Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линкерные гистоны и HMG белки на транскрипционно активном глобиновом гене эритроцитов цыплят

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Линкерные гистоны и HMG белки на транскрипционно активном глобиновом гене эритроцитов цыплят"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имена Е.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

ПОСТНИКОВ Юрий Владимирович

УДК 577.214.6

ЛИНКЕРНЫЕ ГИСТОНЫ И НАЮ БЕЛКИ НА ТРАНСХРИПЦИОННО АКТИВНОМ ГЛОБИНОВОМ ГЕНЕ ЭРИТРОЦИТОВ ЦЫПЛЯТ

13.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологи-к-ских наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии ¡¡¡лени В.Л.Эигсдьгярц АН СССР

Научные руководители :

доктор химических наук, профессор, академик А.Д.Мирзабекол

канд. хим. наук, ст. науч. сотр.

Б.В.Шик

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АН СССР, профессор Ильин Ю.В.

д.б.;:. Лучичк А.Н.

Ведущая организация;

Межфакультстркая ПНИЛ молекулярной биологии и биооргашпеской химии им ни А.Н. Белозерского.

Защите диссертации состоится ........г. в Ш. часов на заседай

специализированного совета В 002 79 01 при Институте молекулярной биологии иы< ни ВА.Эигелигардта АН СССР но адресу 117984 г. Москва, В-334, ул. Вавилог 32.

С диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной бш логии имени В.А.Энгальгардта АН СССР.

Автореферат разослан .................1991 г.

Ученый сек ¡.старь специализированного Совета кандидат яииическях няук -

Л. Л/. Крицып

Актуальность проблемы. Структура транскрипционно-активного хроматина остается весьма неясной в деталях. Одним из основных вопросов является определение состава хромосомных белков при транскрипции, таи как диссоциация одг.их и связывание других белков могут приводить к транскоьформации хроматина, способного транскрибироваться РНК-полимеразоЯ. 0ба1епрмзнано, что ключевыми белками и таких трансконформациях могут бмть линкерные гистоны, обеспечивающие укладку наднуклеосомннх структур хроматина, а также негистоновые 6сл:си высокоподвижной группы (так называемые НМС балки). Для зондирования отличий активного и неактивного хроматина использовались различные подходы: гидролиз нуклеаэами, Фракционирование хроматина седиментацией, электрофорезом, имиу^опроципитациэй и др. Однако предложенные метода не обеспечивают сколько-нибудь чистых препаратов активного ;:роматкна, а также вносят ряд артефактов, самым серьезным из которых является перераспределение хромосомных белков по ДНК. Вследствие этого наблюдаются значительные расхождения как в результатах экспериментов, так й в интерпретации данных.

Цель работы. Целый настоящей работы является разработка нового методического подхода определение локальной концентрации (плотности) хромосомных белков ка специфических

последовательностях генома эукариот. Ка модели эритроцитарлого хроматина эмбрионов цыплят демонстрируется распределение, линкерных гистонов и НМЭ белков на глобино.вом, овальбумнновом и лизоцимсвом генах, взятых как примеры транскрибируемых и нетраьскрибируемых последовательностей.

Научная новизна. Разработан и применен метод количественного анализа плотности хромосомных белков на специфических однокопийнмх последовательностях ДНК. Метод заключается в комбинации ДНК-белковой сшивки внутри цельных клеток или на выделенных ядрах,

иимунолреципитации сшитых комплексов и идентификации сшитой с

помощью дот-гибридизации с одноцепочечщгни пробами. Метод бил применен для количественной оценки линкерных гистонсв ¡П /Н5 и НМС белков на транскрибируемых (глобиноеых) к по-транскрибируемых /пмл.пьбуминовых и лизоцимовсС<) послед'-шательностях эритроцита^.:того хронатина. Транскрибируемый хроматин характеризуется примерно 2-кратно сниженной плотностью Н1 и Н5 по сраснкнию с хроматином неактивных гйноо, что подтверждено методом гибридизаций с •белковыми тенями" . Далее, хроматин тр^мскрибпрус-мих гене и характеризуется в 1.5-2.6 раза повышенной платностью '.¡с.С 14/17 по сравнен!:» с неактивными генами, з то время, как ШЮ 1/2 связаны этими генами равнонеркэ. Ь' регуляторный учаотсх. £ г.чэбиисиого гена был обеднен всеми иссл> дованиыни бе.- 'сами, что Iюдра:;умос.зет резкое прерывание нуклеосомного континуума.

