Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики

Рафикова, Эльвира Рустамовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Отдел физических методов измерений НИИ физико-химической биологии

им. А. Н. Белозерского

На правах рукописи

РАФИКОВА ЭЛЬВИРА РУСТАМОВНА

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ТЕРМОИНДУЦИРОВАННОЙ АМОРФНОЙ АГРЕГАЦИИ НА ПРИМЕРЕ БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ВИРУСА ТАБАЧНОЙ

МОЗАИКИ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2004

Работа выполнена в отделе физических методов измерений НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Е. Н. Добров,

кандидат физико-математических наук, В. А. Драчев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Г. Б. Завильгельский

доктор биологических наук, профессор В. В. Месянжинов

Ведущая организация: институт биохимиии им. А. Н. Баха

Защита состоится _ 2004 г. в на заседании

Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В течение длительного времени процессы агрегации белков рассматривались только как досадная помеха при изучении их свойств. Однако, в последние годы ситуация коренным образом изменилась [Fink. 1998; Horwich, 2002; Stefani et. al.. 2003; Wetzel, 1994, 1996]. Отчасти это связано с тем. что экспрессия белков в гетерологических системах часто приводит к их агрегации и к формированию так называемых тел включения. Но основной причиной взрывного увеличения интереса к процессам агрегации белков явился тот факт, что, как оказалось, развитие целого ряда важнейших заболеваний человека и животных сопровождается накоплением характерных крупных упорядоченных нитевидных белковых агрегатов. Эти агрегаты называются амилоидными и имеют сходную морфологию, хотя и состоят из разных белков. К числу таких заболеваний относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, диабет второго типа, прионовые инфекции и множество других. И на протяжении какого-то времени даже казалось почти доказанным, что именно амилоидные агрегаты являются причиной развития этих заболеваний.

Идентификация патогенных белков и пептидов, а также получение их агрегатов in vitro дали толчок исследованиям агрегации многих других белков и пептидов, не связанных с развитием тех или иных заболеваний. Оказалось, что в определенных (правда, как правило, чрезвычайно жестких) условиях, целый ряд абсолютно непатогенных белков и пептидов также обнаруживает способность к формированию амилоидных агрегатов. И, наконец, как показали работы последнего года-двух. вполне вероятно, что зрелые упорядоченные амилоидные нити на самом деле не являются патогенными, а токсическим действием обладают некие другие, неупорядоченные (аморфные) агрегаты белков и пептидов, в том числе и тех. для которых не показана связь ни с какими болезнями (Bucciantini et. al., 2002; Conway et. al.. 2000; Hartley et. al.. 1999]. Поэтому всестороннее изучение процессов формирования аморфных агрегатов белков представляется более чем актуальным.

Вследствие большого размера, гетерогенности и нестабильности, аморфные (неупорядоченные) агрегаты являются чрезвычайно неудобным объектом для исследования физико-химическими методами. Поэтому в настоящий момент весьма немного известно о механизмах такой агрегации,

разных авторов, неупорядоченной [Fink. 1998: Chi et. aL 2003]. нснативой [Wetzel. 1994]. макроскопической [Орлов и др.. 2001]. неспецифической [Орлов и др.. 2001] или аморфной [Fink. 1998: Bucciantini et. a.. 2002]. Л также о структуре белковых молекул, непосредственно включающихся в агрегаты, и о структуре самих агрегатов.

Вирус табачной мозаики (ВТМ)* давно используется в качестве модельного объекта в разных областях биологии. В частности, его белок оболочки (БО) оказался одной из классических моделей при изучении упорядоченной агрегации («полимеризации» белков). Хорошо известно, что субъединицы БО ВТМ образуют в растворе в зависимости от рН и ионной силы определенный набор упорядоченных агрегатов («полимеров») различной структуры (рис. I. [Butler. 1984]). В нашей лаборатории было, однако, показано, что БО ВТМ является удобным объектом и для изучения необратимой термоиндуцированной неупорядоченной (аморфной) агрегации [Dobrov el. al.. 1996: Орлов и др.: 2001]. Оказалось, что скорость неупорядоченной агрегации БО ВТМ может в очень широких пределах регулироваться путем изменения молярности буфера, концентрации белка и температуры [Орлов и др.. 2001].

Относительная простота получения БО ВТМ. возможность управлять скоростью агрегации и возможность останавливать ее почти в любой точке, явились основными аргументами при выборе этого белка в качестве модели для изучения термоиндуцированной аморфной агрегации.

Цель и задачи исследования. Целями нашей работы являлись выяснение структурных и кинетических механизмов термоиндуцированной необратимой аморфной (неупорядоченной) агрегации белков на модели БО ВТМ и поиск ингибиторов этого процесса.

В соответствии с этой целью были сформулированы следующие задачи: 1. Исследовать влияние условий среды (температуры. рН и ионной силы раствора) на характер термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ.

'Список сокращений и обозначений: ВТМ - вирус табачной мозаики. ВМТ - вирус мозаики томатов. Х-ВК - X вирус картофеля. БО - белок оболочки. ФБ - фосфатный буфер. ДСП -лодецилсульфат натрия. КД- круговой дихроизм. ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия. КС - коэффициент седиментации. Лш Изго) - мутность («поглощение» при 51 ?.(520) им]. Р(,- концентрация белка, ц - ионная сила буферного раствора, v™ - начальная скорость агрегации; к,- - константа скорости реакции первого порядка.

2. Исследовать структуру молекул БО ВТМ на ранних стадиях процесса

неупорядоченной агрегации.

3. Провести кинетический анализ кривых термоиндуцированной агрегации БО ВТМ. полученных с помощью метода турбидиметрии.

4. Исследовать влияние различных соединений на аморфную агрегацию БО ВТМ с

целью обнаружения возможных ингибиторов этого процесса.

5. Выяснить, является ли высокая склонность к аморфной агрегации уникальным свойством БО ВТМ или же она присуща и белкам оболочки других спиральных вирусов растений:

Научная новизна работы. Определена причина необычайно сильной зависимости гермоиндуцировнной аморфной агрегации БО ВТМ от ионной силы буферного расгвора. Исследованы кинетические характеристики процесса термоиндуцированной необратимой агрегации БО ВТМ. Показано, что кинетический режим этого процесса может изменяться при изменении температуры и концентрации белка. Идентифицированы участки молекулы, предположительно ответственные за инициацию аморфной агрегации БО ВТМ. Обнаружено, что аморфная (неупорядоченная) агрегация БО ВТМ эффективно ингибируется очень низкими концентрациями додецилсульфата натрия (ДСН). и что это ингибирование сопровождается дестабилизацией «внешней» части молекулы белка и стабилизацией ее «внутренней» части. Показано, что основные характеристики процесса термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ присуши и белкам оболочки родственных ему палочковидных вирусов растений, но не белку оболочки нитевидного X вируса картофеля (Х-ВК). Полученные результаты существенно расширяют наши представления о процессах аморфной агрегации и позволяют приступить к исследованию одной из центральных проблем «агрегологии»: определению соотношения между МУТНОСТЬЮ, коэффициентом седиментации и размером белковых агрегатов на разных стадиях процесса агрегации. Практическая значимость. Выяснение механизмов упорядоченной и неупорядоченной агрегации белков, обнаружение эффективных ингибиторов этих процессов in vivo и использование таких ингибиторов для лечения «амилоидных» заболеваний является конечной целью всех бесчисленных исследований агрегации белков, проводимых в настоящее время. Результаты данной работы показывают, что

БО ВТМ является весьма удобной моделью для изучения ряда важных характеристик процессов аморфной (неупорядоченной) агрегации.

Апробация работы. Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова и отдела физических методов измерений НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Результаты работы были также доложены на конференции «1st Tsinghua International Conference of Protein Science» (Пекин, Китай, 2001); на II Международном симпозиуме, посвященном памяти академика Н. М. Сисакяна и II Сисакяновских чтениях (Москва, Дубна, 2001); на Международных конференциях студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002» и «Ломоносов-2003» (Москва, 2002, 2003); на III съезде Биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002): на «The FEBS Summer School on Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease» (о. Спецес, Греция, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация, изложена на 155 страницах, иллюстрирована 42 рисунками и 2 таблицами.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Выделение вирусов и га белков оболочки. В работе использованы препараты дикого (U1) штамма ВТМ и его температуро-чувствительного по белку оболочки мутанта ts21-66. ВМТ и Х-ВК. Вирусы выращивали на растениях Nicotiana tabacum var. Samsun (ВТМ и ВМТ) и Datura stramonium L. (Х-ВК) и выделяли стандартными методами [Аграновский и др., 2002; Goldshtein et. al., 1990]. Выделение препаратов белков оболочки из вирионов U1 и ts21-66 ВТМ, и ВМТ проводили ацетатным методом [Fraenkel-Conrat. 1957], а выделение белка Х-ВК - солевым методом [Goodman, 1975].

Определение концентраций вирусов и их белков оболочки проводили спектрофотометрически. В случае светорассеивающих суспензий концентрации рассчитывали из истинных величин поглощения с помощью метода экстраполяции [Dobrov et. al.. 1977].

Измерения кинетики термоиндуиированной агрегации белков проводили на спсктрофомстрах «SPECORD UV-VIS» и «SLM-Aminco DW-2000» в термостатированных кюветах с длиной оптического пути 0.5-1 см при температурах 42о или 52°С и концентрациях белков от 0.01 до 0.4 мг/мл. Кювету с фосфатным буфером (и изучаемыми добавками) предварительно прогревали К) мин при указанных температурах и затем добавляли аликвоты белков до конечного объема 1 или 2 мл. Обычно использовали калий-фосфатный буфер, в экспериментах с ДСН -натрий-фосфатный. Образцы тщательно перемешивали («мертвое время» 15 сек) и измеряли кинетику прироста мутности - «поглощения» при 313 нм (/Iju) (на спектрофотометре «SPF.CORD UV-VIS». Германия) или 320 нм (А^а) (на спектрофотометре «SLM-Aminco DW-2000». США). Начальные скорости агрегации рассчитывали в оптических единицах в минуту (опт.ед./мин) из начальной линейной части кривых прироста мутности. Величины констант скорости первого порядка (к,) определяли как описано Б. И. Кургановым (2002). Данные обрабатывали с помощью программ «Origin 6.0» («MicroCal Inc.», США), «Scientist» («MicroMath». США).

Измерения спектров собственной флуоресиениии препаратов БО ВТМ проводили на спектрофлуориметре «Hitachi MPF-4» (Япония) в 1-см кюветах при концентрации белка 0,1-0.2 мг/мл. Для измерения спектров эмиссии в области 300-400 нм использовали )ч,о.,(;=280 нм. При измерении спектров БО ВТМ в присутствии ДСН использовали натрий-фосфатный буфер. В опытах с ДСН при комнатной температуре порядок добавления компонентов (белок и детергент) не влиял на получаемые спектры.

Спектры кругового дихроизма (КД) препаратов вирусов и белков в областях 198-250 и 250-300 нм измеряли на модифицированном дихрографе «Jobin-lvon Mark V» (Франция), управляемом компьютером. Сбор и обработку данных производили с помощью программ RDA и Wtest. разработанных в лаборатории. Измерения спектров в области 198-250 нм проводили в 0.1-см кюветах при концентрации белка около 0.2 мг/мл. а в области 250-320 нм - в 1-см кюветах при концентрации белка около 0.8 мг/мл. Измерение спектров КД БО ВТМ в присутствии ДСН проводили в тех же условиях, что и при измерении спектров собственной флуоресценции.

