Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Развитие зародыша пиона in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Развитие зародыша пиона in vivo и in vitro"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Ботанический институт им. В, Л. Комарова

На правах рукописи j^fyp^&K^ii,

БРЮХИН ВЛАДИМИР БОРИСОВИЧ

РАЗВИТИЕ ЗАРОДЫША ПИОНА I N V I V О И IN VITRO

03.00.05 - Ботаника

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург . 10ЭЗ

с '

- г -

Работа выполнена в Ботаническом институте им. К Л. Комарова РАН (Санкт-Пэтербург).

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Т. Б. ЕАТЫГИНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Е. А. МИРОСЛАВОВ кандидат биологических наук, доцент Л. А. ЛУТОВА

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский химико-фармацевтический институт,

, Зашита диссертации состоится "¡5" 1993 г,

в ¡¿/^ часов на заседании специализированного ученого совета К 002.46.01 по присуждению ученой степени кандидата биологи-• ческих наук при Ботаническом институте имени В. Л. Комарова РАН по адресу. 197376, С. -Петербург, ул. Проф. Шпова, 2, НИН. зал Ученого Совета.

С диссертацией можно ознакомиться, в библиотеке Ботанического института им; Е Л. Комарова РАЕ

Автореферат разослан "/' 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. С. ЮДИНА

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Для разработки научных основ сохранения и рационального использования растительных ресурсов, а также подхода к управлению морфогенезом необходимо изучение нормального протекания репродуктивных процессов и .выявление закономерностей половой и бесполой репродукции. Особую актуальность приобретает изучение эмбриологических осноз семенной репродукции у редких' и исчезающих видов растений, к ним относятся и представители рода Paeonta, являющиеся ценными декоративными и лекарственными растениями, девять видов которого занесены в Красную Книгу. Монотипный порядок Pasoniales, стоящий в основании филогенетического древа, интересен с точки зрения систематики и общей теории эмбриогенеза

В настоящее.время накоплен большой материал по биологии, морфологии, а такжз по отдельным аспектам эмбриологии пионовых (Sax. 1932; Dark, 1936; Stern, 1946; Яковлев, 1S51, 1958; Яковлев и Иоффе, 1057, 1960, 1965; Cave et al., 1961; Walters, 1962; Carniel, 1967; Жгенти, 1974, 1978; Батыгина, Бутенко, 1981; Ly Thi Ba, 1981).

Видам рода Равома присущ уникальный для покрытосеменных тип эмбриогенеза, который был впервые описан Ы. С. Яковлевым (1S51). Автором было показано, что при этом типе эмбриогенеза деление ядра зиготы не сопровождается заяояздием клеточных перегородок, в результате чего образуется ценоцитная, а впоследствии ценоцитно-клеточная структура, на которой формируется множество зародышей, но лишь один из них раззивается до зрелого полового зародыша в семени. Согласно концепции Т. Е Ба-тыгиной о системах размножения у цветковых растений (Batygina, 1989, .1990), в зрелом семени пиона формируется соматический, а не половой зародыш. Его 'образование схож с дифференциацией змбриоида на эмбриональном клеточном комплексе в кадлусной культуре in vitro. В связи с этим эароднш пиона является прекрасной моделью для исследования соматического эмбриогенеза in si tu, in vivo и in vitro.

Однако в настоящее время праотически отсутствуют детальные данные о генезисе соматического зародыша в семени пиона, дискуссионными остаются вопросы все ли клетки прозмбрио пиона могут быть инициальными клетками эмбриоидов, чем характеризу-

ютс'я эти клетки, почему в конечном итоге в семени остается только один зародыш, сходно ли развитие соматических зародышей в условиях in vivo и in vitro.

Дель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явился сравнительный цитоэмбриологический анализ развития соматического зародыша • в семени пиона in vivo и в культуре in vitro. Исходя из этого были определены следующие задачи:

1. Детально изучить развитие зародыша в семени пиона in vivo.

2. Оптимзировать питательную сроду для получения морфогенеза в культуре in vitro и идентифицировать пути морфогенеза

3. Изучить процесс формирования соматических зародышей (змбри-оидов) в культуре in vitro.

4. Сравнить процесс формирования соматического зародыш, полученного in vitro, с зародышем в семени пиона

Научная новизна. Идентифицированы клетки эпидермиса в апикальной части ценоцитно-клеточного проэмбрио, дащие пачало эмбриоидам. Показано, что развитие эмбриоидов в семени пиона in vivo идет в соответствии с эмбриогенезом Asfcerad-типа Penasз-вариации. Выявлены некоторые морфофизиологичесгае корреляции между накоплением органических веществ (белков, углеводов) и стадиями развития зародыша, эндосперма и окрулащих структур при формировании семени пиона

В культуре in vitro получен прямой соматический эмбриогенез из поверхностных слоев гипокотиля и семядолей изолированных зародышей из семени Paeonia anómala и проростков, полученных в культуре in vitro. Определено сходство и различие при формировании эмбриоидов в семени пиона in vivo и в культуре in vitro, что шкет внести вклад в дальнейшую разработку классификации систем репродукции растений.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведанные исследования еще раз подтвердили уникальность развития зародыша у пионоз, идущего в два этапа, с переходом с полового на бесполый путь репродукции. В этой связи особый интерес представляют полученные впервые детальные данные о процессе заложения эмбриоидов на ценоцитпо-клеточном предзародьше в семени пиона Сравнительное изучение зародышей пиона in vivo и in vitro (в динамике) расширяет наш! знания о развитии соматического заоодыша в естественных условиях и в культуре in

vitro, что интересно для понимания различных аспектов эмбриогенеза пиона, а также теоретических основ соматического эмбриогенеза (эмбриоидогенеза).

