Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами

Хохлова, Екатерина Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами"

На правах рукописи

ХОХЛОВА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИФИДОБАКТЕРИЙ И СОЗДАНИЕ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ ШТАММОВ БИФИДОБАКТЕРИЙ С УСИЛЕННЫМИ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ

03.01.04 - Биохимия 03.02.03 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 9 ЯН5 2012

005008041)

Москва — 2012

ор

005008040

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития России»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАМН, профессор доктор медицинских наук, профессор

Ефимов Борис Алексеевич Шкопоров Андрей Николаевич

Терентьев Александр Александрович Шендеров Борис Аркадьевич

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития России»

Защита состоится « 23 » января 2012 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.072.01 при ГОУ ВПО РГМУ^ Росздрава по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан « 22 » декабря 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность

Одной из первых групп мутуалистических бактерий, заселяющих стерильный кишечник доношенных новорожденных после естественных родов, являются бифидобактерии. Род Bifidobacterium относится к классу Actinobacteria и включает в себя грамположительные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки с высоким содержанием пар гуанин-цитозин в геномной ДНК [Ventura и соавт., 2007]. Благотворное влияние бифидобактерий на физиологию желудочно-кишечного тракта и всего организма в целом связывают с их способностью к конкурентному подавлению патогенных и условно-патогенных бактерий, способностью к продукции витаминов и других биологически активных соединений, а также противовоспалительной, антиканцерогенной и иммуномодулирующей активностью [Fukuda и соавт., 2011; Sreekumar и Hosono, 1998; Kohno и соавт., 2009; Ruas-Madiedo и соавт., 2006]. Позитивные свойства бифидобактерий в сочетании с полным отсутствием факторов патогенности объясняют высокий интерес исследователей к данной группе микроорганизмов.

С позиции практической медицины одним из наиболее важных свойств бифидобактерий является их противовоспалительная активность. Известно, что у больных с тяжелыми воспалительными заболеваниями кишечника (болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом) наблюдается резкое снижение титра бифидобактерий и ряда других комменсалов (бактероидов, клостридий групп 1Ха и IV, Faecalibacterium praustnitzii) в фекальной микрофлоре [Mylonaki и соавт., 2005; Fava и соавт., 2011; Sokol и соавт., 2009]. Одновременно с этим была показана способность ряда пробиотических формул, содержащих бифидобактерии, вызывать и поддерживать стойкую ремиссию у пациентов с неспецифическим язвенным колитом, синдромом раздраженного кишечника и резервуарным илеитом [Miele и соавт., 2009; Guandalini и соавт., 2009]. Исследования с использованием животных и клеточных моделей также выявили способность бактерийных препаратов на основе бифидобактерий подавлять развитие воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника, снижать интенсивность симптомов колита, подавлять секрецию провоспалительных цитокинов и стимулировать продукцию противовоспалительных факторов иммунокомпетентными клетками [Mennigen и соавт., 2009; Maslowski и соавт., 2009]. Однако вопрос о механизме этой противовоспалительной активности и роли секретируемых метаболитов и компонентов клеток бифидобактерий в ее проявлении до сих пор остается открытым.

невозможны без активного использования современных подходов молекулярной биологии, биохимии, геномики и протеомики. В последние два десятилетия совершен значительный рывок в изучении генетики и молекулярной биологии бифидобактерий: просеквенированы геномы нескольких видов бифидобактерий, созданы генетические векторные системы, совершенствуются методы генетической трансформации бифидобактерий [Schell и соавт., 2002; Lee и соавт., 2008; Shkoporov и соавт., 2008; Suzuki и соавт., 2011].

Адаптация современных методов генетической инженерии к работе с бифидобактериями открывает новый этап в изучении биологии данных микроорганизмов и разработке принципиально нового класса пробиотических препаратов на их основе [Cronin и соавт., 2010]. Одним из перспективных направлений может стать получение штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами за счет продукции ими ряда рекомбинантных белков — противовоспалительных цитокинов, миниантител, растворимых рецепторов. В то же время недостаточно проработанным остается вопрос о подходах к эффективной продукции гетерологичных рекомбинантных белков в бифидобактериях. Требуется проведение дополнительных исследований с целью получения клонирующих векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии гетерологичных генов и требуемую субклеточную локализацию целевых рекомбинантных белков.

Цель исследования

Изучение механизмов естественной противовоспалительной активности штаммов бифидобактерий, колонизирующих кишечник здоровых людей, и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с искусственно усиленными противовоспалительными свойствами.

Задачи исследования

1. Провести поиск в коллекции бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей раннего возраста, штаммов, обладающих наиболее выраженными противовоспалительными свойствами на модели клеточной линии кишечных эпителиоцитов.

2. Изучить молекулярный механизм реализации противовоспалительных свойств избранных штаммов бифидобактерий: характер действующего начала, его субклеточную локализацию, особенности воздействия на клетки эпителия кишечника.

3. Создать серию клонирующих векторов для бифидобактерий, обеспечивающих оптимальную экспрессию генов рекомбинантных белков с противовоспалительными свойствами (интерлейкин-10 человека, человеческие анти-ФНО а-миниантитела).

4. Изучить биологическую активность полученных штаммов бифидобактерий, продуцирующих рекомбинантные белки с противовоспалительными свойствами, на модели клеточной линии кишечных

эпителиоцитов.

Научная новизна

В ходе настоящего исследования с использованием модели кишечных эпителиоцитов впервые показано наличие противовоспалительных свойств у широкого круга штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей. Обнаружено, что свежевыделенные изоляты бифидобактерий обладают более выраженной противовоспалительной активностью по сравнению со штаммами, культивированными in vitro в течение длительного времени. Показано, что противовоспалительная активность штаммов бифидобактерий различных видов связана с секрецией низкомолекулярных термостабильных соединений, которые подавляют продукцию провоспалительных цитокинов в культуре клеток. Впервые изучены особенности транскрипционного ответа кишечных эпителиоцитов на воздействие бифидобактерий. Продемонстрировано, что бифидобактерии, не оказывая влияния на базальный уровень транскрипции, модулируют экспрессию генов ИЛ-8, CCL20, 1кВ^, р21С1Р в условиях стимуляции клеток ЛПС и ФНО-а. Определен примерный механизм противовоспалительной активности бифидобактерий. Продемонстрирована способность бифидобактерий к подавлению активности транскрипционного фактора NF-кВ и снижению фосфорилирования его ингибитора — 1кВа.

Впервые проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии рекомбинантного человеческого ИЛ-10 в бифидобактериях с использованием различных регуляторных элементов — промоторов, сайтов инициации трансляции, сигнальных пептидов, заимствованных из нескольких генов бифидобактерий видов В. breve, В. longum, В. adolescentis. Показано, что наивысший уровень экспрессии и корректный процессинг рекомбинантного белка достигается при использовании промотора гена дар В. longum и сигнального пептида белка АшуВ В. adolescentis. С использованием наиболее эффективных регуляторных элементов были созданы клонирующие векторы и получены штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантный ИЛ-10 человека и рекомбинантные человеческие миниантитела к ФНО-а. Противовоспалительная активность данных штаммов была продемонстрирована in vitro на модели воспалительного ответа в клеточной культуре НТ-2Э.

Практическая значимость работы

В ходе данного исследования был проведен скрининг кишечных изолятов бифидобактерий на наличие противовоспалительной активности in vitro, по результатам которого был отобран ряд штаммов, обладающих наиболее выраженными свойствами.

Сконструированные в данной работе клонирующие векторы, обеспечивающие эффективную экспрессию гетерологичных генов в

бифидобактериях, могут быть использованы для создания штаммов, продуцирующих рекомбинантные белки: цитокины, антитела, вакцинные антигены, вещества с антимикробной активностью, ферменты. В ходе исследования получены штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантные белки с противовоспалительной активностью — ИЛ-10 человека и человеческие миниантитела к ФНО-а.

Положения, выносимые на защиту

1. Бифидобактерии, колонизирующие кишечник здоровых детей, обладают противовоспалительной активностью. Эта активность опосредована действием секретируемых термостабильных низкомолекулярных соединений не белковой природы и заключается в дозозависимом подавлении экспрессии генов провоспалительных цитокинов на уровне транскрипции в клетках кишечного эпителия.

2. Воздействие метаболитов бифидобактерий на кишечные эпителиоциты сопровождается подавлением активности сигнального пути NF-кВ, ингибированием фосфорилирования 1кВа и модуляцией экспрессии ряда генов, вовлеченных в процессы воспаления, хемотаксиса и регуляции клеточного цикла.