Измерения кинетики термической денатурации БО ВТМ методами флуоресцентной спектроскопии и КД. Кинетику изменения собственной флуоресценции при 320 нм и-сигнала. КД при 215 нм измеряли в идентичных условиях. Кювету с буферным раствором прогревали 10 мин при 42°С и лобавляли аликвоту белка до конечного объема 2 мл (в случае флуоресценции) или 1 мл (в случае КД). Образец тщательно перемешивали («мертвое время» составляло ]5сек). Для измерений флуоресценции использовали 1-см кюветы, для измерений КД - 0.5-см кюветы.

Ступенчатый прогрев препаратов белка. В опытах по ступенчатому прогрев} («плавлению») препараты белков (0,2 мг/мл) прогревали по 20 мин при последовательно повышающихся температурах в 1-см термостатированных кюветах спектрофотометра «^РЕСОЯБ ЦУ-УК» и затем измеряли спектры поглощения в зоне 240-350 нм. Величины «поглощения» при 313 нм откладывали против соответствующих значений температуры и величину температуры агрегации рассчитывали как температуру, соответствующую 50% максимального прироста оптической плотности. Опыты по флуоресцентному и КД.«плавлению» поводили таким же образом. В опытах по флуоресценции препараты прогревали в 1-см термостатированных кюветах, спектры измеряли в зоне 300-400 нм. В опытах по КД «плавлению» использовали 0.1-см термостатированные кюветы, спектры измеряли в зоне 198-250 им.

Аналитическое ультраиентрифугирование образцов БО ВТМ проводили на ультрацентрифуге «Весктап К» (США), оборудованной сканером и мультиплексной оптикой при длинах волн от 280 до 350 нм. при 20°С и скоростях вращения от 2 000 до 40 000 об/мин. Расчет коэффициента седиментации производили обычным методом [Аграновский и др.. 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Более или менее крупные белковые агрегаты обладают повышенной способностью рассеивать падающий свет по сравнению с молекулами нативного белка. Поэтому агрегацию белков удобно регистрировать методом турбидиметрии при тех длинах волн, при которых сам белок уже не поглощает. Препараты БО ВТМ с концентрацией выше 0,01 мг/мл в ходе прогрева, например, при 52°С В ФБ. рН 7,0-8.0 дают большой и хорошо воспроизводимый прирост мутности («поглощения» при 313-320 нм). причем прирост мутности происходит без лаг-фазы. Для 0.133 мг/мл БО

ВТМ наблюдается прирост поглощения от практически 0 ло 0.8 опт.ед. в течение примерно 15 мин. после чего наступает коагуляция- (рис. 2). Большинство экспериментов по термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ мы проводили в калий-фосфатном буфере при 520С. Нами был выбран 50 мМ ФБ, рН 7,0, поскольку именно при этих условиях БО ВТМ in vitro наиболее эффективно осуществляет свою главную биологическую функцию - специфическое «одевание» собственной РНК с образованием полноценных инфекционных вирионов [Butler. 1984]. А при температуре в 50 мМ ФБ, рН 7.0 выход кривой агрегации БО ВТМ с концентрацией 0.2 мг/мл на плато и коагуляция белка наступали не слишком быстро, и не слишком медленно - через 12-15 мин после начала эксперимента. Зависимость_т е р м о и н

Стопки дисков 27S, 37S

аморфной агрегации БО ВТМ от условий среды.

Хорошо известно (рис. 1. [Butler, 1984]), что в растворе БО ВТМ в зависимости от рН и ионной силы образует целый ряд детально исследованных упорядоченных агрегатов («полимеров») - 4 S-белок (смесь мономеров, тримеров и пентамеров). 20 S-агрегаты (двухслойные диски или двухвитковые фрагменты вирусоподобной спирали) и реполимеризованный белок (длинный вирусоподобный спиральный полимер).

На рисунке 2 представлена зависимость «поглощения» при 313 нм от времени прогрева при 52°С для БО ВТМ (0,133 мг/мл) в 50 мМ фосфатной смеси при различных значениях рН. Видно, что при понижении рН с 8.8 до 6.3 начальная скорость агрегации уменьшается в

несколько раз. При рН 5.6 (оптимальные условия для формирования

0.8

0.6

0.4

0.2

№ппимериюваннь)й белок

''20SÄ1OK

4S-6enoK

з* щ &

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 pH

Рис. 1. Фазовая диаграмма агрегационных

форм Б 0 в т м [ В ш ) е г ]984]

спирального ремолимера) скорость афегации заметно увеличивалась (рис. 2). и кривая прироста мутности изменяла свою форму (линейная часть сильно уменьшается). Вероятно, при этих условиях субъединицы БО ВТМ подвергаются неспецифической агрегации по иному механизму, чем при значениях рН, оптимальных для существования 4 S и 20 S-агрегатов.

Как было показано ранее [Орлов и др., 2002], начальная скорость афегации БО ВТМ очень сильно зависит от молярности ФБ (рис. 3). При прогреве при 52°С препаратов БО ВТМ при концентрации ФБ<20 мМ. прироста мутности вообще не наблюдалось, но в интервале от 30 до 70 мМ начальная скорость агрегации возрастала едва ли не на порядок при увеличении концентрации буфера на каждые 10 мМ. Максимальная достигалась в 150-200 мМ ФБ. При более высоких молярностях начальная скорость агрегации уменьшалась. Аналогичная зависимость (только при более высоких значениях молярности) наблюдалась и в буфере Трис-HCl. рН 7.0.

Кинетический анализ кривых агрегации БО ВТМ показал, что они следуют экспоненциальному закону (см. ниже). Оказалось (рис. 4). что в интервале от 20 до 70 мМ ФБ. рН 7.0 величины константы скорости реакции псевдопервого порядка (к,) укладываются на классическую линейную положительную зависимость Бренстеда . но с необычно большим углом наклона.

Молекулы БО ВТМ имеют pi около 4.5. На их поверхности имеется четыре области электростатических взаимодействий и несколько гидрофобных кластеров. Из приведенных данных о зависимости аморфной агрегации БО ВТМ от ионной силы раствора с рН 7,0 следует, что электростатическое оттапкивание молекул БО ВТМ. обусловленное отрицательными зарядами на их поверхности, оказывает сильное ингибирующее действие на их термоиндуцированную агрегацию. Повышение ионной силы приводит к нейтрализации зарядов и резкому увеличению начальной скорости процесса неупорядоченной агрегации.

Чрезвычайно сильную зависимость от ионной силы обнаруживает не только начальная скорость агрегации, но и конечный размер образующихся агрегатов. В 10 мМ ФБ аморфная агрегация ограничивается ~- 30 S-агрегатами при 52°С и ~ 5 000 S-агрегатами при 80°С. Увеличение молярности буфера приводит к образованию существенно более крупных агрегатов с коэффициентом седиментации около 4104S в 40 мМ ФБ и преципитирующих 6-104 S агрегатов при молярности ФБ > 50 мМ.

Из этих данных следует, что в случае БО ВТМ (как и многих других белков [Fink, I998]) основной движущей силой аморфной агрегации являются гидрофобные взаимодействия, но сильное электростатическое отталкивание белковых субъединиц ингибирует этот процесс. Столь сильная зависимость скорости неупорядоченной агрегации БО ВТМ от ионной силы раствора должна отражать тонкий баланс между взаимным отталкиванием молекул, определяемым-мощными электростатическими силами, и их взаимным притяжением, определяемым сильными гидрофобными взаимодействиями поверхностей частично-денатурированных молекул белка. Кинетика термической денатурации БО ВТМ. Согласно данным рентгено-структурного анализа [Namba et. al.. 1986] субъединица БО ВТМ состоит из классического пучка из четырех -спиралей, расположенного в вирусной частице вблизи оси вириона и менее упорядоченной части, расположенной ближе к поверхности вириона, на расстояниях более 65 от его оси (рис. 5). «Внешняя» часть молекулы содержит значительное число гидрофобных остатков, образующих так называемый гидрофобный гребень недалеко от поверхности вириона. В составе гидрофобного гребня (или вблизи от него) располагаются и все имеющиеся в молекуле БО ВТМ остатки тирозина (2, 70. 72, 139) и триптофана (17, 52, 152).

При комнатной температуре БО ВТМ имеет спектр КД в области 200-250 нм типичный для белков с таким высоким содержанием а-спиралей - с отрицательным максимумом при 208 нм ([0]го8= -16 300 градсиГ-дмоль"1) и плечом при 222 нм (рис. 6). БО ВТМ имеет классический для глобулярных белков спектр собственной флуоресценции с мощным пиком при 320 нм (см. рис. 13). Описанная выше структура молекулы БО ВТМ дает возможность проследить отдельно за денатурацией четырехспирального пучка (по спектру «дальнего» КД в области 200-250 нм) и за денатурацией «внешней» части молекулы (по спектру флуоресценции или по спектру «ближнего» КД в области 250-300 нм).

Ранее было обнаружено, что вирионы

nil по».

ВТМ обладают чрезвычайно высокой стабильностью, а молекулы свободного белка оболочки денатурируются

черезвычайно легко [Орлов и др.. 2001]. Потеря биологической активности БО ВТМ и его денатурация по данным ДСК. измерений спектров флуоресценции и спектров КД в области 250-300 нм происходили уже при 40-42°С. При этих же

л« ^и ^ »и «и температурах субъединицы БО ВТМ А, нм

приобретали и способность к

Рис. 6. Спектры КД в «дальнем» УФ

препарата БО ВТМ (0.2 мг/мл) при термоиндуцированной аморфной агрегации.

ступенчатом прогреве в 10 мМ ФБ. рН 8.0. в то же время оказалось, что наблюдаемая в течение 20 мин при указанных

температурах. (Переход в «-10 000°- денатурация структурно является лишь форму»).

-10000 -15000 -20000

— 80°

72.2°

50.0°

45.5°

. \ .1 40.7°

35.6°

л 31.4°

25.0°

Уа охлажденный/ tfc' / xff

■

l * ^ * z' ■......

является лишь частичной - в области 200-250 нм величина кругового дихроизма при 42°С уменьшалась меньше чем наполовину (при 208 нм с -16 300° до -10 0 0 00). и больше уже не падала вплоть до 90°С (рис. 6). Таким образом, термоиндуцированной аморфной агрегации подвергаются не полностью, а частично денатурированные молекулы БО ВТМ («-10 000° - форма») [Орлов и др., 2001]. Согласно рассчетам с использованием формулы Гринфельда-Фасмана [Greenfield and Fasman, 1969] при переходе из нативной «-16 300° - формы» в частично-развернутую «-10 000° - форму» молекула БО ВТМ сохраняет примерно половину исходного содержания а-спиралей. При этом температура денатурации БО ВТМ слабо зависит от ионной силы буфера и концентрации белка.

С целью изучения структурных изменений на ранних стадиях агрегации, мы исследовали кинетику термической денатурации БО ВТМ.

