Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Линкерные гистоны и НМС белки на транскрипционно активном глобиновом гене эритроцитов цыплят

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Линкерные гистоны и НМС белки на транскрипционно активном глобиновом гене эритроцитов цыплят"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР V > Л

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯГНОЙ БИОЛОГИИ • »мен:1 В. А. ЭН ГЕЛЬ ГЛРДТ А

Не правах рукописи

ПОСТНИКОП ТОрий Владимирович

УДК 577.214.6

ЛШНСЕРНЫЕ ГИСТОНЫ И Н\Ш К ЕЛКИ НА ТРАНСКРИПЦИОННО АКТИВНОМ ГЛОБИНОВОМ ГЕНЕ ЭРИТРОЦИТОВ ЦЫПЛЯТ

13.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биолопмтхих наук

Москву- 1991

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии :;,\:епи В.Л.Энге.чый^дт АН СССР

Научные руководители :

доктор химических наук, профессор, академик А.Д.Мирзабекоп

канд. хим. паук, ст. науч. сотр.

Ь.В.Шик

Официальные оппоненты:

чл.-корр. АН СССР, профессор Ильин 10.В.

д.б.н. Лучник А.Н.

Ведущая организация:

Межфакультстркая ПНИЛ молекулярной биологии и биоорганической химии име ни А.Н. Белозерского.

Защита диссертации состоится ...../.?-.»./.2г.........1991 г. в ..!(?. часов на зассдаки

специализированного совета О 002 79 01 при Институте молекулярной биологии имс ни В.А.Экгельгардта АН СССР но адресу 117934 г. Москва, В-334, ул. Вавилов 32.

С диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной био л огни имени В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан .........!.:.;..(/.......1991 г.

Ученый сек^тарь специализированного Совета

кандидат химических наук

И. М. Кпи^ыи

| -Акт; уа льно сть проблемы. Структура транскрипционно-активного * ¡^хроматина^ остается весьма неясной в деталях. Одним из основных I вопросов I являотся определение состава хромосомных белков при тра'н&чрипции, так как диссоциация одних и спязывакие других белков могут приводить к трансконформэцки хроматина, способного транскрибироваться РНК-полимераэоЛ. Общепризнано, что ключевыми белками в таких трансконформациях могут быть линкерные гистоны, обеспечивающие укладку наднуклеосомных структур хроматина, а также негистоиопые белгеи высоксподвижной группы (так называемые НМС болки). Для зондирования отличий активного и неактивного хроматина использовались различные подходы: гидролиз нуклеаэами, Фракционирование хроматина седиментацией, электрофорезом, иммунопроципитациэй и др. Однако предложенные метода не обеспечивают сколько-нибудь чистых препаратов активного хроматина, а также вносят ряд артефактов, самым серьезным из которых является перераспределение хромосомных белков по ДНК. Вследствие этого наблюдаются значительные расхсздения как в результатах экспериментов, так й в интерпретации данных.

Цель работы. Целью настоящей работы является разработка нового методического подхода определение локальной концентрации (плотности) хромосомных белков ка специфических

последовательностях генома эукариот. На модели эритроцитарного хроматина эмбрионов цыплят демонстрируется распределение, линкерных гистонов и 1!МС белков на глобиновом, овальбуминовом и лизоцимовом генах, взятых как примеры транскрибируемых и нетраьскрибируемых последовательностей.

Научная новизна. Разработан и применен метод количественного анализа плотности хромосомных белков на специфических однокопийнмх последовательностях ДНК. Метод заключается п комбинации ДНК-белковой сшивки внутри цельных клеток или на выделенных ядрах,

иммупопреципптации сситых комплексов н идентификации сшитой с

помокмо дот-гибридизации с одноцепочечнимп пробами. Метод- бил применен для количественной оценки линкерных гистонсв Н1/Н5 и HMG белков на транскрибируемых (глобинсвих) и по-транскрибируемых (лвпльбуминовых и лизо1лИмовс^<) последуиатольностях эритроцитарного хроматина. Транскрибируемый. хроматин характеризуется примарке 2-кратно сниженной плотностью Н1 и Н5 по сраЕнению с хроматином неактивных генов, что подтверждено методом гибридизации с "белковыми тенями" . Далее, хроматин тр«.»нскриСмрусицх геиса характеризуется в 1.5-2.5.раза по&ышенноя плотностью '.¡КС: 14/17 по сравнению с неактивными генами, а то время, как 1!ЧО 3/2 связаны i-этими генами равномерно. 5' регулнторнып учаттг.х ¿ глэбинэиого генп был обеднен всеми иссл* доеаиньшм белками, чю подраиумоиаот pe3i:oe прерывание нуклегссмного континуума.