В результате дальнейших работ с культурой ткани на базе наших исследований по соматическому эмбриогенезу пиона in vitro есть реальная возможность разработать технологию масс-зонального размножения этого ценного лекарственного и декоративного растения, а также получить лекарственные препараты пиона.

Апробация работы. Основные положения работы докладывались на IV Конференции молодых ботаников С. -Петербурга (1992 г.), на XII Международном конгрессе по половому размножению растений (Columbus, Ohio, USA, 1992 г.), на молодежной конференции ботаников стран СНГ "Актуальные проблемы ботаники" в Апатитах (1993 г.), на III съезде Всероссийского общества физиологов ■растений в С.-Петербурге (1993 г.). на II Международной конференции "Биология'культивируемых клеток растений и биотехнология" в Алма-Ате (1993 г.) и на научных семинарах отдела эмбриологии и репродуктивной биологии БИН.

Публикации. Ш теме диссертации опубликовано б печатных работ.

Струга1 ура и объем работы. Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, заключения и с :иска цитированной литературы; включает 2 таблицы, 103 иллюстрации. Список литературы содержит 196 библиографических ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ '

Объектами исследования были два вида пиона - Paeonta anomal a L. и Paeonia lacti flora Pall.. растущие в саду Санкт-Петербургского Ботанического института им. Е Л Комарова РАЯ Отсчет стадий развития зародыша производили с момента искусственного опыления цветка. Семязачаток и семена изучаемых видов фиксировали темпорально ежедневно до опыления и в течение 45-50 суток со дня опыления в даэ - августе 1991 - 1993 года Экспланты и кусочки каллуса при работе с культурой ткани также фиксировали темпорально через каждые пять дней с момента их высадки на питательную среду. В качестве фиксирующей лай-

- б -

кости использовали смесь ФМ (7:7: 100) и смесь Карнуа (3:6:1).

Обработка материала производилась по общепринятой цитоэм-бриологической методике (Прозина, 1970). Срезы для постоянных препаратов приготовлялись толщиной 12-15 мкм с помощью ротационного микротома. Для окраски постоянных препаратов использовали фуксин-сернистую кислоту по (Еёльгену и сафранин по Кар-тису; для подкраски гематоксилин по Зрлиху, лихт-грш и алциа-новый синий. Окраску проционовыми красителями производили для одновременного обнаружения белков (ярко-синий RS) и нерастворимых углеводов (ярко-красный 2BS) 'Иванов и Литинская, 1967). Гистохимическое определение содержания полисахаридов клеточных оболочек и запасног крахмала осуществлялось ШИК-реакцией (Дженсен, 1965).

Материал для исследований с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) был зафиксирован в 2,57. глюгаральде-гиде, приготовленном на фосфатном буфере с 2X сахарозы, рН*7.0, обезвожен и переведен в изоамшювый эфир уксусной кислота Затем материал высушивали методом критической точки, на него напыляли золото и просматривали на сканирующем электронном микроскопе JSM-35C марки JOEL.

Для работы с ' культурой ткани использовали только вид Paeonia anómala. Эксплантами служили следующие органы: лист, стебель, тычиночная нить, эндосперм и зародыш (эмбриоид) из семени пиона на разных стадиях развития (23-50 дней после опыления). Дня стерилизации листьев, стеблей и тычиночных нитей применяли 10% раствор гипохлорита натрия NaDCl; перед вычленением зародышей плоды, содержащие семена, стерилизовали путем опускания в этиловый спирт и легкого обжига на спиртовке.

В качестве основной среды применяли модифицированную питательную среду Ы/расиге и Скуга (ЫС) (Murashige & Skoog, 1S62) . Для улучшения инициации 1?аллусообразования концентрацию макросолей в среде уменьшали вдвое (ДО/2). В качестве регуляторов роста использовали ауксины: индолилуксусную кислоту (ЛУК), 1-нафтилуксусную кислоту (НУК) и 2.4-дихлорфе-ноксиуксусную кислоту (2,4-Ю и цитокинины: кинетин и 6-бензи-ламинопурин (ВАЛ) в концентрации (0.1-2.0 мг/л) в сочетании друг о другом, либо отдельно. Каллусы поддерживались регулярным ежемесячным пересаживашшем на свежую среду.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Развитие зародыша сопряжено с окружающими его структурами семязачатга и семени, поэтому исследование было начато характеристикой семязачатка.