Мы измеряли в идентичных условиях кинетику денатурации БО ВТМ по изменению сигнала КД при 215 нм и по уменьшению интенсивности флуоресценции при 320 нм. Для исследования структуры субъединиц белка на ранних стадиях процесса термоиндуцированной агрегации мы подобрали условия, при которых денатурация БО ВТМ проходит не слишком быстро. но опережает образование крупных. сильно

рассеивающих свет агрегатов. (БО ВТМ очень быстро переходит в агрегированное состояние, и даже на ранних стадиях разворачивания молекулы мы имеем дело с агрегированным материалом (КС более 50 S)).

На рисунке 7 вместе представлены кинетика изменения и в ходе

термической денатурации в процентах от общего изменения. На основании этих

термической денатурации БО ВТМ

данных можно выделить несколько стадий в ходе необратимой термоиндуцированной

Рис. 7. Кинетика изменения I320 (интенсивности флуоресценции при 320 нм)

денатурации БО ВТМ (а молекула этого белка состоит из всего лишь 158 аминокислотных остатков!). На первой стадии (менее 15 секунд «мертвого времени» в наших условиях) происходит утрата примерно половины исходной величины собственной флуоресценции при 320 нм и примерно 25% исходной величины КД при 215 нм. Затем, в течении примерно двух минут, наблюдается полная потеря «нативной» флуоресценции, т.е. полное разупорядочивание «внешней» части молекулы. Еще через 2-3 мин завершается частичное разупорядочивание четырехспирального пучка, и белок переходит в так называемую «-10 000°-форму». То есть, около половины структурных изменений, приводящих к формированию стабильной «-10 000°-формы», происходит менее чем за 15 секунд. Формирование аморфных агрегатов БО ВТМ инициируется значительно раньше, чем завершается переход в «-10 000°-форму». Полученные данные, по нашему мнению, позволяют предположить, что инициация неупорядоченной агрегации БО ВТМ происходит за счет аберрантных межсубъединичных гидрофобных взаимодействий-разупорядоченных «внешних» участков молекулы,- составляющих гидрофобный гребень и включающих остатки Туг и Тгр. При комнатной температуре эти участки ответственны за мощные латеральные и аксиальные межсубъединичные взаимодействия, обеспечивающие формирование упорядоченных агрегатов белка и вирионов ВТМ.

Кинетический анализ термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ.

Мы провели кинетический анализ кривых агрегации БО ВТМ, полученных с помощью метода турбидиметрии, при температурах 42°С. которая соответствует температуре (частичной) денатурации белка, и 52°С и различных концентрациях белка ([Р]о). Мы исходили из предположения, что прирост величины у4з2о (мутности) пропорционален количеству агрегированного белка, и анализировали завершающие стадии процесса, не рассматривая начальные участки кривых. Использовали уравнение для реакций первого порядка, предложенное Б. И. Кургановым (2002):

А = А„т {1-ехрГ-*, (/-*,)]}, (1)

где I - время. А,1т - предельное значение А при I—>оо, 1п - значение t при котором .-1=0, к, - константа скорости реакции первого порядка.

Оказалось, что термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ присуши следующие кинетические характеристики:

1. Кривые прироста мутности, полученные при 52°С. во всем изученном интервале концентраций белка (0.02-0.3 мг/мл), а при 42°С в области относительно низких концентраций (0.01-0.04 мг/мл) на заключительной стадии очень хорошо описываются уравнением (1) (рис. 8, а-в). То есть прирост мутности на заключительной стадии следует кинетике реакции 1 порядка.

2. Полученные значения константы скорости реакции первого порядка линейно увеличиваются с ростом начальной концентрации белка (рис. 9), следовательно, к, следует рассматривать как константу скорости реакции псевдопервого порядка.

3. При 42°С в области более высоких концентраций, величины к,, стремятся к некому предельному значению, и при концентрации 0,3-0,4 мг/мл кривые в координатах {Л/Дт:/} сливаются в общую кривую со временем полупревращения около полуминуты (рис. 8. г).

[ Р ]0 , мг/мл I Р )0, мг/мл

Рис. 9. Зависимость к, от концентрации белка при аморфной агрегации БО ВТМ при 52°С (й) и 42°С (б) в 50 мМ ФБ. рН 8.0.

а б

Н (Р„) »8 (Р0)

Рис. 10. Зависимость логарифма начальной скорости аморфной агрегации БО ВТМ при 42°С (я) и 52°С (б) от логарифма концентрации белка. 50 мМ ФБ, рН 7.0.

4. Начальная скорость v,"™ агрегации пропорциональна квадрату концентрации белка при 52°С, во всем изученном интервале концентраций белка, а при 42°С в области относительно низких концентраций (рис. 10).

Исследование термоиндуцированной денатурации БО ВТМ показало, что при 52°С весь белок к моменту начала регистрации агрегации (спустя 15 секунд «мертвого времени») находится в частично денатурированном состоянии, то есть стадия частичной денатурации при этих условиях не является-скоростьлимитирующей. Что касается 42°С, то подобное заключение можно считать справедливым только для области относительно низких концентрации белка (0,010.04 мг/мл).

Моделью, способной описать полученные экспериментальные данные, оказалась модифицированная модель nucleation-dependent polymerization [Oosawa and Kasai, 1962]. Эта известная модель в ее исходном варианте включает две обратимые стадии: стадию образования ядра агрегата (стадию нуклеации) и стадию роста агрегата. Мы предположили, что, во-первых, стадия нуклеации является необратимой и протекает очень быстро по сравнению со стадией роста агрегата, которая также необратима; и, во-вторых, что концентрация ядер остается неизменной в ходе агрегации.

Исследования кинетики аморфной агрегации БО ВТМ при разных температурах и концентрациях белка показали, что кинетический режим этого процесса может изменяться при изменении указанных парамеров.

При 52° при всех использовавшихся концентрациях белка процесс частичной денатурации протекает значительно быстрее, чем рост агрегатов, поэтому скоростьлимитирующей всегда является именно стадия роста агрегатов.

При 42°С кинетический механизм агрегации оказывается разным при разных концентрациях белка. При низких значениях [Р](, частичная денатурация протекает

достаточно быстро, и скоростьлимитирующей стадией агрегации остается стадия роста агрегата, которая в завершающей фазе следует кинетике реакции первого порядка. Величина кг при этих является линейной функцией концентрации белка. При высоких значениях скоростьлимитирующей стадией процесса агрегации

становится стадия частичной денатурации белковой молекулы. Если денатурация протекает как необратимая мономолекулярная реакция, то агрегация в завершающей

фазе следует кинетике реакции первого порядка, причем величина к, остается постоянной при варьировании концентрации белка.

Поиск возможных ингибиторов термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ. Широкий набор исследованных нами анионов, катионов, нуклеотидов, аминокислот и других соединений не вызывал ингибирования термоиндуцированной неупорядоченной агрегации БО ВТМ. Не давали искомого эффекта и такие известные ингибиторы агрегации других белков, как дитиотреитол. тетрациклин, гепарин. Даже исследованные нами малые белки-шапероны (Hsp 16.3 из Mycobacterium tuberculosus и а-кристаллин из хрустатиков крупного рогатого скота), ингибирующие агрегацию многих других белков, оказались неактивны в нашей системе. Возможно, это связано с отсутствием лаг-периода при аморфной агрегации БО ВТМ - шапероны просто не успевают конкурировать с частично-развернутыми молекулами БО ВТМ за сайты связывания.

Рис. 11. Влияние ДСН на аморфную агрегацию БО ВТМ (0,2 мг/мл, 11.5 дМ) при52°С. Кривая 1 - 50 мМ калий-фосфатный буфер. рН 7.0: кривые 2 50 мМ натрий-фосфатный буфер. рН 7,0. Кривые / и 2 - без ДСН. кривые З-"7 при молярных соотношениях [ДСН]:[БО]: 1:1: 5:1: 7:1; 10:1: 15:1 соответственно.

Рис. 12. Ингибирование агрегации БО ВТМ при 52°С в 50 мМ ФБ. рН 7.0. под действием ДСН при разных молярных соотношениях [ДСН):[БО]. Концентрация БО: 0,05 (Д). 0.1 (о), 0,2 (□) и 0.3 (+) мг/мл. Коэффициент корреляции для линейной части кривой - 0,991.

Единственным из исследованных агентов обнаруживающим ингибирующее действие (но зато какое!) оказался ДСН. Как видно из рисунка 11 низкие (от 0.0016% до 0.005%) концентрации ДСН вызывают уменьшение начальной скорости агрегации БО ВТМ и конечного значения мутности. Полное ингибирование агрегации наблюдалось при концентрации ДСП 0.005% (15 молекул ДСН на одну субъединицу БО. т.е. примерно 1 молекула ДСН на 10 аминокислотных остатков). КС препарата БО ВТМ. прогретого при 52°С в течение 30 мин в присутствии 0.005% ДСН остается равной примерно 3 S. что близко к КС препарата нативного белка. В опытах с использованием разных концентраций БО ВТМ обнаружено, что -эффект ДСН. скорее всего, определяется не его абсолютной концентрацией, а молярным соотношением [ДСН]:[белок], т.е. вероятно, вызывается прямым взаимодействием молекул ДСН с молекулами белка (рис. 12).

Как было показано выше, процесс термоиндуцированной аморфной агрегации БО ВТМ в наибольшей степени коррелирует с процессом денатурации, фиксируемой методом флуоресцентной спектроскопии. Как видно из рисунка 13, а, присутствие детергента не предотвращает разупорядочивания нативного окружения остатков Туг и Т^. В присутствии более высоких концентраций ДСН разупорядочивание «внешней» части молекулы БО ВТМ происходило уже при комнатной температуре (рис. 13. б). В таких опытах

одинаковое уменьшение интенсивности флуоресценции наблюдалось и в 10 мМ. и в 100 мМ ФБ. рН 7.0, что, по-видимому, свилетельствует о гидрофобной природе взаимодействия между молекулами ДСН и БО ВТМ. Аналогичные результаты, были получены и при измерении спектров КД в «ароматической» зоне. Эти результаты еще раз говорят о низкой стабильности расположенной на больших радиусах «внешней» части молекулы БО ВТМ.

В то же время оказалось, что. вызывая дестабилизацию «наружной» (менее стабильной) части молекулы БО ВТМ. низкие концентрации ДСН одновременно вызывают стабилизацию «внутренней» части (четырехспирального пучка), и так наиболее стабильной. С целью изучения влияния ДСН на эгу более стабильную часть молекулы белка, мы измеряли спектры КД препаратов БО ВТМ в области 200-250 нм при ступенчатом прогреве до 90°С в 10 мМ ФБ, рН 7,0 в присутствии 0,005% ДСН (15:1). Оказалось, что ДСН не только не дестабилизирует четырехспиральный пучок БО ВТМ. но. наоборот, еще больше увеличивает его термостабильность (рис. 14, а). В 10 мМ ФБ, рН 7.0 с 0.005% ДСН перехода из «-16 300° - формы» в «-10 000° - форму» не происходило, а наблюдалось лишь небольшое уменьшение (отрицательной) величины [0]2ок при 90оС до -15 000 град-см^дмоль"1. После охлаждения, 10]го8 воспроизводимо оказывалась даже немного ниже (то есть больше) исходного значения.