ОСтхзм работы. ДиссертацмЧ состоит из введения, обгори гитсратури, описания методов исследовании, изложения и обсужде.т.м полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (124 наименование) . Работа из io;.-.3H:s на 94 страница:: машинописного текста и содэржит 19 рисунков и 2 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Характеристика метода сравнения локальных концентраций индивидуальных белков im однокопийннх последовательностях ДНК. Решакстин условием корректного определения плотности хромосомных белисв на специфической последовательности является предупреждение перераспределения от их белков перед • их фракционированием. ДНК-белковая сшнрка нуле«ой длины (УФ и формальдегид/ДКС) внутри цельных клеток предохраняет бел!си от реаранжировки, фиксирует нативьыо ДНК-белковые взаимодействия и позволяет использовать детергенты, сводя к минимуму аггрегацию комплексов. Сшивка УФ -простой нетрудоем!'.нЛ метод, основным ограничением которого является низкия выход аддуктов (увеличение дозы облучения ведет к повреждению ДНК и ухудшению ее гибридиэационых свойств), а также температурная лабильность сшивки.

С цслыо преодоления недостатков УФ и подтверждения результатов независимым методом, мы применили принципиально другой метод сшивки. Он лает кнсокоспецифические ДНК-белковые сшивки после частичной anyринизации ДНК и фиксации альдиминовых связей между апуриниэнрованным участком ДНК и полипептидными амино- или ик:1даэольной группами, в зависимости от реагента для восстановления - боргидрида натрия (NaBH4) и боран-пиридин комплекса (C5H5N-BH3) (Levina et al., 1981; Гущин с соавт., 1988; Hirzabekov et al., 1989). Обратимая и полная фиксация клеток формальдегидом (Jackson, 1978; Solomon et al., 1988) позволяет обойти предварительное приготовление ядер и предотврацает реаранжировку при апуриниэации.

Работа была выполнена на эритроцитах 14-дневных куриных эмбрионов - классической модели сравнения транскрипционно-активного (глобиновый) и неактивного хроматина (овальбуминовый и лиэоцимовый ген). Четыре порции клеток были сшиты четырьмя разными

методами (см. подпись к Рис. 3), лизировани и очищена от несшитых белков ульрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия (М1ггаЬекоу а!., 1990). Далее аддукты фракционировали либо иммунопреципитацией со специфическими антителами, либо двумерным электрофорезом, причем в втором случае проводилось дополнительное фонольное удаление свободной ДНК.

Основными требованиями к иммуноаффинной хроматографии сшитых ."ЯК-белковых комплексов являются моноспецифииюоть антител, предупреждение аггрегацич сшитого материала и избавленио от свободней от белков ДНК, присутствующей в большом избытка над сшитыми комплексами.

Чтобы убедиться в специфичном функционировании антител и

125

условиях иммунопреципитации, меченние по белку ДНК- 1-белковце аддукты фракционировали в аналитическом эксперименте. Учитывая способность препаратов антител к кросс-реакция, проведено титрование меченных йодом комплексов и выявлено то минимальной соотношения антител к материалу, при котором выход специфических комплексов приближается к максимальному, а ко-фракциопирование неспецифических комплексов остается незначительным. Наличие специфических белков в аффинно-выделенных продуктах и весьма незначительная примесь свободной ДИК продемонстрирована двумя вариантами электрофореза (Рис. 1). Наличие одиночных диагоналей сшитой ДНК на автографе двухмерного электрофореза является также дополнительным доказательством специфического связывания комплексов антителами при иммунопрешшитации.

В качестве альтернативного метода разделения ацдуктоа использовалсп двумерный электрофорез, позволяющий визуализировать ДИК, сшитую с короиымн и )|ин;(е[шыми гистонами. Последуицая блот-гибридизация с одноцепочечными зондами детектирует однакопийнне носледовательноости и, таким образом, дает информацию

А

3 4

Б

НМС 1-I/17-DNA HMG 1/2,K-DNA

сд

и

ДВ

ДБ

ДВ

сд

Рис. 1. Характеристика иммуноаффинно выделенных сшитых комплексов по белку (А) и по ДНК (В) . Л - Сшитые формальдегидом/ДМС комплексы ДНК-белок метили 125Х и иммунопреципитировали с антителами к НМО 14/17 (1), НМС 1/2,Е (2), Н1- (3) и Н5 (4) ДНК из комплексов гндролизовали, а белковая часть анализировалась электрофорезом по Лэммли. Н - Характеристика чистоты иммунопреципитированного продукта по ДНК (примеры).

Материал ,■

сшитый

форма л ь деп 1дом /

Дмс/

NaBH,

шмунопреципитировали с использованием антител к HHG 14/17 и Ша 1/2,Е, метили ДНК по 5' концу 32Р, и разделяли свободную IHK (СД) к ДНК-белковые (ДВ) сшитые аддукты двумерным электрофорезом. 1ов направление - ПААГ/ ддс-На/ мочевина; I направление - то же самое после депротеинизацни аддуктов 5 геле. I - после перпого раунда иммунопреципитации; II -юсле второго.

1

о структуре хроматина на уникальных последовательностях. Воспроизводимость нижеприведенных данных говорит об эффектисчости этих методов.

Распределение гистонов на актипно-трннскрибипуемоч и неактит:ьгх генах.

