.4. Предложена модель взаимодействия полимеразы с одноцепочечным промотором на начальной стадии инициации.5. Продемонстрировано, что последовательность ПТГ терминатора (ATCTGTT) узнаётся РНК полимеразой фага Т7 специфически. Мутации в составе этого консенсуса нарушают функционирование терминатора.6. Продемонстрирована необходимость непрерывности двойной спирали ДНК для ^ терминации на ПТГ терминаторе в районе терминатора и перед ним. Показано, что присутствие фагового лизоцима не стимулирует терминацию на ПТГ терминаторе в виде одноцепочечной ДНК. Отличие принципа взаимодействия полимеразы с данным терминатором от шпилькообразующих терминаторов позволяет отнести ПТГ терминатор к отдельному классу П. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Бактериальные штаммы В работе использовали следующие штаммы Escherichia coir.Штамм Генотип Происхождение BL21 Е. соЛВ: F- dcm ompThsdS (гв- гпвг) да/ Novagen, США DH5a Л1аси1б9(ф80 dlacZAMlS) recAl endAl дугА96 Life Technologies, США thi-1 hsdR17supE44 relAl XL-1 Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17supE44 relAl Stratagene, США lac [FproAB lacFZAIHlS TnlO (Tef)] Плазмиды Для экспрессии РНК полимеразы дикого типа использовали плазмиду рВН161 (Не и сотр., 1997). При приготовлении транскрипционных матриц для РНК полисмеразы Т7 использовали плазмиды рВН183, рВН202, рВН220, рВН221, которые линеаризовали при помощи рестрикционной эндонуклеазы Hind I I I (Не и сотр., 1998).Питательные среды Для выращивания клеточных культур при выделении плазмид и белков использовалась питательная среда Лурия-Бертани (LB) (Sambrook и сотр., 1989). В твёрдые среды для заливания чашек Петри добавляли 1,5 % агара. Концентрация ампициллина составляла 100 м кг/мл.Приготовление компетентных клеток и трансформация бактерий Компетентные клетки вышеупомянутых штаммов готовили по описанию и хранили в

30% глицерине в присутствии 50 мМ хлорида кальция при -70** Трансформацию проводили по описанию Сэмбрука и сотр. (Sambrook и сотр., 1989).Выделение плазмидной ДНК Для выделения больших количеств плазмидной ДНК использовали метод щелочного лизиса с последующим использованием полиэтиленгликоля (Sambrook и сотр., 1989). В микроколичествах плазмидную ДНК выделяли на силикагелевых мембранных колонках QUIAprep с использованием набора фирмы Qiagen, США. Использование ферментов в процедурах клонирования В процедурах клонирования плазмидной ДНК использовали различные ресгрикционные эндонуклеазы, щелочную фосфатазу телёнка и Т4 ДНК лигазу (New England Biolabs, США).Для повышения эффективности клонирования продуктов ПЦР их фофорилировали по 5'-

концу при помощи Т4 полинуклеотид киназы (New England Biolabs, США).Электрофорез фрагментов ДНК в агарозных гелях Для идентификации, разделения и очистки молекул ДНК проводили электрофорез в 1-

2% агарозных гелях в 0,04 М трис-ацетатном буфере, рН 7,8 (Sambrook и сотр., 1989). При нанесении в образцы добавляли 10 кратный буфер нанесения, содержащий 0,04 М трис ацетатный буфер, 50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол.Анализ первичной последовательности ДНК Для определения последовательности ДНК в составе плазмид использовали метод секвенирования по Сэнгеру с двуцепочечнои ДНК при помощи набора Sequenase 2.0 DNA sequencing фирмы USB (США) согласно рекомендации производителя. В качестве радиоактивной метки использовали а-^^З- АТР (NEN, США). Олигонуклеотидные праймеры заказывали в Macromolecular Resources, США. После проведения электрофореза в 6% полиакриламидном геле в денатурирующих условиях гель фиксировали в растворе, содержащем 15% метанола, 5% уксусной кислоты в течение 30 мин., переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США). Высушенные гели экспонировали в течение 14-18 часов с рентгеновской плёнкой RX-B (Labscientific, США) и проявляли при помощи автоматического прибора X-