Чтобы попытаться оценить природу взаимодействия молекул ДСН с си-спиралями БО ВТМ. мы решили также посмотреть, как на стабилизирующий эффект низких концентраций ДСН будет влиять повышение концентрации ФБ до 50 мМ (14. Как уже упоминалось выше, повышение концентрации ФБ приводит к резкому ускорению агрегации, а сильная агрегация приводит к искажению спектров

КД.

На рисунке 14,6 видно, что при 70°С спектр КД белка ВТМ искажается характерным образом, и измерения теряют смысл, но до этой температуры перехода в «-10 000° - форму» не происходит и в 50 мМ ФБ. Из этих данных прежде всего следует, что ингибирование агрегации БО ВТМ под действием низких концентраций ДСН не является абсолютным. Из них так же следует, что стабилизирующее действие ДСН на а-спирали белка в 50 мМ ФБ сохраняется как минимум до 60°С и, таким образом, также (по крайней мере частично) определяется гидрофобными взаимодействиями.

Таким образом, низкие концентрации ДСН (0.0016-0,005%) вызывают ингибирование термоиндуцированной агрегации БО ВТМ и оказывают противоположное действие на термостабильность разных частей молекулы - они вызывают разупорядочивание «внешней» части, находящейся на больших радиусах, и стабилизацию По всей вероятности, эти эффекты определяются

непосредственным связыванием молекул ДСН с «внешним» и «внутренним» участками субъединицы БО ВТМ. Вероятно, взаимодействие экспонированных гидрофобных поверхностей белка и гидрофобных «хвостов» молекул детергента приводит к разупорядочиванию «тирозин-триптофанового» сегмента молекулы БО ВТМ. а гидрофильные участки молекулы ДСН препятствуют межсубъединичным гидрофобным контактам и ингибируют аморфную агрегацию.

Небольшой научный интерес к процессам аморфной агрегации белков был причиной того, что долгое время считалось, что этот процесс осуществляется за счет неспецифических гидрофобных взаимодействий боковых цепей полностью денатурированных молекул, экспонируемых в ходе разворачивания в раствор. Альтернативу этим представлениям составляет предложенная М. Гольдбергом [Goldberg, 1974]. а впоследствие развитая Р. Ветцелем [Wetzel, 1994, 1996] гипотеза (рис. 15), согласно которой аморфная агрегация является результатом специфических нековалентных межмолекулярных взаимодействий между участками поверхностей доменов частично-развернутых молекул, которые в нативных молекулах участвуют в аналогичных внутримолекулярных взаимодействиях («native-like interactions»).

Полученные нами данные не подтверждают гипотезу Гольдберга-Ветцеля, хотя и не опровергают ее. Если бы в нашей системе агрегация шла «по Гольдбергу-Ветцелю», то в ней, вероятно, были бы задействованы индивидуальные а-спирали пучка или их пары, меняющие своих партнеров со «внутрисубъединичных» на «межсубъединичных». Однако, как следует из данных КД в области 200-250 нм, в 10 мМ ФБ с ДСН а-спирали субъединиц БО ВТМ почти не разворачиваются при прогреве до 90°С. При этом субъединицы не подвергаются неупорядоченной агрегации. То есть, скорее всего, стабилизация а-спиралей (в том числе и в случае «-10 000°-формы») вызвана не аберрантными, а естественными взаимодействиями между ними. По нашей схеме инициацию аморфной агрегации БО ВТМ обеспечивают (после разупорядочивания) те сегменты молекулы, которые в

за упорядоченную агрегацию

Рис. 15. Формирование аморфных агрегатов (Г) согласно гипотезе Гольдберга-Ветцеля из частично-развернутых (частично-свернутых) молекул белка (Б) путем специфических взаимодействий («native-like interactions»). А - нативная молекула белка, В - полностью денатурированная молекула белка.

Рисунок с изменениями взят из обзора Р. Ветцеля [Wclzel. 1994].

нормальных условиях ответственны («полимеризацию»).

Термоиндуцированная агрегация БО других спиральных вирусов растений.

Мы решили также исследовать

вопрос, о том, является ли склонность к

столь мощной неупорядоченной

агрегации уникальным свойством белка

оболочки дикого (Ш) штамма ВТМ или

она присуща и белкам оболочки других

спиральных вирусов растений. С этой

целью мы подвергали ступенчатому

прогреву в одинаковых условиях

препараты БО дикого штамма Ш ВТМ. Рис. 16. Ступенчатый прогрев (по 20 мин) в

50 мМ ФБ. рН 7,0. препаратов белков

его температуро-чувствительного

мутанта 18 21-66. БО довольно близко указанных температурах, родственного ВТМ вируса мозаики томатов (ВМТ) и БО нитевидного Х-вируса-картофеля (Х-ВК). БО 1821-66 содержит 2 аминокислотные замены по сравнению с БО штамма Ш, БО ВМТ отличается от белка штамма Ш 26 заменами, более или менее равномерно распределенными по полипептидной цепи, а БО Х-ВК не имеет никаких гомологии первичной структуры с БО ВТМ. На рисунке 16 представлены кривые прироста мутности в ходе «плавления» препаратов БО Ш ВТМ, 1821-66, ВМТ и Х-ВК. Видно, что кривые «плавления» БО дикого и мутантного штаммов ВТМ очень похожи. БО ВМТ также подвержен индуцированной нагреванием аморфной агрегации, но она наступает при более высоких температурах, чем в случае БО ВТМ. Кривая «плавления» БО нитевидного Х-ВК существенно менее кооперативна. Для БО ВМТ и БО Х-ВК предельная величина мутности, после которой наступает коагуляция, оказывается в несколько раз меньше, чем для БО ВТМ. Из этого следует, что максимальный размер их агрегатов, еще не подвергающихся коагуляции, оказывается существенно меньшим, чем в случае БО ВТМ.

Мы также исследовали влияние ионной силы раствора на начальную скорость агрегации этих белков. Аморфная агрегация БО ВМТ реагировала на изменения ионной силы также, как агрегация БО штамма Ш. Однако, зависимость агрегации БО Х-ВК от ионной силы имела совершенно иной характер (рис. 3). В 1 мМ ФБ. рН 7,0

т, °с

оба белка (БО ВТМ и БО Х-ВК) не давали прироста мутности. В 10 мМ буфере БО X-ВК обнаруживал ощутимую агрегацию, а БО ВТМ по-прежнему не давал прироста /4^1}. Даже в 25 мМ ФБ для БО Х-ВК еще оказывалась примерно в 15 раз больше, чем для БО ВТМ. однако при дальнейшем увеличении концентрации буфера (до 150 мМ) его начальная скорость агрегации практически не менялась. Тогда как начальная скорость агрегации БО ВТМ, как было сказано выше, обнаруживает чрезвычайно сильную зависимость от молярности буфера в интервале 30-70 мМ. В результате, если в 50 мМ ФБ БО ВТМ всего в три раза превышала таковую для БО Х-ВК, то в 100 мМ ФБ эта разница достигала уже 50 раз.

Таким образом, мы не обнаружили у БО Х-ВК столь сильной, как у БО ВТМ и его родственников, зависимости термоиндуцированной аморфной агрегации от ионной силы буфера. Вероятно, тонкий баланс между электростатическим отталкиванием и гидрофобным притяжением поверхностей молекул белка, наличие которого мы предположили для БО палочковидного ВТМ, отсутствует у молекул БО Х-ВК - представителя другой группы (группы нитевидных вирусов) класса спиральных вирусов растений. Вирионы нитевидных вирусов гораздо менее стабильны, чем вирионы палочковидных, и эта разница в стабильности, несомненно, определяется более слабыми межсубъединичными взаимодействиями у Х-ВК (и его родственников). Вероятно, полученные данные могут рассматриваться как аргумент в пользу высказанного выше предположения, что именно аберрантные межсубъединичные взаимодействия определяют необычайно высокую способность БО ВТМ к неупорядоченной агрегации. Ярко выраженная склонность к чрезвычайно сильным упорядоченным межсубъединичным взаимодействиям является основным свойством белка оболочки ВТМ, поэтому вполне возможно, что предлагаемый нами механизм неупорядоченной агрегации (не по модели Гольдберга-Ветцеля) не распространяется на белки не столь активно вступающие в белок-белковые взаимодействия.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что термоиндуцированная необратимая аморфная агрегация БО ВТМ, по всей вероятности, вызыватся нарушением баланса между электростатическим отталкиванием молекул белка и их взаимным притяжением, определяемым гидрофобными взаимодействиями.

2. На основании анализа кинетики термической денатурации БО ВТМ высказывается предположение, что инициация его аморфной агрегации осуществляется за счет аберрантных межсубъединичных гидрофобных взаимодействий частично-разупорядоченных участков определенной области молекулы, называемой гидрофобным гребнем. Эта область является одним из основных центров межсубъединичных взаимодействий в упорядоченных агрегатах.

3. Исследованы кинетические характеристики процесса аморфной агрегации БО ВТМ, регистрируемой по приросту мутности («поглощения» при 320 нм), при концентрациях от 0,01 до 0,4 мг/мл и температурах 42° и 52°С. Показано, что при 52°С во всем изученном интервале концентраций белка (0,01-0.4 мг/мл). а при 42°С в области относительно низких концентраций (0,01-0,04 мг/мл) агрегация лимитируется стадией роста агрегатов, которая на поздних стадиях протекает как реакция псевдопервого порядка.

4. Показано, что из всех исследованных потенциальных ингибиторов только ДСН подавляет процесс термоиндуцированной неупорядоченной агрегации белка ВТМ. Это ингибирующее действие проявлялось при очень низких концентрациях ДСН и сопровождалось дестабилизацией «внешней» части молекулы белка и стабилизацией его «внутренней» части (пучка из четырех

5. Обнаружено, что вышеперечисленные характеристики процесса аморфной агрегации БО ВТМ присущи и белкам оболочки родственных ему палочковидных вирусов, но не белку оболочки нитевидного X вируса картофеля, который агрегирует по другому механизму.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

1. Арутюнян А. М. Рафикова Э. Р.. Драчев В. А.. Добров Е. Н. (2001) Появление <ф-подобного» спектра кругового дихроизма при агрегации белка, не сопровождающейся переходом в Р-структуру. Биохимия, 66.1702-1705.

2. Kurganov В. I., Dobrov E. N., Rafikova E. R., Fedurkina N. V., Mitskevich L. G., Belousova L. V.. Zhou H.-M. Kinetics of protein aggregation. Proceedings of the 1st Tsinghua International Conference of Protein. Science (TICPS), Tsinghua University, Beijing. China. May 21-23. 2001, p. 36.

3. Курганов Б. И., Добров Е. Н., Рафикова Э. Р. Кинетика агрегации белков. Тезисы докладов Международного симпозиума, посвященного памяти академика Н. М. Сисакяна. Сисакяновские чтения. Москва, Дубна, 29 мая-1 июня 2001, стр. 100-104.

4. Рафикова Э. Р., Арутюнян А. М., Драчев В. А., Добров Е. Н. Появление в спектре КД полосы в районе 215 нм не может использоваться в качестве единственного критерия перехода белка в при агрегации. Тезисы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2002». Москва. 9-12 апреля, стр. 50.

5. Курганов Б. И., Рафикова Э. Р., Добров Е. Н. (2002) Кинетика тепловой агрегации БО ВТМ Биохимия, 67, 525-533.