На Рис. 2 прредставлены данные по гибридлопции с "белковыми тенями" (Кагроу е! аХ., 1984), которые указывают на обеднение (Н1+П5)'ДНК диагонали р глобиноаыми и особенно промотор; 1ымп р глобиновыми последовательностями по сравнению с оьальбуминовымп, причем диагональ сиободной ДНК служит внутренним контролем. Электрофорез бил выполнен на материале, сьитым по методу формальдегид/ДМС - " НаЬН^ и С5Н5М-ВН3 варианты". Для с.^оих вариантоз количестьенная оценка сканировании вы.чаила приблизительно одинаковые показатели обеднения линкерных гистонов на транскрибируемом глобиновом гене по сравнении с овальбуминовым геном с тенденцией менее выраженного обеднения при "С5;| Н-ВН3 варианте" (0.5 и 0.65, соответственно). Линкерные гистоны на промоторном участке практически отсутствуют (0.2 но отношению к овальбуминоаым последовательностям).

Диагональ хоровых гистонов обеднена активными р глобиновыми последовательностями по данным "ИаВН^ варианта" (0.7 относительно овальбуминовых), и практически не изменена (0.0) в "С5Н5М-иН3 варианте". Сходный феномен наблюдала ИасИеуа еЬ а1. (1909) на 1>Бр генах дрозофилы. Сильно • обеднены короиыми гистонами последовательности промотора р глобинозого гена (0.35), однако клонированная проба была несколько длиннее ДНКаза I-гипсрчувствительного участка на промоторном участке р глобинового гена.

При сравнительной оценке данных дот-гибридизации (для Д1Ж

NaBH 4 С rHfN. ПН3

Ова

Ова

Рис. 2. Данные • гибрчпмэасии "бегжотад* теней* (^tK,

перенесенной с двумерного голя ка мембрану) с г-гюбииеасЯ, овальбуминовой и промо герноп пробоя. дак-бодхосая сззсвка проводилась по «формальдегид/ X?JC методу с раэныкм аэ рхактвмм алкнлирования ("НаВН^ вариант* л "С^ П^-Г-?^ вариант"). Свободный белок удаляли и^нтрифугироваккен а CsCl, а бо-ткеро часть свободной ДНК - <$енолсм. ПосяоэдхппП д&ун&рпыЯ электрофорез (см. подпись к Ркс. 1) выяаиа дмагоилдл, <«?а угол наклона зависил от «ретаржируххасго cüancro

белка. 1 - сзободная контролькач ДНК, 2 - споСэдкая ДНК, ■ остающаяся в образце посла финального угажкмя, 3 - здшукт коровых гистонов и 4 - огдуктм ликке^ги» г«сто«5>з и

ДНК. Диагонали переносил?! с г«ля на iWUiowobsö* фильтр Sota Probe и последовательно гибрчдизопади с оаачьвумнповоа (ОВА), глобиновой (ГЛО) и пр-»юторноа (ПРО) рроГ мн,

иммунонреципитатов) принимались во вникание нцколмчесгвенное связывание ДНК с найлоновой мембраной и отсутствие строгой линейности между количеством нанесенной Д!!К и гибридизационнмм сигналом. Поэтому стратегия количественной оценки

гибридизационного сигнала каждого иммунопреципитиропаыюго образца заключалась в сравнении его с рядом разведений нефракционированной ДНК на том же фильтре, прогнбридиэованным с той же пробой.

Рис. 3 показывает гибридиоационные сигналы ДНК, полученные икмуиопреципитацией аддуктор с г,нти-Н1 и анти-1!5 антителами. Экспозиции подобраны для внравниьания интепсииностей точек ДНК стандарта. Экспериментальные точки на одной вертикали представляют, по сути, одну и ту же ДНК на одном и тем ¡ьэ фильтре, последовательно npoi ибридизс заниую с различными пробами. Важная особенность Рис. 3 - сниженные сигнала с ¡11 ДНК и Н5-ДНК при гибридизации с /J глобиновой (Гло) и промоторной /5 глобиповой (Про) пробами по сравнению с лизоцимовой (Лиз) и овальбуминопой (Ова) пробами. Этот признак сохраняется для любого магола сшизки.

Рис. 4 суммирует количественные показания сканнирования автографов, представленных на Рис. 3. Приведенные параметры соответствуют молярным соотношениям специфических

последовательностей, выделяемых при иммунопреципитации, а при низком уровне сшивки, т.е. - < 1 молекулы белка на 1 молекулу. ДНК, и плотностям сшитых белков на единицу длины специфической ДНК. Следует подчеркнуть, что показатели не ноелт точного количественного характера по- ряду причин. Например, шер;:нг ДНК ультразвуком приводит к ложно-положительным гибридм.зг.цнонным сигналам из-за сшички белка к ДНК, ежружяэдуя тестируемую посчедовательность. Н1-ДНК (как и Н5'ДНК) неносились ю найлоновый фильтр п дуплш-.ите, и соотношения дл« дублнруюи-,>1х точек отличались не более, чек па 0.15 г: каждом случаг..