3. Созданные в ходе настоящего исследования клонирующие векторы позволяют получать штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный интерлейкин-10 человека и рекомбинантные анти-ФНО-а миниантитела. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков обладают противовоспалительной активностью в in vitro модели кишечного воспаления.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов, врачей интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития.

Полученные в ходе работы рекомбинантные плазмиды используются на кафедре микробиологии и вирусологии и в лаборатории микробологиии биологической безопасности ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии бифидобактерий и созданию штаммов бифидобактерий с заданными свойствами.

Апробация работы

Минздравсоцразвития 9 июня 2011, а также на 15-ом международном конгрессе International Congress of Mucosal Immunology (5-9 июля 2011, Париж) и на 34-ом международном конгрессе Congress of Society for Microbial Ecology and Disease (20-23 ноября 2011, Йокогама).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 7 статей в рецензируемых научных журналах (2 в отечественных из списка ВАК, 5 в зарубежных).

Объем и структура работы

Работа изложена на русском языке, на 130 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы. Библиография включает 350 наименований работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и 5 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалами исследования являлись 12 штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей, 5 штаммов бифидобактерий различных видов, полученные из международных коллекций American Туре Culture Collection, Nestle Culture Collection, коллекции штаммов микроорганизмов университета Корк (Ирландия) и коллекции штаммов бактерий кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова. Кроме того, объектами исследования являлись рекомбинантные гашмидные ДНК, полученные методами генетической инженерии, а также штаммы бифидобактерий, трансформированные различными генетическими конструкциями.

Бифидобакгерии культивировали на среде RCM в анаэробных условиях при 37°С. Кондиционированные супернатанты культур бифидобактерий получали путем инкубации отмытых клеточных осадков в среде DMEM с добавлением 20 шМ HEPES в течение 20 ч. Термическую обработку супернатантов проводили при 100°С в течение 30 мин, термическую инактивацию клеток бифидобактерий выполняли при 55°С. Бесклеточные экстракты получали путем гомогенизации клеток со стеклянным порошком (d = 0.1 мм). Обработку супернатантов бифидобактерий протеиназой К (20 мкг/мл) и смесью ДНКазы I/РНКазы А (10 мкг/мл) проводили при 37°С в течение 20 ч. Ультрафильтрацию супернатантов бактериальных культур проводили с использованием мембранных фильтров с пределом пропускания 3 и 9 кДа.

В качестве in vitro модели кишечного эпителия использовали линию клеток высокодифференцированной аденокарциномы толстого кишечника НТ-29. Клетки выращивали до 100% конфлюентности в среде DMEM с добавлением

фетальной сыворотки при 37°С в атмосфере 5% С02 и стимулировали добавлением рекомбинантного ФНО-а до концентрации 15 нг/мл или ЛПС Е. coli 055:В5 до 10 нг/мл. За 30 мин до стимуляции к культурам клеток добавляли суспензии клеток, лизаты, супернатанты культур бифидобактерий или их фракции. Иммуноблоттинг проводили через 30 — 120 мин после стимуляции. Определение мРНК и секретируемых цитокинов методами ОТ-ПЦР-РВ и ИФА проводили через 4 и 15 часов после стимуляции соответственно. Цитотоксичность определяли при помощи МТТ-теста через 24 часа после обработки.

Иммуноблоттинг лизатов культур бактериальных и эукариотических клеток, а также концентрированных супернатантов культур проводили при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ и полусухого переноса на ПВДФ-мембрану. Иммунодетекцию проводили с использованием поликлональных антител к ИЛ-10 человека, фосфо-1кВ человека, GAPDH человека, а также моноклональных антител к эпитопу с-Мус в сочетании с антиглобулиновыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена. Визуализацию проводили хемилюминесцентным методом.

Изучение экспрессии мРНК в культурах клеток НТ-29 и трансформированных культурах бифидобактерий проводили с использованием методики ПЦР в режиме реального времени, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ) с интеркалирующим красителем EvaGreen на приборе CFX96 (Bio-Rad). Тотальную РНК выделяли с помощью набора ZR RNA MiniPrep (Zymo Reseach), обратную транскрипцию выполняли с использованием фермента RevertAid Premium (Fermentas).

Иммуноферментный анализ цитокинов проводили с использованием наборов производства НПО Цитокин в соответствии с инструкцией.

Определение экспрессии репортерного гена люциферазы под контролем NF-кВ-промотора проводили в клетках НТ-29, трансфицированных плазмидой pGL3-promoter-NF-KB, с помощью реагента Metafecten Pro (Biontex) и набора реагентов для детекции Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.

Конструирование рекомбинантных плазмид, трансформацию штаммов Е. coli, выделение геномных и плазмидных ДНК проводили в соответствии с общепринятыми методиками [Sambrook и Rüssel, 2001]. Промоторный NF-kB -элемент гена ИЛ-8, был синтезирован как олигонукпеотид и клонирован в вектор pGL3-promoter (Promega). Комплементарная ДНК гена ИЛ-10 была амплифицирована при помощи ПЦР на матрице кДНК-библиотеки мозга человека. Синтетический ген, кодирующий человеческие миниантитела к ФНО-а, был получен из набора синтетических перекрывающихся олигонуклеотидов на основе последовательности миниантитела D2E7 (адалимумаб) и оптимизирован по кодонному составу для экспрессии в клетках В. breve. Фрагменты генов sec2, ариВ, атуВ, кодирующие секреторные сигнальные пептиды, а также промоторы и сигнальные последовательности генов tuf и gSd

были ПЦР-амплифицированы из геномной ДНК В. breve UCC2003, В. longum NCC2705 и В. adolescentis В48. Для клонирования ПЦР-продуктов с «липкими концами» к 5'-концам праймеров добавляли последовательности соответствующих рестрикционных сайтов. Верификацию полученных рекомбинантных плазмид проводили с использование методов ПЦР, рестрикционного анализа и секвенирования ДНК-вставок.

Трансформацию штаммов бифидобактерий В. breve UCC2003 и В. longum NCC27Q5 проводили посредством электропорации после отмывки осадка культуры, находящейся в среднелогарифмической фазе роста в растворе 0,5 M маннита, 1 мМ цитрата аммония (рН 6,0). Электропорацию клеток проводили в приборе GenePulser (BioRad) со следующими настройками: 2,3 кВ, 25 мкФ, 200 Ом, межэлектродное расстояние 2 мм.

Статистический анализ проводился при помощи приложений OpenOffice.org Электронные Таблицы и Primer of Biostatistics с использованием однофакторного дисперсионного анализа и критериев Стьюдента и Ньюмена-Кейлса.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение противовоспалительной активности комменсальных штаммов бифидобактерий

Первичный скрининг бифидобактерий на наличие противовоспалительной активности был проведен с 17 штаммами, в том числе с 12 изолятами бифидобактерий (Bifl, Bif2, Bif3, Lon4, Lon5, Lon6, Cat7, Cat8, Cat9, BrelO, Brell, Adol2) выделенными из фекалий здоровых детей и принадлежащими к наиболее часто встречающимся в кишечнике человека видам (В. bifidum, В. longum, В. catenulatum, В. breve, В. adolescentis), и 5 штаммами из международных коллекций и пробиотических формул.

300250-

с; 200-

1 150-

В 791 А ТСС 16697 L. casei С. glutamioum ФНО-а к-NCC 2705 АТСС15696 VMKB44 L. lactis E.coli

Рисунок 1. Концентрация ИЛ-8 в культуральной среде НТ-29 после обработки супернатантами бактериальных культур (метод ИФА). NCC 2705, АТСС 15697, VMKB44 - супернаганты культур В. longum; В791, АТСС 15696 - супернатанты культур В. bifidum; ФНО-а - клетки, обработанные ФНО-а (положительный контроль); к- - необработанные клетки НТ-29 (отрицательный контроль).

** р < 0,01 по отношению к отрицательному контролю.

В качестве in vitro модели кишечного воспаления в данном исследовании использовалась стимуляция липополисахаридом Е. coli 055:В5 или фактором некроза опухоли а (ФНО-а) клеточной линии кишечных эпителиоцитов НТ-29, а как основной показатель интенсивности провоспалительных процессов в клетках — количество вырабатываемого ими интерлейкина-8 (ИЛ-8).

Бифидобактерии, как и другие грамположительные микроорганизмы (за исключением Lactobacillus casei), не оказывали влияния на базальный уровень продукции ИЛ-8 клетками НТ-29, который составлял не более 10 пкг/мл (Рисунок 1).