6. Рафикова Э. Р., Добров Е. Н., Драчев В. А. Появление в спектре КД полосы в районе 215 нм не может использоваться в качестве единственного критерия перехода белка в при агрегации. Тезисы докладов III съезда Биохимического общества РАН. Санкт-Петербург, 26 июня-1 июля, 2002. стр. 514-515.

7. Рафикова Э. Р. Особенности термоиндуцированной аморфной агрегации белков оболочки спиральных вирусов. Тезисы Международной конференции студентов и. аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2003». Москва, 20-23 апреля, стр. 86.

8. Rafikova E.R., Kurganov В.1., Arutyunyan A.M., Kust S.V., Drachev V.A., Dobrov E.N. (2003) A mechanism of macroscopic (amorphous) aggregation of the tobacco mosaic virus coat protein. Int. J. Biochem. Cell ВЫ.,35, 1452-1460.

Подписано в печать 13.03.2004 Формат 60x88 1/16. Объем 1.5 пл. Тираж 75 экз. Заказ №37 Отпечатано в ООО «Соцветие красок»

119992 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рафикова, Эльвира Рустамовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Современные представления об аморфной (неупорядоченной) и амилоидной агрегации белков

1.1. Аморфная (неупорядоченная) агрегация белков

1.2. Амилоидная агрегация белков

1.2.1. Понятие «амилоидные фибриллы»

1.2.2. Структура амилоидных фибрилл

1.2.3. Получение амилоидных агрегатов in vitro

1.2.4. Гипотеза К. Добсона

1.2.5. Возможные механизмы нейродегенеративных заболеваний

Глава 2. Структура вируса табачной мозаики и упорядоченных агрегатов его белка оболочки

2.1. Морфология вириона

2.2. Упорядоченная агрегация («полимеризация») БО ВТМ

2.3. История исследования структуры ВТМ

2.4. Структура белковой субъединицы в составе вириона и диска

2.5. Межсубъединичные взаимодействия

2.6. Карбоксил-карбоксилатные пары

2.7. РНК-белковые взаимодействия

Глава 3. Термоиндуцированная аморфная агрегация белка оболочки ВТМ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

2. Накопление и выделение вирусов

3. Выделение белков оболочки U1 и ts21 -66 ВТМ, ВМТ и Х-ВК

4. Получение 20 S-агрегатов и реполимеризованного белка ВТМ

5. УФ-спектроскопия

6. Измерения флуоресценции

7. КД-спектроскопия

8. Аналитическое ультрацентрифугирование

РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 1. Зависимость термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ от условий среды

Глава 2. Кинетика термической денатурации БО ВТМ

Глава 3. Кинетический анализ процесса термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ

Глава 4. Поиск возможных ингибиторов термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ

4.1. • Соединения, ускоряющие аморфную агрегацию БО ВТМ

4.2. Соединения, не оказавшие влияния на аморфную агрегацию БО ВТМ

4.2. Соединения, оказавшие ингибирующее действие на аморфнуюагрегацию БО ВТМ. Додецилсульфат натрия

Глава 5. Термоиндуцированная аморфная агрегация белков облочки других спиральных вирусов

Глава 6. Появление <ф-подобного» спектра КД

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Глава 1. Механизм термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ

1.1. Структурные изменения субъединиц БО ВТМ на ранних стадиях аморфной агрегации

1.2. Кинетический анализ процесса термоиндуцированной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ

Глава 2. Ингибирование аморфной агрегации БО ВТМ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики"

В течение длительного времени процессы агрегации белков рассматривались только как досадная помеха при изучении их свойств. Однако, в последние годы ситуация коренным образом изменилась. Отчасти это связано с тем, что экспрессия белков в гетерологических системах очень часто приводит к их агрегации и к формированию так называемых тел включения. Но основной причиной взрывного увеличения интереса к процессам агрегации белков явился тот факт, что, как оказалось, развитие целого ряда важнейших заболеваний человека и животных сопровождается накоплением характерных крупных упорядоченных нитевидных белковых агрегатов. Эти агрегаты называются амилоидными и имеют сходную морфологию, хотя и состоят из разных белков. К числу таких заболеваний относятся болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, диабет второго типа, семейная амилоидная полинефропатия, прионовые инфекции и множество других. И на протяжении какого-то времени даже казалось почти доказанным, что именно амилоидные агрегаты являются причиной развития этих заболеваний.

Идентификация патогенных белков и пептидов, а также получение их агрегатов in vitro дали толчок исследованиям агрегации многих других белков и пептидов, не связанных с развитием тех или иных заболеваний. Окупалось, что в определенных, (правда, как правило, чрезвычайно жестких) условиях, целый ряд абсолютно непатогенных белков (и пептидов) также обнаруживает способность к формированию амилоидных агрегатов. И, наконец, как показали работы последней пары лет, вполне вероятно, что зрелые упорядоченные амилоидные нити на самом деле не являются патогенными, а токсическим действием обладают некие другие, неупорядоченные (аморфные) агрегаты белков и пептидов, в том числе и те, для которых не показана связь с какими либо заболеваниями. Поэтому всестороннее изучение процессов формирования аморфных агрегатов белков представляете я более чем актуальным.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что бе. vie оболочки вируса табачной мозаики, как это ни странно, оказался весьма удобной моделью для изучения не только упорядоченной агрегации (классической «полимериз^ши»), но и для изучения термоиндуцированной неупорядоченной (аморфной) агрегации.

Настоящая работа посвящена изучению кинетическ их и структурных механизмов термоиндуцированнной необратимой аморфной агрегации БО ВТМ, влиянию различных факторов на этот процесс, а также, естественно, поиску возможных его ингибиторов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Рафикова, Эльвира Рустамовна

выводы

3. Исследованы кинетические характеристики процесса аморфной агрегации БО ВТМ, регистрируемой по приросту мутности («поглощения» при 320 нм), при концентрациях от 0,01 до 0,4 мг/мл и температурах 42° и 52°С. Показано, что при 52°С во всем изученном интервале концентраций белка (0,01-0,4 мг/мл), а при 42°С в области относительно низких концентраций (0,01-0,04 мг/мл) агрегация лимитируется стадией роста агрегатов, которая на поздних стадиях протекает как реакция псевдопервого порядка.

5. Обнаружено, что вышеперечисленные характеристики процесса аморфной агрегации

БО ВТМ присущи и белкам оболочки родственных ему палочковидных вирусов, но не белку оболочки нитевидного X вируса картофеля, который агрегирует по другому механизму.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рафикова, Эльвира Рустамовна, Москва

1. Ferreira S. Т, De Felice F. G. (2001) PABMB Lecture. Protein dynamics, folding andmisfolding: from basic physical chemistry to human conformational diseases. FEBS Lett., 498, 129-134.

2. Dobson С. M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci. 24,329.332.

3. Fink A. (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid.

4. Folding and Design, 3, R9-R23.

5. Horwich A. (2002) Protein aggregation in disease: a role for folding intermediates formingspecific multimeric interactions. J. Clin. Invest., 110, 1221-1232.

6. Kopito R. R. (2000) Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. Trends Cell1. Biol., 10, 524-530.

7. Zerovnik E. (2002) Amyloid-fibril formation. Proposed mechanisms and relevance toconformational disease. Eur. J. Biochem., 269, 3362-3371.

8. Temussi PA, Masino L, Pastore A. (2003) From Alzheimer to Huntington: why is astructural understanding so difficult? EMBO J., 22, 355-361.

9. Wetzel R., (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol.,12, 193-198.

10. Wetzel R. (1996) For protein misassembly, it's the "I" decade. Cell, 86, 699-702.

11. Ganesh C., Zaidi F. N., Udgaonkar J. В., Varadarajan R. (2001) Reversible formation ofon-pathway macroscopic aggregates during the folding of maltose binding protein. Protein Sci., 10, 1635-1644.

12. Орлов В. H., Арутюнян А. М., Куст С. В., Литманович Е. А., Драчев В. А., Добров

13. Е. Н. (2001) Макроскопическая агрегация белка оболочки вируса табачной мозаики, Биохимия, 66, 195-204.

14. Rafikova Е. R., Kurganov В. I., Arutyunyan А. М., Kust S. V., Drachev V. A., Dobrov Е.

15. N. (2003) A mechanism of macroscopic (amorphous) aggregation of the tobacco mosaic virus coat protein. Int. J. Biochem. Cell. Biol., 35, 1452-1460.

16. Жоли M. Физическая химия денатурации. M.: Мир. 1968.

17. Anfinsen С. В. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science., 181,223.230.

18. Ptitsyn О. B. (1995) How the molten globule became. Trends Biochem. Sci., 20, 376-379.

19. London J., Skrzynia C., Goldberg M. E. (1974) Renaturation of E. coli tryptophanase afterexposure to 8 M urea. Eur. J. Biochem., 47, 409-415.

20. Haase-Pettingell C. A., King J. (1988) Formation of aggregates from a thermolabile invivo folding intermediate in P22 tailspike maturation. A model for inclusion body formation. J. Biol. Chem., 263, 4977-4983.

21. Mitraki A., Fane B., Haase-Pettingell C., Sturtevant J., King J. (1991) Global suppressionof protein folding defects and inclusion body formation. Science, 253, 54-58.

22. Lefebvre B. G., Robinson A. S. (2003) Pressure treatment of tailspike aggregates rapidlyproduces on-pathway folding intermediates. Biotechnol. Bioeng., 82, 595-604.

23. Verheul M. (1998) Heat-induced aggregation of /?-lactoglobulin studied by small-angleneutron scattering. In Aggregation and Gelation of Whey Proteins. Ph.D. Thesis, Universiteit Twente, Enschede, The Netherlands.

24. Pots A. M., ten Grotenhuis E., Gruppen H., Voragen A., de Kruif K. G. (2003) Thermalaggregation of patatin studied in Situ. J. Agric. Food Chem., 47, 4600-4605.

25. Hoffmann M. A., van Mil P. J. (1999) Heat-induced aggregation of P-lactoglobulin as afunction of pH. J. Agric. Food Chem., 47, 1898-1905.

26. Schokker E. P., Singh H., Pinder D. N., Creamer L. K. (2000) Heat-induced aggregationof P-lactoglobulin AB at pH 2,5 as influenced by ionic strength and protein concentration .Intern. Dairy J., 10,233-240.

27. Carrotta R., Bauer R., Waninge R., Rischel C. (2001) Conformational characterization ofoligomeric intermediates and aggregates in P-lactoglobulin heat aggregation. Protein Sci., 10, 1312-1318.

28. Bauer R., Carrotta R., Rischel C. (2000) Characterization and isolation of intermediates inp-lactoglobulin heat aggregation at high pH. Biophys. J., 79, 1030-1038.

29. Roefs S. P., De Kruif K. G. (1994) A model for the denaturation and aggregation of Plactoglobulin. Eur. J. Biochem., 226, 883-889.

30. Kundu B., Guptasarma P. (2002) Use of a hydrophobic dye to indirectly probe thestructural organization and conformational plasticity of molecules in amorphous aggregates of carbonic anhydrase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 293, 572-577.

31. Kendrick B. S., Lam C. X., Nguyen T., Pandolph T. W., Manning M. C., Carpenter J. F.1998) Aggregation of recombinant human interferon-y: kinetics and structural transitions. J. Pharm. Sci., 87, 1069-1076.