ОМАТ М35 processor (Kodak, США).Разделение РНК и ДНК методом денатурирующего электрофореза в полиакриламидных гелях Для разделения продуктов транскрипционных реакций использовали электрофорез в

12% или 20% полиакриламидных гелях (соотношение акриламида к метиленбисакриламиду

19:1) в трис- боратном буфере (0,09 М Трис - борная кислота, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0-8,5) в присутствии 7 М мочевины (Sambrook и сотр., 1989). Перед нанесением образцов к ним добавляли равный объём буфера нанесения. Использовали буфера нанесения следующего сосотава: буфер с мочевиной, содержащий двукратный трис-боратный буфер, 8 М мочевину и 50 мМ ЭДТА, а также формамидный буфер, содержащий 90% формамид и 50 мМ ЭДТА. Электрофорез проводили при постоянной мощности 85 Вт в течение полутора часов для

20% гелей и 75 Вт, 1 час для 12% гелей.Электрофоретическое разделение белков в денатурирующих условиях Для анализа образцов использовали электрофоретическое разделение белков в 7% и

10% полиакриламидных гелях в трис- глициновом буфере в присутствии додецилсульфата натрия (Sambrook и сотр., 1989). Перед нанесением на гель к образцам добавляли четырёхкратный буфер нанесения (0,2 М Трис- С1, рН 6,8, 4 % ДСП, 1 М меркаптоэтанол, течение 2 мин. Электрофорез проводили в аппарате Miniprotean I I (Bio-Rad, США). После проведения электрофореза гель переносили в фиксирующий раствор, содержащий 10% уксусной кислоты и 45% этанола, и нагревали до кипения, затем переносили на качалку на 10 мин. Прокрашивание проводили в 0,02% растворе кумасси бриллиантового голубого R450 в 10% уксусной кислоте на качалке (10 мин.) с предварительным нагреванием.Отмывку осуществляли в профетом 5% растворе уксусной кислоты в течение 10 мин. на качалке с помещением в кювету бумажной салфетки Kimwipes EX-L (Kimberly-Clark, США) для адсорбции излишнего количества красителя. Процедуру отмывки повторяли, при этом заменяли салфетку на свежую. Гель фотографировали при помощи фотокамеры Polaroid (США) или хранили в высушенном виде. Для этого гель выдерживали ночь в 2% растворе глицерина, переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США).Транскрипция in vitro Использовали буферные растворы следующего состава: Буферный раствор ГГТ: 30 мМ HEPES, рН 7,8; 100 мМ глутамат калия; 15 мМ ацетат магния; 0,25 мМ ЭДТА; 0,05% твин-20; 1 мМ ДТТ. Буферный раствор трис-С1: 20 мМ Трис-С1, рН 7,9; 8 мМ хлорид магния; 0,1 мМ ЭДТА; 0,05% твин-20, 1 мМ ДТТ. Трис-ацетатный буферный раствор: 40 мМ Трис-ацетат, рН 7,9; 10 мМ ацетат магния; 0.05% твин-20, 1 мМ ДТТ. Буферные растворы приготавливали в десятикратной концентрации (ГГТ в

пятикратной) с использованием деионизированной воды, полученной на установке Milli-Q Кроме буферного раствора в компоненты реакции обычно входили по 0,5 мМ АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ, 0,2 мкКи у-^ ^Р- ГТФ (специфическая активность 6000 Ки/ммоль), 50 мкМ матрицы и 20 нг фермента. При приготовлении реакций уникальные компоненты помещали в индивидуальные пробирки, а из общих компонентов составляли реакционную смесь для унифицирования условий. Реакционные смеси и индивидуалные компоненты, разнесённые Транскрипцию инициировали добавлением смеси к ферменту (при тестировании разных

