Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение нового гена, связанного с делением клеток и соматическим эмбриогенезом у растений

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Изучение нового гена, связанного с делением клеток и соматическим эмбриогенезом у растений"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИИСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ ИМЕНИ К.Л.ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукоииси

СКИТ Пария Вильяковна

ИЗУЧЕНИЕ НОВОГО ГЕНА, СВЯЗАННОГО С ДЕЛЕНИЕМ КЛЕТОК И СОМАТИЧЕСКИМ ЭМБРИОГЕНЕЗОМ У РАСТЕНИЙ

Специальность: 03.00.12. - Физиология растений

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 1992

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений им.К.А.Тимирязева АН СССР.

Научный руководитель: Члеп-корр. АН СССР,

анадеиик ВАСХШШ, профессор Р.Г.Бутенко

. Официальные оппоненты: доктор биологических паук

Э.С.Пирузяи

кандидат биологических наук II. П. Ермаков

Ведущее учреждение: Институт общей генетики пи. Н.И.Вавилова РАН

Защита диссертации состоится "А_" 199^ г.

в ¿.3 часов на заседании Специализированного совета по присуждению ученой степени кандидата биологических паук К.002.45.01 при Ииституте физиологии растений РАН, по адресу: Носква, 127276, Ботаническая ул., д.35

Автореферат разослан

С диссертацией мояно ознакомиться в библиотеке.

Института физиологии растений РАН

Ученый секретарь у)

Специализированного совета С ^/? канд. биол. наук / Сергеева Я. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Процессы морфогенеза у растений, как правило, сопровождаются резкими и специфическими изменениями характера г еточ-ных делений. Подобные изменения были детально описаны при изучении соматического эмбриогенеза в культуре клеток моркови: на ранних этапах этого процесса делении в клеточном агрегате резко ускоряются на одном из полюсов зародыша, напоминая деления дробления у животного зародыша (Fujimura and Komamine,1980). Вопрос о регуляции характера клеточных делений при морфогенеза до сих пор остается одним из наиболее неясных в биологии растительной клетки. Эта проблема приобретает особое значение при ' изучении морфогенеза у растительных клеток, культивируемых in vitro, так как многие неудачи при иидукцйи этого процесса могут объясняться недостаточным знанием способов экспериментально воздействовать на способность клеток пенять скорость или направление делений (Бутенко, 1975) .

В качестве модельной системы для изучения морфогенеза у растений широко используются суспензионные культуры клеток моркови (Sung et al., 1984; Моисеева и др., 1987). В одной из работ, проведенной в лаборатории Р.Сайг в Калифорнийском У\..~ верситете, были получены моноклональные антитела, реагирующие с антигеном, присутствующим в эмбриогепной суспензии моркови (J.Smith et al., 1985) . По номеру гибридомы, продуцирующей эти мнЛТ, антиген был назван 21Д7. У моркови этот антиген имел молекулярный вес около 45 кДа, и паблюдался только в активно делящихся клетках, например, п меристемах корня и стебля, в растущей суспензиоппой культуре, в незрелых зарг -,ышах. Непрямой метод иммунофлуоресценции показал, что 21Д7 антиген локализован в ядрах интерфазных клеток, наиболее часто он заметен в ядрышках (J.Smith et al., 1988). Р.Сайг и Да. Смит великодушно предоставили ионоклоналыще антитела 21Д7 нескольким лаг бораториям пира,

Чтобы попытаться выделить ген, кодирующий 21Д7 антиген, и выяснить возможную роль 21Д7 антигена в процессе деления клеток, нами было предложено использовать более простую экспе-

риментальную систему, в которой морфогенез не наблюдается, -неорганизованно растущие в суспензионной культуре клетки барвинка розового - Catharanthus roseus (L.) G.Don. В лаборатории профессора А. Комамине в университете Тохоку (г.Сецдай, Япония) были разработаны иетоди синхронизации клеточных делений в этой системе (Anino et al.,1983; Kodana et al., 1989)<

Рель и задачи исследования' Цель» нашей работы явнлрсь выделение последовательности кДНК, соответствующей 21Д7 антигену , и изучение ее экспрессии на уровне mPJIK в различных растительных системах. Иы назвали предполагаемый ген, кодирующий 21Д7 антиген, cpd 21D7 (сокращенно от "cell proliferation dependent" - "связанный с клеточный делением").

Были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Создать экспрессиониуг библиотеку кДНК моркови и выделить последовательность кДНК, при экспрессии которой в бактериальных клетках образуется полипептнд, ■способный реагировать с инАТ 21Д7 .

2. Доказать, что выделенная последовательность кДНК кодирует в растительных клетках антиген 21Д7.

3. Изучить экспрессию выделенного гена на уровне мРНК в различных тканях м клетках моркови, чтобы выявить ее специфический характер.

4. Исследовать связь между экспрессией гена в клеточный делением в неорганизованно растущих культурах С. roseus при синхронизации клеточного цикла разными способами.

Научная новизна и практическая ценность. Выделены кДНК моркови н С.roseus, соответствующие ранее пеизвестиому гепу, который кодирует 21Д7 антиген, связанный с деление« клеток. Обнаружено сходство ¡этого растительного гена с нутантным животным геном, кодирующим turn- трансплантационный опухолевый антиген Р91А, экспрессия которого в раковых клетках мыши приводит к потере ими способности образовывать опухоли In vivo i (Lirquin et al., 1989).