Сшивка УФ Сшивка форм/ДКС Контрольная ДНК Н1ДНК Н1-ДНК Контрольная ДНК __а б_в г_

О @ % а о |» «| ОВА ллз ГЛО ПРО (* в] | • 90д

!® (5 © ® * • | • ® 1 •! 1 . все

О О О в « I } 1 • • 1 ( в 1.) о

¡У} ф <> & и « ( «] | ? || » V о © о

Сшивка УФ Контрольная ДНК Н5•ДНК а б Сшивка форм/ДКС 115-ДНК Контрольная ДНК п г

©0Ов « в| ОВА ЛИЗ ГЛО ПРО о о] • • © О О

!ооо® • •! 1© •( О 9 - »СО©

в О ® О в | 1 ° '1 I в * I | « е в С О

© О О в • • 1 | в • | [в »| || Й^ОО©

Рис. Данные дот гибридизации инмунопреципитированных

комплексов Н1-ДНК и Н5-ДНК. Комплексы Н1ДНК и Н5-ДНК, сшитые ультрафиолетом п клетках (УФ, а), или на ядрах (УФ,

б), или формальдегидом/ ДМС (форм/ДМС/и - восстановительное «

алкилировани^ - бс _)гидридом натрия, форм/ДМС/г восстановительное алкилирование пиридин-бораном),

иммунопреципитировали, элюировали, депротеинизировали, наносили на фильтр и гибридизовали с овальбуминовой (ОВА), лизоцимовоЯ (ЛИЗ), глобиновой (ГЛО) и промоторной (ПРО) пробами. Контрольная ДНК после сшивки ультрафиолетом (УФ), либо формачьлегидом/ ДМС (форм/ДМС) и

ультрацентрифугирования депротеинизовалась и наносилась на фильтр в виде серии двукратных разведений.

Pife. 4. Относительная гижальная концентрация Hi и № ш кцянгилуальыес п&сяздооатсяьносгях зритроцмтариого хроматина цжзяжг (по дан«!»« wjt-гибридизации иммуиопреципитированных коиала$сса»). Ряояоа»тогра4и, представленные на предыдущем рмсуккс, екзкирзвали, Лок^я&мдя концентрация Ш и HS на «тшьбумдеояом rt-но принята за единицу. Каждая группа стюяВежов - cocrsnoLtettite пожду гибрияизацисшшми сигиалаии одного и того же иьиунопрециттирвеамного образца, сшитого Mito УФ a клетках (УФ, о), mai на ядрах (У*, б), либо фефмальдогмдем/ и - восстановительное

вл-лн><хрот)0П,й» боргиярих&и иагрнм, форм/ДМС, г

ахямлщххтио пиридин-Серамом), вкйелеуяого с эдгителямм к (il и HS, и яоцяедои&толыю с о;5ал:1>бу>м»ис1№й (CPA), лиавиииовой (ЯйЗ), гдебиквдем» (ГДЗД и Я|*»««т>риэй , <П1Ч>) пробемн, Okiíiim*mttnti • чь^нхи - ODA, крапчатый - ГЛО,

прзар&чмм ' »PO, тт'и'у-t/,' - ГШ, Гяиибро;*)!)нйн кривая по дожь* кгагр^ль**?;» дак тзоояяял ераокнваги

си: t.Ajiu jrss>ii¿x шбомпмэяшй.

Тем не пенсе, при всех вариантах опивки наблюдается примерно двукратное обеднение Н1 и Н5 на глобшювои гене (0.45-0.65 и 0.6-0.71 и на его промоторе (0.4-0.55 и 0.4-0.5, соответственно) Важно, что сходное обеднение наблюдается s материале, сшитом по методу формальдегид/ДМС /ЛаВН4 и /C5HSH-BH3. Воспроизводимость данных гибридизации для облученных УФ ядер и клеток предполагает отсутствие миграции Н1 и !!5 ме**,у участхгии активного и неактивного хроматина во время мнзхосол^яого вмделения ядер. Одинаковые гибридизациом.чыо сигналы при использовании двух проб неактивных генов демонстрирует отсутствие значительной зависимости уровня свивки от конкретной последовательности ДНК.

Соотиояоииа "промотор глобино/сзальбумин" варьирует между 0.4-0.55 для Н1 и Н5, хотя заведено превышает ассоциаций этих гистонов с промотором по следукчзин причинам. Длина промотора (200 п.о.) хоре'ю длины пробы (250 п.о.), а средние размеры веримговамнай сидится ДИК в пактам случи» около 400 п.о. Таким гбрааои s гибридиэационкый сигнал дают вклад последовательности, зкру&аахцие промотор, ко-фрпкциомкругчкиеея при имнунопрецилитации •»враз «з»ткй белок. Для более ' длинных проб '¿тот эффект но жаяиаает значительного влияния >ш количественный показатель.