ферментов) или смеси к матрице (при тестировании различных матриц).Для приготовления реакций накопления продуктов транскрипции в зависимости от времени приготавливали общую транскрипционную смесь, из которой после начала реакции отбирали образцы равного объёма через необходимые временные интервалы. Образцы смешивали с равным объёмом буфера для нанесения образцов.После проведения электрофореза гель переносили на использованный лист рентгеновской плёнки или лист фильтровальной бумаги 3мм Chr (Whatman, США) и экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи программы ImageQuant 4.2 и ImageQuant 5.2 (Molecular Dynamics).Приготовление транскрипционных матриц из синтетических ДНК олигонуклеотидов Для приготовления транскрипционных матриц использовали олигонуклеотиды фирм Oligos, США и Macromolecular Resources, США. Полученный сухой осадок ДНК растворяли в деионизированной воде Milli-Q (Millipore, США) в объёме от 20 мкл до 100 мкл, в зависимости от количественного выхода реакции синтеза. Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре Ultraspec I I (Pharmacia LKB, England). Отжиг проводили в объёме 40 мкл транскрипционного буфера, включавшем по 2 мкл рабочего раствора (концентрация 10 мкМ) каждого олигонуклеотида. Смесь выдерживали 10 мин. при 70® С, после чего подвергали медленному охлаждению в течение полутора часов при комнатной температуре.Получение точечных мутаций при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза Точечные замены в ПТГ сигнале были получены при помощи ПЦР на плазмиде рВН220.Амплификацию проводили при помощи PrimeZyme (Biometra) в соответствии с J рекомендациями производителя. Компоненты реакции в объёме 100 включали 10 мкл 10-

кратного буферного раствора, 10 нг плазмидной матрицы, 1 мкМ каждого праймера, по 200 мкМ дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ, 1,5 мМ хлорид магния и 1 единицу термостабильной ДНК полимеразы PrimeZyme. Общий для всех реакций праймер DL31 (5' GTGAAITCAATTAATACGACTCACTATAG) содержал последовательность промотора и рестрикционный сайт EcoRI (подчёркнуто). Второй праймер Dl_33 (5' GCTCTAGATATCAAAACAGATGATCCCCGGGTACCA) содержал последовательность терминатора и рестрикционный сайт Xbal. Для получения мутаций в последовательности терминатора использовали различные варианты второго праймера с одиночными заменами в соответствующих положениях последовательности (см. таблицу). Реакционные смеси на приборе MicroCycler Е (Eppendorf, США) со следующими параметрами инкубации: 1 мин.вышеупомянутыми рестрикционными эндонуклеазами и клонировали в предварительно обработанный теми же эндонуклеазами плазмидный вектор pUC19 с получением плазмид представленных в таблице. Последовательность клонированного фрагмента подтверждали при помощи секвенирования.Метод разделения ДНК в неденатурирующих условиях Для экспериментов ДНК олигонуклеотиды метили при помощи Т4 полинуклеотидкназы (Sambrook и сотр., 1989). Для разделения фрагментов ДНК использовали трис- ацетатную буферную систему и 10% полиакриламидныи гель с отношением акриламида к метиленбисакриламиду 19:1. Перед наносением образцов к ним добавляли 1/10 объёма буфера нанесения (0,04 М трис-ацетатный буфер, 50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол). При проведении электрофоретического разделения использовали стёкла 170x170 мм, при толщине геля 1.5 мм и аппарат модели SE 400 (Hoefer Scientific Instruments, США). Разделение проводили при напряжении 50-100 в течение 5-7 часов. После проведения электрофореза гель вынимали из стёкол и экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи профаммы ImageOuant 5.2 (Molecular Dynamics).Метод изменения электрофоретической подвижности ДНК в полиакриламидном геле Для экспериментов ДНК олигонуклеотиды метили при помощи Т4 полинуклеотидкназы (Sambrook и сотр., 1989). Для разделения фрагментов ДНК использовали трис- ацетатную буферную систему и 5% полиакриламидныи гель с отношением акриламида к метиленбисакриламиду 19:1. Гель и буферный раствор содержал 10 мМ ацетат магния.Образцы в объёме 10 мкл наносили в трис-ацетатном транскрипционном буфере, содержащем 5% глицерина. В крайнюю дорожку геля наносили равный объём разбавленного в 10 раз буферного раствора с красителем (0,04 М трис-ацетатный буфер,