1600! 1400 1200 1000 800 6004002000'

lllllllll

# J" é ^ & #

■ ФНО-а

олпс

Рисунок 2. Концентрация ИЛ-8 в культуральной среде клеток НТ-29 после стимуляции ФНО-а или ЛПС и обработки супернатантами бактериальных культур (ИФА). Bifl-3, A1S696, В791 - штаммы В. bifidum; Lon4-6, NCC2705, АТСС15697, VMKB44 - штаммы В. longum; Cat7-9 - штаммы В. catenulatum; BrelO-ll - штаммы В. breve; Adol2 -штамм В. adolescentis; pos - обработка только ФНО-а или ЛПС.

** Р < 0,01, * Р < 0,05 по отношению к положительному контролю (pos).

В то же время инкубация культуры НТ-29 с супернатантами большинства штаммов бифидобактерий перед стимуляцией ЛПС или ФНО-а (в отличие от

других грамположительных бактерий) существенно снижала как ЛПС-зависимую, так и ФНО-а-зависимую секрецию ИЛ-8 (Рисунок 2). Причем уровень ингибирующего действия сильно варьировал между различными штаммами: от 9,1% и 18,7% (для ЛПС- и ФНО-а-зависимой-секреции соответственно) до 55,7% и 61,4%. Подобным же образом супернатанты культур бифидобактерий снижали продукцию ФНО-а, вызванную стимуляцией клеток липополисахаридом.

Обратили на себя внимание также следующие особенности: 1) уровень противовоспалительной активности конкретного штамма зависит от типа провоспалительного стимула (ЛПС или ФНО-а); 2) бифидобактерии, принадлежащие виду В. bifidum, в большей степени ингибируют ЛПС-зависимую продукцию интерлейкина-8, чем ФНО-а-зависимую; 3) свежевыделенные от человека изоляты бифидобактерий проявляют более выраженную противовоспалительную активность, чем коллекционные штаммы с длительной историей культивирования in vitro.

Ранее в ряде работ было показано подавление бифидобактериями продукции провоспалительных цитокинов в клеточных линиях кишечного происхождения [Roselli и соавт., 2006; Bai и соавт., 2004; О'Нага и соавт., 2006; Park и соавт., 2007]. Однако авторы указанных исследований, проводя изучение противовоспалительных свойств на небольшом наборе производственных штаммов, утверждают, что данные свойства присутствуют лишь у некоторых изолятов бифидобактерий [Heuvelin и соавт., 2009; Imaoka и соавт., 2008; Preising и соавт., 2010]. В то время, как согласно нашим данным, противовоспалительная активность в той или иной мере характерна для всех штаммов без исключения.

Изучение химических свойств активных компонентов культуральных супернатантов бифидобактерий

Перед проведением дальнейших исследований было исключено предположение о том, что наблюдаемое в описанных экспериментах подавление продукции цитокинов является следствием токсического действия компонентов бактериальных супернатантов на культуру НТ-29.

На следующем этапе изучения действия бифидобактерий на кишечный эпителий была показана зависимость уровня снижения индуцированной ЛПС и ФНО-а продукции ИЛ-8 от дозы супернатантов бактериальных культур (Рисунок 3). Наибольшее снижение продукции ИЛ-8, определяемое с помощью ИФА и ПЦР в реальном времени, наблюдалось при высоких концентрациях культуральных сред - в разведениях 1:2 -1:8, что соответствует 5x10е - 1,25x10е бактериальных клеток на 1 лунку 24-луночного планшета.

Рисунок 3. Концентрация ИЛ-8 в кулыуральной среде клеток НТ-29 после обработки различиыми разведениями супернатантов бифидобактерий (1/2-1/32), в условиях стимуляции ФНО-а (ИФА). ФНО-а - клетки, обработанные ФНО-а (положительный контроль); к- - необработанные клетки НТ-29 (отрицательный контроль). Lon4 - штамм В. longum, Cat7 - штамм В. catenulatum, ВгеЮ - штамм В. breve.

Для выяснения субклеточной локализации активного вещества, было проведено сравнение противовоспалительной активности супернатантов культур бифидобактерий, инактивированных нагреванием бактериальных клеток, а также бесклеточных цитоплазматических экстрактов бифидобактерий. Результаты сравнительного эксперимента показали, что только супернатанты культур бифидобактерий способны подавлять ФНО-а-зависимую продукцию ИЛ-8 (Рисунок 4А). Это означает, что действующее соединение (соединения) с противовоспалительной активностью секретируется бифидобактериями во внешнюю среду.

Сходные результаты были получены в работах авторов Broekaert и соавт. [2007], Imaoka и соавт. [2008]. В то же время рядом исследователей сообщается о противоспалительной активности, опосредованной действием живых или фиксированных формалином цельных клеток бифидобактерий [Riedel и соавт., 2006; Preising и соавт., 2010].

В ходе дальнейших экспериментов были охарактеризованы некоторые свойства секретируемых бифидобактериями соединений с противовоспалительной активностью. Так с помощью ультрафильтрации супернатантов было определено, что молекулярная масса активных соединений не превышает 3 кДа, а температурная обработка течение 30 минут при 100°С не влияет на степень подавления ими стимулированной ФНО-а продукции ИЛ-8 клетками НТ-29 (Рисунок 4В).

О клетки

□ бесклеточные экстракты ■ суперна танты культур

B¡f3 Lorvt Cat7

«si?4*

□ протеиназа К

□ смесь нуклеаз Исупернатанты

культур до обработки

Всупернатанты культур ¡Зретектаты □ фильтраты ■ фильтраты после термической обработки

EÍ3 1<Ж Сз17 ВкЮ ФНСЮ

Рисунок 4. Изучение химических свойств противовоспалительных компонентов супернатантов культур бифидобактерий. А - Концентрация ИЛ-8 в культуральной среде НТ-29 после обработки бесклеточными экстрактами, клетками и сулернатантами культур бифидобактерий в условиях стимуляции ФНО-а (ИФА). Б - концентрация ИЛ-8 в культуральной среде НТ-29 после воздействия супернатантов культур бифидобактерий до и после обработки их протеиназой К и смесью нуклеаз в условиях стимуляции ФНО-а (ИФА). В - Концентрация ИЛ-8 в культуральной среде НТ-29 после обработки супернатантами культур бифидобактерий, фракций, образовавшихся в результате ультрафильтрации и фильтратов после термической обработки в условиях стимуляции ФНО-а (ИФА). ФНО-а -клетки, обработанные ФНО-а (положительный контроль); neg - необработанные клетки НТ-29 (отрицательный контроль). Bif3 - штамм В. bifidum, Lon4 - штамм В. longum, Cat7 -штамм В. catenulatum, BrelO - штамм В. breve.

** Р < 0,01, * Р < 0,05 по отношению к положительному контролю (ФНО-а).

Исчерпывающая обработка супернатантов культур бифидобактерий протеиназой К и смесью ДНК-азы и РНК-азы не сказывалась на уровне их противовоспалительной активности. Это свидетельствует о том, что действующие соединения, секретируемые бифидобактериями, не белковой природы, а также не являются нуклеиновыми кислотами (Рисунок 4Б).

Химическая природа и субклеточная локализация веществ, отвечающих за реализацию противовоспалительных свойств бифидобактерий является предметом дискуссии. Так, например, известны взаимоисключающие предположения о противовоспалительной активности бифидобактерий, связанной с молекулами бактериальных ДНК, изомеров конъюгированных линолевых кислот, короткоцепочечных жирных кислот и т. д. [СЬасШш и соавт., 2010; Е\\газс1шк и соавт., 2006; 1таока и соавт., 2008].

Изучение механизма противовоспалительной активности бифидобактерий

В настоящем исследовании было изучено влияние бифидобактерий на уровень активации транскрипционного фактора №-кВ в культуре клеток НТ-29, находящейся под действием провоспалительного медиатора. Данные эксперименты проводили с помощью плазмидной репортерной системы, содержащей ген люциферазы РИостш ругаНз под контролем ИР-кВ-отвечающего элемента из промоторной области гена ИЛ-8. Определение активности люциферазы, отражающее уровень активации ОТ-кВ, проводили в разных временных точках. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что бифидобактерии подавляют активацию транскрипционного фактора ОТ-кВ в клетках НТ-29. Причем максимально данный эффект выражен спустя 6 часов после воздействия провоспалительного медиатора (Рисунок 5А). Временные характеристики противовоспалительного действия бифидобактерий отражены также и в результатах изучения динамики количества мРНК гена ИЛ-8 (Рисунок 5Б). Наибольшая степень подавления бифидобактериями транскрипции гена ИЛ-8 наблюдается через 4 часа с момента обработки клеток НТ-29 фактором некроза опухоли а.

