Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение особенностей регуляции активности генов и контроля времени их репликации в домене альфа-глобиновых генов кур
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология
Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей регуляции активности генов и контроля времени их репликации в домене альфа-глобиновых генов кур"
На правах рукописи УДК 576 315 42
КЛОЧКОВ Денис Борисович
ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ И КОНТРОЛЯ ВРЕМЕНИ ИХ РЕПЛИКАЦИИ В ДОМЕНЕ АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ ГЕНОВ КУР
Специальность 03 00 03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Мойква-2007
003160866
Работа выполнена в рамках программы Российско-Французского научного сотрудничества в лаборатории структурно-функциональной организации хромосом Института биологии гена РАН (Москва, Россия) и лаборатории хроматина, развития и канцерогенеза Института им Густава Русси (Вшшьжуиф, Франция)
Научные руководители:
чл -корр РАН, доктор биологических наук, профессор С В Разин
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Е С Васецкий
кандидат биологических наук, профессор И А Крашенинников
доктор биологических наук Е Н Набирочкина
Ведущая организация:
Институт биорганической химии
им академиков М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН
Захцита состоится 23 октября 2007 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 037 01 при Институте биологии гена РАН по адресу 119334 Москва, ул Вавилова, д 34/5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им В.А Энгельгардта РАН по адресу 119991 Москва, ул Вавилова, д 32
Автореферат разослан 24 сентября 2007 года
Ученый секретарь Диссертационного совета канд фарм наук
Грабовская Л С
Общая характеристика работы.
Актуальность проблемы.
Доменная гипотеза организации генома высших эукариот постулирует, что геном состоит из единообразных структурно-функциональных единиц - геномно-хроматиновых доменов, функционирующих сходным образом Эта гипотеза базируется на результатах изучения ряда тканеспецифических генов и кластеров генов (бета-глобиновые гены позвоночных, ген лизоцима кур, ген аполипопротеина В человека и др) В последние годы широкомасштабное изучение организации геномов различных позвоночных показало, что существует множество «неканонических» доменов, которые часто называют доменами открытого типа Одной из основных характеристик этих доменов является их расположение в богатых генами областях генома, где тканеспецифичные гены соседствуют с неродственными генами «домашнего хозяйства»
Ярким примером геномных доменов с перекрывающимися генами является домен а-глобиновых генов кур В этом домене 5'-регуляторная область кластера тканеспецифичных а-глобиновых генов перекрывается с геном «домашнего хозяйства» 2§РЯХ Как следствие такого перекрывания имеет место интерференция регуляторных систем неродственных генов В настоящей работе идентифицированы два регуляторных элемента из 5'-фланкирующей области а-глобинового домена - промотор гена ggPRX и находящийся поблизости от него СТСР-зависимый сайленсер Предложена модель функциональной изоляции гена ggPRX от кластера а-глобиновых генов с участием этих регуляторных элементов Особенностью доменов открытого типа является то, что в рамках этих доменов каким-то образом должны совмещаться принципиально разные репликационные программы, типичные для генов «домашнего хозяйства» и тканеспецифичных генов Вопрос о том, какая из этих программ реализуется в каждом конкретном случае практически не изучен Поэтому данная работа также посвящена определению времени репликации а-глобиновых генов кур в клетках различного происхождения
Следует отметить, что структурно-функциональные особенности организации доменов открытого типа, содержащих одновременно тканеспецифичные гены и гены «домашнего хозяйства», сравнительно мало изучены О молекулярных механизмах, обеспечивающих функциональную изоляцию перекрывающихся регуляторных систем, так же как и о процессах, лежащих в основе выбора программы репликации в доменах с перекрывающимися генами, практически ничего неизвестно В то же время домены открытого типа широко представлены в геноме высших эукариот Изучение структурно-функциональных особенностей этих доменов, понимание механизмов, регулирующих процессы транскрипции и репликации в таких доменах, позволит лучше понять общие принципы организации эукариотического генома Именно это определяет актуальность темы данной диссертационной работы
Цели и задачи исследования.
В работе были поставлены следующие задачи
1) выяснить, каким образом обеспечивается контроль экспрессии гена в процессе эритроидной дифференцировки,
2) определить, существует ли зависимость между временем репликации и транскрипционным статусом а-глобиновых генов кур
Научная новизна и практическая ценность работы.
В работе впервые продемонстрировано существование «кондиционного» СТСБ-зависимого сайленсера в геноме позвоночных Показано, что данный регуляторный элемент, расположенный в пределах Срв-островка из 5'-регуляторной области домена а-глобиновых генов кур, активен только в эритроидных клетках Вблизи него картирован промотор гена «домашнего хозяйства» ggPRX Предложена оригинальная модель разграничения перекрывающихся регуляторных систем в домене а-глобиновых генов кур, осуществляющегося при участии обнаруженных регуляторных элементов В геноме человека найдены гомологи идентифицированных в настоящей работе регуляторных элементов в той же позиции относительно кластера а-глобиновых генов, что и в курином геноме Эти данные позволяют предположить, что предложенная модель является эволюционно консервативной и может быть применима для объяснения механизмов функционирования и других доменов с перекрывающимися генами Кроме того, нами впервые определена временная программа репликации домена а-глобиновых генов кур Высказано предположение о контроле времени репликации конкретного участка генома на уровне структуры хроматина
Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие представлений о структурно-функциональной организации эукариотического генома
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были представлены на 9-ой международной конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2005), на 6-ой международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), на международных школах, конференциях и конгрессах «Gliwice Scientific Meetings 2004» (Гливицы, Польша, 2004), EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics (Ла Гранд Мотт, Франция, 2005), 18th IGB Meeting «Epigenetic Bases of Genome Reprogramming» (Капри, Италия, 2005), ESF - JSPS Workshop on Functional Genomics (Канагава, Япония, 2006), ICGEB-TUBITAK Workshop on Emerging Topics in Human Functional Genomics and Proteomics (Антапия, Турция, 2006), 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Киото, Япония, 2006), 4th International Summer School «DNA and Chromosomes 2006» (Каржез, Франция, 2006), 32nd FEBS Congress «Molecular Machines» (Вена, Австрия, 2007), EMBO Conference on Nuclear Structure and Dynamics (Монпелье, Франция, 2007)
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ Из них статей - 2, тезисов докладов и материалов конференций - 11
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 150 страницах, содержит 20 рисунков и 2 таблицы, состоит из следующих разделов введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 301 цитируемый источник
Результаты исследований
I Обнаружение CTCF-зависймого сайленсера, расположенного рядом с промотором
гена ogPRX
Кластер регулируемых в развитии куриных а-глобиновых генов содержит эмбриональный (я) и два взрослых (аА и агена (рис 1А) Он находится в «открытой», ДНКаза-чувствительной, конфигурации вне зависимости от клеточной дифференцировки, хотя экспрессия а-глобиновых генов строго ограничена клетками эритроидного происхождения [Craddock et al, 1995] Этот факт может объясняться тем, что домен а-глобиновых генов лежит в богатой генами области генома В частности, в 5'-фланкирующей области а-глобинового домена находится ген «домашнего хозяйства», который транскрибируется в направлении, противоположном транскрипции глобиновых генов, в геноме человека [Vyas et al, 1995], курицы [Sjakste et al, 2000] и мыши [Kielman et al, 1993] Кроме того, главный регуляторный элемент домена, активирующий экспрессию а-глобиновых генов, лежит в одном из интронов этого гена «домашнего хозяйства» [Flint et al, 2001] В данном случае мы сталкиваемся с ситуацией, когда тканеспецифичный домен перекрывается с доменом повсеместно экспрессирующегося гена Таким образом, домен а-глобиновых генов курицы представляет собой яркий пример домена открытого типа [Razm et al, 2003] Регуляторные системы доменов такого типа остаются пока мало исследованными и как следствие плохо понятыми
Нашей задачей было попытаться понять, как достигается функциональная изоляция куриного гена «домашнего хозяйства» ggPRX от перекрывающегося с ним домена а-глобиновых генов Дело в том, что промотор гена ggPRX лежит между главным регуляторным элементом (MRE) а-глобинового домена и кластером самих а-глобиновых генов В процессе эритроидной дифференцировки происходит активация энхансера в составе главного регуляторного элемена а-глобинового домена и начинается ацетилирование гистонов вдоль всей 5'-фланкирующей области домена, включающей часть гена ggPRX и его промотор [Anguita et al, 2001] Изменение статуса ацетилирования гистонов в промоторной области гена ggPRX и действие мощного вышележащего энхансера в процессе эритроидной дифференцировки могут влиять на экспрессию гена ggPRX, повышая ее уровень Тем не менее, экспрессия гена ggPRX в эритроидных клетках остается на прежнем «базовом» уровне [Sjakste et al, 2000] Это указывает на существование неких регуляторных систем, стабилизирующих уровень экспрессии гена ggPRX в эритроидных клетках
Мы предположили, что в регуляции экспрессии гена ggPRX могут участвовать энхансер-блокирующие элементы У позвоночных животных эти элементы работают при участии многофункционального белкового фактора CTCF [Bell et al, 1999] Поэтому мы решили
6
проверить, есть ли участки связывания СТСБ рядом с промотором гена ggPRX Из ранее опубликованных работ было известно, что транскрипция гена ggPRX начинается в пределах Срв-богатой области, лежащей на расстоянии 25-5тпн от начала а-глобинового я-гена [Ууав е1 а1, 1995, е1 а1, 2000] В связи с этим нашей первой задачей был анализ нуклеотидной
последовательности упомянутого Срв-островка на предмет наличия потенциальных участков связывания СТСТ
{дм ш ни
-15 -10 -5 0 +5 ^
DHs
+10 т п н
ggPRX
% aDaA
Smal 13802 Н039)
гаетоксывлаяшСГСТ GCTCCCGGTGCCCaCCQTTCCTCCCAùCAeCTCGCAtlTGÇAQCCQTQCCT F5I TAftTTfcCQTCCCTCCC- -CGGCTAGGSiG-GCAGCAG-GC
юинсснсуе CQT CCTCCG С CT О G GCAGC G QC
Рис 1 Схематическое изображение регуляторных и структурных элементов куриного а-глобинового домена
(А) Показано распределение участков гиперчувствительности к ДНКазе1 - DHs (черные стрелки соответствуют эритроид-специфическим участкам, тонкие стрелки - промоторным областям, белые стрелки - постоянным участкам) Глобиновые гены изображены в виде черных прямоугольников Незакрашенным прямоугольником обозначен CpG-островок, включающий промотор гена ggPRX и точку инициации репликации Горизонтальными стрелками указано направление репликации Позиция и направление транскрипции гена ggPRX показаны пунктирной линией Черный треугольник указывает на эритроид-специфичный энхансерно-сайленсерный элемент (Б) Предполагаемый участок связывания с CTCF (50 п н ) расположен в пределах 200 п н Smal-фрагмента из CpG-островка Стрелка указывает направление транскрипции гена ggPRX Консервативные мотивы, выявленные при сравнении последовательности предполагаемого участка связывания CTCF из 5'-фланкирующей области куриного домена а-глобиновых генов с CTCF-узнающей последовательностью FII из 5'-инсулятора домена Р-глобиновых генов кур, выделены жирным шрифтом Номера, обозначающие позиции Smal-сайтов, соответствуют депонированной в GenBank последовательности под номером AF098919, номера в скобках указывают расстояние от точки старта транскрипции л-гена
11 Обнаружение потенциального участка связывания CTCF в пределах CpG-octpobka,
расположенного в 5'-фланкирующей областидомена альф а-глобиновых генов кур
Проведенный нами анализ нуклеотидной последовательности СрО-островка из 5'-
фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур позволил выявить участок высокой
гомологии с «классической» СТСР-связывающей последовательностью РП из 5'-инсулятора
7
куриного домена ß-глобиновых генов [Bell et al, 1999] Мы обнаружили ~50 пн последовательность, которая с ~70% точностью совпадала по нуклеотидному составу с последовательностью FII-инсулятора (рис 1Б) Найденный участок лежал в пределах 200 п н Smal-фрагмента с координатами 13603 - 13802 на последовательности ДНК, депонированной в базе данных GenBank под номером AF098919 Эта последовательность включает собственно кластер а-глобиновых генов кур и 5'-регуляторную область этого кластера В пользу наличия потенциального участка связывания CTCF в пределах найденной 50 п н последовательности говорило присутствие консервативных мотивов - ССТССС и GCAGC, а также сохранение позиции консервативного CpG-динуклеотида относительно ССТССС-мотива (рис 1Б)
I 2 CTCF взаимодействует IN VITRO с изучаемой последовательностью ДНК
С тем, чтобы определить, действительно ли CTCF связывается с найденной нами последовательностью ДНК, мы поставили опыты по задержке электрофоретической подвижности в геле, которые позволяют судить о наличии в составе изучаемого фрагмента ДНК участков связывания для различных белковых факторов В качестве источника белковых факторов мы использовали экстракт ядерных белков, полученный из клеток линии куриных эритробластов HD3 Электрофорез белков в денатурирующих условиях и последующий Вестерн-блот анализ с использованием CTCF-специфичных антител подтвердил наличие эндогенного CTCF в составе полученного нами экстракта ядерных белков (рис 2В) В результате эксперимента по задержке подвижности при электрофорезе в полиакриламидном геле 200 п н фрагмента ДНК, содержавшего потенциальный участок связывания CTCF, мы обнаружили полосу с замедленной подвижностью, соответствующую ДНК-белковому комплексу (рис 2А) Следовательно, изучаемый 200 п н фрагмент ДНК связывался с неким белковым фактором, присутствующим в экстрактах из куриных клеток HD3 Судя по степени задержки, данный белковый фактор обладал большой молекулярной массой, то есть в принципе это мог быть CTCF Для того, чтобы проверить это предположение, были поставлены опыты по конкуренции связывания избытком немеченого («холодного») двуспирального олигонуклеотида (FII), содержащего канонический участок связывания CTCF из 5'-инсулятора домена ß-глобиновых генов кур Данный олигонуклеотид эффективно конкурировал с изучаемым фрагментом ДНК за связываемый белковый фактор уже при 10-кратном молярном избытке специфического конкурента сигнал, соответствовавший ДНК-белковому комплексу, практически полностью исчезал (рис 2А) В следующей серии экспериментов по задержке подвижности в геле мы использовали наряду с обычным ядерным экстрактом из клеток HD3 экстракт, обогащённый куриным белком CTCF (рис 2В) Для получения такого экстракта проводили сверхэкспрессию куриного белка CTCF в клетках COS-1 В
эксперимент« С обогащенным экстрактом была зарегистрирована зона замедленной подвижности на одном уровне с полосой, соответствовавшей ДНК-белковому комплексу, образованному в результате связывания изучаемого фрагмента с белковым фактором из ядер клеток ПОЗ, и во много раз её превосходившая по интенсивноеги (рис 2Б). Этот факт легко объясняется тем, что увеличенное количество белка ÇTCF в обогащенном экстракте связывает большее количество свободного меченого фрагмента; Результаты экспериментов но задержке подвижности л геле с добавлением конкурентной С ТС F-c в взывающей последовательности FII й использованием обогащенного белком CTCF ядерного экстракта позволяют Заключить, что фактором, взаимодействующим с изучаемой последовательностью ДНК, действительно является CTCF.