50% глицерин, 0.25% бромфеноловый синий и 0.25% ксиленцианол) для наблюдения за фронтом разделения. Электорофорез проводили при постоянной силе тока 35 мА в течение

3-4 часов. После проведения электрофореза гель вынимали из стёкол, переносили на фильтровальную бумагу 3мм Chr (Whatman, США) и высушивали на сушилке Slab Dryer 483 (Bio-Rad, США). Высушенный гель экспонировали с экраном Phospoimager (Molecular Dynamics). Экран сканировали на приборе Storm 860 (Molecular Dynamics). Результаты анализировали при помощи профаммы ImageOuant 4.2 и 5.2 (Molecular Dynamics).Выделение Т7 РНК полимеразы с использованием аффинной хроматографии Для получения РНК полимеразы использовали штамм BL21, несущий плазмиду рВН161, которая несёт модифицированный ген РНК полимеразы с добавлением шести остатков гистидина к N- концу фермента (Не и сотр., 1997). Для приготовления ночной культуры в пробирку с 3 мл среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, переносили одиночную колонию со свежей чашки и инкубировали 16-18 часов без встряхивания при 30" 0,5 мл культуры переносили в 100 мл среды LB в колбе объёмом 500 мл и инкубировали при 600 нм, отбирали образец культуры (1 мл) для анализа (приготовление см. ниже), после чего добавляли 0,1 М ИПТГ до конечной концентрации 0,5 мМ и продолжали инкубацию в течение 4 часов. Клетки собирали центрифугированием (25 мин., 3500 об/мин (Sorvall RT 6000В, Du Pont, США)) в 50 мл полипропиленовых пробирках BlueMax (Becton Dickinson культуры отбирали 125 мкл, переносили в 1,5 мл полипропиленовую пробирку Eppendotf, центрифугировали 2 мин. при 15000 об/мин (VSMC-13, Shelton Scientific, США). Клеточный осадок ресуспендировали в 60 мкл воды, добавляли 20 мкл буфера нанесения (0,2 М Трис С1, рН 6,8, 4 % ДСН, 1 М меркаптоэтанол, 40% глицерин, 0,001 % бромфеноловый синий) и полиакриламидном геле (см. выше). К выделению приступали при наличии ясно видимой зоны экспрессированного белка после индукции. Клеточный осадок из 100 мл культуры