Обт-о.ч работы. Диссертация состоит из введения, обоо;:^ гитератур!^, описания методов исследования, изложения и обсуждения пепучепных результатов, выводов и списка цитируемой >ытора гуры (124 наименований). Работа изложат^ на 94 страницах машинописного текста и содэржит 15 рисункоа и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика метода сравнения локальных концентраций индивидуальных белков на одиокопийимх последовательностях ДНК.. Ремиаганм условием корректного определения плотности хромосомных белков на специфической последовательности является предупреждение перераспределения зтих белков перед их Фракционированием. ДНК-белковая сширка нулевой длины (УФ и формальдегид/ДКС) внутри цельных клеток предохраняет белки от реаранжировки, фиксирует нативные ДНК-белковые взаимодействия и позволяет использовать детергенты, сводя к минимуму аггрегаци» комплексов. Сшивка УФ -простой «©трудоемкий метод, основным ограничением которого является низкий выход аддуктов (увеличение дозы облучения ведет к повреждению ДНК и ухудшении ее гибридизационых свойств) , а также температурная лабильность сшивки.

С целью преодоления недостатков УФ и подтверждения результатов независимым методом, мы приманили принципиально другой метод скивки. Он дает высокоспецифические ДНК-белковые сшивки после частичной апуринизации ДНК к фиксации альдиминовых связей между апуринизированным участком ДНК и полипептидными амино- или имидаэольной группами, в зависимости от реагента для восстановления - боргидрида натрия (НаБН^) и борзн-пиридин комплекса (С5Н5Н-ВН}) (1до1па ег а1., 1981; Гуклн с соапт., 1928; м1ггаЬекоу е! а1., 1989). Обратимая и полная фиксация клеток формальдегидом (Ласквоп, 19.78; 5о1отоп ег а1. , 1988) позволяет обойти предварительное приготовление ядер и предотврааает реаранжировку при апуринизации.

Работа была выполнена на эритроцитах 14-дневных куриных эмбрионов - классической модели сравнения транскрипционно-активного (глобиновый) и неактивного хроматина (овальбуминовый и лизоцимовый ген). Четыре порции клеток были сшиты четырьмя разными

методами (см. подпись к Рис. 3) , лизироианы и очищен» от несшитых белков ульрацентрифугированием и градиенте плотности хлористого цезия {ШггаЬекоУ а1., 1990). Далее аддукты фракционировали либо иммуиопреципитацией со специфическими антителами, либо двумерным электрофорезом, причем в втором случае проводилось дополнительное фенольноо удаление свободной ДНК.

Основными требованиями к иммуноаффинной >:ро) штографпи сшитых ДЧК-белковых комплексов пиляются моноспецифнч.чость антиген, предупреждение аггрегации сшитого материала и избавление от саободнсГ. от белков ДНК, присутствующей о большом избытке над сшитыми комплексами.

Чтобы убедиться в специфичном функционировании антител и

^ 125

условия* иммунопрецнпитации, меченные по Ь^дку ДНК- 1-0'глкО£;ие аддукты фракционировали в аналитическом эксперименте. Учитывая способность препаратов антител к кросс-реакция, г<ров<?денс титрование печенных йодом комплексов и выявлено то мииипал^ноо соотношение антител к материалу, при котором выход специфических комплексов приближается к максимальному, а ко-фракциянирив1лШШ неспецифических комплексов остается незначительный. Наличие специфических белков в аффинно-выделанных продуктах и весьма незначительная примесь свободной ДНК продемонстрирована двумя вариантами электрофореза (Рис. 1). Наличие одиночных диагоналей сшитой ДНК на автографе двухмерного элактрофоре-за является также дополнительным доказательством специфического связывания комплексов антителами при имиуиопреципитации.

В качестве альтернативного метода разделения ацдукто» непользовален двумерный электрофорез, поэволягсциП визуализировать ДШ"., сшитую с коровами и линкерными гиетонаии. Последующая блот-гибридизация с одноцепочечиыми зондами детектирует одяакопиИнис послоловатсльноости и, таким образом, дает ин?орМию

нмс 1/г.к

Б

НМС 14/17—ОМА 1ШО 1/2,Е-0)ЧЛ

II

Рис. 1, Характеристика иммуноа<$>финно выделенных сшитых

комплексов по белку (Л) и по ДНК (В) . Л - Сшитые

формальдегидом/ЯМС комплексы ДНК-белок метали 1г51 и

иммуиопреципитировали с антителами к Н1№ 14/17 (1),

НМО 1/2,Е (2), Н1 (3) и Н5 (4) , ДНК из комплексов

гидролизовали, а белковая часть анализировалась

электрофорезом по Лэмнли, В -. Характеристика чистоты

иммунспреципитированкого продукта по ДНК (примеры).

Материал, сшитый формальдегидом/ ДМС/ МаВН4,

имиунопреципитировали с использованием антител к ННО 14/17 и

3 2

НМО 1/2,Е, метили ДНК по 5' концу Р, и разделяли свободную ДНК (СД) и ДНК-белковые (ДВ) сшитые аддукты двумерным электрофорезом. 1ов направление - ПААГ/ ДДС-На/ мочевина; 2 направление - то жо самое после депротеинизации аддуктов в геле. I - после первого раунда иммунопреципитации; II -после второго.

