Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика сайтов узнавания ДНК белковыми факторами в окрестностях участка начала репликации домена альфа-глобиновых генов кур

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика сайтов узнавания ДНК белковыми факторами в окрестностях участка начала репликации домена альфа-глобиновых генов кур"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ им. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи КИНЦУРАШВИЛИ Екатерина Георгиевна

УДК 576.315.42

ХАРАКТЕРИСТИКА САЙТОВ УЗНАВАНИЯ ДНК БЕЛКОВЫМИ ФАКТОРАМИ В ОКРЕСТНОСТЯХ УЧАСТКА НАЧАЛА РЕПЛИКАЦИИ ДОМЕНА АЛЬФА-ГЛОБИНОВЫХ

ГЕНОВ КУР

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1991

Работа выполнена е лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот института нолекулярнои биологии им.в.а. энгельгарлта АН СССР

Научный руководитель:

доктор биологических наук C.B. Разин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.В.Иткес

кандидат биологических наук о.и.Карпова

ведущая организация: институт вирусологии им.л.и.ивановского анн

СССР

специализированного совета л . 002. 79. 01 при институте Молекулярной Биологии им.в.а. энгельгарлта АН СССР по адрессу И7984. Москва, ул. Вавилова д.зг

с диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института молекулярной Биологии им.в.А.энгельгарлта АН СССР

зашита состоится

г. на заседании

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированное

кандидат химических наук

дкгуадьцодхь проблемы.

изучение механизмов инициации репликации лнк у высших эукариот является одной из центральных задач современной молекулярной миологии. значительные успехи были достигнуты в изучении механизмов инициации репликации ДНК у дрожжей, эти успехи явились следствием обнаружения особой группы последовательностей лнк. способных обеспечивать автономную репликацию плазмид в дрожжевых клетках. к сожалению. многочисленные попытки изолировать специфические последовательности лнк. обеспечивающие автономную репликацию плазнид в клетках высших эукариот. привели к крайне неоднозначным и по большей части негативным результатам, в этой связи очевидной представляется необходимость изыскания иных путей характеристики- последовательностей . лнк высших эукариот. участвующих в инициации репликации, наиболее пряным подходом к данной проблеме является картирование позиция участков начала репликации в клонированных областях генома высших эукариот и последующее изучение организации специфических

последовательностей лнк в окрестностях участка начала репликации, настоящая работа является одной из первых попыток реализации этой экспериментальной стратегии, цель работы.

целью настоящей работы явилась характеристика сайтов узнавания лнк белковыми Факторами в окрестностях участка начала репликации домена альфа-глоеиновых генов кур. параллельно изучалось распределение участков in vitro взаимодействия лнк с ядерным матриксом в той же области.

научная новизна И практическая ценность работы.

В окрестностях участка начала репликации домена альфа-глобиновых ' генов кур идентифицировано ю новых (ранее не известных) сайтов узнавания' лнк. спеииФичныни в отношении последовательности белковыми Факторами.

продемонстрировано, что белки, взаимодействующие с двумя из идентифицированных сайтов связывания, присутствуют в существенно большей количестве в пролиФерирующих клетках по сравнению с покоящимися клетками того же происхождения.

короткие субфрагменты лнк. включающие эти сайты связывания, избирательно удерживаются в составе ядерного матрикса (в условиях эксперимента in vitro).

полученные результаты расширяют наши знания об организации участков начала репликации днк высших эукариот и составляют теоретическую и нетолическую основу для последующей разработки данной проблемы.

Апробация работы. "

материалы диссертации докладывались на 8 двустороннем симпозиуме СССР-ФРГ "(Иркутск, 1989): конгрессе фебо (Рим, 1989); 11 международном совещании по клеточному ядру (Суздаль. 1989); г двустороннем симпозиуме СССР-США (Тбилиси, 1989); ю двустороннем симпозиуме СССР-франция (Киев. 1990); международном симпозиуме "исследование хромосомы: от микроскопа до молекулы" (индия.1990).