0,5 М хлорид натрия, 0.05% твин-20, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 4% глицерин) в 15 мл центрифужной пробирке. К суспензии добавляли 1/100 100 мМ раствора фенилметилсульфонилфлуорида (Sigma, США) для ингибиторования протеазной активности и 1/100 10% раствора деоксихолата натрия. Клетки подвергали обработке ультразвуком на приборе 550 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific) в течение 20 мин. в режиме 30 сек.включено, 30 сек. выключено в ледяной бане. Разрушенные компоненты клеток удаляли центрифугированием 15 мин., 10000 д, 4** С (Sorvall, RC-B5, Du Pont, США). К супернатанту добавляли 5 М раствор хлорида натрия до конечной концентрации 0,8 М и 1/40 10% раствора полиэтиленимина и инкубировали 10 мин. на льду. После удаления осадка насыщенного раствора сульфата аммония (рН 7) и выдерживали 30 мин. на льду. Осадок мл буфера для лизиса, содержащего 5 мМ имидазола и 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорида, нерастворённые компоненты удаляли колонку для афинной хроматографии на N1^ "^ - агарозном сорбенте (Quiagen). Для приготовления колонки использовали 1 мл суспензии Ni^*- агарозы в 50% этаноле, которую помещали в пустую хроматографическую колонку Poly-Prep (Bio-Rad, США, номер по каталогу 731-1550), после чего позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 0,6 мл сформированного носителя.Колонку промывали 2 мл (более 3 объёмов) воды, 3 мл (более 5 объёмов) 50 мМ сульфата никеля (для достижения максимальной ёмкости) и 2 мл воды. Колонку уравновешивали 2 мл буфера для лизиса, содержащего 5 мМ имидазола. Мёртвый объём колонки составлял около 200 мкл (б капель). После нанесения супернатанта собирали фракции в объёме 1,5 мл.Колонку последовательно промывали буфером для лизиса, содержащим имидазол в возрастающих концентрациях: 5 мл буфера с 20 мМ имидазола, 1 мл с 60 мМ и 3 мл с 200 мМ. Содержание РНК полимеразы проверяли нанесением образцов фракций на гель с ДСН, Обычно пик содержался в двух последних фракциях. Полученный раствор концентрировали или Vivaspin 50000 MWCO (Vivascience, Германия). Во время концентрации производили смену буфера на буфер для хранения (40 мМ трис-НС1 (рН 7.9), 100 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 1 мМ ЭДТА, 4% глицерин). После концентрации к раствору белка добавляли глицерин до конечной концентрации 50%. Концентрацию белка определяли спектрофотометрически при длине волны 280 нм, используя коэффициент экстинкции 1,4 х Выделение Т7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматографии При выделении мутантных белков, не модифицированных добавлением остатков гистидина, использовали метод ионнообменной хроматографии. Приготовление клеточных культур, индукцию и озвучивание проводили как описано выше. После переосаждения сульфатом аммония осадок растворяли в 4 мл буфера нанесения Р11 (20 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 50 мМ хлорид натрия, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорид, 5 мМ р меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин) и деализовали против 100 объёмов этого же буфера подготовленную колонку с фосфоцеллюлозой Р11 (Whatman, США). Сорбент обрабатывали согласно рекомендации производителя. 2 мл суспендированной фосфоцеллюлозы помещали в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 1 мл сформированного носителя.Мёртвый объём составлял около 300 мкл (7 капель). Колонку уравновешивали 5 мл буфера нанесения Р11. После нанесения диализного раствора на колонку собирали фракции по 1,5 мл. Колонку промывали 5 мл буфера нанесения Р11. Белок элюировали в четырёх фракциях по 1 мл буфера для элюции (буфер нанесения, содержащий 200 мМ фосфат натрия (рН 7.7) и 400 мМ хлорид натрия). Пиковые фракции определяли при помощи денатурирующего электрофореза в геле. К объединённым фракциям добавляли 15 объёмов буфера доведения (12,5 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 25 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5%

глицерин). Полученный раствор наносили на подготовленную колонку с DE52 (Whatman, США). Диэтиламиноэтилцеллюлозный сорбент обрабатывали согласно рекомендации производителя. 2 мл суспендированного сорбента помещали в колонку Poly-Prep (Bio-Rad) и позволяли сорбенту осесть при протекании раствора под действием силы тяжести. В результате получали около 1 мл сформированного носителя. Мёртвый объём составлял около 300 мкл (7 капель). Колонку уравновешивали 5 мл буфера нанесения DE52 (25 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 50 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин).После нанесения образца колонку промывали 5 мл буфера нанесения DE52, фракции собирали в объёме 1,5 мл. Связанный белок элюировали буферным раствором, содержащим 25 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 125 мМ хлорид натрия, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% \ глицерин. Пиковые фракции объединяли и концентрировали, как описано выше.Выделение GAL4-T7 РНК полимеразы методом ионнообменной хроматофафии При выделении данного белка использовали метод ионнообменной хроматографии на фосфоцеллюлозе. Приготовление клеточных культур, индукцию и озвучивание проводили как описано выше для выделения РНК полимеразы методом ионнообменной хоматографии.В методику далее внесены следующие изменения. При переосаждении сульфатом аммония добавляли 3/5 объема насыщенного раствора сульфата аммония, затем все процедуры выполнялись как описано выше. Буфер для нанесения на фосфоцеллюлозную колонку содержал 20 мМ фосфат натрия (рН 7.7), 200 мМ хлорид натрия, 2 мМ ЭДТА, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфлуорид, 5 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ 5% глицерин. Для промывания колонки использовали этот же буфер, содержащий 80 мМ фосфата натрия. В буфере для элюции концентрация фосфата натрия составляла 400 мМ. Пиковые фракции определяли, концентрировали и хранили, как описано выше. Концентрацию белка определяли при помощи денатурирующего электрофореза против контрольного стандарта РНК полимеразы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кукарин, Александр Вячеславович, Москва