о структуре хроматина на уникальных последовательностях. Воспроизводимость никеприоедсннмх данных говорит об эффективности этих методов.

Распределение гистонов на активно-трннскриЬирурчо»-! и неактивных генах,

На Рис. 2 прредставлены данные по гибридизации с "белковыми тенями" (Кагроу et а1., 1984), которые указывают на обеднение: (Н1+Н5)-ДНК диагонали /? глобиновыми и особенно промотор;¡ими /3 глобиновыни последовательностями по сравнению с оаальбуминовыми, причем диагональ свободной ДНК служит внутренним контролем. Электрофорез был выполнен но материале, сшиъын по методу формальдегид/ДМС - "0аВ114 и С5Н511-В!!^ варианта". Для о боих вариантов количественная оценка сканированием выявила приблизительно одинаковые показатели обеднения линксрных гистоиов на транскрибируемом глобиковом гене по сравнению с свальбуминовым геном с тенденцией менее выраженного обеднения при "С5НЬ1«-ВН3 варианте" (0.5 и 0.65, соответственно). Линкерные гистоны на промоторном участке практически отсутствуют (0.2 по отношению к овальбумимопкм последовательностям).

диагональ коровых гистонов обеднена активными /? глобиновыми последовательностями по данным "НаВН< варианта" (0.7 относительно овальбуминовых), и практически не изменена (0.9) в "С5Н5МВН3 варианте". Сходный феномен наблюдала НасЬеуа еЬ а1. (1909) ка генах дрозофилы. Сильно ■ обеднены коровыми гистонами последовательности промотора р глобинового гена (0.35), однако клонированная проба была несколько длиннее ДНКаза I-гиперчувствительного участка на промоторном участке р глобинового гена.

При сравнительной оценке данных лот-гибридизации (дня ДНК

Ова

Гло

Про

Рис. 2■ Данные • гибридизации "белковых теней" (ДНК,

перенесенной с двумерного геля на мембрану) с глобиновсй, овальбуминовой и промоторной пробой. ДНК-белковая сшивка проводилась по <?ормальдегид/ дмс методу с разными вариантами алкилирования ("НаВН4 вариант" и "С5Н5И-ВН3 вариант"). Свободный белок удаляли центрифугированием в CsCl, а большую часть свободной ДНК - фенолом. Последующий двумерный электрофорез (см. подпись к Рис. 1) выявил диагонали, . чей угол наклона эависил от -ретардирующего эффекта сшитого белка. 1 - сзободная контрольная ДНК, 2 -. свободная ДНК, остающаяся в образце после фенольного удаления, 3 - аддукты коровых гистонов и ДНК,_ 4 - аддукты линкерних гистонов и ДНК'. Диагонали переносили с геля на найлоновый фильтр Zeta Probe и последовательно гибридизовали с овальбуминовой (ОВА), глобиновой (ГЛО) и промоторной (ПРО) проб-ми.

иммунопреципитатов) принимались во внимание ноколичесгвенное связывание ДНК с найлоновой мембраной и отсутствие строгой линейности между количеством нанесенной ДИК и гибридизационным сигналом. Поэтому стратегия количественной оценки

гибридиэационного сигнала каждого иммунопреципитиропашгаго образца заключалась в сравнении его с рядом разведений нефракцмонироаанкоя ДНК на том же фильтре, прогибридиэованным с той же пробой.

Рис. 3 показывает гибридизационнме сигналы ДНК, полученные иммунопреципитациея аддуктоа с гнти-111 и анти-Н5 антителами. Экспозиции подобраны для выравнивания интенсиьностей точек ДНК стандарта. Экспериментальные точки на одной вертикали представляют, по сути, одну и ту же ДНК не одном и то( фипьтре, последовательно прогибридизозанную с различными пробами. Важная особенность Рис. 3 - сниженные сигналы с 111 ДНК и Н5-Д11К при гибридизации с /3 глобиновой (Гло) и проиоторной р глобиповой (Про) пробами по сравнению с лизоцимовой (Л.!з) и овалъбуминооой (Ова) пробами. Этот признак сохраняется для любого метода сщиаки.

Рис. 4 суммирует количественные показания сканнирования автографов, представленных на Рис. 3. Приведенные параметры соответствуют молярным соотношениям специфических

последовательностей, выделяемых при мимунопреципитации, а при низком уровне сшивки, т.е. - < 1 молекулы белка на 1 молекулу. ДНК, и плотностям сшитых белков на единицу длины специфической ДНК. Следует подчеркнуть, что показатели не носят точного количественного характера по ряду причин. Например, шер.'.нг ДНК ультразвуком приводит к ложно-положительным гибридизециопным сигналам из-за спинки белка к ЛИК, окружающую тестируемую постедовательность. Н1 • ДНК (как и 115-ДНК) наносились на найлоновый фильтр и дупликате, и соотношении для дублирующих точек отличались не Солее, чем на 0.15 г. каждом случае.