Строение семязачатка nimm и оплодотворншз

Семязачаток пиона является аяатропным, двупокровным, крассинуцеллятпым, что отмечалось ранее (Walters, 1362; Яковлев, Иоффе, 1S65). Внутренний интегумент двух-трехслойный, образует интегументальный тапетум, наружный интегумент многослойный, фуникулус хорошо выраженный с проводящим пучком, который заходит в наружный интегумент. Нуцэллус в зрелом семязачатке имеется лишь в латеральной зоне в виде 1-2 слоев, разрушающихся вскоре после оплодотворения, и в виде нуцеллярпого колпачка с остаткам! париетальной ткани, а также в области ха-лазы. Нуцеллярная ткань над микропияярной частью зародышевого мешка и в области халазы сохраняется ешэ после оплодотворения. Микропиле образовано обоими штегумзнташ и имеет вид изогнутого |?аиала

Зрелый зародышевый мешок 7-клеточный, 8-ядерный; яйцевой аппарат' состоит из яйцеклетки и двух синергия. Яйцеклетка несколько крупнее скнергид и слегка вдается в полость зародышевого мешка Базальнке концы сянергид характеризуются наличием нитчатых аппаратов и имеют клювовидные выроста В халазаль-ной части зародышевого мешка обычно расположены три довольно крупные клеиет-антиподы. Слияние полярных ядер в центральной клетке происходит до оплодотворения. Развивается зародышевый мешок по Polygonum-rmy.

У изученных видов оплодотворение происходит на 2-5 сутют после опыления. Эндосперм развивается по нукдеарному типу, причем деление первичного ядра эндосперма предшествует делении зиготы. Результаты гистохимического анализа показывают, что зигота, ' как и яйцеклетка, имеет повышенное содержаще белка.

- 8 -

РАЗВИТИЕ ЗАРОДЫША ПИОНА in vivo

Ценоцитиая стадия эмбриогенеза

Деление зиготы наступает вскоре после одного или двух делений центральной клетки и не сопровождается заложением клеточной перегородки. Образуется двуядерный ценоцит. Цитоплазма этой двуядерной клетки более или менее равномерно вакуолизиро-вана, а ядра характеризуются большим количеством хромоцентров. Затем наступает второе деление. Ядра делятся синхронно. Формируется 4-ядерный ценоцит. Ядра нмеиг слегка неправильную конфигурацию. На стадии четырехядернсто проэмбрио эндосперм Р. arómala содержит уже 16 ядер, которые пока распределены более или менее равномерно по полости зародышевого мешка. У Р. lactiflora, по-видимому," темп делений ядер эндосперма несколько более быстрый. Затем происходит еще деление и возникает 8-ядерный ценоцит. Вакуоли в цитоплазме предзародышевого ценоцита сливаются, образуя более крупные вакуоли. В конце коицов, образуется одна большая вакуоль в центре ценоцита, а ядра постепенно занимают периферическое положение, цитоплазма многоядерного проэмбрио также распределяется по периферии. Ядра эндосперма тоже выстраиваются вдоль стенок зародышевого мешка и вплотную прилегают к самому проэмбрио.

Ценоцитное состояние проэмбрио пиона длится 13-15 дней после опыления. К концу ценоцитной фазы нуцеллус сохраняется i только в виде остатков нуцедлярного колпачка в микропилярной

части и нуцеллярной колонки в халаэальной части семени. Начинается разрушение внутреннего интегумента в центральной части . зародышевого мешка.

Данные гистохимического анализа показывают, что самое большое содержание белка в эндосперме и проэмбрио, много также белка во внутреннем и наружном интегументах. Однако, к концу ценоцитной стадии в наружном интегументе и нуцеллусе окрашиваемый проционовыми красителями белок почти полностью исчезает, намного меньше становится его и во внутреннем интегументе. Крахмальных верен Bcicope после оплодотворения больше всего в нуцеллусе, много их также в наружном и внутреннем интегументах. К концу ценоцитной стадии вместе с разрушением нуцедлуса в нем резко сокращается и содержание крахмальных зерен, при

этом небольшое увеличение последних происходит в клетках инте-гументов, вероятно за счет перераспределения крахмала

Цеиоцитю-клеточная стадия эмбриогенеза

По достижении предзародьпвем пиона определенной критической массы, на стадии приблизительно 400-500 ядер, между ними начинается заложение клеточных перегородок. У Р. arómala это происходит на 15-18 день после опыления, а. у P. lactiflora несколько позже, примерно, на 18-10 день после опыления. 3." о-хение меточных перегородок у обоих видов происходит в базипе-тальном направлении, от периферичесгаэй части прозмбрио к центру с постепенным уменьшением объема центральной вакуоли. В момент заложения клеточных перегородок в пристенном слое цитоплазмы прозмбрио между ядра?,я появляется множество довольно крупных вакуолей, отдельные ядра выстраиваются во второй ряд вдоль наружной границы ценоцита

В образовавшейся ценоцитно-клеточной структуре, благодаря лериклинальным делениям периферических клеток, на 19-21 день после опыления начинает асинхронно закладываться эпидермальный слой, ¡слетки которого отличаются более густой цитоплазмой и слепса увеличенными ядрами. Заложение клеточных стенок в прозмбрио и обособление зпидермы можно считать • признаками его дифференциации.