Использование фрагментов выделенной последовательности кДНК в качестве зондов позволило изучи_ ь экспрессию гена на уровне мРНК в различных растительных системах. Показано резкое усиление экси.ессни гена при активизации клеточного деления,

доказав фазоспецифический характер экспрессии при прохождении клеточного цикла, полученные данные свидетельствуют о регуляции активности данного гена па уровне транскрипции. Выделенный геи кодирует ядерный белок, поэтому дальнейшее исследование работы этого гена может помочь в изучении механизма регуляции клеточных делений при различных процессах в культурах клеток растений и животных, что практически важно для разработки эффективных клеточных технологий.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации били доложены на 5-м Межд. конгрессе "Биология клетки d культуре и биотехнология", Новосибирск, 2-6 августа 1988 г; 11-м Кежд. симпозиуме "Эмбриология и семенное размножение", Ленинг-• рад, 3-7 июля 1990 г.; секции ВОФР "Биология культивируемых клеток и клеточная шшекеркя", 16 пая 1991 г.; семинаре лаб. физиологии растений Университета Тохоку, Сендай, Япония; 1-м Всесопз. симпозиуме "Новые-методы биотехнологии растений", Пу-щтю, 22 поября 1991 г.

По результатам исследования бнло опубликовано 8 работ. Структура лнссептзции. •

Специфика представляемого экспериментального материала и необходимость более подробно, чей ото обычно делается в диссертации, изложить примененную нами технику получения результатов заставили меня несколько отойти от привычной структуры кандидатской диссертации. Материал диссертации состоит из введения, общего литературного обзора, двух основных глав, каждая из которых имеет собственный раздел материалов и методов исследования, а также раздел результатов и обсуждения. Заканчивается диссертация общим заключением, выводами и списком цитируемой литературы (154 наименований). Работа изложена на 149 страницах машинописного текста и включает 17 рисунков.

ВВДБЛЕ1ШЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА кДНК, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ГЕНУ cpd 21D7 Материалы и методы исследования

В качестве объекта исследования использовали клеточные суспензии моркови сорта Kurodagosun штаммов F и YT5 (Fujiraura and Копав1пе,1979; lfomura and Komamine, 1985) л Суммарную фрак-

/

•' 6 ■ ' Л/. •

цию РНК из неорганизованно растущих клеток выделяла по слегка модифицированному иетоду Schmidt et al. (1981). Полученную по-ли(А+)Р11К моркови использовали о качество матрицы Для синтеза комплементарной ДНК (кДНК) по методу ïïatson and Jackson (1985). Для создания экспрессиоиной библиотеки кДНК применяли бактериофаг лямбда gtll (Young and Davis,1983). Инмуцоскринниг экспрессионноц библиотеки кДНК (Iluynh et al. , 1985) проводили с помощью моноклональинх антител (ннАТ) 21Д7 и стандартного набо^ (plcoBlue Innunoscreening kit, Stratagene, USA).

Выделение ДНК реконбииаптныэс бактериофагов, субклоииро-панне кДНК в векторе pBluescript KS «13 (Short et al ., 19,88), электрофорез, перенос ДНК на нейлоновый фильтр (Biodyne А, Pall Ultrafine Filtration Corp., USA) проводили по методиках из лабораторного руководства Sa^broolc et al., 1989, Секвеннро-ванне ДНК проводилось по методу Сэнгера (Sanger et al., 1977). Активацию лизогениого пути развития фаговой инфекции, при которой рекоибииантная фаговая ДНК встраивалась в хромосому бак-терин-хозяина E.coli Y1089, проводили по методу Huynh et al.,1985. Для выделения рекоыбинантных составных белков, кодируемых отобранными кДНК, проводилось выращивание культур лизо-гена, получение неочищенного лизата бактериальных клеток (Carrol and Laughon, 1987) и вертикальный SDS-ПАГЭ в 9% геле по Laemmli et al. (1972). После электрофореза проводили инму-ноблоттинг: электроперенос белков на питроцеллюлозиые фильтры Ilybond-C (Aoershaa) и ниыунохимическуп реакцию вначале с мнАТ 21Д7, а затеи со вторичными антителами, которые представляли собой козлиный иммуноглобулин против антител мыши, коньюгиро-ванный с пероксидазой хрена (BioRad lab., USA).

Результаты н обсуждение

Обнаружение последовательностей кДНК. кодирующих белки. которые способны реагировать с нкАТ 21Д7.

В предыдущих работах интернационального коллектива ученых- (Smith et al., 1985, 1988; lloeura, 1986; Ohnishi, личное сообщение) была дана детальная харак! мистика антигена 21Д7, при этой в качестве единственного средства для обнаружения и идентификации данного маркера клеточного деления использова-

- 7 - •

лись мнАТ гкбридокы 21Д7, полученные Дж. Снят d Í985 году. Эти ке иопоклоналыше антитела било, решено использовать в нашей работе для выделения последовательности кДНК гена, названного нами cpd 21D7, который кодирует 21Д7 антиген.

С помощью мнАТ 21Д7 был проведеп имиуноскршшнг имеющейся экспрессиоппой библиотеки кДНК, сконструированной И.Ито па основе поли(А)+РШ£ из клеток корня моркови. В использованной системе (Young and Davis, 1983) кДНК встраивали в ДНК фага лямбда gtll в упикальный EcoRI сайт внутри гена.lac Z, который кодирует бета-галакгозпдазу; : При развитии фаговой инфекции в результате экспрессии рекомбинаитиого гена lac Z в клетках E:colL образовывался составной белок; у которого амино-конец

• представлял собой бета-галактозидазу, обладавшую ферментатив-иой активностью; в к неиу па карбоксильном конце был присоединен дополнительный полипептид, кодируемый кДНК.