1. Ляхов д. л., Ильгенфриц X., Чернов Б. К., Драган М., Речинский В. О., Похолок Д.К.,

2. Туницкая В. Л., Кочетков Н. (1992). "Сайт-специфический мутагенез остатка Lys-172 РНКполимеразы фага Т7: характеризация транскрипционных свойств мутантных белков."

3. Молекулярная биология 26(5): 1022-35.

4. Туницкая В. Л., Лучин В., Мемелова Л. В., Ляхов Д. Л., Речинский В. О., Кочетков

5. Н. (1989). "Аффинная модификация ДНК зависимой РНК-полимеразы бактериофага Tl 5'-Рфлюорофосфонилбензоил аденозином: влияние модификации на взаимодействие с субстратом." Молекулярная биология 23(5): 1273-8.

6. Bandwar, R. Р., Y. Jia, N. М. Stano and S. S. Patel (2002). "Kinetic and thermodynamic basisof promoter strength: multiple steps of transcription initiation by T7 RNA polymerase are modulated by the promoter sequence." Biochemistry^1{11): 3586-95.

7. Brieba, L. G. and R. Sousa (2001). "T7 promoter release mediated by DNA scrunching."1. Embo J 20{23): 6826-35.

8. Brieba, L. G. and R. Sousa (2001). "The T7 RNA polymerase intercalating Ьа1ф1п isimportant for promoter opening during initiation but not for RNA displacement or transcription bubble stability during elongation." Biochemistry 40{13у. 3882-90.

9. Cheetham, G. M., D. Jeruzalmi and T. A. Steitz (1999). "Structural basis for initiation oftranscription from an RNA polymerase- promoter complex." /Vaft/ле 399(6731): 80-3.

10. Cheetham, G. M. and T. A. Steitz (1999). "Structure of a transcribing T7 RNA polymeraseinitiation complex." Science 286(5448): 2305-9.

11. Christiansen, J. (1988). "The 9S RNA precursor of Escherichia coli 5S RNA has threestructural domains: implications for processing." IVudeic Acids Res 16{15): 7457-76.

12. Dunn, J. J. and F. W. Studier (1980). "The transcription termination site at the end of theearly region of bacteriophage T7 DNA." /Vucieic Acids Res 8{10): 2119-32. *^. л

13. Dunn, J. J. and F. W. Studier (1983). "Complete nucleotide sequence of bacteriophage T7

14. DNA and the locations of T7 genetic elements." J/i/o/fi'/o/166(4): 477-535.

15. Golomb, M. and M. Chamberiin (1974). "Characterization of T7-specific ribonucleic acidpolymerase. IV. Resolution of the major in vitro transcripts by gel electrophoresis." J Biol Chem 249(9): 2858-63.

16. Gunderson, S. I., K. A. Chapman and R. R. Burgess (1987). "Interactions of T7 RNApolymerase with T7 late promoters measured by footprinting with methidiumpropyl-EDTAiron(II)." Biochemistry 2S{e)\ 1539-46.

17. Hartvig, L. and J. Christiansen (1996). "Intrinsic termination of T7 RNA polymerase mediatedby either RNA or DNA." EmboJlS{X7)\ 4767-74.

18. He, В., A. Kukarin, D. Temiakov, S. T. Chin-Bow, D. L. Lyakhov, M. Rong, R. K. Durbin and

19. W. T. McAllister (1998). "Characterization of an unusual, sequence-specific termination signal for

20. T7 RNA polymerase." 7 5fo/C77e/n 273(30): 18802-11.

21. He, В., M. Rong, D. Lyakhov, H. Gartenstein, G. Diaz, R. Castagna, W. T. McAllister and R. K.

22. Durbin (1997). "Rapid mutagenesis and purification of phage RNA polymerases." Protein Expr Purif9(1): 142-51.

23. Huang, J. and R. Sousa (2000). "T7 RNA polymerase elongation complex structure andmovement." 7 Ato/5/0/303(3): 347-58. 1.eda, R. A. (1992). "The efficiency of promoter clearance distinguishes T7 c la^ I I and class

24. Jeng, S. Т., J. F. Gardner and R. I. Gumport (1990). "Transcription temnination bybacteriophage T7 RNA polymerase at riio- independent terminators." J Biol Chem 265(7): 382330.

25. Jia, Y. and S. S. Patel (1997). "Kinetic mechanism of transcription initiation by bacteriophage

26. T7 RNA polymerase." B/oc/iem/stry 36(14): 4223-32.

27. V Kumar, A. and S. S. Patel (1997). "Inhibition of T7 RNA polymerase: transcription initiationand transition from initiation to elongation are inhibited by T7 lysozyme via a ternary complex with

28. RNA polymerase and promoter DNA." B/oc/iem/stry 36(45): 13954-62.

29. DHA."/^o/Ce//В/о/16(7): 3773-80.1.ng, M. L., S. S. Risman, J. F. Klement, N. McGraw and W. T. McAllister (1989). "Abortive initiation by bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases under conditions of limiting substrate."

30. Macdonald, L. E., R. K. Durbin, J. J. Dunn and W. T. McAllister (1994). "Characterization oftwo types of termination signal for bacteriophage T7 RNA polymerase." J Mol Biol 238(2): 145-58.

31. Macdonald, L. E., Y. Zhou and W. T. McAllister (1993). "Termination and slippage bybacteriophage T7 RNA polymerase." 7 A/o/5to/232(4): 1030-47.

32. Martin, С Т., D. К. Muller and J. E. Coleman (1988). "Processivity in eariy stages of;;) transcription by T7 RNA polymerase." Biochemistry 17{11): 3966-74.

33. Maslak, M. and C. T. Martin (1993). "Kinetic analysis of T7 RNA polymerase transcriptioninitiation from promoters containing single-stranded regions." Biochemistry 32{16): 4281-5.

34. McAllister, W. T. (1997). "Transcription by T7 RNA polymerase." Nucleic Acids and Molecular1. Biology 11: 15-25.

35. McAllister, W. T. and R. J. McCarron (1977). "Hybridization of the in vitro products ofbacteriop&hage T7 RNA polymerase to restriction fragments of T7 DNA." Virology S7{2y. 288-98.

36. McAllister, W. Т., Morris, A. H. Rosenberg and F. W. Studier (1981). "Utilization ofbacteriophage T7 late promoters in recombinant plasmids during infection." J Mol Biol 153(3): 527-44.

37. Mead, D. A., E. Szczesna-Skorupa and B. Kemper (1986). "Single-stranded DNA 'blue' T7promoter plasmids: a versatile tandem promoter system for cloning and protein engineering." 1. Protein Eng 1(1): 67-74.

38. Mentesana, P. E., S. T. Chin-Bow, R. Sousa and W. T. McAllister (2000). "Characterization ofhalted T7 RNA polymerase elongation complexes reveals multiple factors that contribute to stability." J Mol Я/о/302(5): 1049-62. 1. Л -4) i л

39. Milligan, J. F., D. R. Groebe, G. W. Witherell and O. С Uhlenbeck (1987)."Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates." Nucleic /lac's/?e515(21): 8783-98.

40. Moffatt, B. A. and F. W. Studier (1987). "T7 lysozyme inhibits transcription by T7 RNApolymerase." Ce//49(2): 221-7.

41. Muller, D. K., С Т. Martin and J. E. Coleman (1988). "Processivlty of proteolytically modifiedforms of T7 RNA polymerase." Biochemistry 27(15): 5763-71.

42. Ostrander, E. A., P. Benedetti and J. C. Wang (1990). "Template supercoiling by a chimeraof yeast GAL4 protein and phage T7 RNA polymerase." Science 249(4974): 1261-5.

43. Patra, D., E. 1^. Lafer and R. Sousa (1992). "Isolation and characterization of mutantbacteriophage T7 RNA polymerases."-7 Л/о/Я/о/224(2): 307-18.

44. Place, С, J. Oddos, H. Buc, W. T. McAllister and M. Buckle (1999). "Studies of contactsbetween T7 RNA polymerase and its promoter reveal features in common with multisubunit RNA polymerases." Biochemistry 38{16y. 4948-57.

45. Raskin, С A., G. A. Diaz and W. T. McAllister (1993). "T7 RNA polymerase mutants withaltered promoter specificities." Proc Natl Acad Sci U S A 90(8): 3147-51.

46. Rong, M., B. He, W. T. McAllister and R. K. Durbin (1998). "Promoter specificitydeterminants of T7 RNA polymerase." Proc Natl Acad Sci U S A 95(2): 515-9.

47. Sambrook, J., E. F. Fritsch and T. Maniatis (1989). Molecular Cloning : a laboratory manual.

48. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

49. Sousa, R. (1996). "Structural and mechanistic relationships between nucleic acidpolymerases." Trends Biochem Sci 21{S)\ 186-90.

50. Sousa, R., Y. J. Chung, J. P. Rose and B. С Wang (1993). "Crystal structure ofbacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution." /Vaftyre 364(6438): 593-9.

51. Sousa, R., D. Patra and E. M. Lafer (1992). "Model for the mechanism of bacteriophage T7

52. RNAP transcription initiation and termination." 7/i/o/Ял?/224(2): 319-34.1. Л,1

53. Stano, N. М. and S. S. Patel (2002). "The intercalating beta-hairpin of T7 RNA polymeraseplays a role in promoter DNA melting and in stabilizing the melted DNA for efficient RNA synthesis." J Mo/ Bio/315(5): 1009-25.

54. Tahirov, T. H., D. Temiakov, M. Anikin, V. Patlan, W. T. McAllister, D. G. Vassylyev and S.

55. Yokoyama (2002). "Strucure of a T7 RNA polymerase elongation complex at 2.9 A resolution."1. Nature420(6911): 43-50.

56. RNA polymerase promoter." J Mo/ В/о/273('^): 775-81.

57. Villemain, J., R. Guajardo and R. Sousa (1997). "Role of open complex instability in kineticpromoter selection by bacteriophage T7 RNA polymerase." 7 А/о/^Уо/273(5): 958-77.

58. Villemain, J. and R. Sousa (1998). "Specificity in transcriptional regulation in the absence ofspecific DNA binding sites: the case of T7 lysozyme." J/i/c/5'/o/281(5): 793-802.

59. Weston, B. F., I. Kuzmine and С Т. Martin (1997). "Positioning of the start site in theinitiation of transcription by bacteriophage T7 RNA polymerase." 7 Л/о/^Уо/272(1): 21-30.

60. Young, R. A. (1979). "Transcription termination in the Escherichia coli ribosomal RNA operonrrnC." J В/о/ C/iem 254(24): 12725-31.

61. Zhang, X. and F. W. Studier (1995). "Isolation of transcriptionally active mutants of T7 RNApolymerase that do not support phage growth." 7/i/o/F/b/250(2): 156-68.

62. Zhang, X. and F. W, Studier (1997). "Mechanism of inhibition of bacteriophage T7 RNApolymerase byT7 lysozyme."7A/o/5'/o/269(l): 10-27. » 1. Й