по иммуиопреципитатал Н1•ДНК и Н5-ДНК дают основание утверждать, что обеднение на транскрибируемой последовательности (асаэтся обоих линкорчиис гистоноа,

Таких образом, осо к&тодм фр^кшюниросания и ейивки выявили, по Н1 -fíliK и Н5-ДНК обеднтш (5 глобиисомми последовательностями по rfMisfWHHí» о ¡tHH/'ióyhUhOFf.mi п соот.чпиулжи 0.5-0.65 для Н1 к MÍ5-9.7 для Н'~>, /1/twr.ta г« лиэОиииовому гену нзломинот' твкиеыв 1/3« ftíi'. Л;^умИЯО!,'ОГ>| («VcmfJÍÜ'.WÍ© СИГНЯПОн 0.65-1.1). Можно было *ид»ть &ij)Ií<j>ji'j о5«дн«(1И?| на трзкс«ри5иручмем яремвтит» гистои*' 6, й! из-зя fio rt^sft оп-'/С'эбности И5 етявилизиропять структуры

Я

высшего порядка хроматина. Однако наши данные противоречат этому.

Естественно пр<здполох:ить, что для обеспечения движения РНК-полимеразы требуются изменения HI-ДНК или Н5-ДНК контактов (Harmon et al.', 1984). Принимая во внимание, что нуклеосомный повтор в эритроцитах равен 205-210 п.о., что длина транскрибируемого участка /? глобин^вого гена около 16Р0 п.о., и допуская, что на нуклеосому приходится одна молекула HI или Н5, мы полагаем, что наши данные указывают на диссоциацию линкерных гистонов с 3-4 куклеосом на каждой патрице, т.е. на транзиторныЯ локальный характер изменения состава хромосомных балков.

Было показано, что после нуклеазной обработки связанные с ядерным иеллетом последовательности обогащены активно транскрибирующимися, и обеднены примерно в 2 раза линкерными гистонами (Rose and Garrard, 19С4; Stratling et al., 1986; Mironov et al., 1986). Распределение активных последовательностей в различные фракции указывал на мозаичную природу и обратимый характер активированного хроматина (Ridsdale and Davie, 1987). Хроматиновая матрица транскрипциолно активных генов колец Бальбиани при электронной микроскопии выглядит' как весьма динамическое образование, состоящее из 5, 10 и 30 нм фибрилл, аранжированных между растущими РНП-частицами (Bjorkroth et al., 1968). В таком случае плотность линкерных гистонов на транскрибируемом хроматине должна быть снижена пропорционально интенсивности транскрипции, что и наблюдается при сопоставлении наших данных и данных Nachsva et al. (1989), также продемонстрирована в прямом эксперименте Dedon_et al. (1991).

Используя опосредованную ДМС ДНК-белковую сшивку и гибридизацию с "белковыми тенями", ряд работ показал заметное обеднение HI-ДНК контактов на транскрибируемом hsp 70 гене дрозофилы (Karpov et al. , 1984; Nacheva et al., 1989). Противоречия между этими и

нашими дакнотми связано с использованием двух методов восстановления Шпффоса основания. Macheva et al. (1989) Me обнаружила различий в HI-содержавших последовательностях актирного :i неактивного хроматина при использовании цианборгидрнда натрия (NaBlljCtl) при s-'^TiüKe, что предполагает, что С-конп^вые лиэины (доминирующие п;-и этом варианте c:uhbk;i) остаются связанными с ДНК при транскрипции, а ни обнаружил:: 1.5-7 кратноо снижение плотности линкерных гистонов при обоих вариантах (и NaBK4, и CjH^N•ВИ3, который по специфичности cil шаюкихся с ЦНК аминокислот идентичен HaBHjCií. Некоторые экспериментальны-» детали могут играть роль. Во-первы::, аминокислотная последоаателмность куриных HI и особенно Ii5 (Coles et al., 1987) значительно отличается от дрозофилиногс HI, и таким образом мы нэ молем исключить возможность сшивки глобулярных йоменов линипрнмк гистонов кур при использовании ;рормальде[ ид/ДМС/Cj.HjN-BHj метода. Во- вторых, транскрипция глобинового гена в эр^троиитак отлича-лс;« от таковей гена hsp5 70 в индуцированной культуре дрозофилы. Возможно играет роль некоторый избыток линкерных гистонов в эритроцитах. Во всяком случае обеднение линкерных ' гистонов на последовательностях глобиноdoго гена в эритроцитах цыплят после ДНК-белчовой сшивки и иммунсиреиипитаиии наблюдали и Kamakaka and Thomas (1990)-. Заметим, 41 о наши данные по коровья) гистонам на транскрибируемом хроматине эритроцитов в некотором смысле подтверждают данные Nacheva et al. (1989), хотя различающаяся на порядок интенсивность транскрипции может быть ответственной за отличия и количественных показателях.

Дополнительная информация, следующая из полученных результатов - отсутствие клас—ерирог-ания HI и Н5 в чроматино индивидуальны:« генов, что согласуется с. чор^доьангем !tí и Н5 н г>лигоиукл».>осо^лх, описанным ранее ("'i'rfos-ilirtinez and Ruiz-GatjÎlo. 19Я2; l.enrard

and Thomas, 19в5). Повышенное соотношение HI/Н1° в. кононуклеосонах активного альбуминового гсиа печени крысы (Boche et al., 1985) может объясняться. преимупественним высвобождением Н1° над HI при нуклеаэном гидролизе (Thomas ot al., 1935)