Рисунок 5. Изучение временных характеристик противовоспалительного действия бифидобактерий на кишечный эпителий. А - определение активности люциферазы в клетках НТ-29, трансфицированных плазмидой pGL3promoter-NFkB, обработанных липополисахаридом и супернатантом культуры штамма В. breve BrelO; Б - динамика мРНК ИЛ-8 в клетках НТ-29, обработанных ФНО-а и культуральными супернатантами бифидобактерий. Lon4 - штамм В. longum, Cat7 - штамм В. catenulatum, BrelO - штамм В. breve (по данным ОТ-ПЦР-РВ).

* Р < 0,05 по отношению к положительному контролю (ЛПС)

Для того, чтобы выяснить возможный механизм подавления активации транскрипционного фактора NF-кВ, была проведена оценка уровня фосфорилирования основного ингибитора NF-кВ — 1кВа. Иммунохимический анализ показал, что под действием бифидобактерий в клетках НТ-29, обработанных ЛПС и ФНО-а, снижается уровень фосфорилирования 1кВа. Данный эффект наблюдается через 30 минут после стимуляции эпителия провоспалительными медиаторами, а через 2 часа разница в количестве фосфорилированной формы 1кВа становится едва заметной (Рисунок 6).

ЛПС ++-+++ КС - - - bit Ion cat p-kBa jjgNijfe»™ - ««

GAPDH <тм» ттчячтщт

время 30' 120е

ФНО-а - + ++ + +- + + + <- + «С • - bif Ion cat bre - + bif Ion cat bre

GAPDH Щщщт.............—..................—

время 30' 120'

Рисунок 6. Определение уровня фосфорилирования 1кВа методом иммуноблотгинга в клетках НТ-29, обработанных ЛПС, ФНО-a и культуральными супернатантами (КС) бифидобактерий. Bif - штамм В. bifidum Bif3, Ion - штамм В. longum Lon4 и cat - штамм В. catenulatum Cat7.

Таким образом, реализация противовоспалительных свойств бифидобактерий на используемой модели воспаления происходит по меньшей мере за счет подавления активации транскрипционного фактора NF-кВ. Которое в свою очередь происходит в том числе вследствие снижения уровня фосфорилирования ингибитора NF-кВ - 1кВа.

Согласно результатам большого числа работ, компоненты сигнальных путей NF-кВ зачастую являются мишенями для метаболитов непатогенных бактерий. Так, было показано, что Lactobacillus casei и непатогенные для человека Salmonella pullorum блокируют транслокацию в ядро р65 субъединицы NF-кВ [Neish и соавт., 2000; Tien и соавт., 2006], а Вacteroides thetaiotaomiron активируют PPARy-зэвисимый экспорт из ядра той же субъединицы транскрипционного фактора [Kelly и соавт., 2004] и т. д.

В то же время проведенное на следующем этапе исследования изучение профилей экспрессии ряда генов в клетках НТ-29, обработанных супернатантами культур бифидобактерий и провоспалительными медиаторами, выявило более сложную картину, чем та, которую следовало ожидать при подавлении активации единственного транскрипционного фактора - NF-kB. Так, культуральные супернатанты всех изучаемых штаммов бифидобактерий в значительной степени подавляли стимулированную липополисахаридом и фактором некроза опухоли-а транскрипцию гена ИЛ-8 (Рисунок 7А). В то же время бифидобактерии не влияли на уровень мРНК генов CCL20 и 1кВа, экспрессия которых также находится под контролем транскрипционного фактора — NF-кВ. Уровень транскрипции еще одного NF-кВ-зависимого гена,

. + + + +

- • bif Ion cat

кодирующего неклассический ингибитор ОТ-кВ - 1кВ£, по нашим данным возрастает под влиянием супернатантов некоторых штаммов в присутствие ФНО-а. Сочетание провоспалительных медиаторов и культуральных сред бифидобактерий является также фактором, способствующим увеличению экспрессии гена регуляторного цитокина ТСР-р (Рисунок 7Б), исключительно важного для поддержания гомеостаза в слизистой оболочке кишечника.

— i—-—i—■—i-1-1—

яга вгею Lüo4 Cat7 pos. neg.

Рисунок 7. А - Уровень экспрессии гена ИЛ-8 в клетках НТ-29, обработанных ЛПС, ФНО-а и культуральными супернатантами бифидобактерий (по данным ОТ-ПЦР-РВ) ** Р < 0,01, * Р < 0,05 по отношению к положительному контролю. Б - Уровень экспрессии гена TGF-p в клетках НТ-29, обработанных ЛПС, ФНО-а и культуральными супернатантами бифидобактерий (по данным ОТ-ПЦР-РВ) ** Р < 0,01 по отношению к отрицательному контролю (neg). Bif3 - штамм В. bifidum, Lon4 - штамм В. longum, Cat7 - штамм В. catenulatum, BrelO - штамм В. breve. Pos - клетки, обработанные только ЛПС или ФНО-а (положительный контроль), neg - необработанные клетки (отрицательный контроль).

Экспрессия гена ИЛ-10 человека в клетках бифидобактерий с помощью серии челночных клонирующих векторов

С целью усиления естественной противовоспалительной активности бифидобактерий в настоящем исследовании были созданы штаммы-продуценты рекомбинантных белков с противовоспалительными свойствами. Первый этап на пути создания этих штаммов заключался в поиске регуляторных элементов, позволяющих проводить эффективную экспрессию в клетках бифидобактерий целевых генов.

Результатом данного этапа стало создание серии плазмидных векторов, несущих ген интерлейкина-10 человека. Всего было получено 9 векторных конструкций: 1) pESH92 — содержит ген ИЛ-10 под контролем промотора hup B.longum NCC2705 и сигнальной последовательности гена sec2 В. breve UCC2003, 2) pESH93 — содержит ген ИЛ-10 под контролем промотора дар В. longum и сигнальной последовательности гена sec2 В. breve, 3) pESH99 - вектор pESH93 с заменой сигнальной последовательности на укороченный вариант сигнального пептида sec2, 4) pESHIOO - вектор pESH93 с заменой сигнальной последовательности sec2 на сигнальный пептид гена атуВ В. adolescentis В48 (Рисунок 8), 5) pESHIOl - вектор pESH93 с заменой сигнальной последовательности на сигнальный пептид гена ариВ В. breve UCC2003, 6) pESH102 - дериват pESH93, кодирующий ИЛ-10 с N-концевым гексагистидиновым эпитопом, 7) pESH103 - дериват pESH93, кодирующий ИЛ-10 с С-концевым гексагистидиновым эпитопом, 8) pESH93-SPamy-tuf - дериват pESHIOO, с заменой промотора Рдар на промотор Ptuf из гена tuf В. breve UCC2003, 9) pESH93-G5Dreg - дериват pESH93, содержащий ген ИЛ-10 под контролем промоторов Рдар, Pg5d и сигнальной последовательности гена g5d. Расчетные аминокислотные последовательности фрагментов плазмид pESH93 — pESH103 представлены в таблице 1.