структура и обьем Едест

диссертация состоит из введения. Обзора литературы, нетопического раздела, экспериментальной части, включаюшей обсуждение полученных результатов, и раздела выводы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. субклонирование инсердии изучаемый фрагнент ДНК длиной 1.7 т.п.н. расположен на расстоянии 3.2-4.9 т.п.н. от 5'-кониа домена альфа-глобиновых генов кур. . •

фрагмент предварительно был клонирован и назван о(5Нй, соответственно названию использованного плазмидного клона (Каландадзе. и лр. . 1989).

в настоящей работе был сконструирован комплект субклонов сбнк с короткими инсерциями. инсерции этих субклонов показанны на рис.1.

для экспериментов по задержке электрофоретическоя подвижности (ретардации) инсерции этих субклонов в ряде случаев дополнительно рашеплялись соответствующими рестриктазами.

3.изучение способности послеловатвльностей ДНК,

локализованных в окресностях участка начала Репликации домена альФа-глобиновых сенов кур, образовывать специфические комплексы с белками ядерного Экстракта куриных Фибробластов. '

секвенирование 1,7 т.п.н. фрагмента ДНК. включающего участок начала репликации альфа-.глобинового донена кур. и последующий анализ нуклеотидной последовательности выявили в этой области

о

ЭОО 51 3 613 70 813 888 1088 1288 И8Э 1617 • 1717 Ц.

XRMlXnul Xmal Kpnl Psll Hind M

II |»»ll НоШ H.otl I Hall Prall H. nil Ь|"<»>"«1

I Ii t i I Ol i Ю i и I D4 1, t .

Cl S^IA im il

—' C2 ' "Г" «

' . C3 I)

c« DI. I —•

CS . Dlb

Die -poy

рис.1 субклонирование инсерпии eßffit

несколько участков, гомологичных известным сайтам узнавания ДНК специфичными в отношении последовательности пнк-связывающими белкани (Каландадзе и др., 1989).

для того, чтобы проверить, действительно ли окружающие участок начала репликации последовательности ДНК способны образовывать специфические комплексы с различными белковыми Факторани, присутствующими в ядрах куриных клеток, проводили эксперименты по задержке электрофоретической подвижности.

Была проанализирована способность инсерции ряда субклонов «5HR образовывать специфические комплексы с белками, экстрагируеныни о,45Н раствором Naci из ядер пролиФерируших (эмбриональные Фибробласты) и покоящихся (гепатоциты зрелой печени) куриных клеток. для обогащения препаратов днк-связывающими белкани экстракты фракционировали посредством хронатограФии на деае-целюлозе и. далее. на гепарин-сеФарозе, как было описано (Scheider H.H., 1986). днк-связывающие белки элюировали с гепарин-сеФарозы линейным градиентом концентрации KCl (от 0.2 до о.8Н) в буфере для элюции (20ши Hepes рн 7.9, го-/ глицерина, 4тн дтт. о.гшн эдта). собранные Фракции анализировали на присутствие белков, способных образовывать специфические (не разрушающиеся в присутствии 50-кратного избытка поли dAdT) комплексы с клонированным участком узнавания ядерного Фактора 1. судя по результатам этого теста, специфичные в отношении последовательности днк днк-связывающие белки элюировались с гепарин-сеФарозы в широком интервале концентраций KCl (от 0,45 до

0.65Н). сходные результаты были получены при фракционировании белковых экстрактов из делящихся и покоящихся клеток содержащие днк-связывающие белки фракции обоих экстрактов, а также .фракции белков, не связывавшиеся с гепарин-сефарозой. анализировались в экспериментах по задержке электроФоретической подвижности. Анализ результатов позволяет сделать три важных заключения-, i) все субфрагменты oíshr (A.b.c.di♦D2,D3<D4,E) (рис.1) образуют специфические конплексы с белками, экстрагированными из делящихся клеток. 2) во всех случаях можно наблюдать образование различных комплексов с белками, не удерживающимися на колонке с гепарин-агарозои (фракции проскока) и с белками, элюируюшимися при тех же концентрациях Nací.- что и ядерный Фактор 1. 3) Белки, связывающиеся данными Фрагментами лнк. не детектируются в ядрах покоящихся гепатоиитов. ото заключение относится только к белкам, удерживаемым на колонке с гепарин-сеФарозоя. белки фракции проскока из гепатоиитов не анализировались).