В результате шшупоскрпаинга 2,6x100000 литических бля-иек удалось выявить 7 чистых клонов бактериофагов, составные белки которых реагировали с мнАТ 21Д7. кДНК, изолированные из библиотека кДНК корня моркови, были обозначена'нами как DC ( от Daucus carota), порядковый Номер определялся номерок фильтра, где был обнаружен сигнал. Для установления сходства мег 'у КДНК выбратшх бактериофагов проводили блот-гибридизационный анализ. Оказалось, что трп пз отобрашшх кДНК длиной 700 пар оснований (п.о.) былп идептичпы друг другу, опн были обозначены DC13, а одна - DC31, длиной 850 п.о., не имела с ними никакого сходства. Выяснилось, что 3 коротких кДНК DC11, DC71 и DC94, состоящие примерно из 300 и.о., отличаются друг от друга п от всех остальных ¡{ДНК. Для дальнейшей рабо-v из них была выбрана кДНК DC11, так как клон бактериофага, несущего эту вставку, давал наиболее четкий сигяал при иммуноскринииге.

Таким образом, нами были получены пять совершенно р.з-иых последовательностей кДНК, кодирующих полипептиды, способные реагировать с миАТ 21Д7. Из литературы известно (Harlow and Lane, 1988), что в нестких денатурирующих условиях миАТ иногда дают перекрес—ые реакции с неродственными антигенами, особенно если они исходно были отобраны по способности реагировать не с дативными, а с денатурированным^ белками, как в

• . ■ ' ' i

- в -

случае миАТ 21Д7. Видима, причина Состоит в том, что ынАТ реагируют с маленьким эпытопом, минимальный размер которого кокег составлять 5 аминокислот, и который в необычных и жестких условиях монет появиться у не связанных между собой белков. В ходе дальнейшей работы три из отобранных кДНК: DC11, DC13, DC31, - были охарактеризованы с целью установить, какая же из них соответствует предполагаемому гену cpd 21D7. .

Определение концевых последовательностей нуклеотидов трех выбранных кДНК DC11. DC13. DC31,

Фракция поли(А)+РНК, выделенная на олиго(дТ)-целлюлозе, содержит, как правило, не более 5в% нРНК, в состав которой входит концевая поли(А) последовательность, а все остальное представлено фрагментами рнбосомальной РНК (в общей фракции РНК рибосомальная составляет бпее 99 л) (Saubrook et al., 1989). Поэтому часть синтезированной комплементарной ДНК не соответствует ыРНК и составляет контанииацню библиотеки. Чтобы установить, представляют ли отобранные в результате имыуноск-рининга кДНК собой копии нРШС моркови и, тем самым, могут ли оии соответствовать кодирующим последовательностям гена cpd 21D7, было решено сделать секвенирование концевых последовательностей 3-х клонов кДНК - DC11, DC13, DC31.

Последовательность короткой кДКК DC11, состоящая из 316 п.о. и прочтенная целиком, не содеркала поли(А) 3'-концевой

последовательности ни в одной из двух комплементарных цепей, »

поэтому, видимо, появление этой кДНК в составе библиотеки было связано с контаминацией рибосомальной РНК. Все три возможные при трансляции рамки считывания DC11 соответствовали только коротким полипептидам н кончались стоп-кодонами. В: бактериальной системе трансляция кДНК происходила п соответствие с открытой рамкой считывания гена lac Z, что в данном случае приводило к синтезу рекомбинантного составного белка, в состав которого входил небольшой дополнительный полипептид из 16 a.o.i Из самой структуры последовательности DC11 очевидно, что она не нокет соответствовать гену cpd 21D7.

3' конец самой длинной кДНК -С31, состоящей из 850 п.о., содержал длинную,: более чен в 100 нуклеотидов, поли(А)

последовательность. Считывание 5' конца этой кДНК с открытой

»

5' END 176 IWC. 58 Л.Л.

10 20 30 40 50 60

CCCAGGMGCTGAGATTGGACTCTCCAAATCCTGTTGCTGATGCTGAAAGTATTGTATCC AlaArgLysLeaArBLeuAspSorProASnProValAlaAspAlaGluSe. IleValGar

70 00 90 100 110 120

MGGCAATAAGGGATGGAGCCATTGACGCCACCATCGATOVTGCAAATGGGTGGATGGTG LyeAlalleArgAspGlyAlalleAspAlaThrlleAapIIisAloAsnGlyTrpMetVal

130 140 150 160 ' 170

tcaaaggaaaccggagacatttactcäacaaatgagccacaagcaacttttaattc

SerLysGluThrGlyAspIleTyrSerThrAenGluProGlnAlaThrPhéAsn

Piic.l. Известная последовательность пуклеотидов 5' конца кДИК DCÍ3, и соответствующий eft полипептид.

301" RRTUTNALRKApQHTAVGFKQTVHKLLIVVELLLGEIPDRLQFRaPr KRSLMPYFLLTQ 1 • ' ARK

361й AVaTGtÍLAKrHQVI.DQFGEKFQTDGTiTbIIRLRHNVrKTGVRIiXSLSYSRIS-.ADIAQK

4' lrldsphpvadaesivskairdgaidatidhangwmvsketgdiystnepqatfh 421" lqldspe---daefivakaindgvieasinhekgyvqskemidiystrepqlafhqrisf 470" cldiiinmsvkamrfppksykt'dlesaeerrereqqdlefakemaeddddsfp

* - последовательность а.о., соответствующая кДНК DC13

* - - " соответствующая гену tun- TAI ?91A *- идентичные а.о.