Характерно, что у обоих видов процесс цитокинеза в эндосперме иногда совпадает по времени с цитокинезом в прозмбрио, а иногда происходит чуть позже. У P. lacti flora процесс клеткообразования в эндосперме, так .то как и. в прозмбрио, происходит несколько позже по сравнению с Р. anómala.

На этой стадии развития нуцеллус уже полностью дегенерирует, за исганочением остатков нуцеллярного колпачка; продолжается резорбция внутреннего интегумента, элементы которого сохраняются лишь в микропилярной и халазалыгой частях.

Результаты гистохимического исследования показывают, что на этой фазе эмбриогенеза по прежнему большое содержание белка в прозмбрио и эндосперме, а также во внутреннем интегументе. Происходит резкое увеличение содержалия крйхмала в наружном интегументе и уменьшение во внутреннем. В эндосперме, как и на предыдущих стадиях, крахмала не обнаружено.

- 10 -

Таким образом, завершается формирование полового ценоцитно-клеточного проэмбрио.

Инициация эмбриоидов на базе цзноцитт-;аеточного проэмбрио и начальные фазы их развития

После заложения клеточных перегородок в ценоцитном проэмбрио и обособления эпидермального слоя начинается дифференциация инициальных клеток будущих эмбриоидов (соматических зародышей). Эти клетки выделяются с&оим меристематическим характером. Они имеют утолщенную оболочку более густоокрашенную цитоплазму, крупное ядро с повышенным содержанием нуклеиновых кислот. Гистохимические исследования выявили также, что эти клетки содержат больше белка, чем окружающие их клетки.

Согласно проведенному исследованию, заложение эмбриоидов на базе ценоцитно-клеточного проэмбрио у обоих видов происходит экзогенным путем за счет периклинальных делений эпидермального слоя на стадии примерно 1500-1600 ядер проэмбрио, преимущественно в апикальной части ценоцитно-клеточной структуры. Отмечено, что время заложения этих эмбриоидов и темпы их развития неодинаковы. У Р. апота1а инициация последних на поверхности ценоцитно-клеточного проэмбрио происходит раньше (на 22-24 день после опыления), чем у РЛасЫПога (на 23-30 день после опыления), при этом на поверхности одного проэмбрио Р.апопв1а закладывается меньше эмбриоидов (7-10) по сравнению с Р. 1асЫПога (9-17). Несмотря на заложение столь большого количества эмбриоидов, до состояния двусемядольного соматического зародыша, который мы находим в зрелом семени пиона, развивается обычно только один из них, остальные же гибнут на ранних стадиях развития (как правило, на стадии нескольких клеток). Иногда на одной ценоцитно-клеточной структуре вогут довольно долго формироваться, не погибая, нестолько эмбриоидов. Были отмечены отдельные случаи наличия двух полностью сформированных эмбриоидов в зрелом семени Р. алота]а

Установлено, что развитие большинства эмбриоидов подчинено определенным закономерностям: эыбриоиды образуются из одной эпидермадыюй клетки в основном апикальной части ценоцитно-клеточного проэмбрио, первое деление поперечное, оно приводит к образованию апикальной (са) и базальной (сЬ) клеток. В

дальнейшем апикальная клетка делится поперечной (слегка наклонной) перегородкой, а базадьная дает начало двум клеткам -средней m и самой нижней клетке cl. Каждая верхняя клетка (производная са) делится перегородкой, ориентированной перпендикулярно к первой вертикальной стенке, образуя стадию квадрантов, формируется ярус q. Затем, на стадии октантов, выделяются ярусы 1 и Г. Еерхяий ярус впоследствии образует семядоли зародыша. Клетка m дает начало гипокотилю и шшциалиям плеромы корня. Баэалыш клетка (cb) принимает значительное участие в. общем построении тела развивающегося зародыша. Развитие зм6;и-оида в семени пиона идет в соответствии с эмбриогенезом /sterai-типа Яелаеа-вариации по системе Джогансена (Johansen, 1950).

С этой стадии происходит постепенная потеря тургора в це-ноцитно-клеточной структуре, лизис внутренних клеток и уменьшение ее объема, вплоть до почти полного исчезновения этой структуры в зрелом семени.

Таким образом, на описанной стадии развития происходит клонирование, то есть образуется массовое количество соматических зародышей, формирующихся бесполым путем из соматичесгок клеток (Batygina, 1990; Batygina, Tltova & Brukhin, 1992). Это является аналогичным тому, что наблюдали в культуре m vitro Haccius (1S69); Crouch (1982), Maheswaran и Williams (1984), когда половой зародыш образовывал из поверхностных слоев клон соматических зародышей, или эмбриоидов, а сам впоследствии дегенерировал. Еа определенном этапе развития зародыш пиона происходит смена путей морфогенеза: замена эмбриогенеза на эмбриоидогенез.

Несмотря на большое количество эмбрноидов (до 17 у P. lacti flora), возникающих'на ранних этапах клонирования, в зрелом семени пиона содержится обычно лишь один двусемядольный эмбриоид. Нам также приходилось наблюдать многочисленные сбои и отклонения от описаной закономерности ( Asterad-тт Репава-вариация) при развитии змбриоядов. Вполне вероятно, что эти отклонения и являются одной из причин гибели большинства эмбриодов в развивающемся семени.

К моменту инициации эмбриоидов в семени внутренний инте-гумент практически отсутствует, за исключением небольших его остатков в микропилярной части, начинается постепенная дегра-

дация наружного интегумента Наибольшее содержание белка по прежнему продолжает оставаться в эндосперме и зародыше, особенно много его в инициальных клетках эмбриоидов; также значительное количество белка присутствует в остатках внутреннего интегумента, начинает появляться белок и в формирующейся к этому моменту кожуре семени. Крахмала очень много в наружном интегуыенте (до 20 крупных зерен на одну клетку), в остатках внутреннего интегумента и в эндосперме крахмал не обнаружен. На стадии инициации эмбриоидов в ценоцитно-клеточной структуре появляется большое количество транзиторных форм углеводов. По-видимому, последнее связано с притоком пластических и энергетических веществ к зародышу для дальнейшей инициации и последующего развития на его базе зародышеподобных структур.

Поздние фазы развития эмЗрюадоя е сет ни пиона

С самого момента заложения и до полного завершения своего формирования эмбриоид сохраняет связь с породившей его предза-родышевой ценоцитно-клеточной структурой. На стадии глобулы (26-35 дней после опыления) он прикрепляется к ней небольшой ножсой, толщиной в несколько клеток. На этой стадии развития происходит формирование эпидермалыюго слоя эмбриоида, в зоне, где позже будут закладываться семядоли, наблюдаются перикли-нальние деления. Обращает на себя внимание некоторая асимметрия при развитии эмбриоида В этой фазе развития происходит исчезновение крахмала из наружного интегумента, а в эндосперме продолжается процесс клеткообразования. в центральной его части.

Вскоре после глобулярной стадии происходит дифференциация семядолей и эмбриоид в семени пиона вступает в сердечюэвидную стадию развития (35-38 день после опыления). На стадии сердечка происходит дальнейшее сжимание и лизис ценоцитно-клеточной структуры, практически полностью отсутствует внутренний инте-гумент, иногда сохраняются лишь небольшие его остатки в ыикро-пилярной части, продолжается разрушение наружного интегумента. при этом из него полностью исчезает крахмал. В эндосперме на этой стадии все ещэ идет процесс клеткообразования, центральная часть эндосперма содержит полость. В эндосперме появляется жир.

По мере роста семядолей и удлиннения прокамбиальных тяжей змбриоид переходит в стадию торпеды (38-40 день после опыления). Эмбрноид на этой стадии имеет неярковыражонный апекс побега шириной примерно в 8-10 клеток На этой стадии развития ценоцитно-клеточный проэмбрио практичеаси полностью деформирован и разрушен, от него остаются лишь небольшие тяжи возле микропиле. Постепенно исчезает и ножка, которой змбриоид прикрепляется к породившей его ценоштно-клеточной структуре. На стадии торпедовидного эмбриоида эндосперм полностью клеточный, в центре его иногда сохраняется очень небольшая полость, почти весь объем семени занят массивным эндоспермом, оставляя на долю зародыша (эмбриоида) лишь небольшую часть в области микропиле. Внутренние слои наружного интегумента практически полностью лизированы. периферические же слои еще сохраняются, причем эпидермальные клетки увеличены в размере и заполнены танинами, последние окрашиваются сафранином в красно-коричневый цвет. Таким образом, в формировании семенной ¡сожури принимает участие только наружный интегумент.

Итак, проведенные исследования еще раз показали , что зрелое семя пиона содержит соматический зародыш (змбриоид).

РАЗБИТИЕ ЗАРОДЫША ПИОНА В КУЛЬТУРЕ in vitro

Поведение ломового проэмбрио и эмбриоидов m сешни пиона в культуре, индукция каляусогеяеаа

Проэмбрио Paeonia anómala, вычлененные на ценоцитно-клеточной стадии и глобулярные змбриоиды Сшщ неспособны развиваться ни на одном варианте сред и гибли в течение двух недель. Змбриоиды из зрелых семян на безгормональной среде почти всегда образовывали проростки через 7-10 дней культивирования.

Змбриоиды, изолированные на стадии ранней торпеды или сердечка (апекс побега еще морфологически не выражен), формировали проростки на той же безгормональной среде не более чем в 25Х случаев. Способность эмбрисидов из семени Р. anómala раа-виваться только со стадии сердечка еще раз подтверждает факт, что они становятся автономными, начиная со стадии начала дифференциации семядолей (Батыгина и Васильева, 1SB7; BatугIna S Vs11yeva, 1988).

- 14 -

Каллусогенез лучше всего индуцировала НУК в сочетании с БАП, при добавлении их в питательную среду. Были испробованы несколько концентраций НУК (0.1-2 мг/л) и БАП (0.1-2 мг/л) в различных сочетаниях. Установлено, что каллусообразование лучше всего шло на среде Ш с дважды уменьшенной концентрацией макросолей (МС/2), содержащей 1 мг/л НУК и 0. 5 или 1 мг/л ЕАП. На указанной выше среде сердечковидные эмбриоиды набухали и через три недели формировали светлый рыхлый каллус в 60Т. случаев, каллус появлялся сначала на гипокотиле и семядолях,' а потом и по всему эыбриоиду. То же самое происходило и с торпе-довидныш э[-1бриоидамл только в 80Х случаев. Эмбриоиды из аре-лых семян образовывали каллус на этой среде почти в 100Х случаев.

Первичный каллус на экспланте был более светлый, чем ста-' рый каллус, анатомо-гистологические исследования показали, что он составлен в основном силыювакуолизированными удлиннешшыи червеобразными клетками, свойственными паренхимной ткани.

Образование каллуса на экспланте начиналось в течение 7-14 дней со дня высадки эмбриоидов на среду, перед этим последние сильно набухали, увеличиваясь в размерах. Через 1. 5-2 месяца каллус отделялся от поверхности эксплалта и культивировался независимо от материнской ткачи. С каждым пассажем каллус становился все более рыхлым и немного более темного цвета После нескольких пассажей характер клеток, составляющих каллус, также изменялся, появлялись не только вытянутые паренхиме клетки, но и участки, сложенные из небольших округлых зернистых клеток. В некоторых случаях поверхность каллуса приобретала глобулярную или складчатую форму, наблюдались признаки гистогенеза, например, дифференциация эпидермы в отдельных участках или формирование элементов проводящей системы, которые располагались как регулярно, так и иррегулярно в толще каллуоной массы.

На сред®, содержащей 0.5 мг/л БАП без ауксина, у сформированных эмбриоидов происходило сильное развитие семядолей, часто наблюдалась поликотилия, при этом рост корня нередко замедлялся. Сердечковидные и торпедовидные эмбриоиды иногда образовывали каллус на этой среде.

Наилучший рост светлого рыхлого пассируемого каллуса происходил на МС среде, содержащей повышенную концентрацию аукси-

нов, - 2 мг/д 2.4-Д и 5 мг/л НУК. в сочетании с О. б мг/л БАЛ. Однако, каллус на такой среде хорошо пролиферировал и ншсогда не давал морфогенеза, оставаясь все врем светлым и рыхлим. Каллус,пассируемый на среде, которая использовалась для индукции каллусогенеза (1 мг/л НУК и О. 5 мг/л или 1 мг/л БАЩ, через несколько пассажей проявлял способность к морфогенезу.

Соматический эмбриогенез (эк/бриоидогенез) и органогенез

Каллус, полученный на МС или Ш/2 среде, содержащей 1 мг/л НУК и 0.5 мг/л или 1 мг/л БАП через некоторое время культивирования, как уже отмечалось, становился немного темнее. Когда такой каллус помещали на среду с пониженным содержанием ауксинов и цитокининов ( 0. 5 мг/л НУК и 0. 25 мг/л БАЛ) или на безгормонадьную среду, через некоторое время на каллусе начиналось формирование гарней.

Рыхлый светло-коричневый или желтоватый 1саллус по ле трех-четырех пасоажвй образовывал на своей поверхности почки -монополярние структуры, имеющие сосудистую связь с породившей их материнской тканью, на среде индукции каллусогенеза. содержащей 1 мг/л НУК и О. 5 мг/д или 1 мг/л БАЛ. Обычно после длительного культивирования такой каллус темнел и погибал, хотя в отдельных случаях, при переносе кусочков каллуса о образовавшимся на них почками на безгормональную среду, начиналось также формирование корней и таким, образом происходил геммори-зогенез.

Ризогенез (образование корней) происходил как на свету, так и в темноте, а геммогенеа (образование почек) наблюдали только на свету.

Когда рыхлый светло-коричневый каллус, прошедший зрев серию пассажей, оставляли без пересадки на среде, содержащей 1 мг/л НУК и 0.5 мг/л или 1 мг/л БАП. он становился эмбриоидо-генным и был способен формировать соматические зародыши (эыб-риоиды) - биполярные структуры, не имеющие" сосудистой связи с материнской тканью каллуса с самого начала их возникновения и до завершения своего формирования.

Гистологический анализ эмбриоидогенного каллуса показал, что эмбриоиды возникали преимущественно из зпкдермальшдс меток каллуса Эти клетки имели меристематический характер и от-

личались плотной цитоплазмой, относительно крупным ядром, небольшими размерами и утолщенными клеточными стенками. Вероятно, образование эмбрюидов на каллусе, также как и в семени, подчинено определенным закономерностям. Хотя проследить их генезис в культуре in vitro было намного сложнее, чем в семени in vivo, так как каллус является искусственной несбалансированной системой, в которой нет строго ориентированной оси развития эмбриоида, поскольку отсутствуют стабильные морфофизио-. логичесгае градиенты, подобные тем, что присутствуют в зародышевом мешке. Поэтому здесь более часто встречаются сбои и аномалии в залолении и развитии змбриоида. Тем не менее, были обнаружены двуклеточные, с поперечным заложением клеточной стенки, четырехклеточные, 16-кдеточные эмбриоиды. Причем, начальные стадии их развития очень напоминают начало заложения эмб-риоидов на ценоцитно-клеточном проэмбрио в семени пиона: ' первое деление инициальной клетки происходит поперечной перегородкой, образуются Изобилатеральные тетрады при развитии эмбриоида, слаборазвитый суспензор, апикальная и базальная 1слетки принимают примерно равное участие в построении тела эмбриоида.

Гистологический анализ и данные СЭМ показывают. что эмбриоиды часто формируются в складках эпидермального слоя каллуса, при этом, такие эмбриоиды имеют более правильную форму и более пропорциональные размеры, чем эмбриоиды, формирующиеся на поверхности каллуса вне складок. Возможно это объясняется тем, что сами слои кадлусной ткани, окружающие складку, в которой формируется эмбриоид, в некоторой степени создают физические условия, аналогичные тем, что возникают вокруг зиготи-ческого зародыша в семязачатке покрытосеменных in vivo (Rao & Uarayaswami, 1372).

Глобулярные эмбриоиды, имеющие отчетливо сформированную эпидерму, с последующим ростом дифференцируются в организованные сердечковидные, а затем торпедовидные структуры с npoitaM-биальной связью между апексом корня и семядолями.

На одном кусочке каллуса, как правило, находились эмбриоиды на разных стадиях развития, то есть их формирование шло асинхронно. Данные СЭМ показывают, что на каллусе образовывались как двусемядольные эмбриоиды, напоминающие эмбриоиды в семени in vivo, так и многолопастные аномальные, встречавшиеся довольно часто.

- 17 -

Зрелые змбриоиды были белого цвета и обычно несколько большего размера, чем змбриоиды из сформированного семени Р. anómala. Они легко отделялись от кадлусной массы, так itaK при созревании эмбриоида в месте его прикрепления формировался отделительный слой иг темноокрашенных дегенерирующих клеток.

После перенесения на безгормональную среду или среду, содержащую БАЛ. змбриоиды начинали прорастать при этом характер прорастания был сходен с таковым для эмбриоида из зрелого семени пиона Иногда на БАП-содержащей Ш среде на поверхности эмбриоида пел вторичный соматический эмбриогенез в области семядолей и гипокотиля. Однако, процент прорастания внешне сформированных in vitro эыбриоидов был невысок, что связано, вероятно. с большим количеством аномалий при развитии эмбриоидов и нарушением пространственно-временных корреляций в формирующемся эмбриоиде. что в конечном счете ведет к блоютрованию генетических программ, ответственных за его прорастание.

Примечательно, что неморфогенный пассируемый каллус никогда не образовывал ни почек, ни эмбриоидов при переносе его на безгормональную среду, либо среду, содержащую 0.S мг/л БАЛ без ауксина, в то время как среда с содержанием 0.5 мг/л БАП стимулировала соматический эмбриогенез на уже эыбриоидогенном каллусе. Таким образом,' для индукции соматического эмбриогенеза в каллусе Р. anómala, по-видимому, необходимо присутствие как ауксина, тш и цитокинина, что обеспечивает формирование первоначальной оси развития соматического зародыша (Brawley et al., 108-4), по аналогии с инициацией ауксином вместе с цитоки-нином морфологической полярности при эмбриогенезе в семени покрнтосеменных (Przybullok & Nagl, 1977).

Прямой сотттестя эмбриогенез С энбриоидогенез)

На среде, содержащей 0. 5 мг/л БАП, ранние торпедовидные змбриоиды и эмбриоида из полиостью сформированных семян Р. anómala набухали. Иногда через 3-5 недель культивирования на этой среде на поверхности набухших эмбриоидов отчетливо дифференцировались зародышеподобные структуры с округлыми сеыядоле-подобными бугорками и широким местом прикрепления к родительской ткани. Эти зародышеподобные структуры фактически являлись вторичными эыбриоидами. Обычно юс можно было наблюдать

на семядолях и гипокотиле первоначального эмбриоида-экспланта из семени. Вновь образовавшиеся зародышеподобные структуры (или эыбриоиды) развивались как биполярные-образования и имели стеблевой и корневой апексы, а также центральную ось и напоминали эмбриоиды из семени пиона ¿n vivo и зиготические зародыши других двудольных растений. Как правило, описываемые эмбриоиды in vitro, формировались прямо из поверхностных слоев первоначального эмбриоида семени без образования промежуточного кал-, луса, хотя позже на поверхности экспланта иногда наблюдалось, небольшое количество каллуса. • который инициировался уже. после того как вторичный эмбриоид был сформирован. Схожие данные получены для Brassica napus (Crouch, 1982) и для Trifolium repens, Tri Toll um pratense и Medí cago sativa (Maheswaran & Williams, 1984) на среде MC, содержащей БАЛ.

Проростки Р. anómala, полученные на безгормональной среде MC или МС/2 при перенесении их на среду, содержащую 0.5 мг/л БАП, также образовывали эыбриоиды из поверхностных клеток семядолей и гипокотшш. Глобулярные эмбриоиды развивались далеё в сердечковиднке. Здесь также не наблюдалось сосудистой сеязи между материнской тканью исходного эмбриоида и вторичным эмб-риоидом на всех стадиях его развития. Картина формирования большого количества эмбриоидов на поверхности развитых семядолей проростка P. anomal а была очень сходна с картиной образования большого количества соматических зародышей из поверхностных слоев стебля Ranunculus sceleratus iñ vitro, которую наблюдали Коппаг и Mataraja (1965).

Таким образом, можно отметить, что Р. anómala в культуре способен как к непрямому соматическому эмбриогенезу (с предварительной дедифференциацией клеток, образованием пассируемого каллуса, отдельные клетки которого впоследствии.переходят на путь эмбриомдогенеза), так и к прямому соматическому эмбриогенезу (без дедифференциации клеток первичного экспланта и "кал-лусообразов"шя). При этом, для формирования соматических за-" родыше*. (эмбриоидов) из кадлусной массы необходимо присутствие в среде и аукгчна и цитокинина, тогда как в случае прямого соматического эмбриогенеза образование эмбриоидов на экспланте стимулируется одним лишь цитокинином (БАЛ) на безауксиновой. среде. Должно быть, в последнем случае в пррцесс соматического ' эмбриогенеза вовлекается эндогенный ауксин» синтезируемый са-

мим эксплантом.

Надо сказать, что в отдельных случаях приходилось наблюдать прямой соматический эмбриогенез на поверхности гипокотиля эмбриоида и проростка па безгомональной среде, что лишний рад свидетельствует о высотой тотипотентности клеток пиона и сохранении тенденции к клонированию на достаточно поздних этапах онтогенеза.

Погано змбриоидов из семени Р. алопа1а, в работе использовались также и другие экспланты: тычиночная•нить, эндосперм на различных стадиях развития семени, а также сегменты листа и стебеля. Удалось получить каллус из всех вышеперечисленных эксплантов, кроме эндосперма, на МО среде, содержащей ауксин в сочетании с цитокинином. Однако выход каллуса из эксплантов взрослого растения был намного меньше, чем из змбриоидов семени: не более 10% из листа и стебля и около 25% из тычиночной нити; каллус из этих органов обычно быстро погибал. Более или менее пассируемый 1саллус удалось получить из тычиночной нити и совсем немного из лисга. При переносе на безгормональную среду такой каллус тоже часто формировал корни, однако ни почкообра-зование, ни соматический эмбриогенез ни разу зафиксированы не были. Возможность пролиферации каллуса в таких органах как тает, стебель и тычиночная нить говорит о достаточной степни тотипотентности их клеток Однако неспособность каллуса из этих органов пиона к почкообразованию (геммогенезу) и соматическому эмбриогенезу свидетельствует о том факте, что полной дедифференциации уже достаточно специализированных Iслеток этих органов в культуре все же не происходило.

ВЫВОДЫ

1. Развитие зародыша в семени пиона идет в два этапа; первый этап завершает образование ценоцитно-клеточной структуры полового прозмбрио; второй этап включает формирование змбриоидов (клонирование) на базе этой структуры. То есть системе репродукции пиона свойственна смена путей морфогенеза: замена эмбриогенеза на эмбриоидогенез.

2. Формирование змбриоидов в семени пиона происходит асинхронно экзогенным способом (из шгеток эпидермиса) преиму-

- 20 -

щественно в апикальной части проэмбрио.

3. Развитие змбриоидов идет в соответствии с эмбриогенезом Asterad-ттг Рвпава-вариации.

4. Выявлен ряд.морфофизиологичесгапс корреляций между развитием зародыша и окружающими его тканями семязачатка и семени.

5. В культуре Р. arómala идентифицированы следующие пути морфогенеза - эмбриоидогенез, органогенез (геммо- и ризогенез) и гистогенез.

6. Шлучен прямой (из тканей экспланта) и непрямой (из тканей каллуса) соматический эмбриогенез (эмбриоидогенез) in vitro при культивировании проростков и соматических зародышей из зрелого семени. Установлено, что для инициации прямого со-матуеского эмбриогенеза необходимо присутствие в среде культивирования цитокшшна (БАЛ), а для инициации непрямого соматического эмбриогенеза - как цитокинина (БАЛ), так и ауксина (НУК).

7. Выявлено большое сходство при формировании змбриоидов в семени пиона in vivo и в культуре in vitro (образование змбриоидов из клеток эпидермиса, характер их развития, форма' змбриоидов и др.).'