Распределение HHG белков на активна-транскрибируемом а неактивных

Соотношение сигналов для HMG 1/2,Е-ДНК можно проследить на Рис. 5 и б. Сходная картина для озальбуминового, лизоцимоаого и ß глобинового генов предполагает равномерное распределение НМС 1/2,Е по последовательностям активно транскрибируемого и неактивного хроматина. И только промоторная ß глобиновая пройд гибридизуется слабее с HMG 1/2,Е-ДНК. Результата вновь идентичны для всех вариантов сшивки. Количественная оценка сигналов с HHG 1/2,Е-ДНК подтверждает визуальное впечатление о равномерной распределении HMG 1/2,Е. При сшивке Уф HUG 1/2,Е- ДНК слабо обогащены глобиновыми последовательностями (1.15-1.25}, однако такое слабое обогащение не воспроизвелось при химическом варианте сшивки. Следует подчеркнуть, что при данном подходе регистрируются лишь контактирующие с ДНК белки. Степень обеднения HMG 1/2,Е на промоторе глобинового гена приблизительно такая же, как и линкерних гистонов.

Умеренное обогащение HMG 1 '/17•ДНК ß глобиновыми, но не промоторными ß глобиновыми последовательностями .относительно овальбуминовых и лиэоцммових последовательностей проиллюстрировано на Рис. S и б. Гибридизация с проыоторной ß глобиковой пробой дает приблизительно тот же сигнал, что и с пробами неактивных генов.

♦акт обогащения HMG 14/17- Л''К в 1.5-2.4 раза" кодирующего участка ß глобиновых последовательностей по сравнению с кодирующими участками оаальбуминового и лизоцимового генов

Vi

Сшивка УФ Сшивка форм/ДКС

Контрольная ДКК HKG 1/2,Е-ДНК Контрольная ДНК

а б _в г

© о О О S |э овл ш; з гло ПРО

ООО в * j [с oj EH ü"* £1

а о э * | [о »1 j; * Ф ti j

о О в* ® *• | )» Tj Eh OZZZEEI

Стеска Контрольная ДНК HHG б Сшивка форм/ДНС 14/17 ДНК Контрольная ДНК в г

-Э О О * j «| OUA ЛИЗ ГЛО ПРО J.s <«| ; • • Ф О €5

[а * j 1 - О ф <Tj

¡ООЭв * ; t© oj || ' о |

¡Ö<5 8 в • j [а *| \y_ У а О <Tt<

Рис. 5 ■ Датшо дот-гибридизации иммукопр-эципитпрозанных комплексов HMG 1/2,й-ДНК и I1MG 1-1/17-ДИК. Комплексы HMG 1/2,Е-ДНК и HMG 14/17 ДНК, сбитые ультрафиолетом ь клетках (УФ, а) , или на ядрах (УФ, б) , или формальдегидом/ ДМС (фори/ДМС/о - восстановительное элкилирование боргидридом натрия, форм/ДМС/r - восстановительное алкилирование пиридин-бораном), иммунопрецилитнровали, элюировали, депротеинизиропали, наносили на фильтр и гибридизовали с овальбуминозой (ODA), лизоцимовой (ЛИЗ), глобинсвсй (ГЛО) и прсмоторной (ПРО) пробами. Контрольная ДНК наносилась в виде сэрми двукратных разведений.

1шг. 1/г,Е нмс 1-1/17

абвг ибвг

Рис. б■ Относителмшя локальная концентрация нмв 1/2, Е и ННС 14/17 на индивидуальных последовательностях

эритроцитарного хроматина цыплят (по данным дот-гибридизоции иммунопрецилигироианных комплексов). Радиоавтографы, представлепные на предыдущем рисунке, сканировали. Локальная концентрация ШЮ 1/2,Е и НМС 14/17 на оьальбуминовом гене принята за единицу. Каждая группа столбиков - соотношение между гибридизациэнными сигналами одного и того ' жо иммунопреципитированного образца, скитого либо УФ в клетках (УФ, а) , или на ядрах (УФ, б) , либо формальдегидом/ ДМС (форм/ДМС, в - восстановитепь:;оо алкилированио боргидридом натрия, фсрм/ДМС, г - восстановительное алкилироьание пиридин-бораном), выделенного с антителами к НМО 1/2,Е и НМС 14/17, и последова-ельно прогябридиэооэнного с овельбуминовоЯ (ОЯА) ,' лизоцимсвой (ЛИЗ) , глобииэвой (ГЛО) и промоторной (ПРО) пробами. Обозначения столбиков: черный -ОБА, крапчатый - ГЛО, прозрачный - ПРО, сетчатый - ЛИЗ.