32. Goossens K., Haelewyn J., Meersman F., De Ley M., Heremans K. (2003) Pressure andtemperature-induced unfolding and aggregation of recombinant human interferon-y: a Fourier transform infrared spectroscopy study. Biochem. J., 370, 529-535.

33. Курганов Б. И., Топчиева И. Н. (1998) Рефолдинг белков с участием искусственныхшаперонов. Биохимия, 63, 491-499.

34. Еронина Т. Б., Чеботарева Н. А., Ливанова Н. Б., Курганов Б. И. (2001) Кинетикаденатурации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика. Биохимия, 66, 555-562.

35. Курганов Б. И., Рафикова Э. Р., Добров Е. Н. (2002) Кинетика тепловой агрегации

36. БО ВТМ. Биохимия, 67, 631-641.

37. Wang К., Kurganov В. I. (2003) Kinetics of heat- and acidification-induced aggregationof firefly luciferase. Biophys. Chem., 106, 97-109.

38. Privalov P. (1979) Stability of proteins, small globular proteins. Adv. Prot. Chem., 33,167.241.

39. Branden C., Tooze J. Introduction to protein structure. New York, London: Garland Publ.,1.c., 1991, 2nd ed„ 1999.

40. Kiefhaber Т., Rudolph R., Kohler H.-H. (1991) Protein aggregation in vitro and in vivo: aquantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology, 9, 825-829.

41. Oosawa F., Kasai M. (1962) A theory of linear and helical aggregations of macromolecules. J. Mol. Biol., 4, 10-21.

42. Roher N., Miro F„ Boldyreff В., Llorens F„ Plana M„ Issinger O. G., Itarte E. (2001) The

43. C-terminal domain of human grp94 protects the catalytic subunit of protein kinase CK2 (CK2alpha) against thermal aggregation. Role of disulfide bonds. Eur. J. Biochem., 268, 429-436.

44. Lee GJ, Roseman AM, Saibil HR, Vierling E. (1997) A small heat shock protein stablybinds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBOJ., 16, 659-671.

45. Chang Z., Primm T. P., Jakana J., Lee I. H., Serysheva I., Chiu W., Gilbert H. F„ Quiocho

46. F. A. (1996) Mycobacterium tuberculosis 16-kDa antigen (Hspl6.3) functions as anoligomeric structure in vitro to suppress thermal aggregation. J. Biol. Chem., 271, 72187223.

47. Sipe J. D., Cohen. A. S. (2001) History of the amyloid fibril. J. Struct. Biol., 130, 88-98.

48. Taylor J. P., Hardy J., Fischbeck K. (2002) Toxic proteins in neurodegenerative disease.1. Science, 296, 1991-1995.

49. Soto C. (2003) Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.

50. Nat. Rev. Neurosci., 4, 49-60.

51. Soto C., (2001) Protein misfolding and disease; protein refolding and therapy. FEBS Lett.,498,204-207.

52. Lovestone S., McLoughlin D.M. (2001)Protein aggregates and dementia: is there acommon toxicity? J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry., 72, 152-161.

53. Damaschun G., Damaschun H., Fabian H., Gast K., KrOber R., Wieske M., Zirwer D. (2000) Conversion of yeast phosphoglycerate kinase into amyloid-like structure. Proteins, 39, 204-211.

54. Konno T., Murata K., Nagayama K. (1999) Amyloid-like aggregates of a plant protein: acase of a sweet-tasting protein, monellin. FEBS Lett., 454, 122-126.

55. Guijarro J. I., Sunde M., Jones J. A., Campbell I. D., Dobson C. M. (1998) Amyloid fibrilformation by an SH3 domain. Proc. Natl Acad. Sci. USA., 95,4224-4228.

56. Chiti F., Bucciantini M., Capanni C., Taddei N., Dobson C. M., Stefani M. (2001)

57. Solution conditions can promote formation of either amyloid protofilaments or mature fibrils from the HypF N-terminal domain. Protein Sci., 10,2541-2547.

58. Jones S., Manning J., Kad N. M., Radford S. E. (2003) Amyloid-forming peptides fromp2-microglobulin-Insights into the mechanism of fibril formation in vitro. J. Mol. Biol., 325,249-257.

59. Chiti F., Taddei N„ Baroni F., Capanni C., Stefani M., Ramponi G., Dobson C. M. (2002)

60. Kinetic partitioning of protein folding and aggregation. Nat. Struct. Biol., 9, 137-143.

61. Pertinhez T. A., Bouchard M., Tomlinson E. J., Wain R., Ferguson S. J., Dobson C. M.,

62. Smith L. J. (2001) Amyloid fibril formation by a helical cytochrome. FEBS Lett., 495, 184-186.

63. Fandrich M., Fletcher M. A., Dobson C. M. (2001) Amyloid fibrils from musclemyoglobin. Nature, 410, 165-166.

64. Naiki H., Higuchi K., Matsushima K., Shimada A., Chen W.H., Hosokawa M., Takeda T.1990) Fluorometric examination of tissue amyloid fibrils in murine senile amyloidosis: use of the fluorescent indicator, thioflavine T. Lab. Invest., 62, 768-773.

65. Cohen A. S., Calkins E. (1959) Electron microscopic observations on a fibrous componentin amyloid of diverse origins. Nature, 183, 1202-1203.

66. Glenner G. G., Wong C. W. (1984) Alzheimer's disease: initial report of the purificationand characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 120, 885-890.

67. Forno L. (1996) Neuropathology of Parkinson's disease. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55,259.72.

68. Spillantini M. G., Schmidt M. L., Lee V. M., Trojanowski J. Q., Jakes R., Goedert M.1997) Alpha-synuclein in Lewy bodies. Nature, 388, 839-840.

69. DiFiglia M., Sapp E., Chase K. O., Davies S. W., Bates G. P., Vonsattel J. P., Aronin N.1997) Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science, 277, 1990-1993.

70. Bruijn L. I., Houseweart M. K., Kato S., Anderson K. L., Anderson S. D., Ohama E.,

71. Reaume A. G., Scott R. W., Cleveland D. W. (1998) Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science, 281,1851-1854.

72. Bolton D. C., McKinley M. P., Prusiner S. B. (1982) Identification of a protein thatpurifies with the scrapie prion. Science, 218, 1309-1311.

73. Games D., Adams D., Alessandrini R., Barbour R. et. al.(1995) Alzheimer-type neuropathology in transgenic mice overexpressing V717F P-amyloid precursor protein. Nature, 373, 523-527.

74. Masliah E., Rockenstein E., Veinbergs I., Mallory M. et. al. (2000) Dopaminergic loss andinclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science, 287, 1265-1269.

75. Gurney M. E., Pu H., Chiu A. Y., Dal Canto M. C. Motor neuron degeneration in micethat express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science, 264, 1772-1775.

76. Mangiarini L., Sathasivam K., Seller M., Cozens B. et. al. (1996) Exon 1 of the HD genewith an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice. Cell, 87, 493-506.

77. Hsiao K. K., Scott M., Foster D., Groth D. F., DeArmond S. J., Prusiner S. B. (1990)

78. Spontaneous neurodegeneration in transgenic mice with mutant prion protein. Science, 250, 1587-1590.

79. Selkoe D. J. (1998) The cell biology of beta-amyloid precursor protein and presenilin in

80. Alzheimer's disease. Trends Cell. Biol., 8, 447-453.

81. Goldgaber D., Lerman M. I., McBride O. W., Saffiotti U., Gajdusek D. C. (1997)

82. Characterization and chromosomal localization of a cDNA encoding brain amyloid of Alzheimer's disease. Science, 235, 877-880.

83. Vassar R., Bennett B. D., Babu-Khan S., Kahn S., Mendiaz E. A. (1999). p-secretasecleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE. Science, 286, 735-741.

84. De Strooper B., Saftig P., Craessaerts K., Vanderstichele H., Guhde G., Annaert W., Von

85. Figura K., Van Leuven F. (1998) Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein. Nature, 391, 387-390.

86. Suzuki N., Cheung T. T., Cai X. D., Odaka A., Otvos L. Jr., Eckman C., Golde T. E.,

87. Younkin S. G. (1994) An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants. Science, 264, 13361340.

88. Selkoe D. J. (1999) Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer'sdisease. Nature, 399, A23-31.

89. Jarrett J.T., Berger E. P., Lansbury P. T. Jr. (1993) The carboxy terminus of the betaamyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochemistry, 32,4693-4697.

90. Bitan G., Kirkitadze M. D., Lomakin A., Vollers S. S., Benedek G. B., Teplow D. B.2003) Amyloid p-protein (AP) assembly: Abeta 40 and Abeta 42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 330-335.

91. Fezoui Y., Teplow D. B. (2002) Kinetic studies of amyloid beta-protein fibril assembly.

92. Differential effects of alpha-helix stabilization. J. Biol. Chem., 277, 36948-36954.

93. Walsh D. M., Hartley D. M., Kusumoto Y., Fezoui Y., Condron M. M., Lomakin A.,

94. Benedek G. B., Selkoe D. J., Teplow D. B. (1999) Amyloid beta-protein fibrillogenesis. Structure and biological activity of protofibrillar intermediates. J. Biol. Chem., 274, 25945-25952.

95. Lee V. M., Goedert M., Trojanowski J. Q. (2001) Neurodegenerative tauopathies. Annu.

96. Rev. Neurosci., 24, 1121-1159.

97. Li L., von Bergen M., Mandelkow E., Mandelkow E. (2002) Structure, stability, andaggregation of paired helical filaments from tau protein and FTDP-17 mutants probed by tryptophan scanning mutagenesis. J. Biol. Chem., 277, 41390-41400.

98. Schweers O., Schonbrunn-Hanebeck E., Marx A., Mandelkow E. (1994) Structural studiesof tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for p-structure. J. Biol. Chem., 269, 24290-24297.

99. Sadqi M., Hernandez F., Pan U., Perez M., Schaeberle M., Avila J., Munoz V. (2002) ahelix structure in Alzheimer's desease aggregates of tau-protein. Biochemistry, 41, 7150-7155.

100. Spillantini M. G., Schmidt M. L., Lee V. M., Trojanowski J. Q., Jakes R., Goedert M.1997) a-synuclein in Lewy bodies. Nature, 388, 839-840.

101. Goedert M. (2001) a-synuclein and neurodegenerative diseases. Nat. Rev. Neurosci., 7,492.501.

102. Clayton D. F., George J. M. (1998) The synucleins: a family of proteins involved insynaptic function, plasticity, neurodegeneration and disease. Trends Neurosci., 21, 249254.

103. Steece-Collier K., Maries E., Kordower J. H. (2002) Etiology of Parkinson's disease:

104. Genetics and environment revisited. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 99, 13972-13974.

105. Steece-Collier K., Maries E., Kordower J. (2002) Etiology of Parkinson's disease:

106. Genetics and environment revisited. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 13972-13974.

107. Uversky V., Li J., Fink A. (2001) Evidence for a partially folded intermediate in asynuclein fibril formation. J. Biol. Chem., 276, 10737-10744.