Рис. 2. С ТС F взаимодействует In vitro с фрагментом CpG-острочк:) m 5'-фланкнрующей области куриного доменя
в-глоби новых генов,
(А) Эксперименты но задержке электрофоретической подвижности в ноли акрила м и дно м геле с использованием ядерных экстрактов из клеток HD3 без и с добавлением избытка ( 1 Ох - 5Ох) специфического немеченого конкурента (F1I). (Б) Эксперименты но задержке электрофоре™ чес кий подвижности в полиакриламидном геле с Использованием ядерных экстрактов из клеток I-1D3 и клеток COS 1, суперэкспрессирующих куриный белок СТСТ.
(fï) Вестсрн-блот анализ ядерных экстрактов из клеток HD3 и клеток COS-I,
1.3. Метилирование изучаемой последовательности ДНК
ПРЕДОТВРАЩАЕТ ЕЁ СВЯЗЫВАНИЕ С CTCF.
Известно, что метилирован не CpG-динуклеотидов в участке связывания CTCF препятствует связыванию, Li пределах изучаемой нами 50 п.и. СТСТ-снязыпающей последовательности содержится 5 CpG-динуклеотидов, являющихся мишенями для метилирования. Мы решили проверить, влияет ли метилирование этих CpG-динуклеогпдон на связывание CTCF in vitro, Ьыл приготовлен следующий набор дву спиральных синтетических олигонуклеотидов: 50 н.н. изучаемый участок связывания CTCF (С), участок связывания CTCF. полностью метилированный по всем 5 CpG-динуклеотндам (FM) л 5 олнгонуклеотидов, метилированных по одному из пяти CpG-динуклеотидов (MI - М5). Эти рлигонуклеотиды были
m
- * * * 13
- 1ûh 50x,
[¡мл -
П Cost-
Il D3 CTCF
170 kD«-
130 kD*- ^^ 100 kO»-72kD>-
T
протестированы в экспериментах по задержке электрофоретаческой подвижности в пояиакрияа м и датой геле. По результатам этой серии экспериментов мы выяснили, что, как и предполагалась, полное метилирование всех 5 СрО-дннуклео гидов предотвращает Связывание СТСР, о чём можно судить по отсутствию специфической верхней полосы (рис. 3, КМ). Метилирование по позициям Срй-динуклеотидов 1 или 2 никак не влияло на связывание с СТСР (рис. 4Л, М1 и М2). Напротив, метилирование С рв-дину клеоти да по позиции 3 полностью предотвращало взаимодействие изучаемой последовательности с СТСР (рпс. 4А, МЗ). Метилирование по позициям СрО-ди ну клео гидов 4 или 5 понижало эффективность связывания изучаемой последовательности с СТСР, о чем свидетельствует значительное, но неполное исчезновение верхней полосы, соответствующей СТСР-ДНК комплексу (рис. 4А, М4 и М5).
ra (loa — — +— — — — — —
5S? - + + + + + + + + С С С FM М1 М2 МЗ М4 М5
,гм inar.i тесел гл • - • л :- - - -
m-v«TT.;,r спссс с:ст;г.;:о кием «
['ис. 3. Метилирование предотвращает связывание СТСР с изучаемой последовательностью.
Эксперименты по задержке э л ектрофорети ческой подвижности в пол и акрила инд ион теле с радиоактивно мечеными 50 п.н. о л и го 11 у клеоти да ми, представляющими неметилировайньш (С), полностью метилированный ■ FM) или метилированный по отдельным CpG-димуклеотидам (М1-М5) участок связьгиаЕшя CTCF. Ядерный 'экстракт был выделен из клеток МВД. Стрелка указывает на полосу с замедленной подвижностью, соответствующую специфическому комплексу CTCF с ЛНК.
Таким образом, СрС-дннуклеотиды 3, 4 и 5 участвуют в ДНК-белковом взаимодействии СТСР с изучаемой последовательностью. Причём роль 3-го СрО-динуклеотида наиболее важна, гак как метилирования гю одной этой позиции уже достаточно для полного предотвращения образования комплекса между СТСР и изучаемым фрагментом ДНК Стоит напомнить^ что именно 3-ий СрС-дппуклсотид является «консервативным» между изучаемым нами 50 п.н, участком связывания СТСР и П1 -последовательностью из 5"-Мнсулятора домена [В-глобиновых генов кур.
1.4. Анализ статуса метилирования изучаемой СТСР-связывающей последовательности
ДНК В КЛЕТКАХ ЭРИ ТРОИ ДНО ГО И ЛИМФОИДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ.
Исходя из полученных результатов, можно предположить, что дифференциальное метилирование изучаемой последовательности ДНК может играть эпигенетическую роль,
регулируя ее связывание с CTCF Поэтому мы решили сравнить статус метилирования изучаемой последовательности в клетках эритроидного и лимфоидного происхождения Для реализации данной задачи мы использовали комбинацию бисульфитного геномного секвенирования и ПЦР, чувствительной к метилированию Результаты, представленные на рис 4, указывают на то, что последовательность ДНК, охватывающая изучаемый участок связывания CTCF, неметилирована в эритроидных клетках HD3 и гиперметилирована в лимфоидных клетках DT40 Таким образом, фрагмент ДНК, содержащий CTCF-связывающий мотив, оказался метилирован в клетках неэритроидного происхождения, что, как было продемонстрировано выше, препятствует его связыванию с CTCF in vitro
5' 1 Ml M2 МЗ М4
- - -GCTCCCGGTGCCCGCCGrrCCTCCCAGCACCTCCCAGTGC 41 MS Мб М? М8 М9 AGCCGTOTGCC----CG- -CG— СО-—СО- - -
Рис 4 Статус метилирования С1СГ-связывающей последовательности в эритроидных (НМ) и лнмфондных (БТ40) клетках
Обработанную бисульфитом геномную ДНК из клеток ШЗЗ и ЭТ40 использовали как матрицу для амплификации с внутренних праймеров изучаемого фрагмента ДНК (200 п н ), содержащего 5 СрО-динуклеотидов в пределах СТСР-связывающей последовательности (М1-М5) и ещё 4 примыкающих Срв-динуклеотида (М6-М9) Продукты амплификации были клонированы и просеквенированы Результаты геномного бисульфитного секвенирования представлены в нижней части рисунка (для каждого типа клеток было проанализировано по 14 клонов) Метилированные и неметилированные Срв-динуклеотиды представлены как белые и чепные овалы соответственно
I 5 CTCF взаимодействует IN VIVO с изучаемой последовательностью ДНК
Как мы показали, метилирование предотвращает взаимодействие CTCF с изучаемой последовательностью ДНК in vitro, а сама последовательность в составе CpG-островка 5'-некодирующей области домена а-глобиновых генов кур по-разному метилирована в клетках эритроидного и лимфоидного происхождения В связи с этим, закономерным представляется вопрос о том, как взаимодействует CTCF с изучаемой последовательностью in vivo Наиболее удобным инструментом для получения ответа на этот вопрос является метод иммунопреципитации хроматина (ChIP) - один из немногих биохимических подходов,
позволяющих изучать ДНК-белковые взаимодействия in vivo. Используя данную методику, мы сравнили выделенный хроматин из эритроидных и лимфоидных клеток. На ДНК, полученной из фракции осажденного антителами против CTCF хроматина, проводилась ПЦР амплификация 200 it.п. области, включающей изучаемую последовательность ДНК. В качестве контроля мы ставили ПЦР на той же фракции ДНК с праймерами, амплифицирующими ß/с-энхансер из кластера р-глобиновых генов кур, так как достоверно известно, что CTCF не связывается с этим энхансером [Recilias-Targa et al., 2002 j. Результаты, представленные на рис. 5А, показывают, что CTCF связан с изучаемой нами последовательностью ДНК в клетках эритроидного (HL)3), но не лимфаидного (Г)Т40) происхождения, где она метилирована. Надо отметить, что CTCF экспрессируется в клетках DT40 [ Valadez-Graham et al., 2004]. Следовательно, отсутствие сигнала в лимфоидных клетках DT4Ö (рис. 5А) вызвано невозможностью взаимодействия CTCF с исследуемой последовательностью ДНК в связи с метилированием Cpü-дннуклеотидов в составе последней.
| I
hd3
I
Dtjo
I
■I
1.6. Изучаемый фрагмент ДНК обладает CTCF-зависимой активностью сайленсер^,
I
Так как участок связывания CTCF определяет энхан с ер-блокирующую функцию инСуряторов позвоночных [Bell ei al., 1999], представлялось интересным выяснить, проявляет ли изучаемая CTCF-связывающая последовательность свойства энхансер-б локирующего элемента. Для получения ответа на этот вопрос было приготовлено несколько генных конструктов, содержащих репоргернын ген под контролем энхансера и изучаемую последовательность ДНК, Базовый генетический конструкт для экспериментов по тестированию энхансер-блокируюишх свойств фрагментов ДНК включал репортерпыи ген хлорамфет i и ко лацетщггрансферазы (САТ), поставленный под контроль промотора ß -глобинового гена кур и p/е-энхаисера из домеиа ß-глобиновых генов кур (рис, 6, конструкт 1). Анализируемый фрагмент ДНК длиной 20Ü п.и., включающий найденную нами 50 м.н CTCF-евязывающую последовательность (рис. iE), был встроен в обеих ориентации между репортерным геном и энхансером (рис. 6, конструкты 3, 4) либо после энхансера так же в обеих ориентациях (рис. 6, конструкты 5, 6). Для анализа функциональной активности изучаемой нами последовательности ДНК был использован метод временной трансфекции линейных генетических конструктов в эукариотическне клетки, который,
triput 0,5 ng/pil
Input 0 5 ng/|il
Рис. 5. CTCF взаимодействует ш vivo с и зу ч а ем ой и осл едо вател ьн о ст ь ю.
Хроматин, полученный из клеток HD3 и DT40 иммунопрецигштировали с помощью антител против CTCF (CTCF) или преимунной сыворотки (PI). (А) ПЦР амплификация 200 п.н, фрагмента, содержащего участок связывания CTCF. (Б) «Контрольная» ПЦР амплификация ß/оэнхансера.
как было показано ранее, позволяет тестировать активность как сайда [Серов, так и инсуляторов [ReciJJas-Targa eiaJ., 1999].
Анализ активности репортерного гена CAT пЬказал, что анализируемый фрагмент ДНК существенно угнетает работу этого гена, будучи встроенным после энхансера и «Глобиновой» ориентации (т.е. совпадающей с направлением транскрипции а-глоби новых генов) н перед энхансером в противоположной ориентации (рис. 6, конструкты 4, 5). При положении исследуемою фрагмента в «глобиновой» ориентации перед энхансером й л противоположной ориентации после энхансера наблюдалось гораздо менее существенное снижение активности гена CAT (рис. 6, конструкты 3, 6). Исходя из этих данных, можно заключить, что исследуемы и фрагмент обладает активностью саиленсера, но не является энхансер-блокируЩщим элементом, так как подавляет активность энханеерй и в том случае, когда он иы несен за пределы промотор-эвхансеряой коммуникации. Это заключение было подтверждено и В эксперименте по траисфекцин кольцевых конструктов (рис. 10)
СЛ Г-а|гтквность
Рис. 6. Анализ функциональной активности изучаемой СТСГ-спязмйаинцен последовательности в экспериментах но временной трансфекиии линейных кпт грук г ни в клетки HD3.
Стрелкой показана ориентация встроенного 200 п.н. фрагмента ДНК, содержащего участок связывания СТСГ (чёрный кружок). Активность репортерногй гена CAT показана с учетом эффективности траисфекцин. Вес конструкты были линеаризованы перед трансфекцней в клетки НЕЙ.