Т6

находится в явном диссонансе о данными Dorbic and Wittig il086; 1987) no многократному сбсгааонию гранскрнпциончо активных последовательностей, но согл-лсуеп ci с их утверждением о локализации плотного кластера HI/J 1-1/17 вправо от старта транскрипции (срапннте данные НМЗ 1.;/17-Д11К дп.-- £ iлобиновой и промсторной р глобинсаой проб нд Рис. 5) . Промоторный /5 глобиновый участок обладает такой :::е плотностью ¡IMG 14/17- как и неактивные последовательности, даже видимо и монъ^ей, так как рядом расп-сложенный /? глобинеii.vr, ген обладг.с? повышенной локалъной концентрацие1": HMG 14/17 (даетцеи ло;.-.по-положительный сигнал) . Сшиска УФ на ядрах дает более высокую ст^п^нь обогащения, чем на клетках, что говорит о возможности некоторого перераспределения H МО во время ппиготспяения лле^ . *

Пегки ядер эртроц^тов кур содержа';' ско т.о 1?5 HHG 14/17. В среднем каждая десятая луклеосомг несет дно молекулы этого белка (Sandeen et al., 1930). Двухкратное увеличение HMG 14/17 на активном хроматине, которое мы обнаружили, означает, что каждая пятая нуклеосома становится с ш:м связанной. Связывание HUG 14/17 не влияет ни на рсаранякровку контактов гистоноб в нуклеосомной ДНК (Shick et al., 1905), ни на ебщуы конфигурацию нуклеосомы (Paton et al., 1903) .

Используя прерэвар ННазой в низкой ионной силе и иммунопреципитацио хроматина печени крыс, Druckmann et al. (1986)' не нашел различий между активными и неактивными последовательностями u HMG 14/17-содержащем хроматина

неиндуцированних ядер. Однако в таком че хроматике индуцированных ядер было обогащение как активно транскрибирутимися последовательностями, так и 5' последовательностями неактивно транскрибирующие« гоноп относительно иовторжииншся

последовательностей. К соязлениа, оозис»!«ость ограниченного (около

Î7

5%), но акцептиронанного перераспределения HMG 14/17 в 20 мК соли (см. например Swerdlow and Varshavsky, 1983), некоторая нсодпаэначность в оиенке гнбридизационного сигнала и недостатки дакноЛ версии иммунопреципмтаци»! (невозможность дискриминации кластера HMG 14/17-несущих олигонуклеосем от диспергированных HMG 14/17-несущих ол;!Гонуклзосом) могли привести к сомнительным результатам.

Многократное обогащение активного хроматина 1ШЗ 14/17 было обнаружено Dorbic and Wittig (1986; 1987) при использовании иммунопреципитации лишенного Ш хроматина и рестрикции in situ. Неняя набор рестриктсз, они показали кластерирование HMG 1'1/17-несуаих нуклеоссм только вправо от транскрипционного старта. Однако неясно, следует ли это расцснизать как доказательство подобного распределения in vivo, либо как результат перераспределения белков па сайты связывания с высокой аффинос-ью.

Поскольку HI ¡i HMG 14/17 обладают участками гомологии аминокислотной последовательности в своих центральных участках, HMG 14/17 активно связывается с лишенным HI хроматином, и количественные изменения HMG 14/17 (обогащение) и Н1/Н5 (обеднение) в активном хроматине близки rio величине, заманчиво предположить, что удаление HI и посадка HMG 14/17 - сопряженнее процессы. Также достойна рассмотрения гипотеза о роли HMG 14/17 в поддержании коровых гистои-в активного хроматина а гиперацетилированном состоянии (Nalik et al., 1984).

Не было найдено обогащения по HMG 1/2,Е на транскрибируемом хроматине.ни в каком варианте ДНК-белковой сшивки. Это говорит о неучастии HMG 1/2,Е в процесс активации хроматила, во всяком случае не через взаимодействир с ДНК. •

В последнее время опубликован ряд работ о вкладе высокомолекулярных HMG в процесс транскрипции, хотя определенный

J8

ехакиэм не ппндан. ¡"1П 1/2,Е - группа белкоп, содержат'-. азываемыЯ Л~ уччсточ с почти и --щ .ерьтной последова тельное мгп{с;<ислотнь:х остатков с огрицт^льно р"женнь.'чи о'окп

' ' jjí

руппами (КпгпьЬя\/, ЮГ?). Зги оилки могут облогчлтъ уДа,

■ленив

"п

ндуциронпн||1:.( гнстонами или "-ДНК vpaiic.t риыаомъ;;;

■истоноа с ДНК rfii транскрипции. IHG 1/2.Е способны прсадр ,

■'леи,-

Tnmetbick and Mollcy, 1936; ПЛ8; Waya nt .»1. нутрикл^гочнпг. imboiuun агги lit';; 1/2,L' антитез 'liesi<py„ ■рапскрипччн -рочосом типч ismpcjiiv ниток (Kl'.>lnachniil*t ¿¡j 983). Следует ccviv ппдчткнуть, ч го возможно HMG 1',?игрд|0т оль аллл*. .'рпл'Оиь о пктпваторл MLTT--J лк тор iciij/ot-j