. - сходные а.о.

Рис.2. Участок сходства между предсказанными аминокислотными последовательностями растительного и животного генов' (а.о. обозначены в однобуквенном коде)

- Iß -

ранкой, определяемой геном lac Z, в 46-н положении оканчивалось стоп—кодонон и приводило к синтезу бета-галактозидазы, содержащей короткий дополнительный полнпептнд из 15 а.о. Существовала другая рамка считывания 5'концевой последовательности, соответствовавшая длинному полипептиду и не содержащая стоп-кодона в известной пан части из 51 а.о. Вероятно, эта рамка являлась рамкой считывания растительного гена, соответствующего кДНК DC31, и определяла трансляцию последовательности в эукариотической системе, однако в нашей случае она lie совпадала с открытой рамкой гена lac Z. Таким образом, растительный полнпептнд, образовавшийся в результате экспрессии соответствующего гена in vivo, ne ног иметь ту ае последовательность аминокислот, что у бактериального полипептида, образовавшегося в бактериальной системе н реагировавшего с ынАТ 21Д7, из чего однозначно следовало, что,ни тот, ни другой полипептид не являлись антигеном 21Д7. Результаты секвеннрования позволили со значительной вероятностью предположить, что кДНК DC31, так ве как и DC11, не соответствовала rçuy cpd 21D7.

На рис.1 представлены последовательности концов кДНК DC13. З'-участок этой кДНК содервал поли(А) последовательность, длииа которой составляла 21 нуклеотид. На 5' конце отк-ритал ранка считывания гена lac Z не содержала стоп-кодонов и иодировала длинный полипептид, возможная последовательность первых 58 а.о. стала известна в результате секвеннровання. Очевидно, что эта кДНК являлась наиболее вероятным кандидатом, который мог соответствовать гену cpd 21D7. Для подтверждения соответствия кД11К DC13 гену cpd 21D7 иаии был избран путь, связанный на первом этапе с исследование!! рекомбииантиых составных белков, кодируемых тремя описанными кДНК.

Анализ белковых пропукгов экспрессии выбранных кЛНК в бактериальной системе.

Чтобы иметь возможность получать рекомбинантные белки в > достаточном для исследований количестве для каждого клопа кДНК было необходимо отобрать снфицировашше клетки E.coli, у которых активируется ие литичсский, а лнзо. лшый путь развития фаговой инфекции. Инфицируя штамн Е.соН Y10B9 чистыми клонами рекомбииантиых бактериофагов, в 20-40 % случаев нам удалось

С - контроль - культура исходного атаима E.coli Y1089

культуры лнзогенов, несущих вставки кДНК DC 11 ~ DC13....... DC31

12 i 2 i 2 £. _________

J«- --- . i 1 - 5 «КЛ

Г , - ; 2 - 15 нкл

( íijj в»»» , ' i неочищенного лнзата

hk ' '

Рис.3. Иммуноблоттинг реконбинаптных составных белков с моноклональными антителами 21Д7

получить стабильные культуры лнзогенов, в состав ДИК которых встраивалась одна из выбранных кД11К (Young and Davis. 1983).

Неочищенные лизаты культур лнзогенов содержали значительное количество рекомбинантного составного белка, котооыЛ был хорошо различим в верхней части геля при SDS-ПАГЭ. Наиболее большой н.в. около 130 kDa имел рекомбннантный белок, кодируемый кДНК DC13. Хотя кДШС DC31 была на 150 п.о. длиннее кДНК DC13, в ее случае составной белок оказался существенно меньше, он имел примерно гот ase м.в., что и белок, кодируемый короткой кДНК DC11, дополнительная часть которого состояла всего из 16 а.о. Этот факт еще раз подтвердил, что в случае кДНК DC31 транскрипция последовательности в бактериальной клетке происходила не так, как в растительной, а значит среди выделенных последовательностей только кДШС DC13 когла сог-вет-ствовать гену cpd 21D7.

Результаты ннмуноблоттинга показал«, что все три разных рекомбннаитных белка, кодируемых полностью различными кДНК ' DC11, DC13, DC31, реагировали с мпАТ 21Д7." Поэтому потребова-

• - - 12 \ лось провести трудоемкую серию экспериментов для окоичателыю-го доказательства соответствия «ДНК DC13 и гепа cpd 21D7.

Проверка соответствия кЯНК 13 гену cod 21D7. .

В результате крупномасштабного выращивания нами било получено около 3 литров бактерналыюй культуры лизогена, несущего вставку из кДНК DC13. Для разделения полученного неочищенного лнзата ни провели около 250 препаратившд электрофоре-зов и выделили около 5 нг рекомбинантпого составного белка, который был затем использован, для иммунизации кролпков. Полученная поликлональная аптисипоротка (АС) била использована для проведения нимуноблоттинга с белковыми экстрактами из клеток суспеизиовной культуры моркови. Эта АС реагировала с несколькими растительными белками, один из которых имел молекулярный вес около 45 kDa, как у 21Д7ангтеиа;

Сходство предполагаемой последовательности полипептпда. кодируемого DC13. с последояателыюстьп полипептида, соответствующего животному гену tun- ТАГ Р91А.

Поиск в базах данных- пуклеотядных i: аминокислотных последовательностей, гомологичных кДНК DC31 и ее продукту, ие дал положительного результата, поэтому работа с этой кДИК была пока прекращена, учитывая, что она не могла кодировать 21Д7 антиген. Сравнение последовательности а.о. полипептпда, соответствующего кДНК DC13, привело к выявлению сходной последовательности, когоруи кодирует одни из нугапгпых животных генов, выделенный из раковых клеток мши - ген Ьиш- трансплантационного опухолевого антигена Р91А (Lirquin et al., 19В9).

.Из 58 аминокислот, соответствующих прочитанному нами Б'-концевому участку кДНК DC13, 63 X (35 а.о.) были'идентпчиы, а еще 26 34 (15 а.о. ) - аналогичны аминокислотным остаткам последовательности полапептида, который кодируется 9 и 10 зкзанами гена tum- ТАГ -Р91А. Участок гомологии, приведенный на рис.2, представлял собой практически сплошную последователь-1 иость без .длинных пропусков алп вставок.

1С соаалеина, имеющиеся в литературе дашше, касающиеся нутаитного геи? tun- ТАГ Р91Л, не позволяют сделать какие-либо выводы о функции и локализации в клетке его продуктов (Lirquin et al., 1989). ^ работе, вцподпенной па иивотпых клетках, был

детально исследован один, из возможных механизмов иммунологк-ческого надзора, приводящий к отторжении сиигешшм животным иутантпых раковых клеток, у которых мутация затронула; этот ген. Било показано, что распознавание нутантпого продукта» про>-исходит не на уровне целого белка, кодируемого данным renot.?,. а с участием небольиого олигопсптида, образующегося в результате локальной субгенной транскрипции и трансляции определенного участка работавшего гена. Таким образок, иммунологический надзор но связан с возможной ролы) данного гона в клетке, которая осталась совершенно неизученной. Однако, в той же работе (Lirquln et al., 1989) мутантный геи tun- ТАГ Р91А ц соответствующий ему нормальный ген были выделены целиком к изучены.

Анализ экспрессии гена tun- ТАГ Р91А в животных клетка» показал, что продукт транскрипции этого гена прсдстшпляатгсобой мРНК длиной около 2200 оснований (Lirquin et аШ_„ £958>i>. Полученная нами кДНК DC13 оказалась в три раза короче- позто>-му мы предположили, что она представляла собой часть-кодирующей последовательности растительного гена, и поставили? перед* собой задачу получить соответствующую кДНК полной длины1.

Создание представительной библиотеки кЛИК коркови*. и< пш-леление кДНК полной длины, гомологичной DC13.

На первом этапе необходимо било сконструировали, папуа-представительную библиотеку, построенную с использованием! длинных кДНК. Было известно (Smith et al., 1988), что< 21Д7- ан*-тиген экспрессируется в активно делящихся клетках, поэтому, дш выделения PHIC было решено использовать суспензионную культуру 1 моркови, находящуюся на экспопенциальной фазе роста. Электрофорез и блот-гибридизация полученной поли(А)+РШС с кДШС DC13 показали, что соответствующая мРНК имеет длину около 2203 оснований, то есть длины транскриптов янвотного к растительного генов практически совпадают. В ходе конструирования библиотеки мы провели фракционирование синтезированной двунитевой кДНК по размеру, фракцию длинной кДНК использовали для встраивания1 в» вектор - бактериофаг лямбда gtll,

В результате работы била получена библиотека кДНК объемом 4x100000 частиц бактериофага, 90% которых содержали встав-

ки кДНК. Скрининг этой библиотеки проводили с использованием в качестве зонда меченой кДНК DC13, и в результате выделили соответствующую кДНК длиной около 2100 п.о.

ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА cpd 21D7 НА УРОВНЕ мРЬК ОТ КЛЕТОЧНОГО ДЕЛЕНИЯ

Материалы и методы исследования

В качестве материала использовали 10-дневные проростки моркови, до&тигшие поздней семядольной стадии развития; а также суспензионные культуры клеток Catharanthus roséus (l.) G.Don штамма В (Amino et al., 1983) и штамма TN21 (Kodama, 1989), выращиваемые на среде Мураснге и Скуга с добавлением 2,2 и 4,4 мкМ 2,4-Д соответственно.

Блокирование клеточного цикла C.roseus в G1 фазе осуществляли в результате голодания - частичного или полного удаления из среды сахарозы или азота (Kodama, 1989; Ito et al., 1991). Синхронизацию клеточного цикла производили двумя способами: путем удаления из среды ауксина (штамм TN21) (Ito et al., 1991), или методом двойного фосфатного голодания (штамм В) (Araino et al., 1983; Kodania et al., 1989).

Выделение РНК из растительных тканей в небольшом объеме проводил!! по методу Schnidt et al. (1981). а затем фракционировали ее с помощью электрофореза в 1% агарозном геле, который содержал 2% формальдегида, по модифицированному методу Lehrach et al. (1977), осуществляли перенос на нейлоновую мембрану и блот-гибридизаци» (Saabrook et al., 1989).

Результаты и обсуждение

ТканеспециФическая экспрессия гена cpd 21D7 у моркови

Высокая степень сходства между предполагаемыми последовательностями белковых продуктов животного гена turn- ТАГ Р91А и растительного гена cpd 21D7, а также близкие длины соответствующих им мРНК, синтезируемых в растительных и животных клетках, позволяют предположить сходную функцию обоих генов. О важности данных генов косвенно свидетельствуют данные о том, что в клетках животного этот ген постоянно подвергается иммунологической проверке, когда в кодирующей области работающего

гена происходит локальная транскрипция и на основе ее синтез небольших олигопептидов, которые, в случае нутаций, начинают распознаваться иммунной системой, что приводит к отторжению всей мутантной клеточной линии (Boon and Van Pel, 1909).

Результаты исследования антигена 21Д7 у растительных клеток показали зависимость экспрессии данного гена на уровне белка от интенсивности клеточных делений в изучаемой ткани, • при этом в покоящихся клетках 21Д7 антиген' не обнаруживался bobcq (Smith et al., 1988). В животной системе данный ген экс-прессируется на примерно одинаковом уровне всеми раковыми клетками, как мутантными turn-, так и tum+, которые способны образовывать опухоли в сингешшх животных (Lirquin et al., 1989). В той же работе было показано, что транскрипты гена Р91Л наблюдаются и в обычных тканях - например, в клетках печени и селезенки мыши, однако в гораздо меньием количестве. Существуют данные, что исходная tum+ линия раковых клеток мыши и мутантная tun- линия Р91 характеризуются очень быстрым делением клеток (Uyttenhove et al., 1983). Поэтому повышенная экспрессия гена Р91Л у обоих раковых линий хороио согласуется с предположением о связи данного гена с клеточным делением.

Выделение кДНК моркови, соответствующей гену cpd 21D7, позволило получить специфический зонд для изучения экспрессии данного гена на уровне мРНК у растений, чтобы подтвердить связь между работой гена и пролиферацией клеток.

Для изучения экспрессии в тканях моркови, 10-дневные растения, разрезали на 6 частей: семядоли, участок стеблевой меристемы с окружающими тканями, гипокотиль, верхнюю часть корня с адвентивными корешками, нижнюю часть корня и кончик корня. Наибольшее количество мРШС гена cpd 21D7 наблюдалась в кончике корня"II в клеточной суспензии моркови, находящейся на экспоненциальной фазе роста, именно этим клеткам соответствовала наиболее высокая интенсивность делений. Самый низкий уровень экспрессии оказался в семядолях, дифференциация и рост которых к 10-му дню уже закончились. Количество продукта экспрессии в зоне стеблевой меристемы оказалось низким, видимо, из-за того, что сами меристематические клетки составляли не более IX собранной ткани. Вдоль корпя уровень экспрессии повы-

¡ваяся ш зоне образования адвентивных корней, где также происходило активное деление клеток. Таким образом, стало ясно, что экспрессия изучаемого гена на уровне ыРНК в растительных тканях прямо зависела от уровня клеточных делений.

Экспрессия гена cod 21D7 во время ростового никла клеточной суспензии C.roseus. •".;..

Соответствующую кДНК C.roseus выделили из библиотеки «ДНК клеток барвинка, находящихся на S-фазе клеточного цикла, которую сконструировал И.Кто (Ito eb al., 1991). Скрининг примерно 2x100000 литических бляпек фагов лямбда gfcll проводили с помощью радиоактивно помечено» кДНК DC13. Таким образом, мы £зо луч или к ДНК' C.roseus размером около 1600 п.о., которая затем £ыла использована в качестве зонда при гибридизации с ыРНК. Данная кДНК была названа CR8 (от Catharanthus roseus).- .

Ростовая кривая несинхроннзироваиной клеточной . суспензии C.roseus представлена в нижней части рис,Ц• Первые два дня клетки находились в лаг-фазе, затеи со 2-го по 4^-й день наблюдалась фаза экспоненциального роста (log-фаза), с 5-?-го дня рост замедлялся к к концу 6-7-му дню наступала стационарная фаза (Aaino et al ., 1983). Данная система была использована для исследования динамики содержания мРНК гена cpd 21D7. Результаты гибридизационного анализа, представленные в верхней части рис.3 .показали, что во время лаг-фазы, когда пролифе- . рация клеток не происходила, наблюдалось очень низкое содержание мРНК. Уровень экспрессии гена cpd 21D7 резко возрастал со . * 2-го по 4-й день во время фазы экспоненциального роста, сопро-

вождавшейся наиболее высокой активностью клеточных делений. Затем начиная с 5-го дня (конца экспоненциальной фазы) экспрессия гена начинала падать вместе с уменьшением клеточной пролиферации и достигала наименьшего уровня в начале стацио-! парной фазы роста. Таким образом, в интенсивно делящихся клет-

' ках наблюдалось значительное увеличение транскрипции гена,

i Прекращение экспрессии гена cod 21D7 при блокировании

; клеточного никла v C.roseus в результате голодания.

I Этот вывод еще раз получил подтверждение в эксперимен-

; rax с клетками, деление которых было приостановлено в резуль-

тате голодания, но жизнеспособность сохранялась на прежнем

- 17_-

0 12 3 4

5 6 7 8 дни

Рис.4. Экспрессия гена срс1 2107 на уровне мРНК в ходе' ■ ростовой кривой клеточной суспензии С.говеиз.

уровне, и клеточный цикл был заблокирован в фазе; Наши данные свидетельствуют, что в этих экспериментах уровень экспрессии гена срс! 2Ю7 резко уменьшался по сравнению с контрольными клетками, находящимися в экспоненциальной фазе роста. Если деление опытных клеток полностью останавливалось, то экспрессия изучаемого гена на уровне мРНК такие прекращалась полностью. Таким образов, любая остановка клеточного цикла приводила к резкому падению экспрессии данного гена, и активность гена ре-

- 48 -

гулировалась на уровне транскрипции.

Изменение уровня экспрессия гена ор<1 21Р7 в зависимости от фазы клеточного никла у • синхронно делядихся |<летоц С.гоБеиз. " • \

Чтобы выявить связь иевду экспрессией гена cpd 2Ю7 на уровне мРЫС и прохождением клетками разпых фаз цикла, мы решили использовать два способа, первый - это синхронизация деления клеток с помощью удаления ауксина. При этом за 2 суток,голодания клеточный цикл блокировался преимущественно на фазе (на рис.4 это точка "-2,4-Д"), а затем в питательную среду добавляли 2,4-Д. В такой системе синхронизация первого деления клеток достигала 70-В0Х Шо еЬ а1., 1991) . Синтез ДНК в этой системе наблюдался с 3 по 14 час после добавления ауксина, а деление клеток происходило с 17 по 20 час.

Согласно данным на рис оказалось, что низкий уровень экспрессии гена ср(1 2Ю7 наблюдался у клеток в фазе на среде без ауксина. Уже через 10 нннуг после добавления гормона экспрессия резко, почти в 3 раза, возрастала н сохранялась на высоком уровне в течение всей 01 и Б фаз. Дополнительное увеличение количества мРНК наблюдалось в середине Б фазы, затем в начале 02 фазы содержание мРНК таи же резко падало до низкого уровня, существующего у клеток на среде без ауксина, и оставалось на этом уровне во время митоза. Подобная быстрая реакция, на гормон в виде скачкообразного усилеиия экспрессии другого гена ранее наблюдалось при индукции деления протопластов табака с помощью ауксина (ТакаЬаз111 е1 а1., 1989). ; ' При использовании второго способа - двойного фосфатного

I 1 голодания - клеточный цикл также сначала блокировался на й1

I фазе в результате голодания, а затем второе добавление фосфата

! приводило к синхронному запуску синтеза ДНК и клеточному деле-

( нию. Оказалось, что ген cpd 2107 экспрессировался на невысоком

' = уровне в голодающих клетках во время й1 фазы, затем после до-

.'! бавления фосфата в следующие 4 часа фазы количество мРНК

' умень' члось. Через 8 часов при подготовке клеток к Б фазе и во

, ¿1 время Б фазы содержание мРНК возрастало, после чего снова

1 уменьшалось в начале фазы и до конца интоза.

V Различия в характере экспрессии гена cpd 21Б7 ва уровне

.

-2,4-Д О 2 5 8 11 14 17 20 24 член

Время культивирования (часы)

Рис.5. Экспрессия гена ср(1 2№7 на уровне мРНК при прохождении клеточного-цикла, синхронизация деления клеток была достигнута методом ауксинового голодания.

- 20 - ' , ' . . мРНК во время Gl фазы в обеих системах можно объяснить специфическим действием ауксина на регуляции транскрипции гена.

В обеих системах синхронизации деления после запуска клеточного цикла клеткам требовалось'примерно одинаковое время (около 8 часов) иа прохождение всей Gl фазы и подготовку к па-чалу синтеза ДКК - S фазе. Конто было сделать общие выводы о фазоспецифическои экспрессии гена cpd.21D7, не зависящей от способа синхронизации клеточного цикла. Максимальная экспрессия данного гена происходила в ходе S фазы, после ее окончания в начале G2 фазы наблюдалось резкое снижение количества мРНК гона cpd 21D7. Далее уровень экспрессии гена сохранялся, на низком уровне до конца митоза.

мРШ£ гена cpd 21D7 представляла собой коротко вввущий продукт, что также подтверждалось наличием нескольких ЛТТТ участков в последовательности ее кДНК иа 3' нетранрлируемом конце. Считается (Shaw and Kamen, 1986), что присутствие таких последовательностей увеличивает нестабильность нРНК, приводя к уменьшению ее периода полураспада.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

■ ; Использованные в работе методы позволили выделить кДНК

и изучить экспрессию нового растительного гена cpd 21D7, кодирующего ядерный антиген, который наблюдается только у интенсивно делящихся клеток in vivo и in vitro. Изучение последовательности иуклеотидоа кДНК позволило выявить в банке данных ".ходний животный ген, активно экспрессирующийся в раковых клетках мыши. Высокий уровень сходства между растительным и « нивохным генами позволяет предположить консервативность функ-

: ции, которую выполняют в клетках продукты этих генов. Подобный

i высокий уровень сходства характерен также для генов, участвую-

I щих в контроле клеточного цикла, в частности, растительных и

I человеческих генов p34/cdc2 протеинкиназы и генов циклинов,

'< которые могут успешно работать у дрожжей (Hurse, 1990; Hirt et

al., 19Q1). '

3 Тканеспецифический тип экспрессии иа уровне мРНК, ха-

рактериый для cpd 21D7, также соответствовал типу, свойствен' ноиу генам, участвующим в проховденш- клеточного цикла, напри-

ыер, гену РСНЛ растений (Suzuka et al., 1989), генам циклииов (Hunt, 1991), или генам гистонов (Slttman et al., 1983). Регуляция работы этих генов в клеточном цикле обычно осуществляется на уровне транскрипции (Hurse, 1991), поэтому для них свойственно резкое изменение количество мРНК в зависимости от фазы клеточного цикла. Аналогичная динамика содержания продуктов транскрипции в ходе клеточного цикла наблюдалась и для гена cpd 21D7.

Об участии продуктов данного гена в регуляторных процессах косвенно свидетельствовали несколько фактов: 1. крайне низкая концентрация соответствующих мРНК и белка даже в активно делящихся клетках; 2. наличие одной копии данного гена и в вивотнбм, и в растительном геноме; 3. ядерная и ядршковая локализация 21Д7 антигена. Повышенная экспрессия данного гена во время S фазы и резкое уменьшение количества транскрнпта после ее окончания позволили предположить его участие в процессе репликации ДНК, или в процессинге pPIIK в ядрышках. Однако, имеющиеся данные недостаточны для более точных утверждений, поэтому для выяснения роли гена cpd 21D7 необходимы дальнейшие исследования. Представляется крайне интересным изучить экспрессию данного гена при соматическом эмбриогенезе, т.к. регуляция этого процесса связана со специфическими изменениями характера клеточных делений.

выводи

1. Создана экспрессионная библиотека кДШС моркови в фаге лямбда gtll, сконструированная на основе поли(Л)+РШС из клеточной суспензии на экспоненциальной фазе роста.

2. Выделены кДШС моркови и C.roseus , соответствующие новому растительному гену cpd 21D7, кодирующему антиген 21Д7, наблюдаемый в ядрах быстро делящихся клеток.

3. Определение последовательности кДШС н ее сравнение с последовательностями из банков данных позволило выяиить сходный мутаптный животный ген, который кодирует tum- трансплантационный опухолевый антиген Р91Л клеток мастоцитоиы мыши. Функция продукта данного гена неизвестна, однако траскрипцпя этого гена усилена в раковых клетках по сравнению с нормальными, а

любые мутации, затрагивающие определенный участок данного гена приводят к иммунологическому распознаванию и отторжению мутан-тных клеток in vivo.

4. Определен размер мРНК, соответствующей гену cpd 21D7, который оказался близким к размеру транскрипта сходного животного гена.

5. Установлена прямая зависимость экспрессии гена cpd 21D7 на уровне мРНК в разных тканях проростка моркови от активности клеточных делений, наибольшее количество мРНК содержится в интенсивно делящихся клетках кончика корня,.

6. Динамика уровня экспрессии данного гена на разных фазах ростовой кривой в асинхронных клеточных суспензиях C.roseus подтверждает, что активное клеточное деление сопровождается усиленной транскрипцией гена. Остановка клеточных делений и блокирование клеточного цикла на Gl фазе приводит к прекращению экспресии гена cpd 21D7, что свидетельствует о регуляции активности данного гена на уровне транскрипции.

7. Эксперименты по исследованию экспрессии гена на уровне мРНК при синхронизации клеточного деления показали, что транскрипция происходит фазоспецнфически. Наибольшее количество мРНК наблюдается во время S фазы, затем в начале G2 фазы содержание мРНК существенно уменьшается и сохраняется на низком уровне вплоть до конца митоза. Быстрые изменения количества мРНК подтверждают короткое время жизни данного продукта.

8. Резкое усиление транскрипции при синхронизации клеточного цикла с помощью ауксина свидетельствует о специфическом регуляторном действии гормона на активность гена cpd 21D7.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.Моисеева H.A., Джаиикашвили Н.И., Смит М.В., Бутенко Р.Г. Модельная система для изучения закономерностей развития соматических эмбриоидов в культуре тканей растении // Цитология. - 1987.- Т.29. - N 8. - С.1093-1094

9 Смит М.В., Моисеева H.A. Эффективность соматического эмбриогенеза в клеточных суспензиях разных сортов и линий моркови // Биология культивируемых клеток и биотехнология. - Новосибирск. - 1988. - С. 250-251.

- ЙЗ -

3.Смкт К.З., Яююшмйггя Н.Н.. Коисчзва Н.А. Иетод многократного Фракционирования суспенгкоппоЛ культуры клеток мориорк для получения соматическая зародышэй я возисллссти ¿го практического использования // Адаптацнсызая изменчивость растений при пятрсдукцип. - Рига: Зинатяэ. - 1993. - С. 105-103.

4.Моисеева И.А., Дкашшатпилп М.Й., Смит М.В. Иигибиру-юще действие высокой плотности клеток и кондиционированной среды иа развитие соматических зародышей моркови // Адаптационная изменчивость растений при интродукции. - Рига: Зинатне. - 1990. - С.109-113.

5.Bufcenko R.G., Holseeva II.A., Smith M.ff., Djanikashvllly H.I. Specific proteins as markers for somatic enbryogenosis in carrot cell suspension culture // Abstr. 4th Int. Congress of Cell Biology, Montreal, Quebec, CanaJa, Aug. 14-19. - 198B. - P.12.7.21

6. tioiseeva K.A., Djanikashvily M.I., Smith M.W. A comparative analysis of protein patterns received from carrot somatic embryos at different stages of development// Abstr. Yllth Internat. Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam, June 24-29, 1990. - B4-78. - P.260.

7. Smith И.Л., Djanikashvily H.I., Moiseeva N.A. Different conditioning effects observed in embryogenic suspension cultures of carrot cultivars// Abstr. Yllth Internat. Congress on Plant Tissue and Cell Culture, Amsterdam, June 24-29, 1990. - B4-111. - P.268.

8. Смит И.В., М.Ито, А.Комамине. Изучение нового гена; связанного со скоростью клеточных делений у растений и млеко-питащих//Новые методы биотехнологии растений, I Всесоюзный симпозиум, 20-22 ноября 1991, г.Пущино, -С.96-97.

Smith H.W., M.Ito, A.Komamine. Л novel gene dependent on cell proliferation in plants and rnanmals// Plant Biotechnology and Molecular Biology. 1st Symposium "Trends in Plant Biotechnology", USSR, November 20-22, 1991.- Pushchino. -P. 189-190 _

- Or^