108. Uversky V. (2002) Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics.

109. Protein Sci., 11, 739-756.

110. Zoghbi H., Orr H. (2000) Glutamine repeats and neurodegeneration. Annu. Rev. Neurosci.,23,217-247.

111. DiFiglia M„ Sapp E., Chase K. O., Davies S. W„ Bates G. P., Vonsattel J. P., Aronin N.1997) Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science, 277, 1990-1993.

112. Wellington C. L., Ellerby L. M., Hackam A. S., Margolis R. L. et. al. (1998) Caspasecleavage of gene products associated with triplet expansion disorders generates truncated fragments containing the polyglutamine tract. J. Biol. Chem., 273, 9158-9167.

113. Lunkes A., Lindenberg K. S., Ben-Haiem L., Weber C., Devys D., Landwehrmeyer G B.,

114. Mandel J. L., Trottier Y. (2002) Proteases acting on mutant huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions. Mol. Cell, 10, 259-269.

115. Ross С., Poirier M., Wanker E., Amzel M. (2003) Polyglutamine fibrillogenesis: thepathway unfolds. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100,1-3.

116. Paulson H., Bonini N., Roth K. (2000) Polyglutamine disease and neuronal cell death.

117. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 12957-12958.

118. Orr H. (2001) Beyond the Qs in the polyglutamine disease. Genes. Dev., 15, 925-932.

119. Prusiner S. B. (1995) The prion disease. Sci. Am., Ill, 48-51, 54-57.

120. Зуев В. А., Завалишин И. А., Ройхель В. М. (1999) Прионные болезни человека и животных. М.: Медицина.

121. Dormont D. (2002) Prion diseases: pathgenesis and public health concerns. FEBS Lett., 529, 17-21.

122. Prusiner S. (1982) Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216, 136-144.

123. Prusiner S. B. (1998) Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 95, 13363-13383.

124. Weissmann C. (1999) Molecular genetics of transmissible spongiform encephalopathies. J. Biol. Chem., 274, 3-6.

125. Ceciliani F, Pergami P. (2001) Infective proteins: the prion puzzle. Curr. Protein Pept. Sci., 2,191-204.

126. Harris D. A. (1999) Cell biological studies of the prion protein. Curr. Issues Mol. Biol., 1, 65-75.

127. Petchanikow C., Saborio G. P., Anderes L., Frossard M. J., Olmedo M. I., Soto C. (2001) Biochemical and structural studies of the prion protein polymorphism. FEBS Lett., 509, 451-456.

128. Martins V. R., Linden R., Prado M. A., Walz R., Sakamoto A. C., Izquierdo I., Brentani R. R. (2002) Cellular prion protein: on the road for functions. FEBS Lett., 512, 25-28.

129. Milhavet O., Lehmann S. (2002) Oxidative stress and the prion protein in transmissible spongiform encephalopathies. Brain Res. Brain Res. Rev., 38, 328-339.

130. Stahl N., Prusiner S. B. (1991) Prions and prion proteins. FASEB J., 5, 2799-2807.

131. Calzolai L., Lysek D. A., Guntert P., von Schroetter C., Riek R., Zahn R., Wuthrich K. (2000) NMR structures of three single-residue variants of the human prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 8340-8345.

132. Kocisko D. A., Come J. H., Priola S. A., Chesebro В., Raymond G. J., Lansbury P. Т., Caughey B. (1994) Cell-free formation of protease-resistant prion protein. Nature, 370, 471-474.

133. Saborio G. P., Permanne В., Soto C. (2001) Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding. Nature, 411, 810-813.

134. Bueler H., Aguzzi A., Sailer A., Greiner R. A., Autenried P., Aguet M., Weissmann C. (1993) Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell, 73, 1339-1347.

135. Prusiner S. B. (1991) Molecular biology of prion diseases. Science, 252, 1515-1522.

136. Come J. H., Fraser P. E., Lansbury P. T. Jr. (1993) A kinetic model for amyloid formation in the prion diseases: importance of seeding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5959-5963.

137. Gabriel J.-M., Oesch B., Kretzschmar H., Scott M., Prusiner S.B. (1998) Molecular cloning of a candidate chicken prion protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 90979101.

138. Paushkin S.V., Kushnirov V.V., Smirnov V.N., Ter-Avanesyan M.D. (1997) In vitro propagation of the prion-like state of yeast Sup35 protein. Science, 277, 381-383.

139. Masison D. C., Maddelein M. L., Wickner R. B. (1997) The prion model for URE3. of yeast: spontaneous generation and requirements for propagation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12503-12508.

140. Maddelein M. L., Dos Reis S., Duvezin-Caubet S., Coulary-Salin B., Saupe S. J. (2002) Amyloid aggregates of the HET-s prion protein are infectious. Proc. Natl Acad. Sci. U S A, 99, 7402-7407.

141. Tycko R. (2003) Insights into the amyloid folding problem from solid-state NMR. Biochemistry, 42, 3151 -3159.

142. Sunde M., Serpell L. C., Bartlam M., Fraser P. E., Pepys M. B., Blake C. C. (1997) Common core structure of amyloid fibrils by synchrotron X-ray diffraction. J. Mol. Biol., 273, 729-739.

143. Lin H., Bhatia R., Lai R. (2001) Amyloid beta protein forms ion channels: implications for Alzheimer's disease pathophysiology. FASEB J., 15,2433-2444.

144. Der-Sarkissian A., Jao C., Chen J., Langen R. (2003) Structural organization of a-synuclein fibrils studied by site-directed spin labeling. J. Biol Chem., 278, 37530-37535.

145. Ding T., Lee S., Rochet J., Lansbury J. (2002) Annular a-synuclein protofibrils are produced when spherical protofibrils are incubated in solution or bound to brain-derived membranes. Biochemistry, 41, 10209-10217.

146. Lee H.-J., Lee S.-J. J. (2002) Characterization of cytoplasmic a-synuclein aggregates. Biol. Chem., 211,48976-48983.

147. Perutz M., Staden R., moens L., DeBaere I. (1993) Polar zippers. Curr. Biol., 3, 249-253.

148. Monoi H. (1995) New tubular single-stranded helix of poly-L-amino acides suggested by molecular mechanics calculations. Biophys. J., 69, 1130-1141.

149. Chen S., Ferrone F., Wetzel R. (2003) Huntington's disease age-of-onset linked to polyglutamine aggregation nucleation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11884-11889.

150. Sadqi M., Hernandez F., Pan U., Perez M., Schaeberle M., Avila J., Munoz V. (2002) a-helix structure in Alzheimer's desease aggregates of tau-protein. Biochemistry, 41, 7150-7155.

151. Castano E. (1986) In vitro formation of amyloid fibrils from two synthetic peptides of different lengths homologous to Alzheimer's disease (3-protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 141, 782-789.

152. Morillas M., Vanik D. L., Surewicz W. K. (2001) On the mechanism of alpha-helix to beta-sheet transition in the recombinant prion protein. Biochemistry, 40, 6982-6987.

153. Colon W., Kelly J. W. (1992) Partial denaturation of transthyretin is sufficient for amyloid fibril formation in vitro. Biochemistry, 31, 8654-8660.

154. Chiti F„ Calamai M., Taddei N., Stefani M., Ramponi G., Dobson C. (2002) Studies of the aggregation of mutant proteins in vitro provide insights into the genetics of amyloid diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. US A, 99, 16419-16426.

155. Chiti F., Stefani M., Taddei N., Ramponi G., Dobson C. M. (2003) Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature, 424, 805-808.

156. Dobson C. M. (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem. Sci. 24, 329-332.

157. Booth, D. R. (1997). Instability, unfolding and aggregation of human lysozyme variants underlying amyloid fibrillogenesis. Nature, 385, 787-793.

158. Lomakin A, Chung D. S., Benedek G. B., Kirschner D. A., Teplow D.B. (1996) On the nucleation and growth of amyloid beta-protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci USA, 93, 1125-1129.

159. Jarrett J. T., Lansbury P. (1993) Seeding "one-dimensional crystallization" of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie? Cell, 73, 1055-1058.

160. Wood S. J., Wypych J., Steavenson S., Louis J. C., Citron M., Biere A. L. (1999) a-synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. Implications for the pathogenesis of Parkinson's disease./ Biol. Chem., 274, 19509-19512.

161. Chen S., Ferrone F., Wetzel R. (2002) Huntington's disease age-of-onset linked to polyglutamine aggregation nucleation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, 11884-11889.

162. Jaroniec C. P., MacPhee C. E., Astrof N. S., Dobson C. M., Griffin R. G. (2002) Molecular conformation of a peptide fragment of transthyretin in an amyloid fibril. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99, 16748-16753.

163. Gutekunst C. A., Li S. H., Yi H. et. al. (1999) Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: relationship to neuropathology. J. Neurosci., 19, 2522-2534.

164. Saudou F., Finkbeiner S., Devys D., Greenberg M. E. (1998) Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell, 95, 55-66.

165. Lambert M. P., Barlow A. K., Chromy B. A., Edwards C. (1998) Diffusible, nonfibrillar ligands derived from AJ31-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 6448-6453.

166. Moechars D., Dewachter I., Lorent K., Reverse D. et. al. (1999) Early phenotypic changes in transgenic mice that overexpress different mutants of amyloid precursor protein in brain. J. Biol. Chem., 274, 6483-6492.

167. Klement I. A., Skinner P. J., Kaytor M. D., Yi H. (1998) Ataxin-1 nuclear localization and aggregation: role in polyglutamine-induced disease in SCA1 transgenic mice. Cell, 95,41-53.

168. Bucciantini M„ Giannoni E., Chiti F., Baroni F., Formigli L., Zurdo J., Taddei N., Ramponi G., Dobson C. M., Stefani M. (2002) Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature, 416, 507-511.

169. Kayed R., Head E., Thompson J. L., Mclntire T. M., Milton S. C., Cotman C. W., Glabe C. G. (2003) Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science, 300, 486-489.

170. Hetz C., Maundrell K., Soto C. (2003) Is loss of function of the prion protein the cause of prion disorders? Trends Mol. Med., 9, 237-243.

171. Makrides V, Shen T. E., Bhatia R., Smith B. L„ Thimm J., Lai R„ Feinstein S. C. (2003) Microtubule-dependent Oligomerization of Tau: Implications for tau physiological function and tauopathies. J. Biol. Chem., 278, 33298-33304.

172. Watase K., Weeber E. J., Xu B., Antalffy B., Yuva-Paylor L. et. al. (2002) A long CAG repeat in the mouse Seal locus replicates SCA1 features and reveals the impact of protein solubility on selective neurodegeneration. Neuron, 34, 905-919.

173. Saudou F., Finkbeiner S., Devys D., Greenberg M. E. (1998) Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions. Cell, 95, 55-66.

174. Goldberg M. S., Lansbury P. T. Jr(2000) Is there a cause-and-effect relationship between alpha-synuclein fibrillization and Parkinson's disease? Nat. Cell Biol., 2, El 15-119.

175. Walsh D. M„ Klyubin I., Fadeeva J. V., Cullen W. K„ Anwyl R„ Wolfe M. S„ Rowan M. J., Selkoe D. J. (2002) Naturally secreted oligomers of amyloid P protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature, 416, 535-539.

176. Conway K. A., Lee S. J., Rochet J. C., Ding T. T., Harper J. D., Williamson R. E., Lansbury P. T. Jr(2000) Accelerated oligomerization by Parkinson's disease linked alpha-synuclein mutants. Ann. N. Y. Acad. Sci., 920, 42-45.