К

Сшивка УФ Сшивка форм/ДМС Контрольная ДНК Н1■ДНК Н1•ДНК Контрольная ДНК __._а б_в г_

»Зёй® » |• в| ОВА ЛИЗ то ПРО 9 в | • О © ®

® * • !* ®) 1» »] | • © с О

Ф О О е » Г " { I • -1 1 • 9

& €> & 5. V ' } ')

Сшивка УФ Сшивка форм/ДМС Контрольная ДНК Н5-ДНК Н5-ДНК Контрольная ДНК _а б_п г__

© © О в * ф в| ОВА ЛИЗ ГЛО ПРО о о ( • » о О

!ооэв . •{ [*> «( | • »

• I 1 ® '] | в * | | . * «в 0 О

© Д.-» «• * I 1« • | *| || о О-

Рио. Данные дот гибридизации иммунопреципитированных

комплексов Н1-ДНК и Н5■ДНК. Комплексы Н1ДНК и Н5ДНК, сшитые ультрафиолетом в клетках (У4>, а), или на ядрах (УФ, б), или формальдегидом/ ДМС (форм/ДНС/в - восстановительное алкилировани^ - бс_>гидридэм натрия, Форм/ДМС/г восстановительное алкилировакие пиридин-бораном),

иммунопреципитировали, элюировали, делротеинизировали, наносили на фильтр и гибридиэовали с овальбуминовой (ОВА), лизоцимовой (ЛИЗ), глобиновой (ГЛО) и промоторной (ПРО) пробами. Контрольная ДНК после сшивки ультрафиолетом (УФ), либо формальдегидом/ ДМС (форм/ДМС) и

ультрацентрифугиропания депротекнизовалась и наносилась на фильтр б виде серии двукратных разведений.

Рцс. 4. Относительная локальная концентрация Н1 и Н5 на индивидуальных последовательностях эритроцитарного хроматина цыплят (по данным дот-гибридизации иммунопреципитированных комплексов). Радиоавтографы, представленные на предыдущем рисунке, сканировали. Локальная концентрация Н1 и Н5 на овальбукиноаом гене принята за единицу. Каждая группа столбиков - соотношение между гибриднзационными сигналами одного и того же иммунопреципитированного образца, сшитого либо УФ в клетках (УФ, в) , или на ядрах (УФ, б) , либо формальдегидом/ ДКС (форк/ ДНС, в - восстановительное алкилирование боргидридом натрия, форм/ ДМС, г восстановительное алкилирование пиридин-бораном),

выделенного с антнтелами к Н1 и Н5, и последовательно прогибридизованг.ого с овальбунмновой (ОВА) , лизоцимовой (ЛИЗ), глсбиновой (ГЛО) и промоторной . (ПРО) пробами. Обозначения столбиков: черный - ОВА, крапчатый - ГЛО, прозрачный - ПРО, сетчатый - ЛИЗ. Калибровочная кривая по данным сканирования контрольной ДНК позволяла срапнивать сигналк разньс: гибридизаций.

Тем но менее, при всех вариантах сшивки наблюдается примерно аукратное обеднение Н1 и Н5 на глобиновом гене (0.45-0.65 и .6-0.7) и на его промоторе (0.4-0.55 и 0.4-0.5, соответственно) мыто, что сходное обеднение наблюдается в материале, сшитом по этоду ¡юрмальдегид/ДМС /МаВН4 и /С5Н5Н-ВИ3 . Воспроизводимость шных гибридизации для облученных У<> ядер и клеток предполагает гсутствие миграции Н1 я Н5 межлу участками активного и зактипиого хроматина во время низкосолезого выделения ядер, шнакоеые гнбридизациониью сигналы при использовании чвух гтроб ¡активных генов демонстрируют отсутствие значительной зависимости юаня сшивки от конкретной последовательности ДНК.

Соотношение "промотор р глобина/овальбуиин" варьирует между 4-0.55 для Н1 и Н5, хотя залеломо превышает ассоциаций этих ■стонов с промотором по слодухкуж причинам. Длина промотора (200 о.) короче длины пробы (250 п.о.), а средние размеры ¡рингованной сшитой ДНЯ а нашем случае около 400 п.о. Таким ¡разом в гибридизационнмй сигнал дают вклад последовательности, ;ружа:ощие прсмотор, ко-фракцйонируюаиеся при иммунопреципитации ¡раз сшитый белок. Для более длинных проб этот эффект не [азывает значительного влияния на количественны:"! показатель, шные по иммуиоп; еципитатам Н1-ДНК и Н5 ДНК дают основание -перждать, что обеднения на транскрибируемой последовательности юается обоих линкерных гистонов.

Таким образом, все методы Фракционирования и огицки выявили, •о Н1-ДНК и Н5ДНК обеднены /? глобинсвыми последовательностями по тпнени» с овальбуминовьичн п соотношении 0.5-0,65 для Н1 и 65-0.7 для Н5. Данные по лизрцимовоиу гзну напоминают таковые ¡я овьльбуминового (соотношение сигиалоь 0.85-1.1). Можно было шдать большего обеднения на транскрибируемом хроматине гистонэ" , чем Н1 из-за бо.:ьмс-й способности 115 стабилизировать структуры

Еысшего порядка хроматина. Однако каши данные противоречат этому

Естественно предположить, что для обеспечения движем РНК-полимеразы требуются изменения Н1-ДНК или Н5-ДНК контакт« (Harmon et al., 1984). Принимая во внимание, что нуклеосомш повтор в эритроцитах равен 205-210 п.о., что длш транскрибируемого участка /? глобинов ого гена около 3600 п.о., допускай, что па нуклеосоиу приходится одна молекула К1 или (15, i полагаем, что наши данные указывает на диссоциацию линкерН! гистонов с 3-4 куклеосон на каждой матрице, т.е. на транзиторт локальный характер изменения состава хромосомных бэлков.

Было показано, что после нуклеазной обработки связанные яд«зр»:ым пеллегом последовательности обогащены актив! транскрибирующимися, и обеднены примерно в 2 раза линкерньп гистонами (Rose and Garrard, 19С4; Stratlxng et al., 1986; Mironc et al., 1986). Распределение активных последовательностей различные фракции указывал на мозаичную природу и обратимь характер активированного хроматина (Ridsdale and Davie, 198?) Хроматиновая матрица транскрипциоино активных генов коле Бальбианн при электронной микроскопии выглядит как весы-динамическое образование, состоящее из 5, 10 и 30 нм фибрил/ аранжированных между растущими РКП-частицами (Bjorkrotii et al. 1968) . В таком случае плотность линкерных гистонов у транскрибируемом хроматине должна Сыть снижена пролорциональь интенсивности транскрипции, что и наблюдается при сопоставленк наших данных и данных Nachsva et al. (1989), так» продемонстрирована в прямом эксперименте Dedon_et al. (1991).

Используя опосредованную ДМС ДНК-белковую сшивку и гибридизащ-с "белковыми тенями", ряд работ показал заметное обеднение Hl-flt контактов на транскрибируемом hsp 70 гене дрозофилы (Karpov с al. , 1984; Nacheva et al., 19И9). Противоречия между этими

Панчи данными связано о пспопьзсоачием ли ух методов 'сстзновлапич Шиффо^а основания. Hacheva et al. {19691 Не !маруж::л<1 разлк'-н-Г: в Н1-содерасадих г.сслэдспательностях активного неактивного лромати!'.а при использовании цианборгидрида натрия JaBHjCH) при валике, что предполагает, что С-коничвьга лизины зомчнируюи'ло при этом варианте c:iman:i) остаются связанными с ДНК зи транскрипции, а ки обнаружил:: 1.5-7 кратноэ снижение плотности анкерных г:1стоноб ггри обоих вариантах (и NaBI!4, и CSH N-BH3, íTOpHñ по специфичности cu. шаюшясся с ДНК амчнокислот идентичен jBHjCN. Неке гоуые э: ; с п e р !tt í н та я ы а г? детали могут играть роль. >-пер"зы::, аминокислотная последовательность куримых HI и особенно 5 (Coles et al., 1907) значительно отличается от дрозофилиногс I, и таким стразом »;ы но моием исключить возможность сишэк;? побулярных доменов лнккорних гистонов кур при использовании зрм.чльдег ид/ДМС/CjHj N • ВН3 метода. Зо-вторыу, транскрипция лосинового гена в эритроцитах отличавшей от таковой гена hsp5 70 индуцированной культуре дрозофилы. Возможно играет роль ¿который избыток линкерьыч 1-истонов в эритроцитах. Во всякой лучае обеднение линкерных ' гистонов на последовательностях лобинопого генп в эритроцитах цыплят после- ДНК-белчочсй сшивки и ммунспреципитсции наблюдали и Kamakaka and Thoraas (1990)-. аиетим, чю наши данные по коровым гистон&м на транскрибируемом роматиие эритроцитов в некотором смысле подтверждают данные acheva et al. (1989), хотя различающаяся на порядок интенсивность ранскрипции может быть ответственной за отличия в количественных охазат^лях.

Дополнительная информация, следуюаая из полученных результатов отсутствие клас"ерирования HI и Н5 в хроматине индивидуальных сноп, что согласуется с чередованием HT и Н5 и олигонукдеосомаз;, писанным ранее (Torres-lïartinez and P^iiz-Oar i lie, 1-J02; I.enr.arci

and Thomas, 1985). Повышенное соотношение Hl/Hl° в.мононуклеосома активного альбуминового гена печени крысы {Roche et al., 1985 может объясняться. преимущественным высвобождением Iii" над Н1 пр нуклеазном гидролизе (Thomas et al., 1935)

Распределение HMG белков на актионо-транскрибируемэн и неактивны генах.

Соотношение сигналов длй H11G 1/2, Е-ДНК можно проследить на Гис. и 6. Сходная картина для овгльбуминового, лизоцимового i ß глобиновего генов предполагает равномерное распределени* IIMG 1/2, Е по последовательностям активно транскрибируемого i неактивного хроматина. И только промоторная ß глобиновая проб; гибридизустся слабее с ИКС- 1/2, Е-ДНК. Результаты вновь идентичш для всех вариантов сшивки. Количественная оценка сигналов < HMG 1/2,Е-ДНК подтверждает визуальное впечатление о равномерно» распределении KMG 1/2,Е. При сшивке УФ HMG 1/2,Е-ДНК слабс обогащены глобиновыми последовательностями (1.15-1.25), одпакс такое слабое обогащение не воспроизвелось при химическом варианте сшивки. Следует подчеркнуть, что при данном подходе регистрируют« лишь контактирующие с ДНК белки. Степень обеднения HMG 1/2,Е hî промоторе глобинового гена приблизительно такая же, как и линхерных гистонов.

Умеренное обогащение HMG 1"/17-ДНК ß глобиновыми, но не промоторными ß глобиновыми последовательностями , относительно овальбуминовых и лизоциновых последовательностей проиллюстрировано на Рис. 5 и б. Гибридизация с промсторной ß глобиновой пробой дает приблизительно тот же сигнал, что и с пробами неактивных генов.

Факт обогащения HMG 14/17Д'!К s 1.5-2.4 раза кодирующего участка ß глобиновых последовательностей .по сравнению с кодирующими участками овальбукинояого и лизоцимового геноо

Сшивка УФ Контрольна:! ДНК

0 599 J

1а о &

о »

О0о е

Сшивка форм/ДМС HKG 1/2,Е-ДИК Контрольная ДНК

а б ____________в г______________________

ЕЗ

I ПГо]

* о]

< -а |

ОВД

лкз гло

ПРО

I^JÜi fbi

о ^ j

LL

]

ъ О

El

Eju

Сигшка vr Сшивка форг./ДМС Контрольная ДНК НИЗ 14/17 ДНК Контрольная ДНК __6____в_г__

еао® в j ! овл ЛИЗ ГЛО пго Т^З 1, » о • - .■>

ОО О О • ®| «►[ ! * es ©о j

}->©©« • 1 |v>.0| UTr« t. II ■ 11 « а О 9 I

¡ОФ© * j {«j.oj <a V; о -'5 ф* .....I Li .'■ • ■■■ ———-—

Зис. 5. Данные дет-гибридизации инмунопреципитироаакных {омплекссв KMG 1/2,Е-ДНК и IIMG 14/17-ДНК. Комплексы IMG 1/2,Е-ДНК' и HMG 14/17-ДНК, сюитие ультрафиолетом ь снетках (УФ, а) , или на ядрах (УФ, б) , или формальдегидом/ 1МС (форм/ДМС/в - восстановительное злкилировамие Зоргидридом натрия, форм/ДНС/г - восстановительное эдкилированме пиридин-бораном), иммунопреципитировали, злюировали, депротеинизировали, наносили на фильтр и гибридизовали с овальбуминовой (ODA), лиэоцимсвоЯ (ЛИЗ), глобиновой (ГЛО) и промоторней (ПРО) пробами. Контрольная ГШК наносилась с. виде се£>ии двукратных разведений.

Iii

Рис. Относительная локальная концентрация HMG 1/2, Е и

1IMG 14/17 на индивидуальных последовательностях

эритроцитарного хроматина цыплят (по данным дот-гибридизации иммунопрецплитированнах комплексов). Радиоавтографы,

представленные па предыдущем рисунке, сканировали., Локальная концентрация HMG 1/2,Е и HKG 14/17 на овальбуминовом гене принята за единицу. Каждая группа столбиков - соотношение между гибридизацизнными сигналами одного и того ' же иммунопреципитнрованного образца, сшитого либо УФ в клетках (УФ, а), или на ядрах (УФ, б) , либо формальдегидом/ ДМС (форм/ДМС, в - восстановительное алкилировапия боргидридом натрия, форм/ДМС, г - восстановительное алкилирование пиридин-бораном), выделенного с антителами к HMG 1/2,Е и HHG 14/17, и последовательно прогкбридизованного с ОВВЛЬбуИИНОВОЙ (ОЗА) ,' лнзоц-1нсвои (ЛИЗ), глобиновой (ГЛО) и промоторной (ПРО) пробами. Обозначения столбиков: черный -ОВА, крапчатый - ГЛО, прозрачный - ПРО, сетчатый - ЛИЗ.

находится в яином диссонансе с данными Dorbic and Wiitig (,1006; 1907) по многократному обогащению транскрипциончо активных последовательностей, но согласуется с их утверждением о локализации плотного кластера HMG 14/17 впраяо от старта транскрипции (сравните данные HMS 1-1/17 -ДИК для р i лобииааой и промоторной í¡ глобпновоЯ проб на Рис. 5) . ПромоторньиЧ в глобиновый участок обладает такой :;¿e плотностью ¡IMC3 14/17- как и неактивные последовательности, даже видимо и меньшей, так как рядом расположенный # {i глсбиног,::;. ген обладает повышенной лока/ъной концентрацией .4MG 14/17 (даящой ложно-положительный сигнал). Сшивка УФ на ядрах дает болей высокую степень обогащения, чем на клетках, что говорит о возможности некоторого перераспределения НМС во время приготовления «дер.

Белки ядер эритроцитов кур содержат с,голо 1% W1G 14/17. В среднем каждая десятая пуклсосома несет две молекулы этого белка (Sandeen et al., 1980). Двухкратное увеличение HMG 14/17 на активном хроматине, которое мы обнаружили, означает, что каждая пя-ая нуклеосоиа становится с ним связанной. Связывание HMG 14/17 не влияет ни на реаранжи.ровку контактов гистонов и нуклеосомной ДНК (Chick et al., 1985), ьи на общую конфигурацию нуклеосомы (Patón et al., 1983).

Используя преревар МНазой я низкой ионной силе и лммукопреципитацию хроматина печени крыс, Druckmann et al. (1986)' ке нашел различий между активными и • неактивными последовательностями п HMG 14/17-содержащем хроматина

неиндуцированных ядер. Однако а таком же хроматине индуцированных ядер было обогаиенио как активно транскрибируиимися последовательностями, таи к 5' последовательностями неактммпо транскрибирующихся генов относительно повторявшие*

последовательностей. К сожалению, возможность ограниченного (около

5?;) , но акцеьтиропаниого перераспределения HMG 14/17 в 20 мм соли (см. например Swerdlow and Varshavsky, 1983), некоторая каодназначность и оценке гибридизэциоиного сигнала и недосгатки данной версии иммуьопрецилитацчл (невозможность дискриминации кластера HMG 14/17-несущих олигонуклеосеч от диспергированных HMG 14/17-несужих олмгонуклеосом) могли привести к сомнительным результатам.

Многократное обогащение активного хроматина IÍMG 14/17 било обнаружено Dorbic and Wittig (1906; 1987) при ирпользовании иммунопреципитации лишенного HI хроматина и рестрикции in situ. Меняя набор рестриктаз, они показали кластерирование НМЗ 14/17-несуиих иуклеосом только вправо от транскрипционного старта. Однако неясно, следует ли это расценивать как доказательство подобного распредсланиг. in vivo, либо как результат перераспределения белков па сайты свяоычания с высокой а<54инос™ыо.

Поскольку HI и HMG 14/17 обладают участками гомологии аминокислотной последовательности в своих центральных участках, HMG 14/17 активно связывается с лишенным HI хроматином, и количественные изменения HMG 14/17 (обогащение) и Н1/Н5 (обеднение) в активном хроматине бнизки по величине, заманчиво предположить, что удаление Н] и посадка HMG 14/17 - сопряженные процессы. Также достойна рассмотрения гипотеза о роли HMG 14/17 в поддержании коровых гистои"в активного хроматина в гиперацетилированном состоянии (halik et al., 1984).

Не было найдено обогащения по HMG 1/2,К на транскрибируемом хроматине ни в каком варианте ДНК-белковой сшивки. Это говорит о неучастии НМП 1/2, Е в процесс активации хромати.ча, во всяком случае не через взаимодействие с ЦНК.

В последнее время опубликован ряд работ о' вкладе высокомолекулярных HMG в процесс транскрипции, хотя определенный

мганчом по нсидеп. ÜMG 1/2,Е - группа белков, содержащих так аэьлзпемыЯг Л участок с почти яепресыпной последовательностью шчс;<ислотнь:х остатков с отрицательно заряженными боковыми руппа.чи (Earnshav, 19"?). ати оелки могут облегчать удаление (¡стоноз с ДНК грп транскрипции • HHG 1/2,Е способны преодолевать вдуциронанный гнетонами или 2-ДНК транскрипционный блок rrrraatbick and Mcliey, 1936; 19Я8; Waya et al., 1980). кутрикл^точнак инъекция анги■ HUfs 1/2, Е антитез! ингибирует рапскрипцпю хромосом -тип-:, лзмгооых щеток (KleinuohniJt et al., 933) . Следует oc^'jo подчеркнуть, ч-гс возможна HMG 1/2, Е играют эль аллос .ci*.;£';eCKOi o активатора MLTF-фактор-зависимой

рйлофипцяи. причли работают □ отсутствие контакта с ДНК (Watt et I., 19Я8). Зследсгзие крайне легко возникающей реарапжчревки Ч" 1/2,2, мы ¡.о находим возможным комментировать ранние работы по ссоцигцин HKG 1/2,Е и активного хроматина. Пдинственная работа, в эторой HMG фнксиропал;: а ДНК с поиооыэ У4> налла обогащение канеспсцифичного НМЯ-Т на неактивных последовательностях ротаминовых генов по сравнению с активными последовательностями истоновых и зителлогекиковых геноа печени форели (Blanco et al., 985), и эти. результата отличаются от каких. За это могут быть гпетстсенны хорошо известные отличия свойств (например си. Wright t al., 1938) HfíG 1/2,Ь' и HMG- Т. Мы ив пгшли доказательств участия' I1G 1/2,Е в образовании транскрипционного комплекса на промоторе, глобинового гена эритроцитов куп, возможно вследствие отсутствия заимодеГгствия HMG 1/2, Е и ' ДНК в таком комплексе, или MG 1/2,Е-независимости транскрипции глобинового гена (например, следстпио отсутствия на глобинопом гена необычных структур ДНК, ызывающих блок транскрипции). Таким ofразом, нам не удалось случить доказательств участия HMG 1/2,Е а транскрипции in vivo, ак это было показано in vitro.

IV. выводы

1. Разработан метод количественного анализа распределен;-!* белке на специфических последовательностях Д;!К in vivo и ' in vitro. О состоит из ДНК-белковой сшивки внутри цельных клеток ид»: и выделенных ядрах, специфического и|.;муноаффинього выделения сшиты комплексов через белок и идентификации сшитой ДНК при помет гибридизации с одноцепочачными пробами. Метод бал применен дл количественной оценки плотности линкеркых гистоноа Н1/Н5 KMG белков на транскрибируемых, репрессированных я регулятерны последовательностях.

2. Транскрибируемый хроматин /Í глобинового гона эритроците эмбрнонэи кур характеризуется примерно 2-кратно снижение; плотностью ¡U и Н5 по сравнению с .-.еактивными овальОуминовым i лизоцимовым генами. Обеднение H1/ÍÍ3 глоСиноььа-и последовательностями подтверждено методом гибридизации i "белковмми тенями". Эти данные указыЕают на деконденсированно< состояние .активного хроматина, связанное с удалением динкерньг гистоков.

3. Транскрибируемый хроматин (3 глобинового гена эритроцитсн эмбрионов" кур характеризуется в 1.5-2.5 раза повышенной плотность» белков HKG 14/17 по сравнение с неактивными овэльбуминовыи > лизоцимовым генами. Еслци HMG 1/2 ассоциированы с активны* глобиновым и репрессированными овал^буниновым и лизоцимовом генами равномерно,

4. 5'' - .регуляторный участок /? глобинового гена .существенно обедне* всеми исследованными белками, что указывает на отсутствие нуклеосомной организации.

Основный результаты опубликоаанм в следующих работах

1. Shick V.V., Belyavsky Л.v., Postni!<ov Vu.V. end Studitsky v.M Localisation of IIMC proteins in chromatin of chicken £-gloh'in and ovalbumin прпез. Organization and Function of tl.e eukaryotic genono, 7th Соглап-Soviet Symposiura, 1987,Heidelberg

2. Shick V.V., Celyavsky A.V., Fost"ikov Vu.V,, Khrapko K.R. and P&taridzo I.0. Localization of HK3 proteins in chromatin of globin and ovalbumin genes. Abstracts Inter. Syir.p. "Physico-chemistry of DNA and moltcitlar mechanism of genome functioning", 1967, Tbilisi, p. 113.

3. Храпко К.Г., Белявский В., Постников Ю.В., Бродолин К.Л. и Инк B.D. Распределение HHG по Функционально различным участкам генома. Тезисы 3 конф. 1 мол.уч:л:.э;<с.-бнол. 1988, Ереван.

4. Постников Ю.В., Шик B.S. , Ведлпекий Л.В., Вродолин К. Л., Храпко К.Р., Никольская Т.А. и Мирзабехов А. Д. Хромосомные белки эритроцитов змбриэноп кур на транскрипционно-активных и неактивных генах. Молекулярная Биология, 1939, 23 (6), 1682-1691.

5. Po3tnikov Yu.V., Shick V.V., Brodolin K.L. and Mirzabekov A.D. Chicken embryonic erythrocyte chromosomal proteins HMG 1/2,E, HMG14/17 and histones HI and H5 on active and inactive genes. Indo-Soviet workshop on DNA-protein interactions and cross-linking, 1990, Bangalore.

6. Postnikov Yu.V., Shick V.V., Belyavsky A.V., Khrapko K.R., Brodolin K.L., Hikolskaya Т.Д. and Mirsabekov A.D. Distribution of high mobility group proteins 1/2,E and 14/17 and linker histones HI and HS on transcribed and - non-transcribed region of chicken erythrocyte chromatin. Mucl. Acids R*s., 19)1, 19(4), 717-725.

АП "Маис" Заказ tt 2737 Тираж 100 Экз