(N) 5'GGTCCCSGTGCCSTTCCTCCCAGCACCrcsCAOTC C/GCCG ГСССТЭ' IMuiiSGCTCCCGGTeCCGTTCCT—AGCACC- ■ CAGTGCAGCCaTOCCl 3"
В а
- + +
N \ Mill
—■ V
ё 6
в
Sal i „ Hind ill
I ■ i
«■Я
_I_
Рис.7. Зависимость активности саиленсера о г связывания с CTCF.
(Л) I 1ормальный (ДО н мутантный (Ми!) участки связывания CTCF. Мотивы, Предположительно важные для взаимодействия с СТСГ. выделены подчеркиванием. (Б) Эксперименты по задержке электрофоре™ чес коп подвижности в полиакрил а мидном геле е 200 п.н. фрагментом ДНК, содержащим нормальный (.V) или мутантный (МгЩ участок связывания CTCF. (В) Сайлеиссрная активность нормального (й) и содержащего мутантный участок связыьапия СТСГ" [в) фрагментов ДНК. fice конструкты были линеаризованы ггсред трансфекиией в клетки HD3.
С целью доказать, что сайленсерная активность исследуемого фрагмента действительно зависит от связывания с СТСБ мы сконструировали 200 п н фрагмент ДНК с мутантным участком связывания СТСБ (рис 7 А) Данный мутантный фрагмент не образовывал комплекса с СТСР в экспериментах по задержке подвижности в геле (рис 7Б) и одновременно не проявлял активности сайленсера в экспериментах по временной трансфекции (рис 7В) Таким образом, можно сделать вывод, что активность сайленсера, проявляемая изучаемым фрагментом ДНК, зависит от связывания с СТСР
17 Расстояние между участком связывания СТСТ и энхансером влияет на активность
сайленсера
В экспериментах по временной трансфекции генетических конструктов максимальная активность сайленсера наблюдалась в случае конструктов 4 и 5 (рис 6), когда 200 п н фрагмент был встроен в «глобиновой» ориентации после р/е-энхансера или в противоположной ориентации перед энхансером Единственной общей чертой этих двух конструктов было то, что 50 п н участок связывания СТСР, расположенный асимметрично в пределах 200 п н 8та1-фрагмента (см рис 1Б), в составе этих конструктов был одинаково удален на расстояние 120 пн от р/Е-энхансера В случае же конструктов 3 и 6 (рис 6), когда активность сайленсера была значительно менее выражена, СТСР-связывающий участок располагался на расстоянии 40 п н от энхансера В связи с этим мы предположили, что расстояние между участком связывания СТСР и энхансером играет важную роль при формировании функционального комплекса между СТСР и другими белками, взаимодействующими с последовательностью энхансера С целью проверить данное предположение, мы взяли конструкт 3 (см рис 6), где СТСР-связывающий участок был удален на расстояние 40 пн от (З/е-энхансера, и встроили 80 пн функционально инертную последовательность между (3/е-энхансером и 200 п н фрагментом, тем самым подвинув участок связывания СТСР на расстояние 120 пн от р/е-энхансера (рис 8, конструкт 4) При трансфекции данного конструкта в клетки НБЗ активность сайленсера резко возрастала (в 15 раз) по сравнению с исходным конструктом (рис 8, конструкт 2) и была сходной с сайленсерной активностью 200 п н фрагмента из конструкта, где связывающий СТСР участок был изначально позиционирован на расстоянии 120 пн от р/е -энхансера (рис 8, конструкт 3) Сдвиг участка связывания СТСБ на расстояние 200 п н от р/е -энхансера (рис 8, конструкт 5) приводил к резкому снижению его сайленсерной активности (в 8 раз) по сравнению с исходным конструктом (рис 8, конструкт 4) Исходя из этих результатов, можно заключить, что позиционирование участка связывания СТСР на расстояние 120 п н от модельного р/е-энхансера является оптимальным для проявления его максимальной сайленсерной активности
120 И-Jí
СЛТ активность 50%
__fi/s Hlndlll
^шппшлАл
1ГЩ7ГМ %
Htnd III
#3+160(111
Рис. 8. Зависимость активности сайленсера от расстояния между участком связывания С ТС Г и энхансером
Черным кружком обозначена позиция участка связывания СТСР в пределах 200 п н БшаГ-фрагмента Заштрихованными квадратами показаны 80 п н блоки, встроенные между 200 п н фрагментом и р/е-энхансером Все конструкты были линеаризованы перед трансфекцией в клетки НЭЗ
18 Определение позиции промотора гена ggPRX
Обнаруженный нами сайленсер располагается в З'-части СрО-островка из 5'-фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур В пределах того же CpG-островка должен находиться промотор гена «домашнего хозяйства» ggPRX Из ранее опубликованных работ было известно, что ген ggPRX, перекрывающийся с доменов а-глобиновых генов, начинает транскрибироваться в области изучаемого CpG-островка [Sjakste et al, 2000], но промотор этого гена так и не был картирован Так как мы изначально предполагали промотор гена ggPRX в качестве возможной мишени действия обнаруженного CTCF-зависимого регуляторного элемента, то было необходимо определить точную позицию этого промотора в пределах CpG-островка и относительно найденного сайленсера Сравнив последовательность промотора гена «-14» [Vyas et al, 1995] - человеческого гомолога гена ggPRX - с последовательностью CpG-островка из 5'-некодирующей области куриного домена а-глобиновых генов, мы обнаружили на расстоянии 120 п н от охарактеризованной в нашей работе CTCF-связывающей последовательности участок высокой гомологии с промотором гена «-14» (см рис 14 Диссертации) Этот участок гомологии длиной 110 п н был тестирован на промоторную активность в клетках различного происхождения Из результатов серии трансфекций, представленных на рис 9А, видно, что фрагмент CpG-островка, представляющий участок гомологии с промотором гена «-14» человека (конструкт 2), обладал промоторной активностью (примерно такого же уровня, что и промотор гена «-14» человека (конструкт 3)) не только в куриных эритроидных (HD3) и лимфоидных (DT40) клетках, но и в человеческих эпителиальных (HeLa) клетках Таким образом, фрагмент куриной ДНК, гомологичный промотору гена «-14», обладает промоторной активностью, которая не является ткане- и видоспецифичной
Чтобы подтвердить, что найденный нами промотор действительно направляет транскрипцию гена ggPRX in vivo, мы поставили серию ОТ-ПЦР с несколькими парами праймеров, охватывающих область промотора и фланкирующие последовательности ДНК (тест-
фрагменты 1 - 4, схема па рис. 9Ь). Результаты ОТ-ПЦР [рис. 9Ь> продемонстрировали, что области; лежащие ниже промотора (тест-фрагменты 1 и 2), транскрибируются в направлении транскрипции гена ggPRX, й то время как область, охватывающая собственно промотор (тест-фрагмент 3), и область выше промотора (тест-фрагмечт 4) не транскрибируется в этом направлении. Таким образом, данный промотор действительно направляет транскрипцию гена ggPRX.
Принимая но внимание результаты вышеописанных экспериментов, можно заключить, что в пределах изучаемого CpG-островка обнаружен промотор гена ggPRX, пс являющийся ткан е- и вндоспспифичным, что подтверждает ранее опубликованные предположения о том, ЧТО ген ggPRX представляет собой ген «домашнего хозяйства» [Vyas ct al.. [995; Sjaksle e( al,, 200C ].
Д clontrtü
CAT :
PgyPR^ P "T4" r o„D r
HD3
ту¿2 >10! 4
HeLa
0 5 10 15
DIJO
12 3 4 5
активность CAT (cpm kIO'I
1 2 3 i 5
нромогир :c.i.i^vPRX СТС^-сшэышкищгЛ учаь'Гик
RT primer 1 ^
RT primer 2 ) мест- юеет-фрахигмт 2 тгет-фрогмгнт i
фрагмент ¡ ПК п.п. ¡Ы л.к. Í-/6 «,н.
нжт-фрлс.чгнт ,1 210 ikh,
1 2 3 4
fc t ^
¿ÍCG = CO=G£ = O O -S i I + 5 i + Щ. i + ■ +
Рмс.'). Определение позиции промотора куриного гена %1>РКХ.
(Л) Эксперименты по временной трансфекцни н клетки НШ, О Г40 и НеЬа. (3 качестве отрицательного контроля использовался не содержащий промотора вектор (конструкт I). Конструкт содержащий эритроидспеиифичный промотор а"-геиа, использовали как положительный контроль в клетках НШ и как отрицательный - в клетках ОТ'40 и Не!,а (1>) ОТ-П1ДР анализ транскрипции гена ¡^РКХ. в клетках I !ПЗ. Вверху: на схеме показаны позиции амплцфицируемых тест-фрагментов Нншу: Амплификация тест-фрагментов 1-4; дорожки «-ОТ» обозначают контрольные препараты, в которых ПЦР-гшплификацня проводилась йен предварительной обратной транскрипции; на дорожки, обозначенные «ДНК», наносились продукты амплификации на куриной геномной ДНК .
II Определение времени репликации тканеспецифичного кластера альфа-глобиновых генов кур в клетках различного происхождения
Наряду с вопросом о разграничении функций регуляторных систем разных генов в доменах открытого типа важным представляется и вопрос о том, зависит ли от программы клеточной дифференцировки время репликации доменов открытого типа, содержащих тканеспецифичные гены Этот вопрос на настоящий момент очень мало исследован Время, или «тайминг», репликации определенной геномной области говорит о том, за какой период S-фазы произошла полная репликация данной области Обычно различают «раннюю» (в начале S-фазы) и «позднюю» (в конце S-фазы) репликацию Постоянно активные гены «домашнего хозяйства» всегда реплицируются «рано» Тканеспецифичные геномные домены «классического» типа являются раннереплицирующимися в клетках, где гены данного домена экспрессируются, и позднереплицирующимися во всех остальных типах клеток, где эти гены неактивны [Holmquist, 1987] Иными словами, существует зависимость между временем репликации гена и его транскрипционным статусом В случае кластера а-глобиновых генов курицы, являющимся ярким примером доменов открытого типа, мы сталкиваемся с парадоксом С одной стороны, экспрессия а-глобиновых генов является строго тканеспецифичной [Moss et al, 1969], и, исходя из вышеизложенных наблюдений, в клетках неэритроидного происхождения они должны реплицироваться поздно С другой стороны, домен а-глобиновых генов кур перекрывается с повсеместно экспрессирующимся геном «домашнего хозяйства» [Sjakste et al, 2000], который, исходя из тех же соображений, должен реплицироваться рано во всех типах клеток Меняется или нет время репликации а-глобиновых генов в зависимости от клеточного типа? Существует ли в таком случае зависимость между временем репликации и транскрипционным статусом а-глобиновых генов? Для того чтобы ответить на эти вопросы мы определили время репликации а-глобиновых генов курицы в клетках эритроидного и неэритроидного происхождения
Для определения времени репликации была выбрана методика флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) уникальной геномной последовательности с несинхронизированными клетками [Selig et al, 1992] В том случае, если изучаемая последовательность ДНК не является «импринтированной», возможны только два варианта результатов либо два одиночных гибридизационных сигнала («синглеты») в ядрах тех клеток, где изучаемый сегмент ДНК еще не реплицировался (рис 10А), либо два двойных гибридизационных сигнала («дублеты») в ядра тех клеток, где изучаемый сегмент ДНК уже прошел репликацию (рис 10Б) Характер распределения «дублетов» и «синглетов» в несинхронной популяции клеток позволяет определить время репликации в S-фазе любой неимпринтированной последовательности ДНК Для ранннереплицирующихся генов будет характерна большая доля «дублетов» среди
гибриди'мшшнных Сигналов, тогда как в случае поздн сре п л и ш t р у ю тих с я генов большая часть ядер буд^т давать «сингл етные» гнбридизационнме сигналы
Рис. 10. Использование флуоресцентной in sita гибридизации для визуализации специфических последовательностей и и и u pó;I шыя ядрах н ее и ихрокизиров а и ны x клеток выявляет недореплннироваиные локусы в виде двух отдельных точек в дннлоилных клетках (А), тогда как реплицироваиная ДНК характеризуется двойными сигналами (Ь).
Мы провели in situ гибридизацию флуоресцентных зондов на овальбуминовый ген (контроль на позднереп лицирующийся локус), ген р-актииа (контроль на раниереплицирующийся локус), Jl-глобпновый домен (как пример локуса, меняющего время репликации в зависимости от клеточной дифференцировки) и а-г«обиновый домен с препаратами куриных эритробластрв {HD3J* куриных лнмфобластов (DT40) и куриных эмбриональных фибробластов (CEF). Результаты гибридизаций, представленные в табл. i , показали, что, как и предполагалось, куриные р'ТЛобщювые гены реплицировались согласно своему экспрессной ному профилю: рано в клетках эритроидиого происхождения и поздно в клетках неэритроидного происхождения. В то время как а-глобиновые гены реплицировались рано в клетках как эритроидиого, гак и неэритроидного происхождения. С целый проверить, насколько время репликации с^гл оби новых генов курицы соотносится с их транскрипционным статусом, мы провели анализ профиля экспрессии аА-геиа и клетках различного происхождения методом ОТ-ПЦР. Результаты ОТ-Г1ЦР (рие, 11) свидетельствует о том, что экспрессия аА-гена ограничена исключительно клетками эритроидиого происхождения (в наших экспериментах - линия НПЗ). В итоге, исходя из полученных результатов, можно утверждать что время репликации куриных а-глобиновых генов не соотносится с их транскрипционным с татусом
UAPÜH ¡UII^J Л
CEF ПТЮ НПЗ С» DT4Q HPS £ I ~¡1 _ ¡_ j. ~ ~~ ~ ¡T | Рис..II. Сравнительный анализ
~ 7 ° ? • t ~ T : ' £; транскрипционного статуся
¿A-rena H клетках различного тина методом ОТ-ПЦР. «-ОТ» обозначает контрольные препараты, в которых ПЦР-амппифнкация проводилась без Вредварителйкй обратной транскрипции. Амплификация фрагмент куриного гена «домашнего хозяйства» GAPD1I проводилась в качестве положительного контроля.