Таблица 1. Расчетные аминокислотные последовательности участков между сигнальными пептидами и последовательностью белка ИЛ-10, кодируемые векторами pESH93 — pESH103 (подчеркнуты предполагаемые сайты распознавания сигнальной пептидазы, стрелкой указаны сайты расщепления, первая аминокислота ИЛ-10 выделена жирным шрифтом, SP — сигнальные пептиды генов sec2, атуВ, ориВ)

Плазмида Полипептид

PESH93 (SP sec2 31 a.o.)-AQAi^DQLPNPDWVAL-HM-(IL-10 161 a.o.)

pESH99 (SP sec2 31 a.o.)-AQAi-HM4IL-10 161 a.o.)

pESHIOO (SP amyB 41 a.o.)-AQM-HM-(IL-10 161 a.o.)

pESHIOl (SP apuB 31 a.o.WVSAl-HM-dL-10161 a.o.)

pESH102 (SP sec2 31 a.o.)-AOAl-DQLPNPDWVAL-HSHffiJHHH-GM-(IL-10 161 a.o.)

pESH103 (SP sec2 31 a.o.)-AOA 1 -DQLPNPDWVAL-HM-(IL-10 161 a.o ,)-HHHHHH

Всеми полученными плазмидами трансформировали штаммы бифидобактерий В. breve UCC2003 и/или В. longum NCC2705. Изучение субклеточной локализации ИЛ-10 в трансформированных штаммах бифидобактерий показало, что целевой белок присутствует как в цитоплазматической фракции, так и в супернатантах бактериальных культур. Белки, находящиеся в цитоплазме имеют молекулярную массу соответствующую предсказанной молекулярной массе препротеина, содержащего сигнальный пептид — 23-24 кДа (Рисунок 9А). При анализе

культуральных супернатантов методом иммуноблоттинга на наличие растворимого ИЛ-10 в случае выращивания бактерий в среде RCM зоны иммунореактивности для штаммов, трансформированных плазмидами pESH93 pESH92, находились на уровне 14 кДа и ниже. Возможно, это связано с деградацией рекомбинантного белка при низких значениях рН питательной среды. Штамм, трансформированный плазмидой pESHIOO, секретировал белок, устойчивый к деградации, который тем не менее имел молекулярную массу соответствующую расчетной для препротеина SPamyB-ILlO (23,4 кДа), а не для процессированного зрелого белка (18,9 кДа). Данный факт свидетельствует, вероятно, о неспособности сигнальной пептидазы В. breve отщеплять сигнальный пептид в среде RCM. Для того, чтобы создать подходящие условия для корректного сортинга, процессинга и сохранения рекомбинантного белка ИЛ-10 в последующих экспериментах штаммы бифидобактерий культивировали в среде DMEM с добавлением буфера HEPES.

При выращивании в забуференной среде DMEM штаммы В. breve, трансформированные плазмидами pESH99 и pESHIOl, не секретировали целевой белок в детектируемых концентрациях. Напротив, кулыуры В. breve, трансформированные плазмидами pESH93, pESHIOO, pESH102 и pESH103, секретировали значительное количество интерлейкина-10 (Рисунок 9Б).

Рисунок 8. Схема клонирующего вектора рЕЭШОО для экспрессии гена ИЛ-10 в клетках бифидобактерий.

кДа 1 2 3 456789

Рисунок 9. Определение с помощью иммуноблоттинга (антитела к ИЛ-10 человека) субклеточной локализации и целостности рекомбинантного ИЛ-10 человека, продуцируемого штаммами В. breve UCC2003, трансформированными плазмидами. А,

клеточные лизаты: 1 - pESH92; 2 - pESH93; 3 - pESH102; 4 - pESH103; 5 - pESHIOl; 6 -pESHIOO; 7 - не трансформированный штамм; Б, концентрированные культуралъные среды: 1 и 2 - штаммы, трансформированные pESH92 и pESH93 в среде RCM; 3, 4, 5, 6 и 7 -штаммы,трансформированные pESH93, pESH102, pESH103, pESH99 и pESHIOl соответственно в среде DMEM; 8 - штамм с плазмидой pESHIOO в среде RCM; 9 - штамм с плазмидой pESHIOO в среде DMEM.

Экспрессию гена ИЛ-10 в клетках бифидобактерий оценивали также с помощью ПЦР в реальном времени. Промотор Рдар обеспечивал более высокий уровень экспрессии мРНК целевого белка ИЛ-10 по сравнению с промотором Рhup. Замена сигнального пептида SPsec2 на сигнальную последовательность гена атуВ приводила к резкому увеличению уровня мРНК ИЛ-10 (Рисунок 10А). Максимальная концентрация ИЛ-10 (1,9 нг/мл по данным ИФА-теста) была обнаружена в супернатантах штамма В. breve, несущего плазмиду pESHIOO (Рисунок 10Б), что согласуется с данными, полученными с помощью ПЦР в реальном времени.

Таким образом, максимальный уровень продукции белка и правильный его процессинг обеспечивала генетическая конструкция, содержащая ген ИЛ-10, объединенный с сигнальной последовательностью а-амилазы, под контролем промотора гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы. Микроорганизмы, содержащие данный вектор (pESHIOO), синтезировали и секретировали зрелый ИЛ-10 не только при росте в специализированной питательной среде, но и при ферментации молока.

160 х I МО

2500

§ 500' .

Q. r^l.í*!---era

1 1500

° 1000

I 2000

PESH93 pESH101 pESH92 pESH100

pESH92 pESH101 pESH93 pESH100

Рисунок 10. A - Уровни мРНК ИЛ-10 в штаммах В. breve UCC2003, трансформированных ллазмидами pESH92, pESH93, pESHIOO, pESHIOl, несущими ген ИЛ-10 человека (по результатам ОТ-ПЦР-РВ); Б - Определение с помощью ИФА интерлейкина-10 в культуральных супернатантах штаммов В. breve UCC2003, трансформированных различными вариантами плазмид, содержащих ген ИЛ-10 человека.

Клонирование и экспрессия гена D2E7mut

Исходя из полученных данных по экспрессии гена ИЛ-10 с использованием серии клонирующих векторов, для последующих экспериментов был выбрана плазмида pESHIOO. После удаления гена ИЛ-10 в данный вектор был клонирован ген D2E7mut, кодирующий мутантный вариант (со значительно уменьшенным значением KD) человеческого scFv-миниантитела к ФНО-a (клон D2E7 — основа препарата адалимумаб, «Хумира», Abbot). Нуклеотидная последовательность D2E7mut была оптимизирована по кодонному составу для экспрессии в клетках бифидобактерий и синтезирована из 16 пар перекрывающихся олигонуклеотидов. С-концевая часть последовательность содержала эпитоп 6xHis и эпитоп С-Мус для последующей детекции рекомбинантного белка при помощи стандартных коммерческих антител. Полученной плазмидой (pESH100/D2E7) трансформировали штамм В. longum

В цитоплазматической фракции В. ¡опдит 1ЧСС2705, трансформированного плазмидой рЕ5Н100/Б2Е7, с помощью вестерн-блоттинга выявлялось рекомбинантное миниантитело, по молекулярной массе соответствующее непроцессированному протеину (35 кДа). В супернатантах культур присутствовал как зрелый белок (с молекулярной массой 28,5 кДа), так и в меньшем количестве, белок, несущий сигнальный пептид (Рисунок 11А). Концентрация миниантител в клетках бифидобактерий составляла примерно 25 нг/мл.

NCC2705.

А 1 2 3 4 5 6 Б 1 2 3 4 5 6

ттШ Лао i '

«hE*F___ —30 В ■ ^

«• '—20

* — 15 — 10

Рисунок IX. Детекция рекомбинантных миниантител к ФНО-а в клеточных лизатах и супернатантах штамма В. longum NCC2705, трансформированного плазмидой pESH100/D2E7 (имуноблоттинг, окрашивание антителами к эпитопу С-шус). А: 1, 2 —

клеточная фракция В. longum NCC2705, трансформированного плазмидой pESH100/D2E7; 3 — клеточная фракция ^трансформированного контроля; 4, 5 — концентрированные супернатанты В. longum NCC2705 [pESH100/D2E7]; 6 - концентрированный супернатант контрольного штамма; Б: 1 - клеточная фракция В. longum NCC2705 [pESH100/D2E7]; 2-6 — разведения препарата миниантитела, выделенного из Е. coli: 0,0625 мкг/мл, 0,125 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 1 мкг/мл соответственно.

Изучение биологической активности рекомбинантных белков, секретируемых штаммами бифидобактерий.

В экспериментах по изучению биологической активности тестировали препараты культуральных сред бифидобактерий, наличие рекомбинантных белков в которых подтверждали с помощью иммуноблоттинга. Для изучения биологической активности рекомбинантного ИЛ-10, вырабатываемого В. breve UCC2003 [pESHIOO], препаратом концентрированного супернатанта данного штамма обрабатывали культуру НТ-29, после чего стимулировали клетки ФНО-а. Спустя 4 часа в клеточных лизатах с помощью ПЦР в реальном времени оценивали уровень экпрессии гена ИЛ-8. Концентрированные культуральные супернатанты штамма В. breve UCC2003, трансформированного «пустой» плазмидой pESH80, и коммерческий препарат рекомбинантного ИЛ-10 человека использовали в качестве отрицательного и положительного контроля соответственно. Было показано, что в отличие от супернатантов контрольного штамма В. breve, концентрированный супернатант штамма В. breve UCC2003 [pESHIOO] (содержащий ИЛ-10 в концентрации примерно 40 нг/мл) снижал на 53% стимулированную ФНО-а экспрессию гена ИЛ-8 (Рисунок 12А).