3. характеристика' участков связывания белкоЕЫХ Факторов. присутсвуюших £ ялврнмх ЭКСТГаКТаК делящихся и покоящихся эритроипних клеток КУР.

В описываемых ниже экспериментах были охарактеризованы комплексы инсершш субклонов << 5hr < рис;1). с белками ядерных экстрактов из трансформированных aev вирусом эритроидных клеток кур (клетки hd3) и эритробластов уток, полученные результаты излагаются последовательно в соответствии с порядком расположения'•инсерций субклонов в исходном фрагменте клонированной лнк (обНВ).

б

а) СаИТЫ связывания белка внутри Фрагмента д и В фрагненты А ив содержат g-c богатую Часть исследуеной области днк. прй анализе этих Фрагментов по задержке электрофоретической подвижности было выявлено несколько сдвинутых полос. при инкубации фрагментов А и В с экстрактом из пролиФериругаих клеток HD3 можно было наблюдать одну весьна интенсивную сдвинутую полосу ( с относительно небольшим сдвигон по отношению к исходнону Фрагменту клонированной дню и несколько * более слабых дополнительных полос, располагающихся существенно ближе к старту, с экстрактами из нормальных эритробластов утки наблюдались две относительно слабо сдвинутых мажорных полосы при практически полном отсутствии дополнительных полос с меньшей интенсивностью и большим относительный сдвигом электрофоретической подвижности, для определения сайтов узнавания ДНК специфичными в отношении последовательности белковыми Факторами был использован метод интерференции метилирования ' в сочетании с препаративным электрофоретическим выделением ДНК-белковых комплексов. ( sieben-1ist and Gilbert.. 1987) (только экстракты aev клетки), было показано , что во Фрагменте А имеет место взаимодействие белковых Факторов с каноническим сайтом связывания транскрипционного Фактора SP1 в позициях 9-14, 179-184 и 289-394 последовательности днк (мажорные сдвинутые полосы), полосы слабой интенсивности возникали благодаря взаимодействию неких белковых Факторов с gc-богатами мотивами, такими как 'gcgcgc (Фактор Fl) или gccgccgccg (Фактор па), внутри фрагмента в нам не удалось выявить каких-либо сайтов связывания белков.

б) СйИТЫ связывания вк£Ш1 фрагмента £_,

при инкубации целого Фрагмента с с белковыми экстрактами и последующей электрофорезе можно было видеть "лесенку" задержанных полос. количество материала в полосах с сильным сдвигом электрофоретическоя подвижности было относительно более высоким при использовании экстракта из трансформированных аеу клеток (по сравнению с экстрактом из эритробластов утки), для устанавления позиция участков связывания более точно, пять субфрагментов фрагмента с (полученных после ратепления нит или нае ш рестриктазани) также анализировались в экспериментах по задержке электрофоретическоя подвижности и в экспериментах по интерференции метилирования.в результате было продемонстрировано, что четыре из пяти упомянутых субфрагментов фрагмента с (С1-СЗ. С5) содержат участки узнавания для белковых Факторов, даюших начало относительно слабо сдвинутым комплексам . при инкубации фрагмента С4 с белками, экстрагированными из трансформированных аеу клеток, часть материала была обнаружена в составе сильно сдвинутого комплекса, располагающегося около старта геля. с использованием нетола интерференции метилирования результаты экспериментов позволяют утверждать, что медленно нигрирушие конплексы образуются благодаря взаимодействию белковых Факторов с двумя последовательностями, одна из которых включает участок УЗНаВаНИЯ ДНК реСТРИКТаЗОЯ Н11Ш ( ъ'-олвАСТссААСвтвАССгв-з') . второй связывающий сайт локализован на расстаянии 5 пар оснований от первого сайта и содержит последовательность

I i

5-тОАбАСАтесесАО-з. надо отметить, что обе узнаваемые последовательности имеют общий мотив: бА/тетстСА/т: значение этого мотива предстоит выяснить в дальнейшем.

что касается относительно быстро мигрирующих комплекса. то они возникают в результате взаимодействия неких белков с элементами последовательности типа ТбСРУСОб (Фактор пз). в составе Фрагмента С (который Еключает область с несовершенными внутренними повторениями нуклеотидной последовательности) можно видеть несколько упомянутых эленентов последовательности. с использованием техники интерференции метилирования оыло продемонстрировано, что эти последовательности участвуют в связывании неких белковых Факторов . в последующих экспериментах было продемонстрировано, что синтетический олигонуклеотид, включающий тссруесб нотив специфически конкурирует с различными субфрагментами фрагмента с за белки, образующие относительно быстро мигрирующие комплексы.

Целый фрагмент Л является очень длинным (728 пар основании) для экспериментов по задержке электроФоретическоп подвижности. Поэтому изначально были исследоЕаны четыре субфрагмента (полученные после расщепления фрагмента л гестриктазамы руип и НШЛ). Было обнаружение, что тги из них (Д1. аг, Д4) содержат сайты узнавания для некоторых днк-связывающих белков, присутствующих в ядерном экстракте клеток поз . для определения локализации этих сайтов более точно, в экспериментах по задержке

электрофоретической подвижности были проанализированы различные субфрагненты фрагментов Л1. лз, Л4 (полученные после расшепления соответствующими рестриктазами). оценивая результаты этих экспериментов, ножно отметить, что в составе фрагмента Л1 присутствуют участки связывания для двух различных белков, так как спектр задержанных полос отличен для субфрагментов Д1в и Д1с (при использовании одного и того же экстракта). очевидные различия в спектрах задержанных полос наблюдались и при сравнении экстрактов из ноз клеток и норнальных эритробластов утки, однако в экспериментах по установлению точных позиция участков связывания был использован лишь экстракт из ноз клеток, позиция белок-связывающего сайта внутри фрагмента Д1в была определена с помощью интерференции метилирования. Белок-связывающий сайт 5'-сстсасот6ССС-з'(Фактор Г4> включает маленький обгаженный повтор саазтб и метилирование только двух соседствующих б остатков ( и только в одной цепи) частично препятствует взаимодействию белка с лнк. во фрагненте Л1с узнаваемый белком сайт на лнк не был определен с помощью интерференции метилирования, хотя анализировались обе цепи, одноко сравнение последовательности лнк этого фрагмента с последовательностями л 4 (а-е субфрагментов) дает возможность для предположения, что коплексы'ретардации в этом случае возникали благодаря взаимодействию неких белков с сс-богатыми нотивами . вкпючаюшини 5-бАО(3<з-з' (Фактор Г5) элемент, эксперименты по задержке электрофоретической подвижности различных субфрагментов дз продемонстрировали, что правая часть этого фрагмента ... (субфрагмент лзв) включает белок -связывающий

сайт . Более точно позиция этой узнаваемой последовательности была картирована с помошыо интерференции нетилирования существенный для взаимодействия элемент последовательности днк имел следующую структуру: 5-татп6атассаататтта6Тапт-з' (Факторге).

Фрагнент Д4 был разрезан на три части с помощью рёстриктазы наеш . Результаты экспериментов по задержке электроФоретической подвижности позволяют говорить, что все эти фрагменты имеют сайты узнавания для одного и того же белкового Фактора, действительно, спектры задержанных полос были очень схожими для фрагментов Д4а и Д4в (при использовании одного и того же экстракта). при анализе Фрагмента Д4с наряду с аналогичными полосани наблюдали eme ряд дополнительных полос, соответствующих комплексам с более низкой подвижностью, эти дополнительные полосы возникали в результате взаимодействия некого белкового Фактора с элементом последовательности ¿-ttagaattg-з1 (фактор f7). что касается наиболее интенсивных задержанных полос (во всех трех случаях), то они, вероятно, отражают взаимодействие некого белкового Фактора с dG(dC) олигомером. включающим одну dA(dT) пару. существование подобного взаимодействия было пряно продемонстрировано (с помощью днказа1 ФУтпринтинга> в случае фрагмента Д4а. здевь последовательность ДНК, включающая gaggg мотив, 'была частично занижена от ратепления днказой1 и. более того, на границах защищенной области были обнаруженны сильные гиперчувствительные сайты . gggag нотив может быть обнаружен и в других фрагментах (Д1с- Д4В. Д4с), демонстрирующих сходный

комплекс задержанных полос, что и фрагмент Л4а. но не в составе фрагментов л1а. Д1в, дг. лз. характеризующихся совершенно иным спектрон задержанных полос (при использовании того же экстракта).

и секвенс-специфические взаимодействия ДНК-связывающих здшш £ ФРагментон

при электроФоретическом анализе лнк-белковых комплексов, сформированных в ходе инкубации Фрагмента Е с экстрактами из Ш)3 клеток и из эритрооластов уток, было обнаружено 5 задержанных полос . интересно, что нажорные полосы, полученные при использовании этих двух экстрактов, не совпадали, для определения позиции сайтов узнавания использовали интерференцию метилирования и футпринтинг ЛНКазой 1. четкая картина интерференции метилированием наблюдалась только при анализе материала из основной (наиболее интенсивной) задержанной полосы и только при использовании экстракта из юз клеток. узнаваеныя сайт локализован внутри ат-богатого элемента в правом конце Фрагмента е (ез) и имеет следующую структуру: э'-ааатс&ааоалтааасзсса-з' (Фактор ге). звездочка показывает, какие из присутствуют« в этой элементе гуанозинов вовлечены во взаимодействие. Аналогичная, хотя и менее четкая картина интерференции в той же области наблюдалась и при анализе наиболее интенсивной из задержанных полос, получающихся при инкубации фрагнента е с экстрактом из эритробластов уток .

происхождение минорных задержанных полос остается неясным.

д)идентификация возможных репликапионных Факторов. Результаты описанных выше экспериментов позволили идентифицировать ю участков узнавания днк белковыми Факторами в пределах инсерции «зшг (рис.2), в последующих опытах мы пытались получить ответ на вопрос о тон, какие из перечисленных Факторов могут участвовать в инициации репликации, с этой целью сравнивали относительное содержание Факторов, взаимодействующих с каждым из идентифицированных участков узнавания, в экстрактах из пролиФерирущих и дифференцированных НБЗ клеток, из этих клеток были приготовлены белковые экстракты с одинаковой концентрацией белка, с данныни экстрактами инкубировали различные субфрагменты аЗНК. включающие все ю идентифицированных участков узнавания днк белковыми Факторами, после этого анализировали возникшие лнк-белковые комплексы с использованием техники торможения в полиакриламилнон геле, полученные результаты показаны на рис.з. можно видеть, что после индукции диФФеренцировки относительное содержание Факторов, взаимодействующих с участками узнавания Гб и ть резко снижается. Факторы, взаимодействующие с остальными восенью участкани узнавания, представлены примерно в одинаковых количествах в обоих экстрактах (судя по интенсивности задержанных полос).

такин образом, эти Факторы могут быть либо Факторами инициации репликации. либо негативными регуляторами транскрипции (дифференцированные клетки Ш)3 отличаются от пролиферируюших еще и в том отношении, что начинается экспрессия глобинов), из работ.

Выполненных в лаборатории ФельзенФельда. следует однако, что

Па

О

10

1

-1_1 Ш

О А п__а о

18 Ыьр. _|_

Р2а Р2Ь РЗРЗРЗ ?А ?5 Т

Р6Р5Р5Р5Р7

08 М1Ы ЕЫНАЫСЕК НК

I

1.6 Ю>.р.

П вС6С6С Р4 ССТСАССТвССС

Па 6С66С66С Р5 ЗДбОД

Р2 ТСАССТТввАСТСГСТТСТ Т6 ТЛТТТеАХАвСАА1АГТТАе1АГТ Р2а СТбСбСАвТСТСТСА Р7 ТТАбААГТе РЗ тесруббб Рв ОААЛЗДМАААг

тис.2 ядерные бельковые Факторы специфически взаимодействующие с СУбФРагнентани участка начала репликации кур

А (П«Р1А«8р1) 1 » 3

И

СЗ(РЗ)

I з .1

С4(Р2»Р?<1)

01 (Р4 ♦ 5)

1 2 з

ОЗ(Рб) 1 г э

©«(«♦т Е(Г8)

1 г з

щ

тН Ы

Рис.3 эксперименты по задержке электроФоретической подвижности с экстрактами из дифференцированных и недифференцированных нвз клеток. (1) контроль (инкубация без экстракта); (2) инкубация с экстрактом из дифференцированных клеток; (3) инкубанил с •экстрактом из недифференцированных клеток Обозначения нал автографами показывают, какие участки узнавания содержали данные фрагменты ДНК (соотв. обозначениям на рис.2)

1 .1

экспрессия альФа-глобиновых генов кур регулируется ткане-специфичнын энхансером. расположенный после альфа А гена. т.е. на расстоянии более 5 т.п.н. от исследуеной нами области, в этой связи предложение о toHi что Факторы F6 и F8 являются негативными регуляторами транскрипции. представляется нам весьма мало вероятным. Участие же этих Факторов в регуляции инициации репликации кажется вполне возможным в силу расположения в данной области участка начала репликации.

веема интересно то обстоятельство, что участки связывания F6 и F8 находятся в тех субфрагментах инсерции c<5HR, которые включают также mar (натрикс-прекрепляюнше области) элененты (снори ниже), в этой связи можно предпологать, что в покоящихся клетках данные области прикреплены к ядернону матриксу. при начале же репликации более прочные взаимодействия со специфическими в отношении последовательности днк растворимыми Факторами (F6.F8) освобождают участок начала репликации, что составляет один из этапов запуска репликации, понятно, что это всего лишь гипотеза, нуждаюшая в экспериментальной проверке.

4) идентификация участков связывания дик с шшешн натриксон IHAR) В ОКРесНРСТЯЗС участка начала репликации донена аль»а-глобиновых генов кур.

эксперимент проводили в соответствии с оригинальным протоколом кокерила и Гаррарда (1986). ядерный натрикс получали из культивируеных эритробластов кур (линия lscc hd3 клон аб (Beug et al, 1987) ). снеси неченных по концу ФРагнентов клонированной днк (инсерции субклонов <йню инкубировали с натриксами. полученными из 2хют клеток в течение 2 * часов при комнатной тенпературе в присутствие избытка фрагнентированноя лнк E.coli (400мкг/нл). после инкубации натриксы осаждали и выделяли лнк из осадка и супернатанта. полученные препараты анализировали посредством электрофореза в полиакриланиднон геле с последующей авторалиограФией.

результаты экспериментов представлены на рис 4 можно видеть, что 2 из ю проанализированных фрагментов лнк содержат mar (фрагменты 8 и ю согласно нунерашга. использованной на рис 4 ). эти фрагменты выявляются в составе ядерного натрикса. все остальные фрагменты выявляются предпочтительно в супернатанте. нуклеотидные последовательности ФРагнентов 8 и ю были определены ранее (Каландадзе и др. 1989). эти последовательности не обладают какой либо выраженной гонологией. в то же вреня обе они являются АТ богатыми и содержат участки узнавания для ДНК-Топоизонеразы 11. что находится в хорошем соответствии с предыдущими наолюденияни.

чш ч ч

N8_9_д_

11 1 III V 11

2 3 4 56789 10

ЭкЬр

Т Р Б

1 - •

5 - •

Б Р Т

9 6

8

7

рис.4 связывание с изолированный ядерным матриксом субфрагментов днк из области, включашей участок начала репликации домена <Х глобиновых генов кур. в верхней части рисунка показаны схема домена (белые прямоуголники демонстрируют позиции глобиновых генов) и более подробная карта области, включающей участок начала репликации, субклонированые фрагменты обозначены номерами 1-ю Внизу показаны результаты связывания этих ю фрагментов с изолированным ядерным матриксом. т - исходная смесь меченных по концу фрагментов, инкубировавшихся с препаратом матриксов, Р фрагменты, связавшиеся с матриксом, з - Фрагменты изолированные ио супернатанта.

выводы

1. в окрестностях участка начала репликации донена альфа глобиновых генов кур в пределах 1.7 т.п.н. уникального Фрагмента лнк идентифицировано ю новых участков узнавания лнк специфичными в отношении последовательности белковыми Факторами.

г. показано, что Факторы, взаимодействующие с двумя из идентифицированных участков узнавания, могут быть обнаружены только в реплицирующихся эритроидных клетках и отсутствуют в покоящихся клетках того же происхождения.

з. в окрестностях участка начала репликации домена альФа-глобиновых генов кур выявлено также два участка ш vitro связывания ДНК с ядерный матриксом (MAR элементы).

содержание диссертации изложено в следующих работах:

1.Е.г.кинцурашвили, в.в.Адлер. Е.м.кленова. в.в.лобаненков. С.В.Разин -множественные сайты узнавания днк специфичными в отношении последовательности днк-связывающими белкани в окрестностях участка начала репликации, расположенного в 5'-кониевои области домена альфа-глобиновых генов кур." Докл. АН СССР Т.310 СТ.227-230.; (1990)

2.с.в.Разин. Е.с.васецкий. А.г.каландадзе, Е.г.кинцурашвили "Характеристика последовательностей днк. расположенных по соседству с участкам начала репликации в 5'-концевой области домена альфа-глобиновых генов кур. тез. 8-го двуст. сим. ссср-фрг

ст.58. (иркутск.1989)

3"s.v.Razin, A.e.Kalandadze. Y.s.vassetzky. E.G.Kintsurashviii -characterization of a fragment of chicken aipha-globin eene domain containing both replication oriem and permanent site of dna attechment to the nuclear matrix." Abstracts of II nuclear workshop, suzdal. 1989. p. 151

4.s.v.Razin, Y.s.vassetzky. A.e.Kalandadze. E.o.Kintsurashviu. A.l.Kvartskhava "DNA-sequences. located in the vicinity of replication origins in the 5'-upstream region of the domain of chicken alPha-giobin proteins." Abstracts of the second bilateral simposium USSR-USA. Tbilisi. 1989. p.33

s.s.v.Razm, E.e.Kintsurashvm, A.I.Kvartskhava. A.N.Boedanova "Anatomy of a eukariotic replication origin." Abstracts of international symposium on chromosome research: From Hicroscope to Moliecull. №dia. 1990. p.7i

6. Y.s.vassetzky. E.G.Kintsurashvin. N.F.crmenco. K.T.Turpaev "organization of the chicken sites of initiation of dna replication and dna attachment to the nuclear matrix." Abstracts-of international symposium or. chromosome research: From Hicroscope to Moleculi. India. 1990. p.71

т.s.v.Razin, A.G.Kaiandadze. E.G.Kintsurashviii, Y.s.vassetzky "characterization of the dna pattern in the vicinity of a replication origin located upstream from the domain of chicken ereiobin eenes." Nuclear structure and Function, Edited by J.R.Harris and l.B.Zbarsky, Plenum Press. New York. 1990. р.ззт-380

8.Y.s.vassetzky, A.G.kalandadze. E.G.Kintsurashviii, K.T.Turpaev, N.F.Grmenko, A.D.Alstem and s.v.Razin "A fragments of chicken nuclear matrix-associated dna maintain autonomous replication of piasmids in mammalian cells." Nuclear structure and Function, Edited by J.R.Harris and l.B.Zbarsky, Plenum press. New York, 1990. P.343-349

9.Y.s.vassetzky, E.G.Kintsurashviii, a.I.Kvartskhava. n.f.Grinenco, s.v.Razin "Cloning and characterization of chicken dna fragments originating from permanent sites of dna attachments to the nuclear matrix that either coincide or are located near replication origins." The xth Bilateral symposium USSR-France, (Kiev. 1990)

10.е.г.кинцурашвили, Е.с.васецкий, С.В.Разин " сайты связывания лнк с ядерным матриксом в окрестностях участка начала репликации помена альфа-глобиновых генов кур", локл. ан СССР. 1991.