Таблица 1 Время репликации генных локусов курицы в клетках различного типа.
Клеточная культура ген синглеты дублеты время репликации
фибробласты (CEF) овальбумин 86% 14% позднее
Р-актин 42% 58% раннее
Р-глобин 71% 29% позднее
а-глобин 52,5% 47,5% раннее
лимфобласты (DT40) овальбумин 82% 18% позднее
р-актин 35% 65% раннее
р-глобин 70% 30% позднее
а-глобин 45% 55% раннее
эритробласты (HD3) овальбумин 83% 17% позднее
р-актин 32% 68% раннее
Р-глобин 53% 47% раннее
а-глобин 37% 63% раннее
Обсуждение результатов
Как уже было многократно отмечено выше, особенностью домена а-глобиновых генов кур, равно как и доменов а-глобиновых генов других позвоночных животных, является тот факт, что эти домены перекрываются с доменом гена «домашнего хозяйства» (ген -14 у человека [Vyas et al, 1995], ген ggPRX у кур [Sjakste et al, 2000]) В условиях активации домена а-глобиновых генов, сопровождающейся, в частности, появлением гиперацетилированного хроматинового домена, включающего и промоторы этих генов [Anguita et al , 2001], уровень экспрессии данных генов может возрасти Последствия этого трудно предсказать, так как функции генов «домашнего хозяйства», перекрывающихся с кластером а-глобиновых генов, до сих пор не установлены Однако трудно предположить, что увеличение уровня экспрессии этих генов необходимо в дифференцирующихся эритроидных клетках Более того, было прямо показано, что этого не происходит
В настоящей работе мы обнаружили и охарактеризовали новый сайленсер, расположенный в CpG-островке из 5'-фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур Этот сайленсер является CTCF-зависимым, причем CTCF ассоциирован с последовательностью сайленсера лишь в клетках эритроидного происхождения, но не в лимфоидных клетках, где она гиперметилирована В экспериментах in vitro мы продемонстрировали, что метилирование обнаруженного нами участка связывания CTCF предотвращает связывание Таким образом, обнаруженный нами
19
регуляторный элемент можно охарактеризовать как «кондиционный» сайленсер, т е способный «включаться» и «выключаться» в ответ на определённые сигналы В данном случае активность сайленсера регулируется посредством метилирования участка связывания СТСБ Поэтому сайленсер должен быть активен лишь в эритроидных клетках, где он неметилирован, в отличие от лимфоидных и других клеток неэритроидного происхождения В непосредственной близости от обнаруженного сайленсера (120 п н) мы картировали промотор гена ggPRX Надо отметить, что в модельных экспериментах, проведенных в нашей работе, сайленсер проявлял максимальную активность, когда был удален от энхансера на то же расстояние в 120 п н Принимая во внимание, что промоторы генов «домашнего хозяйства» представляют обычно единый промоторно-энхансерный блок, можно с высокой степенью уверенности говорить о том, что обнаруженный нами сайленсер контролирует работу промотора гена ggPRX в эритроидных клетках Согласно предлагаемой нами модели (рис 12), активный в эритроидных клетках сайленсер стабилизирует экспрессию гена ggPRX в ситуации, когда промотор этого гена может быть дополнительно стимулирован действием мощного вышележащего энхансера (М1Ш), ответственного за активацию а-глобиновых генов, и появлением домена гиперацетилирования гистонов, включающего и промотор гена ggPRX В неэритроидных клетках, где цис-действующие а-глобиновые регуляторные элементы неактивны, сайленсер «выключен» посредством метилирования участка связывания СЮТ В силу этого транскрипция с промотора гена ggPRX остается неизменной
Эрнтрощщые клетки
ч
нет повышенной гипервцетилщюван экспрессии
Лимфоидные клетки
базовый уровень тражкршщнн
—и Г
¿ип&ацежгыиряеви
а-ашвитиш «и нтктишы
Рис. 12 Модель действия СТСР-зависимого сайленсера из 5'-фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур В эритроидных клетках СТСИ взаимодействует с проксимальным к промотору гена ggPRX элементом, расположенным на расстоянии ~4 т п н от эмбрионального тс-гена Образовавшийся сайленсер позволяет избегать активирующего действия главного регуляторного элемента (МНЕ), контролирующего экспрессию а-глобиновых генов, на промотор гена «домашнего хозяйства» ggPRX В неэритроидных клетках выключение сайленсера посредством метилирования его последовательности и изменение структуры хроматина 5'-фланкирующей области а-глобинового домена обеспечивают нормальную экспрессию гена ggPRX
Следствием перекрывания домена а-глобиновых генов кур с геном «домашнего хозяйства» также является возможность наложения двух разных репликационных программ Согласно накопленным экспериментальным данным, в эукариотическом геноме гены «домашнего хозяйства» реплицируются рано в Э-фазе, тогда как тканеспецифичные гены реплицируются в зависимости от их транскрипционного статуса - рано в экспрессирующих их клетках и поздно во всех остальных клетках Определение нами времени репликации а-глобиновых генов кур в клетках различного происхождения показало, что, несмотря на различный транскрипционный статус, они реплицируются рано в Э-фазе как в эритроидных клетках, так и в клетках неэритроидного происхождения Данные результаты согласуются с ранее опубликованной работой, утверждающей, что гены, расположенные в богатых генами вС-изохорах, не меняют время своей репликации в зависимости от клеточной дифференцировки [Шга1аш е1 а1, 2004] Подобное явление можно объяснить тем, что такой параметр, как время репликации, определяется не уровнем транскрипции, а конфигурацией хроматинового домена и, как следствие, характером доступности ДНК для компонентов репликационной машины
Выводы
1 Картирован промотор повсеместно экспрессирующегося гена ggPRX, перекрывающегося с доменом а-глобиновых генов кур
2 Обнаружен и охарактеризован СТСР-зависимый сайленсер, расположенный в Срв-островке из 5'-фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур, рядом с промотором гена ggPRX
3 Впервые показано, что функционирование СТСБ-зависимого сайленсера регулируется метилированием участка связывания СЮТ
4 Продемонстрировано, что время репликации домена а-глобиновых генов кур не зависит от транскрипционного статуса домена
Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи.
1 Клочков Д Б. Юдинкова Е С, Разин С В 2004 Характеристика сайленсера, расположенного в CpG-богатой области перед кластером а-глобиновых генов кур Доклады Академии Наук 398(5), 699 - 701
2 Klochkov D . Rincon-Arano Н , Ioudmkova Е S , Valadez-Graham V , Gavrilov А, Recillas-Targa F and Razm SV 2006 A CTCF-dependent silencer located in the differentially methylated area may regulate expression of a house-keeping gene overlapping a tissue-specific gene domain Molecular and Cellular Biology 26(5), 1589-97
Тезисы конференций.
1 Klochkov D . Ioudmkova E , Razm S Characterization of a regulatory element located within CpG-island upstream to the chicken а-globm gene cluster Gliwice Scientific Meetings 2004 Ghwice, Poland, 19-20 November 2004, 21
2 Клочков Д Б , Юдинкова E С , Петрова Н В , Разин С В Идентификация нового CTCF-связывающего регуляторного элемента из 5'-некодирующей области домена а-глобиновых генов кур 9-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - Наука XXI Века» Пущино, Россия, 19-21 апреля 2005, 30
3 Klochkov D . Ioudmkova Е , Recillas-Targa F and Razin S V New CTCF-dependent regulatory element withm the area of overlapping gene loci of chicken ggPRX gene and a-globm gene cluster EMBO/FEBS Conference on Nuclear Structure and Dynamics La Grande Motte, France, 24 - 28 September 2005, 82
4 Klochkov D . Ioudmkova E S , Rincon-Arano H , Recillas-Targa F and Razin S V The novel CTCF-dependent silencer in the vicinity of ggPRX gene promoter in the upstream part of the chicken a-globin gene domain 18th IGB Meeting «Epigenetic Bases of Genome Reprogramming» Capri, Italy, 8-11 October 2005, 56
5 Клочков Д Б . Юдинкова E С , Гаврилов А , Ресиллас-Тарга Ф , Разин С В Функциональная характеристика CpG-богатой области из 5'-некодирующей области куриного домена а-глобиновых генов VI Международная конференция по молекулярной генетике соматических клеток Звенигород, Россия, 12-16 декабря 2005, 22-23
6 Klochkov D , Rmcon-Arano H , Ioudmkova E, Gavnlov A, Recillas-Targa F and Razin S V Differentially methylated region in the extended upstream area of chicken a-globm gene domain reveals silencer activity in erythroid cells ESF - JSPS Workshop on Functional Genomics From the Bench to Bioinformatics Kanagawa, Japan, 6-11 March 2006, 39
7 Klochkov D. Gavnlov A, Ioudmkova E S, Recillas-Targa F and Razm S V Vertebrate a-globin gene domain as a tissue-specific domain with vague boundaries ICGEB-TUBITAK Workshop on Emerging Topics m Human Functional Genomics and Proteomics Antalya, Turkey, 26-31 March 2006, 14
8 Klochkov D. Rmcon-Arano H, Ioudmkova E, Recillas-Targa F and Razin S Structural-functional characterization of differentially methylated region in the extended upstream area of chicken a-globm gene domain 20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress Kyoto, Japan, 16-23 June 2006, 761
9 Klochkov D . Rmcon-Arano H. Recillas-Targa F and Razm SV Functional isolation of a housekeeping gene overlapping tissue-specific gene domain may be ensured by a conditional CTCF-dependent silencer 4th International Summer School "DNA and Chromosomes 2006 Physical and Biological Approaches" Cargese, France, 19 June - 1 July 2006, 68
10 Klochkov D . Vassetzky Y and Razin S Replication timing is likely to depend on the chromatin structure than the transcriptional status of gene locus 32nd FEBS Congress "Molecular Machines" Vienna, Austria, 7-12 July 2007 The FEBS Journal, 274(1), 77
11 Klochkov D, Gavnlov A, Vassetzky Y and Razm S The tissue-specific gene domain overlapping house-keeping gene an effect on replication timing EMBO Conference on Nuclear Structure and Dynamics Montpellier, France, 1-5 September 2007, 67
Заказ № 173/09/07 Подписано в печать 19 09 2007 Тираж 110 экз Уел п л 1,5
- ^ ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \ www cfr ru , e-mail info@cfr ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Клочков, Денис Борисович
Список сокращений.
Введение.
I. Обзор литературы.
1.1. Доменная гипотеза организации генома.
1.2. Домены открытого типа.
1.2.1. Регуляция экспрессии генов в доменах открытого типа.
1.2.2. Экспериментальные подходы к картированию доменов открытого типа.
1.3.Структурно-функциональная организация домена. альфа-глобиновых генов кур.
1.4. CTCF-зависимые регуляторные элементы.
1.4.1. Структура белка CTCF.
1.4.2. Функции CTCF-зависимыхрегуляторных элементов.
1.4.2.1. Транскрипционная репрессия/активация.
1.4.2.2. Энхансер-блокирующая активность инсуляторов эукариот.
1.4.2.3. Роль CTCF-зависимых элементов в организации геномных доменов.
1.4.2.4. Участие CTCF-зависимых элементов в пространственной организации ядра.
1.5. Время репликации.
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
11.1. МАТЕРИАЛЫ.
II. 1.1. Клеточные линии.
II. 1.2. Бактериальные штаммы.
II. 1.3. Химические реактивы.
11.2. МЕТОДЫ.
11.2.1. Ведение клеточных культур.
11.2.2. Временная трансфекция ДНК в эукариотические клетки.
11.2.3. Анализ ферментативной активности репортерных генов.
II.2.3.1. Определение активности хлорамфениколацетилтрансферазы с помощью тонкослойной хроматографии.
II.2.3.2. Определение активности хлорамфениколацетилтрансферазы с помощью жидкостного сцинтилляционного счёта.
11.2.3.3. Определение активности ß-галактозидазы.
II.2.4. Приготовление ядерных экстрактов.
П.2.5. Вестерн блот.
11.2.6. Связывание ДНК с экстрактом ядерных белков IN VITRO.
11.2.7, Эксперименты по задержки подвижности в полиакриламидном геле.
11.18. ОТ-ПЦР анализ.
11.2.9. Иммунопреципитация хроматина.
11.2.10. Бисульфитное секвенирование.
11.2.11. Флуоресцентная IN SITU гибридизация (FISH).
11.2.11.1. Приготовление препаратов клеток.
IÍ.2.11.2. Синтез гибридизационной пробы.
11.2.11.3. Гибридизация.
11.2.12. Проверка распределения клеток в культуре по фазам клеточного цикла методом FACS-анализа.
11.2.13. Другие методы.
III. Результаты исследований.
III. 1. Обнаружение CTCF-зависимого сайленсера, расположенного рядом с промотором гена ggPRX.
III.1.1. Обнаружение потенциального участка связывания CTCFe пределах.
CpG-островка, расположенного в 5'-фланкирующей области домена. альфа-глобиновых генов кур.
III. 1.2. CTCF взаимодействует in vitro с изучаемой последовательностью ДНК.
III. 1.3. Метилирование изучаемой последовательности ДНК предотвращает её связывание с CTCF.
III. 1.4. Анализ статуса метилирования изучаемой CTCF-связывающей последовательности ДНК в клетках эритроидного и лимфоидного происхождения.
III. 1.5. CTCF взаимодействует in vivo с изучаемой последовательностью ДНК.
III. 1.6. Изучаемый фрагмент ДНК обладает активностью сайленсера.
III. 1.7. Активность обнаруженного сайленсера является CTCF-зависимой.
III. J.8. Расстояние между участком связывания CTCF и энхансером влияет на активность сайленсера.
III. 1.9. Определение позиции промотора гена ggPRX.
III.1.10. Обнаружение потенциального участка связывания CTCF в.
5'-фланкирующей области домена альфа-глобиновых генов человека.
III.2. Определение времени репликации тканеспецифичного кластера. альфа-глобиновых генов кур в клетках различного происхождения.
IV. Обсуждение результатов.
Выводы.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение особенностей регуляции активности генов и контроля времени их репликации в домене альфа-глобиновых генов кур"
Доменная гипотеза организации генома высших эукариот постулирует, что геном состоит из единообразных структурно-функциональных единиц - геномно-хроматиновых доменов, функционирующих сходным образом. Эта гипотеза базируется на результатах изучения ряда тканеспецифических генов и кластеров генов (бета-глобиновые гены позвоночных, ген лизоцима кур, ген аполипопротеина В человека и др.). В последние годы широкомасштабное изучение организации геномов различных позвоночных показало, что существует множество «неканонических» доменов, которые часто называют доменами открытого типа. Одной из основных характеристик этих доменов является их расположение в богатых генами областях генома, где тканеспецифичные гены соседствуют с неродственными генами «домашнего хозяйства».
Ярким примером геномных доменов с перекрывающимися генами является домен а-глобиновых генов кур. В этом домене 5'-регуляторная область кластера тканеспецифичных а-глобиновых генов перекрывается с геном «домашнего хозяйства» ^РЯХ ^а!^ е! а1., 2000]. Следствием такого перекрывания является интерференция регуляторных систем неродственных генов. Другой особенностью доменов открытого типа является то, что в рамках этих доменов каким-то образом должны совмещаться принципиально разные репликационные программы, типичные для генов «домашнего хозяйства» и тканеспецифичных генов.
Следует отметить, что структурно-функциональные особенности организации доменов открытого типа, содержащих одновременно тканеспецифичные гены и гены «домашнего хозяйства», сравнительно мало изучены. О молекулярных механизмах, обеспечивающих функциональную изоляцию перекрывающихся регуляторных систем, так же как и о процессах, лежащих в основе выбора программы репликации в доменах с перекрывающимися генами, практически ничего неизвестно. Поэтому данная работа посвящена проблеме функциональной изоляции гена «домашнего хозяйства» ggPRX, перекрывающегося с доменом а-глобиновых генов кур, в процессе эритроидной дифференцировки, а также определению времени репликации а-глобиновых генов кур в клетках различного происхождения. Нашей целью было получение ответов на два основных вопроса:
1) каким образом обеспечивается контроль экспрессии гена ggPRX в процессе эритроидной дифференцировки;
2) существует ли зависимость между временем репликации и транскрипционным статусом а-глобиновых генов кур.
Актуальность работы определяется тем, что домены открытого типа встречаются в геноме достаточно часто, а, возможно, составляют большую его часть. Изучение структурно-функциональных особенностей этих доменов, понимание механизмов, регулирующих процессы транскрипции и репликации в таких доменах, позволит лучше понять общие принципы организации эукариотического генома.
I. Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Клочков, Денис Борисович
Выводы
1. Картирован промотор повсеместно экспрессирующегося гена ggPRX, перекрывающегося с доменом а-глобиновых генов кур.
2. Обнаружен и охарактеризован СТСР-зависимый сайленсер, расположенный в Срв-островке из 5'-фланкирующей области домена а-глобиновых генов кур, рядом с промотором гена ggPRX.
3. Показано, что функционирование СТСР-зависимого сайленсера, расположенного в Срв-островке домена а-глобиновых генов кур, регулируется метилированием участка связывания СТСР.
4. Продемонстрировано, что время репликации домена а-глобиновых генов кур не зависит от транскрипционного статуса домена.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Клочков, Денис Борисович, Москва
1. Лобаненков И.И., Гудвин Г.Г. 1989. СССТС связывающий белок, новый ядерный белковый фактор, взаимодействие которого с 5'фланкирующей последовательностью онкогена с-тус коррелируете его репрессией. Докл. АН СССР, 309 (3), 741-745.
2. Максименко О.Г., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. 2006. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика, 42 (8), 845-857.
3. Разин C.B. 2003. Инициация репликации ДНК у высших эукариот. Генетика, 39(2), 173181.
4. Разин C.B. 2006. Пространственная организация эукариотического генома и работа эпигенетических механизмов. Г?нетика, 42(12), 1605-1614.
5. Разин C.B. 2007. Хроматин и регуляция транскрипции. Мол. Биол., 41 (3), 387-394.
6. Разин C.B., Юдинкова Е.С. 2007. Механизмы, контролирующие активацию домена альфа-глобиновых генов в эритроидных клетках кур. Биохимия, 72(5), 581-585.
7. Юдинкова Е.С., Разин C.B. 1999. Участок связывания ДНК с ядерным матриксом (MAR элемент) локализован в кластере сайтов гиперчувствительности к ДНКазе I в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. Мол. Биол., 34(5), 821-827.
8. Юдинкова Е.С., Разин C.B. 2002а. Геномные домены и регуляторные элементы доменного уровня. Мол. Биол., 36,947-955.
9. Юдинкова Е.С., Разин C.B. 20026. Перед кластером альфа-глобиновых генов кур находится блок CpG-динуклеотидов, которые по-разному метилированы в эритроидных и неэритроидных клетках. Докл. АН, 384(5), 692-694.
10. Юдинкова Е.С., Разин C.B. 2003. Регуляторные системы геномных доменов с размытыми границами. Генетика, 39, 182-186.
11. Aggarwal B.D. and Calvi B.R. 2004. Chromatin regulates origin activity in Drosophila follicle cells. Nature, 430,372-376.
12. Aladjem M.I. 2007. Replication in context: dynamic regulation of DNA replication patterns in metazoans. Nat Rev Genet., 8(8), 588-600.
13. Alevy M., Tsai M. and O'Malley B. 1984. DNase 1 sensitive domain of the gene coding for the glycolitic enzyme GAPDH. Biochem., 23, 2309-14.
14. Anguita E., Johnson C.A., Wood W.G., Turner B.M. and Higgs D.R. 2001. Identification of a conserved erythroid specific domain of histone acetylation across the alpha-globin gene cluster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98, 12114-12119.
15. Anguita E., Hughes J., Heyworth C., Blobel G.A., Wood W.G. and Higgs D.R. 2004. Globin gene activation during haemopoiesis is driven by protein complexes nucleated by GATA-1 and GATA-2. EMBOJ., 23(14), 2841-52.
16. Antequera F. 2003. Structure, function and evolution of CpG island promoters. Cell Mol Life Sci., 60, 1647-58.
17. Antequera F. and Bird A. 1999. CpG islands as genomic footprints of promoters that are associated with replication origins. Curr Biol., 9, 661-667.
18. Aparicio J.G., Viggiani C.J., Gibson D.G. and Aparicio O.M. 2004. The Rpd3-Sin3 histone deacetylase regulates replication timing and enables intra-S origin control in Saccharomyces cerevisiae, Mol Cell Biol., 24,4769-4780.
19. Ashe H., Monks J., Wijgerde M., Fraser P. and Proudfoot N. 1997. Intergenic transcription andtransduction of the human beta-globin locus. Genes Dev., 11, 2494-2509.
20. Azizkhan J.C., Jensen D.E., Pierce A.J. and Wade M. 1993. Transcription from TATA-less promoters: dihydrofolate reductase as a model. Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 3(4), 229-54.
21. BabaT.W., Giroir B.P. and Humphries E.H. 1985. Cell lines derived from avian lymphomas exhibit two distinct phenotypes. Virology, 144(1), 139-51.
22. Bartolomei M.S. and Tilghman S.M. 1997. Genomic imprinting in mammals. Annu Rev Genet., 31, 493-525.
23. Bazett-Jones D., Mendez E., Czarnota G., Ottensmeyer F. and Allfrey V. 1996. Visualization and analysis of unfolded nucleosomes associated with transcribing chromatin. Nucleic Acids Res., 24,321-329.
24. Bell A.C., West A.G. and Felsenfeld G. 1999. The protein CTCF is required for the enhancer-blocking activity of vertebrate insulators. Cell, 98,387-396.
25. Bell A.C. and Felsenfeld G. 2000. Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted expression of the Igf2 gene. Nature, 405, 482-485.
26. Bell A.C., West A.G. and Felsenfeld G. 2001. Insulators and boundaries', versatile regulatory elements in the eukaryotic genome. Science, 291, 447-450
27. Beug H., Doederlein G., Freudenstrein C. and GrafT. 1979. Erythroblast cell lines transformed by a temperature sensitive mutant of avian erythroblastosis virus. A model system to study erythroid differentiation in vitro. J. Cell. Physiol., 1, 195-207.
28. Beug H., Palmieri S., Freudenstein C., Zentgraf H. and GrafT. 1982. Hormone-dependent terminal differentiation in vitro of chicken erythroleukemia cells transformed by ts mutants of avian erythroblastosis virus. Cell, 28, 907-919
29. Bird A. 1986. CpG-rich island and the function of DNA methylation. Nature, 321,209-213
30. Blackledge N.P., Carter E.J., Evans J.R., Lawson V., Rowntree R.K. and Harris A. 2007. CTCF mediates insulator function at the CFTR locus. Biochem J., Aug 14.
31. Borunova V., larovaia O., Vassetzky Y. and Razin S. 2005. The upstream area of the chicken alpha-globin gene domain is transcribed in both directions in the same cells. FEBS Lett., 579, 4746-4750.
32. Bosco G., Du W. and Orr-Weaver T.L. 2001. DNA replication control through interaction of E2F-RB and the origin recognition complex. Nat Cell Biol., 3, 289-295.
33. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72, 248-54.
34. Breger K.S., Smith L. and Thayer M.J. 2005. Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing. Hum. Mol. Genet., 14, 2813-2827.
35. Broders F. and Scherrer K. 1987. Transcription of the a-globin gene domain in normal and AEV-transformed chicken erythroblasts: Mapping of giant globin-specific RNA including embryonic and adult gene. Mol. Gen. Genet., 209, 210-220.
36. Broders F., Zahraoui A. and Scherrer K. 1990. The chicken a-globin gene domain is transcribed into a 17-kilobase polycistronic RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 503-507.
37. Bulger M. and Groudine M. 1999. Looping versus linking: toward a model for long-distance gene activation. Genes Dev., 13, 2465-2477.
38. Burch J., Davis D. and Haas N. 1993. Chicken repeat 1 element contain a pol-like open reading frame and belong to the non-long terminal repeat class of retrotraspozons. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90, 8199-8203.
39. Burgess-Beusse B., Farrel C., Gasziner M., Litt M., Mutskov V. and Recillas-Targa F. 2002. The insulation of of genes from external enchancer and silencing chromatin. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 16433-16437.
40. Butcher D.T., Mancini-DiNardo D.N., Archer T.K. and Rodenhiser D.I. 2004. DNA binding sites for putative methylation boundaries in the unmethylated region of the BRCA1 promoter. Int. J. Cancer., 111(5), 669-78.
41. Caiafa P. and Zampieri M. 2005. DNA methylation and chromatin structure: the puzzling CpG islands. J. Cell. Biochem., 94(2), 257-65.
42. Chakalova L., Debrand E., Mitchell J. A., Osborne C. S. and Fraser P. 2005. Replication and transcription: shaping the landscape of the genome. Nature Rev. Genet., 6, 669-677.
43. Chang B.H., Smith L., Huang J. and Thayer M. 2006. Chromosomes with delayed replication timing lead to checkpoint activation, delayed recruitment of Aurora B and chromosome instability. Oncogene, 26, 1852-1861.
44. Chao W., Huynh K.D., Spencer R.J., Davidow L.S. and Lee J.T. 2002. CTCF, a candidate trans-acting factor for X-inactivation choice. Science, 295(5553), 345-7.
45. Chau C.M., Zhang X.Y., McMahon S.B. and Lieberman P.M. 2006. Regulation of Epstein-Barr virus latency type by the chromatin boundary factor CTCF. J. Virol., 80(12), 5723-32.
46. Chen S. and Corces V. 2001. The gypsy insulator of Drosophila affects chromatin structure in a directional manner. Genetics, 159, 1649-1658.
47. Chen Q., Lin L., Smith S., Huang J., Berger S.L. and Zhou J. 2007. CTCF-dependent chromatin boundary element between the latency-associated transcript and ICP0 promoters in the herpes simplex virus type I genome. J. Virol., 81 (10), 5192-201.