Для проверки биологической активности рекомбинантных миниантител к ФНО-а, продуцируемых бифидобактериями, препарат ФНО-а перед добавлением его к культуре НТ-29 инкубировали с супернатантом штамма В. longum NCC2705 [pESH100/D2E7]. После этого в клеточных лизатах НТ-29 оценивали количество мРНК нескольких генов, экспрессия которых регулируется ФНО-а (ТкВа, CCL20, IL8). В качестве препарата сравнения использовали супернатанты нетрансформированного штамма NCC2705.

т>-е ксгт im

Рисунок 12. Изучение биологической активности рекомбинантных белков, продуцируемых генетически-модифицированными штаммами бифидобактерин. А

Определение методом ОТ-ПЦР-РВ уровня экспрессии гена ИЛ-8 в клетках НТ-29, обработанных ФНО-а и супернатантами штаммов бифидобактерий, трансформированных плазмидами рЕЗНЮО, рЕБШО (см. текст). Б Определение методом ОТ-ПЦР-РВ уровня экспрессии генов ИЛ-8, ССТ20, 1кВа в клетках НТ-29, обработанных ФНО-а, и супернатантами бифидобактерий-продуцентов анти-ФНО-а антител. N002705 - клетки, обработанные ФНО-а и супернатантом контрольного нетрансформированного штамма В. \ongum N002705; Б2Е7 - клетки, обработанные ФНО-а и супернатантом штамма В. 1опдит N002705, трансформированного плазмидой рЕ5Н100ЯЭ2Е7. К- (отр. контроль) - не обработанные клетки НТ-29, ФНО-а (пол. контроль) - клетки, обработанные только ФНО-а.

** Р < 0,01, * Р < 0,05 по отношению к положительному контролю.

Как было показано ранее, наибольшие изменения при обработке культуры НТ-29 фактором некроза опухоли-a претерпевает экспрессия гена IL8, и в меньшей степени - CCL20 и 1кВа. Супернатант штамма В. longum NCC2705, трансформированного плазмидой pESH100/D2E7, на 84% снижал ФНО-а зависимую экспрессию гена IL8, на 60% экспрессию гена CCL20, на 35% экспрессию гена ТкВа (Рисунок 12Б). Контрольный штамм В. longum NCC2705

с достоверными показателями изменял только количество мРНК ИЛ-8, что вероятно является отражением его собственной противовоспалительной активности, как представителя рода Bifidobacterium. На экспрессию генов CCL20,1кВа контрольный штамм В. longum влияния не оказывал.

Таким образом было показано, что полученные методами генетической инженерии штаммы бифидобактерий способны осуществлять продукцию и секрецию рекомбинантных белков - интерлейкина-10 человека и миниантител к ФНО-а. Продуцируемые бифидобактериями рекомбинантные белки продемонстрировали биологическую активность на модели воспаления in vitro.

За последнее десятилетие опубликован ряд работ, доказывающих возможность получения биологически активных белков в бифидобактериях, таких как холестеролоксидаза или педиоцин РА-1 [Moon и соавт., 2005; Park и соавт., 2008], а также возможность использования полученных методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий для продукции in situ в организме человека белков с терапевтическими свойствами (вакцинных антигенов, ферментов и др.) [Sasaki и соавт., 2006; Takata и соавт., 2006]. Продолжением этой линии исследований является и часть настоящей работы, посвященная получению штаммов бифидобактерий, секретирующих рекомбинантные белки - ИЛ-10 человека и миниантител к ФНО-а.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы бифидобактерий, выделенные из кишечника здоровых детей, обладают противовоспалительной активностью в in vitro модели кишечного воспаления, подавляя секрецию основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ФНО-а) клеточной линией кишечных эпителиоцитов НТ-29.

2. Противовоспалительная активность бифидобактерий имеет дозозависимый характер и реализуется за счет действия секретируемых термостабильных низкомолекулярных метаболитов (Мг < 3 кДа), резистентных к обработке протеазами и нуклеазами.

3. Молекулярный механизм противовоспалительной активности секретируемых метаболитов бифидобактерий связан с их участием в подавлении активации сигнального пути NF-кВ, снижении уровня фосфорилирования 1кВа и модуляции экспрессии генов, вовлеченных в процессы воспаления, хемотаксиса и регуляции клеточного цикла.

4. Созданные в ходе исследования челночные клонирующие векторы Е. coli — Bifidobacterium обеспечивают экспрессию и секрецию в клетках бифидобактерий рекомбинантного человеческого ИЛ-10 и рекомбинантных человеческих анти-ФНО-а миниантител.

5. Полученные генно-инженерные штаммы бифидобактерий,

продуцирующие рекомбинантный ИЛ-10 человека и рекомбинантные человеческие анти-ФНО-а миниантитела, обладают противовоспалительной активностью, выражающейся в подавлении экспрессии ИЛ-8 клеточной линией НТ-29, стимулированной ФНО-а.

Практические рекомендации

Изучение противовоспалительной активности микроорганизмов может быть рекомендовано как дополнительный критерий при выборе штаммов для включения в состав пробиотических препаратов, наряду с изучением их антагонистических свойств по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, способности к адгезии к эпителиальным клеткам, устойчивости к низким значениям pH, высоким концентрациям солей желчных кислот и т. д.

Созданные нами клонирующие векторы, обеспечивающие экспрессию гетерологичных белков в бифидобактериях, могут быть использованы для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии бифидобактерий и созданию штаммов бифидобактерий с заданными свойствами.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шкопоров А.Н., Хохлова Е.В. Молекулярная идентификация изолятов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей раннего возраста // Материалы I Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции.- Москва, 2006,- С. 443-444.

2. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С., Смеянов В.В., Кириллов М.Ю., Постникова Е.А., Максимов Ф.Е., Хохлова Е.В., Ефимов Б. А. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста // Журнал «Вестник РАМН», 2006, № 1.- С. 45-50.

3. Efimov В.А., Shkoporov A.N., Khokhlova E.V., Steele J.L., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V. Characterization of plasmid DNAs from human infant Bifidobacterium strains: sequence analysis and construction of E. coli-Bifidobacterium shuttle vectors // Материалы международного симпозиума «Propionibacteria and Bifidobacteria: Dairy and Probiotic Applications».-Wadahl, 2007,- P. 25.

4. Shkoporov A.N., Khokhlova E.V., Kulagina E.V., Smeianov V.V., Kafarskaia L.I., Efimov B.A. Application of several molecular techniques to study numerically predominant Bifidobacterium spp. and Bacteroidales order strains in the feces of healthy children // «Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry», 2008, № 72:3,- P.-742-748.

5. Ефимов Б.А., Шкопоров A.H., Хохлова E.B., Афанасьев С.С., Кулагина Е.В., Кафарская Л.И. Плазмиды бифидобактерий и их использование в генетической инженерии // «Вестник РАМН», 2008, N° 2.- С. 16-21.

6. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Steele J.L., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V. Characterization of plasmids from human infant Bifidobacterium strains: sequence analysis and construction of E. coli-Bifldobacterium shuttle vectors // «Plasmid», 2008, № 60:2,- C. 136-148.

7. Shkoporov A.N., Efimov B.A., Khokhlova E.V., Kafarskaia L.I., Smeianov V.V. Production of human basic fibroblast growth factor (FGF-2) in Bifidobacterium breve using a series of novel expression/secretion vectors // «Biotechnology Letters», 2008, №30:11. - C. 1983-1988.

8. Khokhlova E.V., Efimov B.A., Kafarskaia L.I., Shkoporov A.N. Heterologous expression of secreted biologically active human interleukin-10 in Bifidobacterium breve II «Archives of Microbiology», 2010, T. 192, № 9, C. 769-774.

9. Khokhlova E.V., Efimov B.A., Kafarskaya L.I., Pavlova S.I., Shkoporov A.N. Anti-inflammatory properties of Bifidobacterium spp. strains isolated from healthy infant feces // Материалы конференции «The Joint Meeting of The XVIIth International Symposium on Gnotobiology and The XXXIVth Congress of the Society for Microbial Ecology and Disease», Yokohama, 2011, P. 130.

10. Khokhlova E.V., Smeianov V.V., Efimov B.A., Kafarskaya L.I., Pavlova S.I., Shkoporov A.N Anti-inflammatory properties of intestinal Bifidobacterium strains isolated from healthy infants // «Microbiology and Immunology», 2011 Nov 1. doi: 10.1111/j.l348-0421.2011.00398.x.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ФНО-а - фактор некроза опухоли а

ИЛ-8 - интерлейкин-8

ИЛ-10 - интерлейкин-10

ИФА - иммуноферментный анализ

ЛПС - липополисахарид

ОТ-ПЦР-РВ - полимеразная цепная реакция в режиме реального времени, совмещенная с обратной транскрипцией

ДСН-ПААГ - гель-электрофорез в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия

ПВДФ - поливинилдифторид

Подписано в печать: 21.12.11

Объем: 1,5 усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 1085 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, Проспект Вернадского д.39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Хохлова, Екатерина Викторовна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Введение

1.2 Бифидобакгерии как облигатные представители кишечного микробиоценоза

1.3 Взаимодействие микрофлоры с системой врожденного иммунитета в кишечнике

1.4 Вклад бактерий нормальной микрофлоры в поддержание гомеостаза в кишечнике

1.5 Механизмы подавления воспалительного ответа на антигены нормальной микрофлоры в кишечнике

1.6 Микроорганизмы как векторы для направленной доставки лекарственных препаратов в кишечник

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные культуры

2.2 Фракционирование бактериальных культур

2.3 Культуры эукариотических клеток

2.4 Изучение связывания ЛПС с клетками и проточная цитометрия

2.5 Выделение ДНК из бактерий

2.6 ПЦР. ПЦР в реальном времени

2.7 Методы молекулярного клонирования. Синтез гена

2.8 Анализ экспрессии репортерного гена люциферазы

2.9 Выделение РНК и обратная транскрипция

2.10 Синтез олигонуклеотидов

2.11 Трансформация бифидобактерий и кишечной палочки

2.12 Иммуноферментный анализ

2.13 Электрофорез в агарозном и полиакриламидом геле

2.14 Секвенирование плазмидных ДНК

2.15 Выделение и очистка белков. Высаливание, диализ. Ионообменная хроматография. Масс-спектрометрический анализ

2.16 Иммуноблотгинг

2.17 Методы биоинформатики и статистической обработки данных

Глава 3. Собственные результаты

3.1 Изучение противовоспалительной активности комменсальных штаммов бифидобактерий

3.2 Изучение химических свойств активных компонентов культуральных супернатантов бифидобактерий

3.3 Изучение механизма противовоспалительной активности бифидобактерий

3.4 Изучение влияния бифидобактерий на экспрессию в клетках НТ-29 генов, продукты которых вовлечены в процессы воспаления и апоптоза

3.5 Изучение секретируемых белков В. breve UCC

3.6 Экспрессия гена ИЛ-10 человека в клетках бифидобактерий с помощью серии челночных клонирующих векторов

3.7 Клонирование и экспрессия гена D2E7mut

3.8 Изучение биологической активности рекомбинантных белков, секретируемых штаммами бифидобактерий

Глава 4. Обсуждение полученных результатов 89 Выводы 101 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами"

Актуальность

Одной из первых групп мутуалистических бактерий, заселяющих стерильный кишечник доношенных новорожденных после естественных родов, являются бифидобактерии. Род Bifidobacterium относится к классу Actinobacteria и включает в себя грамположительные неспорообразующие облигатно-анаэробные палочки с высоким содержанием пар гуанин-цитозин в геномной ДНК [323]. Благотворное влияние бифидобактерий на физиологию желудочно-кишечного тракта и всего организма в целом связывают с их способностью к конкурентному подавлению патогенных и условно-патогенных бактерий, способностью к продукции витаминов и других биологически активных соединений, а также противовоспалительной, антиканцерогенной и иммуномодулирующей активностью [94, 160, 266, 292]. Позитивные свойства бифидобактерий в сочетании с полным отсутствием факторов патогенности объясняют высокий интерес исследователей к данной группе микроорганизмов.

С позиции практической медицины одним из наиболее важных свойств бифидобактерий является их противовоспалительная активность. Известно, что у больных с тяжелыми воспалительными заболеваниями кишечника (болезнью Крона, неспецифическим язвенным колитом) наблюдается резкое снижение титра бифидобактерий и ряда других комменсалов (бактероидов, клостридий групп ГХа и IV, Faecalibacteriam pranstnitzii) в фекальной микрофлоре [84, 222, 291]. Одновременно с этим была показана способность ряда пробиотических формул, содержащих бифидобактерии, вызывать и поддерживать стойкую ремиссию у пациентов с неспецифическим язвенным колитом, синдромом раздраженного кишечника и резервуарным илеитом [113, 209]. Исследования с использованием животных и клеточных моделей также выявили способность бактерийных препаратов на основе бифидобактерий подавлять развитие воспаления в слизистой оболочке толстого кишечника, снижать интенсивность симптомов колита, подавлять секрецию провоспалительных цитокинов и стимулировать продукцию противовоспалительных факторов иммунокомпетентными клетками [191, 206]. Однако вопрос о механизме этой противовоспалительной активности и роли секретируемых метаболитов и компонентов клеток бифидобактерий в ее проявлении до сих пор остается открытым.

Выяснение молекулярных механизмов противовоспалительного эффекта бифидобактерий расширит наши представления о путях взаимодействия бактерий-комменсалов с организмом хозяина, позволит глубже понять роль микрофлоры в регуляции воспалительных процессов в кишечнике, и приведет к созданию новых лекарственных средств для лечения воспалительных заболеваний кишечника. Однако дальнейшие исследования в этом направлении невозможны без активного использования современных подходов молекулярной биологии, биохимии, геномики и протеомики. В последние два десятилетия совершен значительный рывок в изучении генетики и молекулярной биологии бифидобакгерий: просеквенированы геномы нескольких видов бифидобактерий, созданы генетические векторные системы, совершенствуются методы генетической трансформации бифидобактерий [172, 277, 283, 304].

Адаптация современных методов генетической инженерии к работе с бифидобактериями открывает новый этап в изучении биологии данных микроорганизмов и разработке принципиально нового класса пробиотических препаратов на их основе [71]. Одним из перспективных направлений может стать получение штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами за счет продукции ими ряда рекомбинантных белков — противовоспалительных цитокинов, миниантител, растворимых рецепторов. В то же время недостаточно проработанным остается вопрос о подходах к эффективной продукции гетерологичных рекомбинантных белков в бифидобактериях. Требуется проведение дополнительных исследований' с целью получения клонирующих векторов, обеспечивающих высокий уровень экспрессии гетерологичных генов и требуемую субклеточную локализацию целевых рекомбинантных белков.

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна

В ходе настоящего исследования с использованием модели кишечных эпителиоцитов впервые показано наличие противовоспалительных свойств у широкого круга штаммов бифидобактерий, выделенных из кишечника здоровых детей. Обнаружено, что свежевыде ленные изоляты бифидобактерий обладают более выраженной противовоспалительной активностью по сравнению со штаммами, культивированными in vitro в течение длительного времени. Показано, что противовоспалительная- активность штаммов бифидобактерий различных видов связана с секрецией низкомолекулярных термо стабильных соединений, которые подавляют продукцию провоспалительных цитокинов в культуре клеток. Впервые изучены особенности транскрипционного ответа кишечных эпителиоцитов на воздействие бифидобактерий: Продемонстрировано, что бифидобактерии, не оказывая влияния на базальный уровень транскрипции, модулируют экспрессию генов ИЛ-8, CCL20, 1кВ£, р21С1р в условиях стимуляции клеток ЛПС и ФНО-а. Определен примерный механизм противовоспалительной активности бифидобактерий. Продемонстрирована способность бифидобактерий к подавлению активности транскрипционного фактора NF-кВ и снижению фосфорилирования его ингибитора — 1кВа.

Впервые проведено сравнительное изучение эффективности экспрессии рекомбинантного человеческого ИЛ-10 в бифидобактериях с использованием различных регуляторных элементов — промоторов, сайтов инициации трансляции, сигнальных пептидов, заимствованных из нескольких генов бифидобактерий видов В. breve, В. longum, В. adolescentis. Показано, что наивысший уровень экспрессии и корректный процессинг рекомбинантного белка достигается при использовании промотора гена gap В. longum и сигнального пептида белка АтуВ В. adolescentis. С использованием наиболее эффективных регуляторных элементов были созданы клонирующие векторы и получены штаммы бифидобактерий, -продуцирующие рекомбинантный ИЛ-10 человека и рекомбинантные человеческие миниантитела к ФНО-а. Противовоспалительная активность данных штаммов была продемонстрирована in vitro на модели воспалительного ответа в клеточной культуре НТ-29.