рилскрипцин, пги1.'м рлботяпт п отсутстши контакта <: Wtt ej. 1 , 1908). lie м'-пп оно кр.-згшо легко познмкаюаей Г^'Ъсвкл М" 1/2,5, мп ! •• плхо-'.ин по^мо:х11.1Ч комментировать рлннм По ссоиипции HfG 1/J,i: и м< тинного хроматина. Г.дмнствешм'а fJ оторой HMG фниенроп.чпч к- ДНК с помощь» УФ нгчил.л ,ццр ■канеспсцифичного HIliVT на i»с активных послелсп.-р^, |ротаминосых Г'.'ноп сю cpvt::-мню с актишнии последом <i1Mri истоповых и лнтеллоп.нимояих геном печени фороли (Hl.in< 985), и эти. рспультлти отлпчпт-ся от иапих. За -.»то Гь 1тпетстпен1:ы хорошо нщчеппм птличип свойств (нпприморц. it al., 19SQ) IIMG 1/2,1-: и IIMO-т. Мы на нашли доказатолы^. MG 1/2,Е в обраэоплшш трдно.-рипционного комплекса

глобинового гена эритроцнтоп куп, возможно вследстико| заимодоПстиип 1IMG 1/2,1: к ДНК в таком компл! IMG 1/2,Е-независимости трпн'-критми р глобинопого гона следствие отеутстпия tin г.-оОкмопом гена необычных ctj ызывающих блок толнсиригцпм). Тпким оГразом, нам юлучить дока.1атол1.стп у"истин H1IG 1/2,Е а трангкрнпци ак это было показано In vitro.

IV. в ьш оды

1 рпзрноотаи метил количественного анализа распределения оелкс сП«цнфлчсясих последовательностях ДНК in vivo и ' in vitro. С о стоит из 1НК-болковоя севшкп внутри цельных клстс1с ид»: 1 идоле11НК "-Рах' специфического иммуноаффинього выделения сшить емплс1'с' '¡iPe:j Ослик и илонтификацин сшитой ДНК при помси гибриДи3"' с tl^1¡o,l0no4tí4m,''-,t' пробами. Метод был пргагенон дл кодачвст|.гл оценки плотности лиикерних гнетоиэа 111/135 HMü белкна транскрибирует ¡х, репрессированных и регулятерны „оследо^ьностях.

2 -?рабмруемый хроматин /3 глобинового гена эритроците эмбРиОИУР характеризуется примерно 2-кратно снижонно пдоТИОС\ и Н5 по сравнении с ..еактивными овальОуминовым Jlvl3oUiii'i генами. Обеднение HI/115 глоОиновьм

послеД^остями подтверждено методом гибридизации • белкоашми" . Эти данные указывают на деконденсированно с0сто«»вного хроматика, связанное с удалением линк^рны гнетов

3 _ 'Тр.усньй хроматин /5 глобинового гена эритроците! эмбр^ьрактериэустся в 1.5-2.5 раза'повышенной плотносты 6еЛ'<-оЕ 7 по сравнение с неактивными оеальбуминовим I jiu30W-ic:ih . Белки Hf.Q 1/2 ассоциированы с активны: гло6ИИрсссированными овальбуминовкм и лизоцимовом генам)

равное

4. 'V "iuh участок глобииового гена .существенно обедне! всоиМчными белками, что указывает на отсутствие 11уКЛ®Ъизации.

Оснопныо реэул'.тати опубликованм в следуювих работах

1. Shick V.V., B.jlya'7sky a.V. , Postni'n-jv Vu.V. end Studitsky v.m Localization of liMC protsir.s in ch-.-тэсХп of chicken /?-glob'in and ovalbumin genes. Organization and Function oi the aukaryotjc genono, 7th Согззп-Soviet Symposium, 19B7,Heidelberg

2. Shick V.V., DelyavFky A.V., ?ost^ikcv Vu.V,, Khrapko K.R. and Pataricize 1.0. Localization of !iKG proteins in chromatin of globin and ovalbumin genes. Abstracts Inter. Symn. rPhysico-chemistry of DNA and molewlsr mechanism of gencue functioning - , 1937, Tbilisi, p. 113.

3. Храпко К.Г., Велявский й.В., Постников Ю.В., Вродолин К.Л. и Шик В.Б. Распределение НМО по функционально различным учестким генома. Тезисы 3 конф. 1 мг.л.уч^1:.о}сс.-биол. 1988, Ереван.

4. Постников Ю.В., Шик В.В., Белг.пский А.В., Вродолин К.Л., Храпко к.р., Никольская т. а. и Мирэабеков А.д. Хромосомные бэлки эритро!дитов эмбрионов кур на транскрипционио-активных и неактивных генах. Молеиулярае» Биология, 1939, 23 (6), 1682-1691.

5. Postnikov Yu. V., Shick V.V., Brodolin К.L. and Mirzabekov A.D. Chicken embryonic erythrocyte chromosomal proteins HMG 1/2,E, HMG14/17 and histones HI and H5 on active and inactive genes. Indo-Soviet -..orkshop on DNA-protein interactions and cross-linking, 1990, Bangaloro.

6. Postnikov Yu.V., Shick V.V., BelyavBky A.V., Khrapko K.R., Brodolin K.L., Hikolskaya T.A. and Mirzabekov A.D. Distribution of high mobility group proteins 1/2,Б and 14/17 and linker histones HI and H5 on transcribed and - non-transcribed region of chicken erythrocyte chromatin. Nucl. Acids №i4 1991, 19(4), 717-725.

ЛП "Шанс" Заказ • 2737 ГЯрак 100 экэ