48. Chong S., Riggs A. and Bonifer C. 2002. The chicken lysozyme chromatin domain contains a second, widely expressed gene. Nucl. Acids Res., 30,463-467.
49. Chung J.H., Whiteley M. and Felsenfeld G. 1993. A 5' element of the chicken ß-globin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell, 74,505-514.
50. Chung J.H., Bell A.C. and Felsenfeld G. 1997. Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94, 575-580.
51. Cimbora D.M. and Groudine M. 2001. The control of mammalian DNA replication: a brief history of space and timing. Cell, 104, 643-646.
52. Cosgrove A.J., Nieduszynski C.A. and Donaldson A.D. 2002. Ku complex controls the replication time of DNA in telomere regions, Genes Dev., 16, 2485-2490.
53. Craddock C.F., Vyas P., Sharpe J.A., Ayyub H., Wood W.G. and Higgs D.R. 1995. Contrasting effects of alpha and beta globin regulatory elements on chromatin structure may be related to their different chromosomal environments. EMBOJ., 14, 1718-1726.
54. CremerT. and Cremer C. 2001. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nat. Rev. Genet., 2, 292-301.
55. Cremer T., Cremer M., Dietzel S., Müller S., Solovei I. and Fakan S. 2006. Chromosome territories—a functional nuclear landscape. CurrOpin Cell Biol., 18(3), 307-16.
56. Cross S. and Bird A. 1995. CpG islands and genes. Curr Opin Genet Dev., 5, 309-314.
57. Czelusniak J., Goodman M., Hewett-Emmett D., Weiss M.L., Venta P.J. and Tashian R.E. 1982. Phylogenese origins and adaptive evolution of avian and mammalian haemoglobin genes. Nature, 298(5871), 297-300.
58. Danis E., Brodolin K., Menut S., Maiorano D., Girard-Reydet C. and Mechali M. 2004. Specification of a DNA replication origin by a transcription complex. Nat. Cell. Biol., 6(8), 721-30.
59. Davie J. and Moniwa M. 2000. Control of chromatin remodeling. Crit Rev Eukaryot Gene Expr., 10,303-325.
60. DePamphilis M.L. 1993. Origins of DNA replication that function in eukaryotic cells. Curr. Opin. Cell Biol., 5, 434-441.
61. Delgado S., Gomez M., Bird A. and Antequera F. 1998. Initiation of DNA replication at CpG islands in mammalian chromosomes. EMBOJ., 17, 2426-2435.
62. Delgado M.D., Chernukhin I.V., Bigas A., Klenova E.M. and León J. 1999. Differential expression and phosphorylation of CTCF, a c-myc transcriptional regulator, during differentiation of human myeloid cells. FEBS Lett., 444(1), 5-10.
63. Dhar V., Skoultchi A.I. and Schildkraut C.L. 1989. Activation and repression of a beta-globin gene in cell hybrids is accompanied by a shift in its temporal replication. Mol. Cell. Biol., 9, 3524-3532.
64. Dijkwel P.A., Wang S. and Hamlin J.L. 2002. Initiation sites are distributed at frequent intervals in the Chinese hamster dihydrofolate reductase origin of replication but are used with very different efficiencies. Mol. Cell. Biol., 22, 3053-3065.
65. Dillon N. and Sabbattini P. 2000. Functional gene expression domains: defining the functional unit of eukaryotic gene regulation. Bioessays, 22, 657-665.
66. Dimitrova D.S. and Gilbert D.M. 1999. The spatial position and replication timing of chromosomal domains are both established in early GI phase. Mol. Cell, 4, 983-993.
67. Donaldson A.D. 2005. Shaping time: chromatin structure and the DNA replication programme. Trends Genet., 21, 444^449.
68. Drewell R.A., Goddard C.J., Thomas J.O. and Surani M.A. 2002. Methylation-dependent silencing at the H19 Imprinting Control Region by MeCP2. Nucleic Acid Res., 30, 1139-1144.
69. Drouin R., LemieuxN. and Richer C.L. 1990. Analysis of DNA replication during S-phase by means of dynamic chromosome banding at high resolution. Chromosoma, 99(4), 273-80.
70. Dunn K.L., Zhao H. and Davie J.R. 2003. The insulator binding protein CTCF associates with the nuclear matrix. Exp Cell Res., 288(1), 218-23.
71. Eberharter A. and Becker P. 2004, ATP-dependent nucleosome remodelling: factors and functions. J Cell Sci. ,117, 3707-3711.
72. EI-Kady A. and Klenova E. 2005. Regulation of the transcription factor, CTCF, by phosphorylation with protein kinase CK2. FEBS Lett., 579(6), 1424-34.
73. Engel J.D., Beug H., LaVail J.H., Zenke M.W., Mayo K„ Leonard M.W., Foley K.P., Yang Z„ Kornhauser J.M., Ko L.J. et al. 1992. eis and trans regulation of tissue-specific transcription. J Cell Sei Suppl., 16,21-31.
74. Epner E., Rifkind R.A. and Marks P.A. 1981. Replication of alpha and beta globin DNA sequences occurs during early S phase in murine erythroleukemia cells. Proc Natl Acad Sei U SA, 78(5), 3058-62.
75. Epner E., Forrester W.C. and Groudine M. 1988. Asynchronous DNA replication within the human ß-globin gene locus. Proc. Nail Acad. Sei. USA, 85, 8081-8085.
76. Farache G., Razin S.V., Recillas Targa F. and Scherrer K. 1990b. Organization of the 3'-boundary of the chicken u-globin gene domain and characterization of a CR 1-specific protein binding site. Nucleic Acids Res., 18,401-409.
77. Farrell C., West A. and Felsenfeld G. 2002. Conserved CTCF insulator elements flank the mouse and human ß-globin loci. Mol Cell Biol., 22, 3820-3831.
78. Faurholm B., Millar R. and Katz A. 2001. The genes encoding the type II gonadotropin-releasing hormone receptor and the ribonucleoprotein RBM8A in humans overlap in two genomic loci. Genomics, 78, 15-18.
79. Feng Y.Q., Warin R„ Li T., Olivier E., Besse A., Lobell A., Fu H., Lin C.M., Aladjem M.I. and Bouhassira E.E. 2005. The human beta-globin locus control region can silence as well as activate gene expression. Mol. Cell Biol., 25,3864-3874.
80. Filippova G.N., Fagerlie S., Klenova E.M., Myers C., Dehner Y., Goodwin G., Neiman P.E., Collins S.J. and Lobanenkov V.V. 1996. An exceptionally conserved transcriptional repressor,
81. CTCF, employs different combinations of zinc fingers to bind diverged promoter sequences of avian and mammalian c-myc oncogenes. Mol. Cell. Biol., 16, 2802-2813.
82. Forrester W., Thompson C., Elder J. and Groudine M. 1986. A developmental^ stable chromatin structure in the 0-gIobin gene cluster. Proc Natl Acad Sci USA, 83, 1359-1363.
83. Forsberg E.C. and Bresnick E.H. 2001. Histone acetylation beyond promoters: long-range acetylation patterns in the chromatin world. BioEssays., 23, 820-830.
84. Friedman K.L., Diller J.D., Ferguson B.M., Nyland S.V., Brewer B.J. and Fangman W.L. Multiple determinants controlling activation of yeast replication origins late in S phase. Genes Dev., 10, 1595-1607.
85. Gamsjaeger R., Liew C.K., Loughlin F.E., Crossley M. and Mackay J.P. 2007. Sticky fingers: zinc-fingers as protein-recognition motifs. Trends Biochem Sci., 32(2), 63-70.
86. Garel A. and Axel R. 1976. Selective digestion of transcriptionally active ovalbumin genes from oviduct nuclei. Proc Natl Acad Sci USA, 73(11), 3966-70.
87. Garel A., Zolan M. and Axel R. 1977. Genes transcribed at diverse rates have a similar conformation in chromatin. Proc Natl Acad Sci USA, 74(11), 4867-71.
88. Gerasimova T.I. and Corces V.G. 1998. Polycomb and trithorax group proteins mediate the function of a chromatin insulator. Cell, 92(4), 511-21.
89. Gerasimova T., Byrd K. and Corces V. 2000. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA. MolCell, 6, 1025-1035.
90. Gerbi S.A. and Bielinsky A.K. 2002. DNA replication and chromatin. Curr Opin Genet Dev, 12,243-248.
91. Gey G.O., Coffman W.D. and Kubicek M.T. 1952. Tissue culture studies of the proliferative capacity of cervical carcinoma and normal epithelium. Cancer Res., 12, 264-265.
92. Geyer P. 1997. The role of insulator elements in defining domains of gene expression. Curr Opin Genet Dev, 7, 242-248.
93. Gilbert D.M. 2002. Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect, Curr Opin Cell Biol, 14, 377-383.
94. Gilbert D.M., Miyazawa H. and DePamphilis M.L. 1995. Site-specific initiation of DNA replication in Xenopus egg extract requires nuclear structure. Mol. Cell. Biol., 15, 29422954.
95. Gilbert N., Boyle S., Fiegler H., Woodfine K„ Carter N.P. and Bickmore W.A. 2004. Chromatin architecture of the human genome: gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. Cell, 118, 555-566.
96. Gluzman Y. 1981. SV40-transformed simian cells support the replication of early SV40 mutants. Cell, 23(1), 175-82.
97. Goldman M.A., Holmquist G.P., Gray M.C., Caston L.A. and Nag A. 1984. Replication timing of genes and middle repetitive sequences. Science, 224(4650), 686-92.
98. Goldman M. 1988. The chromatin domain as a unit of gene regulation. BioEssays, 9, 50-55.
99. Goren A. and Cedar H. 2003. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol., 4(1), 25-32.
100. Gourdon G., Sharp J., Higgs D. and Wood W. 1995. The mouse alpha-globin locus regulatory element. Blood, 86, 766-775.
101. Gray C.E. and Coates C.J. 2005. Cloning and characterization of cDNAs encoding putative CTCFs in the mosquitoes, Aedes aegypti and Anopheles gambiae. BMC Mol Biol., 6(1), 16.
102. Gribnau G., Diderich K., Pruzina S., Calzolari R. and Frazer P. 2000. Intergenic transcription and developmental remodelling of chromatin subdomains in the human fi-globin locus. Mol Cell Biol, 5, 377-386.
103. Gribnau J., Hochedlinger K., Hata K., Li E. and Jaenisch R. 2003. Asynchronous replication timing of imprinted loci is independent of DNA methylation, but consistent with differential subnuclear localization. Genes Dev., 17, 759-773.
104. Grosveld F., Dillon N. and Higgs D. 1993. The regulation of human globin gene expression. Baillieres Clin Haematol., 6(1), 31-55.
105. Hand R. 1978. Eucaryotic DNA: organization of the genome for replication. Cell, 15(2), 317-25.
106. Hapgood J.P., Riedemann J. and Scherer S.D. 2001. Regulation of gene expression by GC-rich DNA cis-elements. Cell Biol Int., 25(1), 17-31.
107. Hardison R. 1998. Hemoglobins from bacteria to man: evolution of different patterns of gene expression. J Exp Biol., 201(Pt 8), 1099-117.
108. Hardison R.C. 2001. New views of evolution and regulation of vertebrate beta-like globin gene clusters from an orphaned gene in marsupials. Proc Natl AcadSci USA, 98(4), 1327-9.
109. Harendza S., Pollock A., Mertens P. and Lovett H. 1995. Tissue-specific enhancer-promoter interactions regulate high level constitutive expression of matrix metalloproteinase 2 by glomerular mesangial cells. J Biol Chem, 270, 18786-18796.
110. Hark A.T., Schoenherr C.J, Katz D.J, Ingram R.S, Levorse J.M. and Tilghman S.M. 2000. CTCF mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature, 405,486-489.
111. Harrison P.R., Plumb M., Frampton J., Llewellyn D., Chester J., Chambers 1., MacLeod K., Fleming J., O'Prey J., Walker M. et al. 1988. Regulation of erythroid cell-specific gene expression during erythropoiesis. Br J Cancer SuppL, 9, 46-51.
112. Hatton K.S., Dhar V., Brown E.H., Iqbal M.A., Stuart S., Didamo V.T. and Schildkraut C.L. 1988. Replication program of active and inactive multigene families in mammalian cells. Mol Cell Biol., 8(5), 2149-58.
113. Havas K., Whitehouse I. and Owen-Hughes T. 2001. ATP-dependent chromatin remodeling activities. Cell Mol Life Sci, 58, 673-682.
114. Hebbes Т., Clayton A., Thorne A. and Crane-Robinson C. 1994. Core histon hyperacetilation co-maps with generalized DNase I sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. EMBOJ., 13, 1823-30.
115. Higgs D.R., Wood W.G., Jarman A.P., Sharpe J., Lida J., Pretorius 1-M. and Ayyub H. 1990. A major positive regulatory region located far upstream of the human a-globin gene locus. Genes Dev., 4, 1588-1601.
116. Hiratani A., Leskovar A. and Gilbert D.M. 2004. Differentiation-induced replication-timing changes are restricted to AT-rich/long interspersed nuclear element (LINE)-rich isochores. Proc Natl Acad Sci USA, 101,16861-16866.
117. Hoffmann F.G. and Storz J.F. 2007. The {alpha}D-Globin Gene Originated via Duplication of an Embryonic {alpha}-Like Globin Gene in the Ancestor of Tetrapod Vertebrates. Mol Biol Evol., 24(9), 1982-90.