177. Sousa M. M., Cardoso I., Fernandes R., Guimaraes A., Saraiva M. J. (2001) Deposition of transthyretin in early stages of familial amyloidotic polyneuropathy: evidence for toxicity of nonfibrillar aggregates. Am J. Pathol., 159, 1993-2000.

178. Yan S. D., Zhu H„ Zhu A., Golabek A., Du H„ Roher A., Yu J., Soto C. (2000) Receptor-dependent cell stress and amyloid accumulation in systemic amyloidosis. Nat. Med., 6, 643-651.

179. Rapoport M., Dawson H et al. (2001) Tau is essential to p-amyloid-induced neurotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 99, 6364-6369.

180. Cummings C. J., Mancini M. A., Antalffy B„ DeFranco D. B., Orr H. T., Zoghbi H. Y. (1998) Chaperone suppression of aggregation and altered subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1. Nat. Genet., 19, 148-154.

181. Hsu L. J., Sagara Y., Arroyo A., Rockenstein E., Sisk A. (2000) a-synuclein promotes mitochondrial deficit and oxidative stress. Am. J. Pathol., 157, 401-410.

182. Lin M. C., Mirzabekov T., Kagan B. L. (1997) Channel formation by a neurotoxic prion protein fragment. J. Biol. Chem., 272, 44-47.

183. Caughey B., Lansbury P. T. (2003) Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev. Neurosci., 26, 267-298.

184. Anguiano M., Nowak R. J., Lansbury P. T. Jr. (2002) Protofibrillar islet amyloid polypeptide permeabilizes synthetic vesicles by a pore-like mechanism that may be relevant to type II diabetes. Biochemistry, 41, 11338-11343.

185. Wyss-Coray T., Mucke L. (2002) Inflammation in neurodegenerative disease—a double-edged sword. Neuron., 35, 419-432.

186. Williams R. C., Steere R. L. (1951) Electron microscopic observation on the unit length of the particles of tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 73, 2057-2060.

187. Huxley I. (1957) Some observation on the structure of tobacco mosaic virus. «Stockholm Conf., Electron Microscopy, Sept. 1956, Proc.», Academic Press, New York, 260-261.

188. Hill I. N., Shephered R. I. (1972) Molecular weights of plant virus coat protein by polyacrylamide gel electrophoresis. Virology, 47, 817-822.

189. Watson J. D. (1954) The structure of TMV. Biochim. Biophys. Acta, 13, 10-19.

190. Franklin R. (1956) Location of the RNA in the tobacco mosaic virus particle. Nature, 111, 928-930.

191. Boedtker H. (1968) Dependence of the sedimentation coefficient on molecular weight of RNA after reaction with formaldehyde. J. Mol. Biol., 35, 61-70.

192. Goelet P., Lomonosoff G. P., Butler P. J. G., Akam M. E., Gait M. J., Karn J. (1982) Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5818-5822.

193. Namba K., Pattanayek R., Stubbs G. (1989) Visualization of intact tobacco mosaic virus at 2.9A resolution by X-ray fiber diffraction. J. Mol. Biol., 208, 307-325.

194. Fraenkel-Conrat H. (1957) Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology, 4, 1-4.

195. Fraenkel-Conrat H. and Williams R. S. (1955) Reconstitution of active tobacco mosaic virus from its inactive protein and nucleic acid components. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 41, 690-698.

196. Butler, P. J. G. (1984) The current picture of the structure and assembly of tobacco mosaic virus, J. Gen. Virol., 65, 253-279.

197. Schuster T. M., Scheele M. L., Khairallah L. H. (1979) Mechanism of self-assembly of tobacco mosaic virus protein. I. Nucleation-controlled kinetics of polymerization. J. Mol. Biol, 127,461-468.

198. Klug A. (1979) The assembly of tobacco mosaic virus: structure and specifity. Harvey Lect., 74, 141-172.

199. Champness I. N., Bloomer A. C., Bricogne G., Buttler P. J. G„ Klug A. (1976) The structure of the protein disk of tobacco mosaic virus to 5 A resolution. Nature, 259, 2024.

200. Bloomer A. C., Champness J. N., Bricogne G., Staden R., Klug A. (1978) Protein disk of tobacco mosaic virus at 2.8A resolution showing the interaction within and between subunits. Nature, 276, 362-368.

201. Bhyravbhatla B., Watowich S., Caspar D. (1998) Refined atomic model of the four-layer aggregate of the tobacco mosaic virus coat protein at 2.4-A resolutioa Biophysical Journal, 74, 604-615.

202. Mandelkow E. G. (1981) Structure of the helical aggregates of tobacco mosaic virus protein. J. Mol. Biol., 152, 375-386.

203. Raghavedra K., Kelly I. A., Khairallah L., Schuster T. M. (1988) Structure and function of disk aggregates of the coat protein of tobacco mosaic virus. Biochemistry, 27, 75837588.

204. Orlov V.N., Kust S.V., Kalmykov P.V., Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A. (1998) A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Lett., 433, 307-311.

205. Holmes K., Stubbs G., Mandelkow E., Gallwitz U. (1975) Structure of tobacco mosaic virus at 6.7A resolution. Nature, 254, 192-196.

206. Stubbs G., Warren S., Holmes K. (1977) Structure of RNA and RNA binding site in tobacco mosaic virus from 4A map calculated from fiber diagrams. Nature, 267, 216221.

207. Namba K., Stubbs G. (1986) Structure of tobacco mosaic virus at 3.6A resolution: Implication for assembly. Science, 231, 1401-1406.

208. Dobrov E. N., Atabekov J. G. (1985) Reconstitution of plant viruses. In «Plant Viruses», ed. Mandahar. C. L., CRC press, Flor., 173-186.

209. Caspar D. L. D. (1963) Assembly and stability of the tobacco mosaic virus particle. Adv. Protein Chem., 18, 37-121.

210. Culver J. N., Dawson W. O., Plonk K., Stubbs G., (1995) Site-directed mutagenesis confirms the involvement of carboxylate groups in the disassembly of tobacco mosaic virus. Virology, 206, 724-730.

211. Wang H., Planchart A., Stubbs G. (1998) Caspar carboxylates: the structural basis of tobamovirus disassembly. Biophys. J., 74, 633-638.

212. Butler, P. J. G., Klug A. (1971) Assambly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disk of protein. Nature New Biol., 229, 47-50.

213. Абу-Ед M. M., Куст С. В., Макеева И. В., Новиков В. К., Добров Е. Н. (1994) Изучение процесса термической агрегации белков оболочки нескольких представителей группы тобамовирусов, Молек. Генет. Микробиол. Вирусол., 3, 2832.

214. Taniguchi М., Taniguchi Т. (1975) Thermally induced conformational changes of tobacco mosaic virus and their protein assemblies. Biochim. Biophys. Acta, 386, 1-17.

215. Dobrov E. N., Kust S. V., Yakovleva O. A., Tikchonenko Т. I. (1977) Structure of single-stranded virus RNA in suti. Biochim. Biophys. Acta, 475, 623-637.

216. Jockusch H. (1966) Temperaturesensitive mutanten des Tabakmosaikvirus, I. In vivo-Verhalten., Z. Verebungsl, 98, 320-343.

217. Greenfield N., and Fasman G. (1969) Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry 12, 1290-1299.

218. Практикум по общей вирусологии. Ред. Атабеков И.Г. М.: МГУ. 2002.

219. Fraenkel-Conrat H. (1957) Degradation of tobacco mosaic virus with acetic acid. Virology, 1, 1-4.

220. Goodman R.M. (1975) Reconstitution of potato virus X in vitro. I. Properties of the dissociated protein structural subunits, Virology, 68, 287-298.

221. Глинка H. Jl. (1984) Задачи иупражнения no общей химии, Л.: Химия.

222. Monahan F. J., Mc Clements D. J., German J. B. (1997) Disulfide-mediated polymerization of whey proteins in whey protein isolate-stabilized emulsions. Adv Exp Med Biol., 415, 127-36.

223. Forloni G., Colombo L., Girola L., Tagliavini F., Salmona M. (2001) Anti-amyloidogenic activity of tetracyclines: studies in vitro. FEBS letters, 487, 404-407.

224. Cohlberg J. A., Li J., Uversky V. N., Fink A. L. (2002) Heparin and other glycosaminoglycans stimulate the formation of amyloid fibrils from alpha-synuclein in vitro. Biochemistry, 41, 1502-1511.

225. Bergamaschini L., Donarini C., Rossi E., De Luigi A., Vergani C., De Simoni M. G. (2002) Heparin attenuates cytotoxic and inflammatory activity of Alzheimer amyloid-beta in vitro. Neurobiol. Aging, 23, 531-536.

226. Hatters D. M., Lindner R. A., Carver J. A., Howlett G. J. (2001) The molecular chaperone, a-crystallin, inhibits amyloid formation by apolipoprotein C-II. J. Biol. Chem., 276, 33755-33761

227. Chiti F„ Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson C. M. (1999) Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 3590-3594.

228. Ohnishi S., Koide A., Koide S. (2000) Solution conformation and amyloid-like fibril formation of a polar peptide derived from a beta-hairpin in the OspA single-layer betasheet. J. Mol. Biol., 301, 477-489.

229. Schubert D, Krafczyk B. (1969) Circular dichroism studies on the reversible depolymerization of tobacco mosaic virus protein. Biochim. Biophys. Acta, 188, 155157.

230. Chiti F., Calamai M., Taddei N., Stefani M., Ramponi G., Dobson С. M. (2002) Studies of the aggregation of mutant proteins in vitro provide insights into the genetics of amyloid diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, Suppl. 4, 16419-16426

231. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: Мир. 1991.

232. D'Auria S., Di Cesare N., Gryczynski I., Rossi M., Lakowicz, J.R. (2001) On the effect of sodium dodecyl sulfate on the structure of beta-galactosidase from Escherichia coli. A fluorescence study. J. Biochem. (Tokyo), 130, 13-18.

233. Muga A., Arrondo J., Bellon Т., Sancho J., Bernabeu C. (1993) Structural and functional studies on the interaction of sodium dodecyl sulfate with beta-galactosidase. Arch. Biochem. Biophys., 300,451-457.

234. Pertinhez Т., Bouchard M., Smith R., Dobson C., Smith, L. (2002) Stimulation and inhibition of fibril formation by a peptide in the presence of different concentrations of SDS. FEBSLett., 529, 193-197.

235. Mammi S., Peggion, E. (1990) Conformational studies of human 15-2-aminohexanoic acid. little gastrin in sodium dodecyl sulfate micelles by 1H NMR. Biochemistry, 29, 5265-5269.

236. Rizo J., Blanco F., Kobe В., Bruch M„ Gierasch, L. (1993) Conformational behavior of Escherichia coli OmpA signal peptides in membrane mimetic environments. Biochemistry, 32,4881-4894.

237. Hamada S., Takeda K. (1993) Conformational changes of a-lactalbumin and its fragment, Phe31-Ile59, induced by sodium dodecyl sulfate. J. Prot. Chem., 12,477-482.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Рафикова, Эльвира Рустамовна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Изучение механизмов термоиндуцированной аморфной агрегации на примере белка оболочки вируса табачной мозаики - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы