Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование искусственных хромосом дрожжей в качестве модели для изучения высших уровней организации хроматина

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование искусственных хромосом дрожжей в качестве модели для изучения высших уровней организации хроматина"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

СВЕТЛОВА

На правах рукописи

терина Юрьевна

Использование искусственных хромосом дрожжей в качестве модели для изучения высших уровней организации хроматина,

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата .биологических наук.

МОСКВЯ 1996

Работа выполнена в лаборатории структурно Функциональной организации хромосом Институт биологии гена РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Разим C.B. доктор Филипский Я.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Габибов Й.Г.

кандидат биологических наук Сащенко Л.П.

Ведуцая организация: Институт обцей генетики им.H . И.Вавилова PRH

на заседании Диссертационного совета Д.200.30.01 ■ пр

Защита состоится

ноября 1996 года в

Институте биологии гена РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институт! молекулярной биологии им.В.Я.Энгельгардта РАН

октября 1996 года

Ученым секретарь Диссертационного совета

канд .«>арн . наук. . С. Грабовская

Общая характеристика работы.

.Актуальность г.робпапы.

Вопрос о существовании структурно-функциональных доменов в геноме эукариот обсуждается уже в течение 30 лет. В настоящее время считается общепризнанным, что существует несколько уровней компактизации хроматина в клетке. Одним из высших уровней структурной организации хроматина является его укладка в квазиэапкнутые петли ДНК размеров от 30 до 200 тысяч пар нуклеатидов, закрепленные на ядерной матриксе. Неоднократно" высказывалось предположение о вероятной соответствии хроносопных петель ДНК. функциональным доменап генома, таким как транскриптоны, репликоны, реконбинаны (термин введенный впервые Филипскин Я. и Светловой Е.В.). Однако, многочисленные попытки проверить эту гипотезу экспериментальным путем привели к противоречивым результатам. Одной из причин этого являлась отсутствие надежного метода картирования границ петель ДНК. В качестве возможных кандидатов на роль границ петель предлагались ЗНЯ/ПЯВ-элементы, инсуляторы, легкоплавкие последовательностн. На ни один из этих элементов не был найден во всех пограничных районах транскрнпционно-активмых доменов хроматина. Изучение доменной организации генома осложняется динамичность .этой организации в процессе развития и дифференцирования (зародыаевые и тканеспецифические клетки, метилирование) и в течение клеточного цикла (организация в хромосомы, в метафозе -репликации хроматина и экспрессия генов в интерфазе). В этой связи не вызывает сомнения необходимость разработки новых подходов для характеристики специфичности организации хромосомной ДНК в петли, что и явилось целью настоящей работы.

Цели и задачи работы,

Целью данной работы явилось изучение базисных принципов, по ^которым происходит укладка хронатиновой оибриллы в хромосомы в ядре эукариотической клетки, используя в качестве экспериментальной модели

искусственные хромосомы дрожжей. Нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1 . исследовать возможность использования искусственных хромосом дрожжей С V Н С), имеющих протяженные участки ДНК человека, в качестве модели для изучения Физико-химических и биохимических свойств Фрагментов ДНК человека, претендующих на роль границ петель или доменов.

2. сравнить характер организации ДНК в доменную структуру в искусственной хромосоме дрожжей, имеющей в своем составе последовательности ДНК человека, со структурой доменов в человеческих клетках на участке ДНК с уже известным нуклеотидным' составом и свойствами."Для этой цели предполагалось использовоние искусственной хромосомы дрожжей, несущей кластер |}-г лобиновых генов человека.

3. провести крупномасштабное картирование СБ-боготых участков ДНК и сравнить характер их распределения с распредлением гиперчувствительных к нуклеазам сайтов и сайтов, по которым происходит орагментирование ДНК эндогенной топоизомеразой II, в хроматине искусственных хромосом дрожжей.

Научная новизна и практическое значение работы.

В настоящей работе впервые показана возможность использования искусственных хромосом дрожжей (V А С) в качестве модели для изучения доменной организации хроматина высших эукариот.

Продемонстрирована значительная корреляция позиций гиперчувствительных к нуклеазам сайтов и Сб-богатых участков.

Сделано предположение о мозаичноп расположении в геноме рекомбинонов (термин, введенный в этой работе) и о том, что ' идиосинкратичные сайты (термин, введенный в этой работе впервые для обозначения сайтов, в которых преимущественно происходит Фрагментиро в ание хроматина нуклеазами и расцепление ДКК рестриктазами) являются предпочтительными участками рекомбинации.

Предложена оригинальная модель структуры границ доменов хроматина.

Обнаружение иди о синкратичных сайтов позволит конструировать трансгенные клетки с больней эффективностью (встраивание в геном Чужерэдных последовательностей ДНК будет проводиться по "горячим" точкам рекомбинации) .

Полученные данные являются основой для дальнейшего изучения механизмов организации ДНК в доменные структуры, а ,также представляют определенный интерес в исследованиях, связанных с изучением рекомбинации.

Япробацмя работы.

Работа была апробирована иа FE8S Lecture Course (Греция, 1995), на симпозиуме "Progress in Tumor Biology" (Польва, 1995) и на конференции "Structure and Function of DHfl: ft Physical Rpproach" (Франция, 1996).

Публикации,

По материалам диссертации опубликовано 3 научные работы.

Объеи и структура диссертации.

Диссертация изложена на "jiQ страницах машинописного текста и состоит из следующих частей: введение, обзор литературы, материалы >и методы исследований, результаты, обсуждение, выводы, заключение и список литературы. Библиография включает' 216 источников. Работа проиллюстрирована 20 рисунками и 1 таблицей.

Основное содержание работы.

Картирование гиперчувствительных к нуклеазам сайтов, топосайтов и участков неполного расцепления нативной ДНК нуклеазами и рестриктазами в искусственной хромосоме дрожжей VRC 881D2, несущей последовательность ДНК 21 хроносопьК.человека.

ч

По навей гипотезе,' гиперчувствительные к нуклеазам сайты хроматина, а также сайты, по которым происходит расщепление ДНК эндогенной топоизомерааой II, могут быть колокализованы с CG-богатыпи участками ДНК,

Для проверки этой гипотезы в серии экспериментов, которые будут описанны в этой главе использовалась искусственная хромосома дрожжей YAC 881D2 размером 1 500 т.п.н., имеющая протяженную последовательность из GC-богатого участка 21 хромосомы человека и две искусственные телоиеры "С" и "Т",

Картирование гиперчувствительных сайтов и сайтов неполного расцепления нативной ДНК с помощью нуклеазы S1 ,

Для картирования ■ гиперчувствительных к нуклеазе S1 сайтов в хроматине агарозные блоки с изолированными ядрами инкубировали в соответствующем буфере с нуклеазой St. После проведения реакции и последующей депротеиниаации Фрагментированную ДНК разделяли с помощью электрофореза в пульсирующем поле. После переноса ДНК на нейлоновый- фильтр для выявлении Фрагментов VfiC использовали радиоактивную пробу "t", которая узнает искусственную теломеру "Т" VRC. Для картирования сайтов, по которым происходит фрагментация нативной ДНК, блоки с изолированными ядрами г;газу же после приготовления депротеинизировсли, затем отмывали и также инкубировали в соответствующем буфере с нуклеазой' S1. Результаты картирования сайтов неполного расщепления нативной ДНК (дор.1-43 и гиперчувствительных сайтов хроматина • (дор.5-7) нуклеазой S1, представлены на рисунке 1. Можно видеть,, что расщепление ДНК в ядрах ведет к появлению полос, находящихся не расстоянии 50, 70 (слабая), 90, 105 (слабая), 120, Н5 (слсбая), 175, 195, 210 и 280 от теламеры "Т" (дор.5, б). При фрагментировании нативной ДНК

12 3 4

5 6 7 8 9

Рисунок 1.

YAC 881D2. Картирование гиперчувствительных к нуклеазе S1 сайтов. Радиоавтограф иммобилизованной н-а Hybond ДНК, Фракционированной методом пульс-злектрошореза. Гибридизация с пробой "t". 1-3 - расщепление натизной ДНК нуклеазой 51, А - контроль, нет Фермента, 5-6 - расщепление хроматина в ядре нуклеазой S1, 7 - контроль (5-6), нет Фермента, 8 - расщепление натавной ДНК рестриктазой' Bsh1236l, 9 -маркер, полимеры Фага Я. .

С правой стороны указаны размеры ДНК в тля. характер расцепления заметно отличается. При внимательном анализе пожно обнаружить полосы размером 50, 70, 90, 145, 160, 175,- 210, 270, 280 т.п.н.(дор.3), при этом общий фон очень сильный и полосы не такие четкие.

Картирование гиперчувствительных к ДНКозе I сайтов хроматина .

При картировании гиперчувствительных к Д*НКазе I сайтов использовали два разных буфера. Это было сделано для того чтобы посмотреть, влияет ли изменение рН на характер «рагментирования хроматина ДНКазой I .

В первом случае (рис.2) блоки с ДНК промывали 3 раза в KCI-буФере для топоизомеразы II и инкубировали с ДНКазой I, С помощь» пробы "t" были выявлены фрагменты длиной 50, 70, 90, 105 (.слабый), 120, 115, 175, 195, 210,'.250 и 280 т.п.-н.

Во второй4 случае использовался буфер, рекомендованный по каталогу для ДНКазы I. Как видно, характер Фрагментирования не изменился (рис.3).'

-350

—250

150"\

- 50

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 2.

YAC 88Ю2. Картирование гиперчувствительных к ДНКазе I сайтов. Радиоавтограф иммобилизованной на Hydond ДНК, Фракционированной методом пульс-электрофореза. Гибридизация с пробой "t". Инкубация блоков в KCl-бувере с ДНКазой I (I, 3-6), 2 - нет Фермента, контроль, 7 - маркер, полимеры шага X .

С правой стороны указаны размеры ДНК в тл.н.

Рисунок 3.

YAG 88Ю2. Картирование: гиперчузствительных- к ДНКазе i сайтов. Радиоавтограф иммобилизованной на Hyboncf ДНК. Фракционированной методом пульс-электрофореза. ¡>,:ридазация с пробой "Г.

1. маркер, полимеры «ага X, 2 - расщепление натизной ДНК р^гржтззой Bsh1236l. Инкубация блокоз е будаере для ДНКа:.;' I с ДН'<ззпй I (3-5), б -контроль, нет Фермента.

С левой стороны указаны размерь ДНК в тл.н.

1 2 3 4 5 6'

Картирование сайтов неполного расцепления хроматина эндогенной топоизоиеразой II.

При картировании сайтов фрагментировани я генома эндогенной топоизоиеразой II (рис.4, дор.4-7) с помощью ингибитора топонзомеразы I I иП-26 и их выявления при гибридизации с пробой "I" были обнаружены фрагменты длиной 50, 70, 90, 105, 120, И5, 175, 195, 210, 250, 2в0 т.п.к. Следует отметить высокий фон, вызванный присутствием ЙТФ. В отсутствии ЯТФ, иП-26 и инкубации при ЗО'С фон не обнаруживается (рис.4, дор.8). При инкубации блоков с ядрами в КС I-бувере при 30°С' в присутствии 0,2Х тритона X-100 и в отсутсвии НТР (рис.4, д-ор.7), характер Фрагнентирования аналогичен полученному при использовании ингибитора топоизоиеразы II иП-2б.

250—л . Г -

1Я ** т. Щг Ш-

* . - -

150—-

I

50—И *|0|t

1 2 3 4 5 6 7 8

Рисунок 4.

YAC 88Ш2. Картирование топосайтов с помощью ингибитора топоизомерззы II VM-26.

Радиоавтограф иммобилизованной на Hybond ДНК, фракционированной метопом пульс-электроФореза. Гибридизация с пробой "t". 1 - расщепление нэтивной ДНК рестриктазой Bshl236 I, 2 - маркер, полимеры тага X. Инкубация в КС1-буо>ере в присутствии АТа> (З-б), 3,5 - с VM-26, 4,6 - контроль, нет VM-26. только 7 - 0,2% тритона Х-ЮО, 8 -контроль блоков, нет ATffl, инкубация только на льду. С левой стороны указаны размеры ДНК в т.п.н.

Картирование CG-богатых участков ДНК и сравнение характера их распределения с распределением гиперчувствительных сайтов.

Фрагментирование ДНК рестриктазой Bsh!236l (узнает тетрануклеотид CGCG) происходит преимущественно в участках с высоким содержанием GC (рис.1, дор?6., рис.3, дор.2, рис.4, дор.1). Полосы имеют размеры 50, 60,4 105, И5, 175, 195-205, 210, 250 т.п.н. При сравнении характера распределения полос, полученных при картировании GC-богатых участков в результате неполного расщепления рестриктазой ВзН1 236 I и гиперчувствительнух к ДНКазе I сайтов на участке между 50 и 250 т.п.н. можно видеть, что среди десяти полос, которые соответствуют гиперчувствительным сайтам (50, 70, 90, 105, 120, 145, 175, 195, 210, 250 т.п.н.) семь колоколизованы (за исключением 70, 90, 120 т.п.н.) с CGCG сайтами. Среди CGCG сайтов только один (60 т.п.н.) не колоколизован с гиперчувствительными сайтами.

При картировании GC-богатых последовательностей с помощью другой рестриктазы НЬа I (узнает тетрануклеотид GCGC) были выявлены Фрагменты 50, 60, 70, 105, 120, 145, 1 60, 1 95 (слабый), 240, 250 т.п.н." В этом'случае восемь гиперчу вствительных сайтов колокализованы с GC-бсгатых последовательностями (за исключением 9J3, 175 т.п.н.). Как и в предыдущем случае среди GCGC сайтов не совпадает лишь полоса размером 60 т.п.н.

Отсюда' иожно сделать вывод о топ, что хотя наличие CGCG или GCGC тетрануклеотидов _ не является условиеп, достаточный для того чтобы ДИК стала гиперчувствительнойтеп не пенее колоколиоация гиперчувствительных сайтов и GC богатых последовательностей говорит о тон, что гиперчувствительные сайты расположена в GC-богатои "окружении".

Картирование гиперчувствительных к нуклеазам сайтов, топосайтов и участков неполного расщепления нативной ДНК рестриктазами и нуклеазани в YflC, несуцем кластер ß-глобиновых генов человека.

Для того чтобы подтвердить полученные в предыдущей главе выводы о ко локализации гиперчувствительных сайтов хроматина и CG-богатых участков и попытатся ближе приблизиться к анализу участков ДНК, расположенных в гиперчувствительных сайтах, было реаено использовать другую искусственную хромосому дрожжей, имеющую участок ДНК с известным нуклеогндным составом- и свойствами - УЙС Летерсона, несущий кластер ß-глобиновых генов человека.

Картирование гиперчувствительных сайтов хроматина и сайтов расщепления нативной ДНК нуклеазой S1.

Результаты картирования сайтов, гиперчувствительных к ДНКазе I и сайтов расщепления генома эндогенной топоизомеразой II в изолированных ядрах показаны на рис.5. На этом же рисунке представлены результаты картирования сайтов расщепления нативной ДНК искусственной хромосомы нуклеазой 51. Выявление Фрагментов УЯС происходило с помощью метода непрямого концевого печения пробой "с". Среди гиперчувствительных к ДНКазе I сайтов ß-глобинового кластера, появляющихся на ранних стадиях расщепления ДНК, наиболее интенсивными являются те, которые локализованный на расстоянии 35, 15, 75, 105 и 125 т.п.н. от теломеры "С". При инкубации даже в одном только нуклеазном буфере без Фермента заметно некоторое Фрагментирование ДНК, вызванное, вероятно, следами эндогенных нуклеаз или топоизонеразы I I . Характер фрагментиравания ДНК оказался схожим, когда нативную ДНК обрабатывали нуклеазой S1, специфичной к однонитевым участкам и неканоническим структурам. После инкубации хроматина с ДНКазойЧ отсутствует лиаь полоса 115 т.п.н. Обработка блоков с изолированными ядрами ингибитором топоизомеразы II UH-26 ведет к Фрагнентированию ДНК, характер которого был. таким же, как и для ДНКазы I. В присутствии ЯТФч расщепление проходит полнее.

я

50

100

150

200 Kb

"c*

0 DDD 00

12511510575 ■ . 45 ■ 35 '

lM Ш.щ

©

ш.

r- - 1-- , -Ы- ■ -

k-

125

105

75 45

35

В

84,84

75,75 45

1 2 3 4 5

Рисунок 5.

Искусственная хромосома дрожжей (YAC) Петерсонз, несущая кластер р-глобиновых генов человека. А. Схема YAC. Б и В. Радиоавтограф иммобилизованной на Hybond ДНК, Фракционированной методом пульс-электроФореза. Гибридизация с пробой "с". Б. Картирование гиперчувствительных сайтов- хроматина и сайтов неполного расщепления нативной ДНК нуклеазой S1. 1 - контроль, нет Фермента, 2-4 - нзтикная ДНК, инкубация блокез с ну/легзой S!, 5 - маркер, лоялмера оага ).; 6-8 -инкубация с ДНКазой 1,9- контроль, нет сормента.

В. Картирование толссайтов и СG-богатых участков. - расцепление нативной ДНК рестриктазой Bsh 12361. 2 - конгроль, пет инкуоацт при ЗО'С, 3 - контроль, нет ATffl, 4 - инкубация с ингибитором шюизомеразы II VM-26 и с АТШ, 5 - инкубация только с АТШ.

Картирование CG-богатых участков ДНК и расположение гиперчувствительных сайтов в геноме.

Картирование тетрануклеотидов CGCG, осуцгствленное с помочью рестриктазы ВзЬ123б1 показало, что сайты расположены в тех участках, в которых мы и предполагали, исходя из анализа нуклеотидного состава, проведенного с помощью компьютерной программы - это участку, расположенные на расстоянии 39-45, 73-85, 105-110 т.п.н. от телонеры "С.

Научение корреляции между нуклеотипнын составом ДНК и местонахождением гиперчувствительных сайтов показало, что все гиперчувствительные сайты расположены в пестах с высоким содержанием 6С,т.е. участки 30-50 т.п.н., 70-90 т.п.н. и 105 т.п.н. Эти участки включают в себя 9 из ti CCGC тетрануклеотидos и все 5 CGCG тетрануклеатидов. Сайты, гнперчувствнтеяьные к нуклеазап, и топосайты расположены именно в этих участках (рис. 6).

Соответствуют ли найденные в УЯС гиперчувствительные сайты известным в литературе гиперчувствительным сайтам человеческих клеток ß-глобинового кластера.

Гиперчувствительные сайты, расположенные на расстоянии 35 и 15 т.п.н.были локализованы на.протяженном участке в 20 т.п.н. Этот участок включает в себя последовательности (LCR), необходимые для регуляции экспрессии ß-глобиновых генов как в человеческих клетках, так и в клетках трансгенных животных. Сайты, локализованные на участке в 35 и 45 т.п.н., принимая во внимания используемый в данной работе уровень разрешения, соответствуют известным из литературы сайтам HS5 и HS2 (рис.6). HS5 - это сайт, находящийся на З'-конце ß-глобинового домена. Он является гиперчувствительным во всех изученных клеточных линиях и тканях человека и к о л ока лиз о в ан с tlRR-элементом . HS2 находится внутри участка контроля локуса (LCR) и является гиперчувствительным в большинстве как гематогенных, так и негематогенных клеток независимо от того, экспрессируются ли ß-глобиновые.гены. Сайты, находящиеся на расстоянии 105 и 75 т.п.н. от теломеры "С", не соответствуют никаким гиперчувствительным сайтам в клетках человека. Тем не менее сайт 105 т.п.н. колокализован с MRR-элементом и двумя filu-

Б В

Д

pEpD } 1 Г

Ь (35) (45) Р5) 005) ' (125)

Рисунок б. Функциональная и структурная характеристика клонированной в YAC Петерсона последователености ДНК, несущей кластер р-глобиновых генов человека. А'. Распределение нуклеотидного состава ДНК. В. Схема картированных CG-богатш участков: верхние стрелки - с помощью рестриктззы Hha I , нижние стрелки - BSM236! . Г. Схема расположение генов (5-глобинового кластера. Д. Позиции конститутивных гиперчувствительных сайтов эритроманых и неэритроиднах клеток человека. Ж и 3. Картированные гйлерчувствитеязние сайты. Автограоы мембран. Гибридизация.с пробой "t" (3) и "с" (Ж)", Линиями указаш соответствующее картированным сайтам участей иг схеме генов р -глобинового кластера.

О 10 20 30 40 SO 60 70 80 kb

I i I i I I ¡ i I

(39,40) (52) (57) (73---85) (107)

V lül >

(«) (74.74) (84. B4)

JfÜj-8-□ D □ nAB

e ti- V s ' p

I I

CCGG

CGCG

HS5 HS2 __

OBI HS6

богатыми последовательностями. Сайт 75 т.п.н. расположен между £ и -yG-rлобиновыми генами. Один дополнительный слабый гиперчувствительный сайт расположен на расстоянии 125 т.п.н. от телонеры "С" и колокализован с MRR-элементом и сайтами, являющимися гиперчувствительными в некоторых, но не всех тканях человека.

В литературе имеются данные, указывающие на корреляцию между высоким содержанием GC и частотой рекомбинации. Было показано, например, что GC-богатые Т-полосы хромосом являются "горячими" точками рекомбинации , что CpG-острова являются местами предпочтительного интегрирования в клетках зародешей и что у дрожжей GC-богатые участки являются "горячими" точками рекомбинации в мейозе. По всей видимости, обогащение GC-динуклеотидами в процессе эволюции это результат рекомбинации, точнее результат способа репарации неспаренных оснований, возникающих в процессе рекомбинации. Гиперчувствительные сайты часто являются источником двуцепочечных разрывов, которые, в свою очередь, явлются инициаторами рекомбинации. Поэтому совсем не удивительно, что локализация гиперчу вствительных сайтов происходит в GC;-6oraTbnc участках.

Таким образом, можно сделать заключение о топ, что к онститутивные гиперчувствительные сайты, обнаруженные з клетках человека на участке ДНК р-глобинового кластера длимой 70 т.п.н., являются также гиперчувствительныни в искусственных хромосомах дрожжей, Можно пред положить, что сайты, которые не являются конститутивными гиперчувствительныни в клетках человека, но обнаружены в искусственных .хромосомах дрожжей, могут принимать участие в рекомбинации в мейозе и в зародышевых клетках человека.

Картирование одного из гиперчувстаительных сайтов в YAC Петерсоно с высоким разрешением.

Для того чтобы более четко определить местонахоядение гиперчувствительного участка з хроматине V Я С и попытаться ответить на вопрос," какие же последовательности ДНК вовлечены в организацию гиперчувствительных сайтов, был картирован гиперчувствительный сайт в YAC Петерсона, находящийся но расстоянии приблизительно 75 т.п.н. от

я Б

1С 1S 30 2S 30 35 »•».«.

10 ts 20 25 » as «.я.«.

•12-3 f • ' 12 'З

Рисунок 7.

Картирование гиперчувствительного к ДНКазе I сайта с высоким уровнем разрешения.

А и Б. Сверху представлена схема Фрагмента ДНК р-глобинового кластера. "е" - расположение гена, BspEI-BamHI Фрагмент которого использовался при гибридизации. Стрелками снизу указаны сайты узнавания рестриктазами BspE I (19361 и 43121 т.п.н.) (А) и Hha I (18056 и 33072) (Б). Жирной стрелкой указан гиперчувствительный сайт, найденный в процессе эксперимента, который расположен на расстоянии между 29 и 30 т.п.н. от начала Фрагмента ДНК с известной нуклеотиднсй последовательностью, которая.клонирована в YAC Петерсона. Снизу представлена автографы иммобилизованной на Hybond ДНК, разделенной с помощью пульс -электрофореза в 1% агарозе. Гибридизация с пробой ". £".

А. 1 - растепление хроматина ДНКазой I , 2 -"расщепленный ДНКазой I хроматин, подвергшийся дальнейшей рестрикции Ферментом BspEI, 3 рестрикция натмвной ДНК BspEI, 4 - кативная ДНК.

Б. 1 - натданая ДНК, 2 - рестрикция нативной ДНК Hha 1,3- расщепленный ДНКазой I хроматин, подвергшийся дальнейшей рестрикции Hha I.

теломеры "С". Для этой цели была использована проба, узнающая участок ДНК, кодирующий ген "£" (рис.7). Эксперимент провели следующим образом: после инкубации блоков с изолированными ядрами с ДНКазой I v. последующей депротеи>!изации, блоки тщательно отмывали и инкубировали с рестриктазами ВзрЕ! или Hha I. В качестве контроля использовали нативнуга ДНК, которую обрабатывали этими хе рестриктазами . Результаты эксперимента представлены на рис.7. Можно видеть, что гиперчувстзительный участок находится на расстоянии между 29 и 30 т.п.н. от участка ДЯК с известной нуклеотидной последовательностью, клонированной в VflC или *е на расстоянии от 63 до 69 т.п.н. от теломеры "С" (на рисунке указаны размеры фрагментов ДНК, которые находятся в середине радиоактивного сигнала, который виден но автографе). В описанных выше экспериментах этот сайт был определен, как сайт, расположенный приблизительно на расстоянии 75 т.п.н. от теломеры "С" .

Фрагментирование нативной ДНК V R С 881D2 частощепяцими рвстриктазами.

В этой серии экспериментов блоки с яарапи сразу хе после приготовления инкубировали с протеиназой К. После усиленной отмывки от протеиназы блоки, содержащие лишенные белков молекулы ДНК, инкубировали в подходящем буфере с рестриктазами Eco RI или ПЬо I (рис.8). После проведения пульс-злектроФореза и переноса ДНК на нейлоновые мембраны, Фильтры г и брИдиоовали с пробой "t". После обработки нотивной ДНК рестриктазой Eco RI (рис.ЗЯ) ча автограое после гибридизации с пробой '"t* видны полосы размером 50, 80-90, И5, 160, 155 (слабая), 240, 250 т.п.н.(слабая) , а после обработки рестриктазой ПЬо I (рис.85) полосы размером 50, 70-80, 105, Н5, 195, 210 (слабая), 280 т.п.и.

fi

1 2 3 4 5 6

l 2 3 1 S б

Рисунок 8.

Л и Б. YAC 881D2. Радиоавтограф иммобилизованной на Hybond ДНК, ©рационированной методом пульс-электроФореза. -Гибридизация с пробой "t". Слева указаны размеры ДНК в тля.

А. Картирование сайтов неполного расщепления нативной ДНК с помощью рестриюгазы Eco RI (2-5). 1 - маркер, полимеры тага X, б - контроль, нет «»ермента.

Б. Картирование сайтов неполного расщепления нативной ДНК с помощью рестриктазы ИЬо I (2-5). 1 - маркер, полимеры ©ara X, б - контроль, нет Фермента. ... ... ...

Что такое идиосинкратичные сайты.

Демонстрация колокализации гилерчувствительных к нуклеазам сайтов и топосайтов не явились неожиданным результатом, так как в литературе имеются данные на этот счет. Неожиданным оказалось то, что некоторые из гиперчувствительных сайтов хроматина колоколизованы с сайтами неполного расцепления нативной. ДНК частицепяцини рестриктазами, сайты узнавания которых находятся приблизительно с частотой 2-3 сайта на каждую тысячу пар нуклеотидов. Неожиданным оказался сом «акт наличия таких "гип е'р чувствительных" участков в нативной ДНК, изолированной из' дрожжей. ...

Для объяснения этого Эффекта можно предложить следующую мхадель: гиперчувствительность вызвана появлением барьеров на пути рестриктоз, свободно движущихся по молекуле ДНК. На

первой стадии реакции взаимодействия рестриктазы и ДНК происходит образование комплекса между ними (то есть "посадка" Фермента на молекулу ДНК), после чего Фермент начинает свое движение по молекуле в поисках сайта для рестрикции. Фермент может и проскочить участок узнавания, прежде чем все-таки произойдет реакция гидролиза ДНК оерпентом (то есть двуцепочечный разрыв ДНК). Если Фермент встречает препятствие на своем пути по молекуле ДНК, то он соскакивает с нее или меняет направление. Если много молекул Фермента сталкиваются с препятствием, то они образуют как бы 'пробку из молекул", как папины на дороге. Повышенная концентрация Фермента на каком-то одном участке и ведет к увеличению количества "разрезов" ДНК в месте возникновения "пробки". Интенсивность сигнала зависит от частоты разрезов. Эта частота в свою очередь, зависит от количества сайтов узнавания рестриктазы в окрестностях барьера.

Схематическая карта участка длиной 300 т.п.н. 88102 (рис. 9) показывает серию гиперчувствительных к нуклеазам и рестриктазап сайтов в хроматине и в нативной ДНК. По всей видимрст.и, рермент.ы, .которые были использованы при картировании, узнают различные черты первичной и вторичной структуры ДНК. Эти сайты, возможно, представляют из себя регулярно расположенные элементы ДНК, обладающие какими-то специФиическини Физическими и биохимически ми свойствами. Самые "странные" или "идиосинкратичные" среди них - это те, которые являются гиперчувствительными в большинстве тecтoвJ, описанных в этой работе, включая классическую гиперчувствительность к нуклеазам и неклассическую к частощепящим рестриктазам (например, 50, 70, 105, 115, 195, 210 т.п.н.). Нужно заметить, что используемая в этой работе степень разрешения электро«ореза в пульсирующем поле не позволяет с высокой точностью картировать гиперчувств;1тельные сайты, поэтому говоря, что сайты колокализованы, мы должны понимать, что имеется в виду их нахождение в окрестностях друг друга, то есть приблизительно на участке несколько тысяч пар нуклеотидов. По всей видимости, идиосинкратические участки включают в себя единичные

А_ В

топонэопераэо 1I

• л •• л л т т_л л »

ДНКаэа 1 в • • п • & в • • •

нативная ДНК нуклеоэо S1 • • • • • • • • •

В»К12361 оа • • © О •

Hhc 1 в • • • т т т п О в

ПЬо 1 л л a • • <г> •

Eco RI в о а п в О •

л

ну&леаэа S1 после экстракции ядер 2Л в в HoCI • • •

«- 50 100 I I 150 I 200 I 250 I -*—

Рисунок 9.

YAC 881D2. Схема расположения гиперчувствительных сайтов и сайтов неполного расщепления нативной ДНК рестриктазами на участке ДНК, расположенном-на расстоянии от 0 до 300 т.п.н. от искусственной теломеры "Т". Схема расположения гилерчувствительных к нуклеазе SI (1), ДНКазе I (3) сайтов хроматина и сайтов расщепления генома эндогенной толоизомеразой П (2), а также сайтов неполного расщепления нативной ДНК нуклеазой S1 (4) и рестриктазами Bsh1236l (5), Hha I (6), Mbo I (7) и EcoRl (8) и участков гиперчувствительности к нуклеазе S1 после экстракции ядер раствором 2Ii NaCl.

препятствия, или барьеры, на пути плавно скользящего движения Фернентов по иоле куле ДНК или представляют из •себя участки-"занозы", в которых плавное скольжение «ерментов по ДНК замедляется - это могут быть, например, шпильки, образованные из легкоплавких последовательностей

или квадруплексы (рис.ЮН), а также белки, резистентные к протеиназе К. Вследствие образования таких структур, гчстоны не могут взаимодействовать с такими участками, поэтому они и являются, гиперчувствительныни. Барьеры могут представлять из себя участки ДНК, которые вызывают остановку или являются барьерами при прохождении ДНК через белковые репликационные или транскрипционные "фабрики". Барьеры могут быть образованы в ядре в виде ДНК, связанной с ядерным матриксом. Наконец, эти участки могут быть границами структурных и Функциональных доменов хромосом (рисунок 10Б) .

Рисунок 10.

Модель организации петель ДНК в хромосоме.

А. Модель сайга прикрепления петли ■ хроматина к матриксу или гипотетического баоьера, который возникает на пути движения рестриктазы по ДНК.

Б. Модель Фрагмента хромосомы, организованной в петельные структуры. 33 - осжцегочечные участки, 6 - гуанин, 46 - квадруплекса.

55

>

Анализ нуклеотидной последовательности гиперчувствительного участка |}-г лобинового кластер на возможность наличия необычной вторичной структуры.

Для анализа ну к. леотидного состава ДНК на возможность наличия петельных структур ны использовали нуклеотидную последовательность ДНК из "Генбанка" гиперчувствительного участка р-глобинового кластера, местонахождение которого было указано при низком разреаении в районе 75 т.п.н., а при более высоком разреаении местонахождение этого гиперчувствительного сайта было определено между 68 и 69 т.п.н. в искусственной хромосоме Петерсона (или же внутри района от 29 до 30 т.п.н. с известной нуклеотидной последовательностью) .

пшпг пшш

Рисунок 11.

Модель структуры с однонитевыми петлями, предложенная на основе анализа нуклеотидной последовательности ДНК гиперчувствительного участка р-глобинового кластера. ....

Ствол образсван преимущественно из Си 6 нуклеотадов, а петля из А и Т. Жирной линией выделен участок петли от 29631 до 29657 нуклетадов.

Этот участок включает в себя часть так называемой И, ЯТ-богатой последовательности, которая заканчивается приблизительно в районе 29650 нуклеотидов. На этон участке длиной 1000 пар нуклеотидов пы нашли две . СС-богатые последовательности длиной 9 пар нулеотидов, которые разделены ЯТ-богатым участком в 156 пар нуклеотидов. Эта последовательность ДНК может образовывать структуру, которая представлена на рисунке 11. Ствол этой петельной структуры образован из антипараллельного повтора, состоящего из 18 нуклеотидов, находящихся на участке 2961529624 и 29781-29790. Он состоит из 13 (из 18) С или Э нуклеотидов. Часть однонитевой петли включает в себя легкоплавкий участок из 27 нуклеотидов (29631-29657), 24 из которых являются Я или Т.

Указанная последовательность ДНК может Формировать, возможно, и другую структуру, с образованием квадруплексов, модель которой была предложена.

Выводы.

1... Продемонстрировано, что - гиперчув стеительные к топо изомеразе II и нуклеазам области хроматина искусственных хромосом дрожжей совпадают с блоками ОС-богатых последовательностей, которые достаточно регулярно распределены вдоль молекулы ДНК и, возможно, являются детерминантами, направляющими Формирование гиперчувствительных областей.

2. Показано, что конститутивные гиперчувствительные сайты, обнаруженные в- клетках человека на участке ДНК (5-глобинового кластера длиной 70 т.п.н., являются также гиперчувствительными в искусственных хромосомах дрожжей. Выдвинуто предположение о топ, что сайты, которые не являются конститутивно гиперчувствительными в клетках человека, но обнаружены в искусственных хромосомах дрожжей, могут 'принимать,- участие в рекомбинации в мейозе и в зародышевых клетках человека.

3. Показано, что некоторые из гиперчувствительных сайтов хроматина являются также участками предпочтительного

расщепления частоцепящини рестриитазани в условиях

ндиосинкратичныпи и предложили модель, объясняющую этот Феномен.

Список публикаций.

!. Filipski J.j Suetiowa E., flvriI-Fournout H., Deschauane

t

P., Bel I is tt. Neo approaches of the mapping of chronosone domains. // Abstracts from I (it .. Syep Progress in Tumour Biology", 1995, p.92.

2. Suet I ova E., Filipski J. Formation of complexes between heterologous chromosomes in yeast. // flb3trtacts from the Conference "Structure and Function of DHR: R Physical Approach", 1996, p.41.

3. Filipski J., Suet Ioua E., Bur i I-Fournout H., Deschauane P., Bel lis П. Нею approaches to the napping of chromosome donains.// Acta Вiochem.Po I ., 1996, u.43, Ho 2, pp.289-292.

4. Светлова Е.Ю., Разин С.В., Филипский Я. Картирование гиперчувствительных к нуклеазе S1 сайтов в искусственной хромосоме дрожжей,' несущей кластер - [$- г лсбиновмх .генов' человека. // ДАН (в печати, 1996-97).

5. Светлова Е.Ю., Разин С.В., Филипский Я. Картирование гиперчувствительных к нуклеазе 51 сайтов III хромосомы дрожжей. //ДАН Св печати, 1996-97).

неполного гидролиза

Мы назвали такие'- сайты