118. Holmgren C., Kanduri C., Dell G., Ward A., Mukhopadhya R., Kanduri M., Lobanenkov V. and Ohlsson R. 2001. CpG methylation regulates the lgf2/HI9 insulator. Curr. Biol, 11, 1128-1130.
119. Holmquist G.P. 1987. Role of replication time in the control of tissue-specific gene expression. Am J Hum Genet., 40(2), 151-73.
120. Imaizumi M.-T., Diggelmann H. and Scherrer K. 1973. Demonstration of Globin Messenger Sequences in Giant Nuclear Precursors of Messenger RNA of Avian Erythroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 70, 1122-1126.
121. Ioudinkova E., Razin S., Borunova V., De Conto F., Rynditch A. and Scherrer K. 2005. RNA-dependent nuclear matrix contains 33 kb globin full domain transcript as well as prosomes but no 26S proteasomes. J Cell Biochem, 94, 529-539.
122. Ishihara K., Oshimura M. and Nakao M. 2006. CTCF-dependent chromatin insulator is linked to epigenetic remodeling. Mol Cell, 23(5), 733-42.
123. Jantzen K., Fritton H., lgo-Klemenes T. 1986. The DNase I sensitive domain of the chicken lysozyme gene spans 24kb. Nucl Acids Res, 14,6085-99.
124. Jaunin F. and Fakan S. 2002. DNA replication and nuclear architecture. J Cell Biochem., 85(1), 1-9.
125. Kaffer C.R., Srivastava M., Park K.Y., Ives E., Hsieh S., Batlle J., Grinberg A., Huang S.P. and Pfeifer K. 2000. A transcriptional insulator at the imprinted H19/Igf2 locus. Genes Dev., 14, 1908-1919.
126. Karnani N., Taylor C., Malhotra A. and Dutta A. 2007. Pan-S replication patterns and chromosomal domains defined by genome-tiling arrays of ENCODE genomic areas. Genome Res., 17(6), 865-76.
127. Keplinger B., Guo X., Quine J., Feng Y. and Cavener D. 2001. Complex organization of promoter and enhancer elements regulate the tissue-and developmental stage-specific expression of the Drosophila melanogaster GId gene. Genetics, 157, 699-716.
128. Kidman M.F., Smits R., Devi T.S., Fodde R. and Bernini L.F. 1993. Homology of a 130-kb region enclosing the alpha-globin gene cluster, the alpha-locus controlling region, the two non-globin genes in human and mouse. Mamm. Genome, 4, 314-323.
129. Klenova E.M., Nicolas R.H., U S., Carne A.F., Lee R.E., Lobanenkov V.V. and Goodwin
130. G.H. 1997. Molecular weight abnormalities of the CTCF transcription factor: CTCFmigrates aberrantly in SDS-PAGE and the size of the expressed protein is affected by the
131. UTRs and sequences within the coding region of the CTCF gene. Nucleic Acids Res., 25, 466-474.
132. Klenova E. and Ohlsson R. 2005. Poly(ADP-ribosyl)ation and epigenetics. Is CTCF PARt of the plot? Cell Cycle, 4( 1), 96-101.
133. Knezetic J.A. and Felsenfeld G. 1989. Identification and characterization of a chicken a-globin enhancer. Mol. Cell. Biol., 9, 893-901.
134. Knezetic J. and Felsenfeld G. 1993. Mechanism of developmental regulation of a", the chicken embryonic a-globin gene. Mol Cell Biol, 13, 4632-4639.
135. Knoll B., Woo S., Beattie W. and O'Malley B. 1981. Identification and sequence analisis of 5' domain of the X and Y pseudo-ovalbumin genes .J Biol Chem, 256, 7949-53.
136. Kohne A.C., Baniahmad A. and Renkawitz R. 1993. NePl. A ubiquitos transcription factor synergizes with v-ERBA in transcriptional silencing. J. Mol. Biol., 232, 747-755.
137. Krueger C. and Osborne C.S. 2006. Raising the curtains on interchromosomal interactions. Trends Genet., 22(12), 637-9.
138. Kuhn E.J. and Geyer P.K. 2003. Genomic insulators: connecting properties to mechanism. Curr Opin Cell Biol, 15(3), 259-65.
139. Kuzmin I., Geil L., Gibson L., Cavinato T., Loukinov D., Lobanenkov V. and Lerman M.I. 2005. Transcriptional regulator CTCF controls human interleukin 1 receptor-associated kinase 2 promoter. J Mol Biol., 346(2), 411-22.
140. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680-5.
141. Laroche T., Martin S.G., Gotta M., Gorham H.C., Pryde F.E., Louis E.J. and Gasser S.M. 1998. Mutation of yeast Ku genes disrupts the subnuclear organization of telomeres. Curr Biol, 8, 653-656.
142. Larsen F., Gundersen G., Lopez R. and Prydz H. CpG islands as gene markers in the human genome. Genomics, 13(4), 1095-107.
143. LaSalle J.M. and Lalande M. 1995. Domain organization of allele-specific replication within the GABRB3 gene cluster requires a biparental I5ql 1-13 contribution. Nature Genet., 9, 386-394.
144. Lawson G., Knoll B„ March C., Woo S., Tsai M. and O'Malley B. 1982. Definition of 5' and 3' structural boundaries of the chromatin domain containing the ovalbumin multigene family. J Biol Chem, 257, 1501-7.
145. Lemaitre J.M., Danis E., Pasero P., Vassetzky Y. and Mechali M. 2005. Mitotic remodeling of the replicon and chromosome structure. Cell, 123, 787-801.
146. Levy-Wilson B., Kuehl L. and Dixon G. 1980. The release of high mobility group protein H6 and protamin gene sequences upon selective DNase I degradation of trout testis chromatin. Nucleic Acids Res, 8,2859-69.
147. Li X. and Noll M. 1994. Compatibility between enhancers and promoters determines the transcriptional specificity of gooseberry and gooseberry neuro in the Drosophila embryo. EMBOJ., 13,400-406.
148. Li Y.M., Franklin G., Cui H.M., Svensson K, He X.B., Adam G., Ohlsson R. and Pfeifer S. 1998. The H19 transcript is associated with polysomes and may regulate IGF2 expression in trans .J Biol Chem., 273(43), 28247-52.
149. Li Q., Peterson K.R., Fang X. and Stamatoyannopoulos G. 2002. Locus control regions. Blood, 100(9):3077-86.
150. Ling J.Q., Li T., Hu J.F., Vu T.H., Chen H.L., Qiu X.W., Cherry A.M. and Hoffman A.R. 2006. CTCF mediates interchromosomal colocalization between lgf2/HI9 and Wsbl/Nfl. Science, 312(5771), 269-72.
151. Litt M., Simpson M., Recillas-Targa F., Prioleau M. and Felsenfeld G. 2001. Transitions in histone acetylation reveal boundaries of three separately regulated neighboring loci. EMBO J, 20, 2224-2235.
152. Litt M., Simpson M., Gaszner M., Allis C. and Felsenfeld G. 2001. Correlation between histon lysine methylation and developmental changes at the chicken P-globin locus. Science, 293,2453-55.
153. Liu Y., Bondarenko V., Ninfa A. and Studitsky V.M. 2001. DNA supercoiling allows enhancer action over a large distance. Proc Natl AcadSci USA, 98(26), 14883-8.
154. Lutz M., Baniahmad A. and Renkawitz R. 2000b. Modulation of thyroid hormone receptor silencing function by co-repressors and a synergizing transcription factor. Biochem. Soc. Trans., 28, 386-389.
155. MacAlpine D.M., Rodriguez H.K. and Bell S.P. 2004. Coordination of replication and transcription along a Drosophila chromosome. Genes Dev., 18, 3094-3105.
156. Maniatis T., Fritsch E. and Sambrook J. 1982. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.
157. Matthews J.M. and Sunde M. 2002. Zinc fingers-folds for many occasions. IUBMB Life, 54(6), 351-5.
158. Means A.R., Woo S., Harris S.E. and O'Malley B.W. 1975. Estrogen induction of ovalbumin mRNA: evidence for transcription control. Mol Cell Biochem., 7(1), 33-42.
159. Merli C., Bergstrom D., Cygan J. and Blackman R. 1996. Promoter specificity mediates the independent regulation of neighbouring genes. Genes Dev, 10, 1260-1270.
160. Moreau J., Marcaud L., Maschat F., Kejzlarova-Lepesant J., Lepesant J.A. and Scherrer K. 1982. A+T-rich linkers define functional domains in eukaryotic DNA. Nature, 295,260-262.
161. Moss B. and Tompson E. 1969. Adult fowl haemoglobin and its acetylation. Diochem BiophisActa, 188,348-350.
162. Muller M., Gerster T. and Schaffner W. 1988. Enhancer sequences and the regulation of gene transcription. EurJBiochem, 176,485-495.
163. Nolte R.T., Conlin R.M., Harrison S.C. and Brown R.S. 1998. Differing roles for zinc fingers in DNA recognition: structure of a six-finger transcription factor III A complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 95, 2938-2943.
164. Nothias J.Y., Majumder S., Kaneko K.J. and DePamphilis M.L. 1995. Regulation of gene expression at the beginning of mammalian development. J Biol Chem., 270(38), 22077-80.
165. Ohlsson R., Renkawitz R. and Lobanenkov V. 2001. CTCF is a uniquely versatile transcription regulator linked to epigenetics and disease. Trends Genet., 17, 520-527.
166. Paul C.L. and Clark S.J. 1996. Cytosine methylation: quantitation by automated genomicsequencing and GENESCAN analysis. Biotechniques, 21(1), 126-33.
167. Perez-Juste G., Garcia-Silva S. and Aranda A. 2000. An element in the region responsible for premature termination of transcription mediates repression of c-myc gene expression by thyroid hormone in neuroblastoma cells.,/. Biol. Chem., 275, 1307-1314.
168. Pevny L., Lin C.S., D'Agati V., Simon M.C., Orkin S.H. and Costantini F. 1995. Development of hematopoietic cells lacking transcription factor GATA-1. Development, 121(1), 163-72.
169. Pikaart M.J., Recillas-Targa F. and Felsenfeld G. 1998. Loss of transcriptional activity of a transgene is accompanied by DNA methylation and histone deacetylation and is prevented by insulators. Genes Dev.,12(18), 2852-62.
170. Plant K., Routledge S. and Proudfoot N. 2001. Intergenic transcription in the human beta-globin cluster. Mol Cell Biol, 21,6507-6514.
171. Prioleau M., Nony D., Simpson M. and Felsenfeld G. 1999. An insulator element and condensed chromatin region separate the chicken (3-gIobin locus from an independently regulated erythroid-specific folate receptor gene. EMBOJ., 18,4035-48.
172. Prioleau M.N., Gendron M.C. and Hyrien O. 2003. Replication of the chicken |i-globin locus: early-firing origins at the 5' HS4 insulator and the rho- and P A-globin genes show opposite epigenetic modifications. Mol. Cell. Biol., 23, 3536-3549.
173. Quitschke W.W., Taheny M.J., Fochtmann L.J. and Vostrov A.A. 2000. Differential effect of zinc finger deletions on the binding of CTCF to the promoter of the amyloid precursor protein gene. Nucleic Acids Research, 28, 3370-3378.
174. Raghuraman M.K., Winzeler E.A., Collingwood D., Hunt S., Wodicka L., Conway A., Lockhart D.J., Davis R.W., Brewer B.J. and Fangman W.L. 2001. Replication dynamics of the yeast genome. Science, 294, 115-121.
175. Razin S. 1987. DNA interaction with the nuclear matrix and spatial organization of replication and transcription. BioEssays, 6, 19-23.
176. Razin S. 1996. Functional architecture of chromosomal DNA domain. Crit Rev Eukaryot Gene Expr., 6, 247-269.
177. Razin S. 1997. The nuclear matrix and spatial organization of chromosomal DNA domains. "Landes Biosciences ".
178. Razin S.V. 1999. Chromosomal DNA loops may constitute basic units of the eukaryotic genome organization and evolution. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 9, 279283.
179. Razin S.V. 2001. The nuclear matrix and chromosomal DNA loops: is their any correlation between partitioning of the genome into loops and functional domains? Cell Mol Biol Lett., 6(1), 59-69.
180. Razin S.V. and Yarovaya O.V. 1985. Initiated complexes of RNA polymerase II are concentrated in the nuclear skeleton associated DNA. Exp Cell Res., 158(1), 273-5.
181. Razin S.V., Kekelidze M.G., Lukanidin E.M., Scherrer K. and Georgiev G.P. 1986. Replication origins are attached to the nuclear skeleton. Nucleic Acids Res., 14, 8189-8207.
182. Razin S.V. and Vassetzky Y.S. 1992. Domain organization of eukaryotic genome. Cell Biol IntRep., 16(8), 697-708.
183. Razin S., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O., Gromova I. and Georgiev G. 1993. Structural-functional organization of chromosomal DNA domain. Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 58,25-35.
184. Razin S.V., De Moura Gallo C.V. and Scherrer K. 1994. Characterization of the chromatin structure in the upstream area of the chicken rr-globin gene domain. Mol. Gen. Genet., 242, 649-652.
185. Razin S.V. and Gromova I.I. 1995. The channels model of nuclear matrix structure. Bioessays, 17(5), 443-50.
186. Razin S.V., Gromova I.I. and Iarovaia O.V. 1995. Specificity and functional significance of DNA interaction with the nuclear matrix: new approaches to clarify the old questions. Int Rev Cytol., 162B, 405-48.
187. Razin S.V., Ioudinkova E.S., Trifonov E.N. and Scherrer K. 2001. Non-clonability correlates with genomic instability: a case study of a unique DNA region. J. Mol. Biol., 307,481-486.
188. Razin S.V., Farrell C.M. and F. Recillas-Targa. 2003. Genomic domains and regulatory elements operating at the domain level. Int. Rev. Cytol., 226, 63-125.
189. Razin S., Rynditch A., Borunova V., Ioudinkova E., Smalko V. and Scherrer K. 2004. The 33 kb transcript of the chicken alpha-globin gene domain is part of the nuclear matrix. J Cell Biochem., 92,445-57.
190. Razin S.V., Iarovaia O.V., Sjakste N., Sjakste T., Bagdoniene L., Rynditch A.V., Eivazova E.R., Lipinski M. and Vassetzky Y.S. 2007. Chromatin domains and regulation of transcription. J Mol Biol., 369(3), 597-607.
191. Recillas-Targa F. 2000. The chicken a- and p-globin gene domains and their chromatin organization. Cell. & Mol. Biol. Letters., 5, 451-467.
192. Recillas Targa F., De Moura Gallo C.V., Huesca M., Scherrer K. and Marcaud L. 1993. Silencer and enhancer elements located at the 3'-side of the chicken and duck alpha-globinencoding gene domains. Gene, 129, 229-237.
193. Recillas-Targa F., Bell A.C. and Felsenfeld G. 1999. Positional enhancer-blocking activity of the chicken beta-globin insulator in transiently transfected cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14354-14359.
194. Recillas-Targa F. and Razin S.V. 2001. Chromatin domains and regulation of gene expression: familiar and enigmatic clusters of chicken globin genes. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression, 11, 227-242.
195. Recillas-Targa F., De La Rosa-Velazquez 1.А., Soto-Reyes E. and Benitez-Bribiesca L. Epigenetic boundaries of tumour suppressor gene promoters: the CTCF connection and its role in carcinogenesis. J Cell Mol Med., 10(3), 554-68.
196. Reitman M. and Felsenfeld G. 1988. Mutational analysis of the chicken beta-globin enhancer reveals two positive-acting domains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 6267-6271.
197. Renaud S., Loukinov D., Bosman F.T., Lobanenkov V. and Benhattar J. 2005. CTCF binds the proximal exonic region of hTERT and inhibits its transcription. Nucleic Acids Res., 33(21), 6850-60.
198. Rincon-Arano H., Valadez-Graham V., Guerrero G., Escamilla-Del-Arenal M. and Recillas-Targa F. 2005. Y Y1 and GATA-1 interaction modulate the chicken З'-side alpha-globin enhancer activity. J Mol Biol., 349(5), 961-75.
199. Robinett C.C, O'Connor A. and Dunaway M. 1997. The repeat organizer, a specialized insulator element within the intergenic spacer of the Xenopus rRNA genes. Mol. Cell. Biol., 17, 2866-2875.
200. Sadoni N, Cardoso M.C., Stelzer E.H, Leonhardt H. and Zink D. 2004. Stable chromosomal units determine the spatial and temporal organization of DNA replication. J Cell Sci., 117, 5353-5365.
201. Saitoh N, Bell A.C, Recillas-Targa F., West A.G., Simpson M., Pikaart M. and Felsenfeld G. 2000. Structural and functional conservation at the boundaries of the chicken beta-globin domain. EMBOJ., 19(10), 2315-22.
202. Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a Laboratory Manual, Ed.2. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
203. Scherrer K. 2003. Historical review: the discovery of'giant' RNA and RNA processing: 40 years of enigma. Trends Biochem Sci., 28(10), 566-71.
204. Schubeler D, Scalzo D, Kooperberg C, van Steensel B, Delrow J. and Groudine M. 2002. Genome-wide DNA replication profile for Drosophila melanogaster: a link between transcription and replication timing. Nat Genet, 32,438-442.
205. Schwaiger M. and Schubeler D. 2006. A question of timing: emerging links between transcription and replication. Curr Opin Genet Dev., 16(2), 177-83.
206. Selig S, Okumura K, Ward D.C. and Cedar H. 1992. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBOJ., 11(3), 1217-25.
207. Sharpe J, Chan-Thomas P., Lida J, Ayyub H., Wood W. and Higgs D. 1992. Analysis of the human alpha globin upstream regulatory element (HS-40) in transgenic mice. EMBOJ, 11, 4565-4572.
208. Sharpe J., Summerhill R., Vyas P., Gourdon G., Higgs D. and Wood W. 1993. Role of upstream DNase I hypersensitive sites in the regulation of human alpha globin gene expression. Blood, 82, 1666-1671.
209. Silim A., El Azhary M.A. and Roy R.S. 1982. A simple technique for preparation of chicken-embryo-skin cell cultures. Avian Dis., 26, 182-185.
210. Simon I., Tenzen T., Reubinoff B.E., Hillman D., McCarrey J.R. and Cedar H. 1999. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature, 401, 929-932.
211. Simon I., Tenzen T., Mostoslavsky R., Fibach E., Lande L., Milot E., Gribnau J., Grosveld F., Fraser P. and Cedar H. 2001. Developmental regulation of DNA replication timing at the human beta globin locus. EMBOJ, 20, 6150-6157.
212. Singal R., van Wert J. and Ferdinand L. 2002. Methylation of alpha-type embryonic globin gene alpha pi represses transcription in primary erythroid cells. Blood, 100,4217-4222.
213. Singh N., Ebrahimi F.A., Gimelbrant A.A., Ensminger A. W., Tackett M.R., Qi P., Gribnau J. and Chess A. 2003. Coordination of the random asynchronous replication of autosomal loci. Nature Genet., 33, 339-341.
214. Smith Z.E. and Higgs D.R. 1999. The pattern of replication at a human telomeric region (16pl3.3): its relationship to chromosome structure and gene expression. Hum Mol Genet., 8(8), 1373-86.
215. Splinter E., Heath H., Kooren J., Palstra R.J., Klous P., Grosveld F., Galjart N. and De Laat W. 2006. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes Dev., 20(17), 2349-54.
216. Stalder J., Larsen A., Engel J.D., Dolan M., Groudine M. and Weintraub H. 1980. Tissue-specific DNA cleavages in the globin chromatin domain introduced by DNAase I. Cell, 20, 451-460.
217. Tata G., Baker B. and Deeley J. 1980. Vitellogenin as a multigene family. Not all Xenopus vitellogenin genes may be in an "expressible" configuration. J Biol Chem, 255, 6721-27.
218. Tolhuis B., Palstra R.J., Splinter E., Grosveld F. and De Laat W. 2002. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. Mol Cell., 10(6), 1453-65.
219. Travers A. 1999. Chromatin modification by DNA tracking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 13634-13637.
220. Tremblay K.D., Duran K.L. and Bartolomei M.S. 1997. A 5' 2-kilobase-pair region of the imprinted mouse H19 gene exhibits exclusive paternal methylation throughout development. Mol. Cell. Biol, 17,4322-4329.
221. Tsutsumi S., Hogan V., Nabi I.R. and Raz A. 2003. Overexpression of the autocrine motility factor/phosphoglucose isomerase induces transformation and survival of NIH-3T3 fibroblasts. Cancer Res., 63(1), 242-9.
222. Tuan D., Solomon W., Li Q. and London T. 1985. The "P-like-globin" gene domain in human erythroid cells. Proc Natl Acad Sci USA, 82, 6384-6388.
223. Valadez-Graham V., Razin S.V. and Recillas-Targa F. 2004. CTCF-dependent enhancer blockers at the upstream region of the chicken alpha-globin gene domain. Nucleic Acids Res., 32, 1354-1362.
224. Valenti M.T., Bertoldo F., Dalle Carbonare L., Azzarello G., Zenari S., Zanatta M., Balducci E., Vinante O., Lo Cascio V. 2006. The effect of bisphosphonates on gene expression: GAPDH as a housekeeping or a new target gene? BMC Cancer, 6,49.
225. Verbovaia L. and Razin S.V. 1995. Analysis of the replication direction through the domain of alpha-globin-encoding genes. Gene, 166,255-259.
226. Vogelauer M., Rubbi L., Lucas 1., Brewer B.J. and Grunstein M. 2002. Histone acetylation regulates the time of replication origin firing. Mol Cell, 10, 1223-1233.
227. Vostrov A. and Quitschke W. 1997. The zinc finger protein CTCF binds to the APBbeta domain of the amyloid beta-protein precursor promoter. Evidence for a role in transcriptional activation. J. Biol. Chem., 272, 33353-33359.
228. Vyas P., Vickers M.A., Simmons D.L., Ayyub H., Craddock C.F. and Higgs D.R. 1992. cis-acting sequences regulating expression of the human alpha-globin cluster lie within constitutively open chromatin. Cell, 69, 781-793.
229. Vyas P., Vickers M.A., Picketts D.J. and Higgs D.R. 1995. Conservation of position and sequence of a novel, widely expressed gene containing the major human alpha-globin regulatory element. Genomics, 29,679-689.
230. Wagener R., Aszodi A., Aeschlimann D. and Paulsson M. 2001. Characterization of the mouse matrUin-4 gene: a 5' antiparallel overlap with the gene encoding the transcription factor RBP-I. Genomics, 76, 89-98.
231. Walters M.C., Fiering S., Bouhassira E.E., Scalzo D., Goeke S., Magis W., Garrick D„ Whitelaw E. and Martin D.I. 1999. The chicken p-globin 5'HS4 boundary element blocks enhacer-mediated suppression of silencing. Mol. Cell. Biol., 19, 3714-3726.
232. Wasylyk B. 1988. Enhancers and transcription factors in the control of gene expression. Biochim Biophys Acta, 951, 17-35.
233. Weintraub H. and Groudine M. 1976. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation. Science, 193(4256), 848-56.
234. Wen S.C., Roder K., Hu K.Y., Rombel I., Gavva N.R., Daftari P., Kuo Y.Y., Wang C. and Shen C.K. 2000. Loading of DNA-binding factors to an erythroid enhancer. Mol Cell Biol., 20(6), 1993-2003.
235. West A.G., Huang S., Gaszner M., Litt M.D. and Felsenfeld G. 2004. Recruitment of histone modifications by USF proteins at a vertebrate barrier element. Mol Cell., 16(3), 453-63.
236. Wong G., Passey D. and Yu J. 2001. Most of the human genome is transcribed. Genome Res., II, 1975-1977.
237. Woodfine K., Fiegler H., Beare D.M., Collins J.E., McCann O.T., Young B.D., Debernardi S., Mott R., Dunham I. and Carter N.P. 2004. Replication timing of the human genome. Hum Mol Genet., 13, 191-202.
238. Woodfine K., Beare D.M., Ichimura K., Debernardi S., Mungall A.J., Fiegler H., Collins V.P., Carter N.P. and Dunham I. 2005. Replication timing of human chromosome 6. Cell Cycle, 4, 172-176.
239. Wu J.R. and Gilbert D.M. 1996. A distinct G1 step required to specify the Chinese hamster DHFR replication origin. Science, 271, 1270-1272.
240. Wu R., Singh P.B. and Gilbert D.M. 2006. Uncoupling global and fine-tuning replication timing determinants for mouse pericentric heterochromatin. J. Cell Biol, 174, 185-194.
241. Yang Y., Quitschke W.W., Vostrov A.A. and Brewer G.J. 1999. CTCF is essential for up-regulating expression from the amyloid precursor protein promoter during differentiation of primary hippocampal neurons. J. Neurochem., 73,2286-2298.
242. Yompakdee C. and Huberman J.A. 2004. Enforcement of late replication origin firing by clusters of short G-rich DNA sequences. J. Biol. Chem., 279, 42337^2344.
243. Yunis J.J. 1981. Mid-prophase human chromosomes. The attainment of 2000 bands. Hum Genet., 56(3), 293-8.
244. Yusufzai T. and Felsenfeld G. 2004. The 5' HS4 chicken beta - globin insulator is a CTCF -dependent nuclear matrix-accociated element. Proc Natl Acad Sci USA, 101, 8620-8624.
245. Yusufzai T., Tagami H., Nakatani Y. and Felsenfeld G. 2004. CTCF tethers an insulator to sunuclear sites, suggesting shared insulator mechanisms across species. Mol Cell, 30, 291298.
246. Zegerman P. and Diffley J.F. 2007. Phosphorylation of Sld2 and Sld3 by cyclin-dependentkinases promotes DNA replication in budding yeast. Nature, 445,281-285.
247. Zeng L. and Zhou M. 2002. Bromodomain: an acetyl-lysine binding domain. FEBS Lett., 513,124-128.
248. Zink D. 2006. The temporal program of DNA replication: new insights into old questions. Chromosoma, 115(4), 273-87.
249. Zhong X.P. and Krangel M.S. 1997. An enhancer-blocking element between alpha and delta gene segments within the human T cell receptor alpha/delta locus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 5219-5224.
-
Клочков, Денис Борисович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2007
-
ВАК 03.00.03
- Роль пространственной организации геномного локуса в феномене переключения экспрессии глобиновых генов
- Структурно-функциональная организация домена альфа-глобиновых генов кур
- Изучение репликационной структуры больших областей генома высших эукариот
- Характеристика сайтов узнавания ДНК белковыми факторами в окрестностях участка начала репликации домена альфа-глобиновых генов кур
- Расширение функционального домена альфа-глобиновых генов кур как следствие хромосомной перестройки