Практическая значимость работы

Сконструированные в данной работе клонирующие векторы, обеспечивающие эффективную экспрессию гетерологичных генов в бифидобактериях, могут быть использованы для создания штаммов, продуцирующих рекомбинантные белки: цитокины, антитела, вакцинные антигены, вещества с антимикробной активностью, ферменты. В ходе исследования получены штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантные белки с противовоспалительной активностью — ИЛ-10 человека и человеческие миниантитела к ФНО-а.

Положения, выносимые на защиту

3. Созданные в ходе настоящего исследования клонирующие векторы позволяют получать штаммы бифидобактерий, экспрессирующие и секретирующие рекомбинантный интерлейкин-10 человека' и рекомбинантные анти-ФНО-а миниантитела. Полученные штаммы-продуценты рекомбинантных белков обладают противовоспалительной активностью в in vitro модели кишечного воспаления.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в материалы лекционного курса и практических занятий для студентов, врачей-интернов и клинических ординаторов, проходящих обучение на кафедре микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития.

Полученные в ходе работы рекомбинантные плазмиды используются на кафедре микробиологии и вирусологии и в лаборатории микробиологии и биологической безопасности ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии бифидобактерий и созданию штаммов бифидобактерий с заданными свойствами.

Апробация работы

Основные положения работы были доложены на заседании совместной научно-практической конференции кафедр микробиологии, биохимии и медицинских нанобиотехнологий ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздравсоцразвития 9 июня 2011, а также на 15-ом международном конгрессе International Congress of Mucosal Immunology (5-9 июля 2011, Париж) и на 34-ом международном конгрессе Congress of Society for Microbial Ecology and Disease (20-23 ноября 2011, Йокогама).

Публикации

Объем и структура работы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Хохлова, Екатерина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Штаммы бифидобактерий, выделенные из кишечника здоровых детей, обладают противовоспалительной, активностью в: in vitro модели^ кишечного воспаления, подавляя1 секрецию основных провоспалительных цитокинов (ИЛ-8 и ФНО-а) клеточной линией кишечных эпителиоцитов НТ-29:

2. Противовоспалительная активность бифидобактерий имеет дозозависимый характер и реализуется за счет действия секретируемых. термостабильных низкомолекулярных метаболитов (Мг< 3 кДа), резистентных к обработке протеазой и нуклеазами.

5. Полученные генно-инженерные штаммы бифидобактерий, продуцирующие рекомбинантный ИЛ-10 человека и рекомбинантные человеческие анти-ФНО-а миниантитела, обладают противовоспалительной активностью, выражающейся в подавлении экспрессии ИЛ-8 клеточной линией НТ-29, стимулированной ФНО-а.

Практические рекомендации

Изучение противовоспалительной активности микроорганизмов может быть рекомендовано как дополнительный критерий при выборе штаммов для включения в состав пробиотических препаратов, наряду с изучением их антагонистических свойств по отношению к патогенным и условно-патогенным бактериям, способности к адгезии к эпителиальным клеткам, устойчивости к низким значениям рН, высоким концентрациям солей желчных кислот и т. д.

Созданные нами клонирующие векторы, обеспечивающие экспрессию гетерологичных белков в бифидобакгериях, могут быть использованы для проведения фундаментальных и прикладных исследований, посвященных изучению биологии бифидобактерий и созданию штаммов бифидобактерий с заданными свойствами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Хохлова, Екатерина Викторовна, Москва

1. Афанасьев С.С., Поспелова В.В., Шендеров Б А., Алешкин В А., Лахтин В.М., Лахтин М.В. Лектины, агдезины и лектиноподобные вещества лактобацилл и бифидобактерий. Вестник Российской Академии медицинских наук. 2006.-N 1 .-С.28-34

2. Барзашка-Попова С.Н. Коррекция микрофлоры и местного иммунитета кишечника при дисбактериозах с помощью лактобацилл. Автореф. дисс. на соискание уч. степени канд. мед. наук. М., 1990,- 24 с.

3. Бондаренко В.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидо- и лактобактерий. Журнал Микробиологии Эпидемиологии и Иммунобиологии. 2006, (2):89-97.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора-человека, её защитная роль в организме и обоснование сфер, применения препарата бифидумбактерин. Автореф. дисс. на соискание уч. степени докг. биол. наук. М:, 1982.

5. Ефимов Б.А. Микроэкология кишечника человека, коррекция микрофлоры при дисбиотических состояниях. Диссертация на соискание ученой степени доктора медицинских наук. М., 2005.

6. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А; Рациональные подходы к проблеме коррекции микрофлоры кишечника. Вестник Российской академии медицинских наук. 1996. № 2, с. 6064.

7. Хромова С.С., Ефимов Б.А., Тарабрина Н.П., Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Сепиашвили Я.Р. Иммунорегуляция в системе микрофлора интестинальный тракт. Аллергология и иммунология, том 5, №2 май 2004,265-271.

8. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология: некоторые итоги и перспективы исследований. Вестник РАМН. 2005. - № 12. - С. 13-17.

9. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С., Смеянов В.В., Кириллов М.Ю., Постникова Е.А., Максимов Ф.Е., Хохлова Е.В., Ефимов Б.А. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста.

10. Вестник Российской Академии Медицинских Наук. №1, 2006. Москва, Медицина.45-50.

11. Abbad Andaloussi S, Talbaoui H, Marczak R, Bonaly R. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum. Appl Microbiol Biotechnol. 1995 Nov;43(6):995-1000.

12. Abraham C, Cho JH. Functional consequences of NOD2 (CARD15) mutations. Inflamm Bowel Dis. 2006 Jul;12(7):641-650.

13. Abreu MT, Fukata M; Arditi M. TLR' signaling in the gut in healtht and disease. J Immunol. 2005 Apr 15;174(8):4453-4460.

14. Akira S, Uematsu S, Takeuchi'O. Pathogen recognition and. innate immunity. Cell. 2006 Feb 24; 124(4):783-801.

15. Akira S. Pathogen recognition by innate immunity and its signaling. Proc. Jpn. Acad. 2009. doi: 10.2183/pjab/85.143.

16. Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and activation ofNF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 2001 Oct 18;413(6857):732-738.

17. Andoh A, Yagi Y, Shioya M, Nishida A, Tsujikawa T, Fujiyama Y. Mucosal cytokine network in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2008 Sep 7;14(33):5154-5161.

18. Ansel KM, Djuretic I, Tanasa B, Rao A. Regulation of Th2 differentiation and 114 locus accessibility. Annu Rev Immunol. 2006;24:607-656.

19. Aujla SJ, Dubin PJ, Kolls JK. Thl7 cells and mucosal host defense. Semin Immunol. 2007 Dec;19(6):377-382.

20. Ayabe T, Satchell DP, Wilson CL, Parks WC, Selsted ME, Ouellette AJ. Secretion of microbicidal alpha-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria. Nat Immunol. 2000 Aug;l(2):113-118.

21. Bach JF. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases. N Engl J Med. 2002 Sep; 347(12):911-920:

22. Baeuerle PA, Henkel T. Function and activation of NF-kappa B in the immune system: Annu Rev Immunol. 1994;12:141-179.

23. Baert F, Noman M, Vermeire S, Van Assche G, D1 Haens G, Carbonez A, Rutgeerts P. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. N Engl J Med: 2003 Feb 13;348(7):601-608.

24. Bai AP, Ouyang Q, Zhang W, Wang CH, Li SF (2004) Probiotics inhibit TNF-alpha-induced interIeukin-8 secretion of HT29 cells. World J Gastroenterol 10:455-457.

25. Bansal T, Alaniz RC, Wood TK, Jayaraman A (2010) The bacterial signal indole increases epithelial-cell tight-junction resistance and attenuates indicators of inflammation: Proc Natl Acad SciUS A 107:228-233

26. Barbara G, Xing Z, Hogaboam CM, Gauldie J, Collins SM (2000) Interleukin 10 gene transfer prevents experimental colitis in rats. Gut 46:344-349

27. Baricault L, Denariaz G, Houri JJ, Bouley C, Sapin C, Trugnan G. Use of HT-29, a cultured human colon cancer cell line, to study the effect of fermented milks on colon cancer cell growth and differentiation. Carcinogenesis. 1995 Feb;16(2):245-252.

28. Barnes PJ, Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription factor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med. 1997 Apr 10;336(15):1066-1071.

29. Barnes MJ, Powrie F. Regulatory T cells reinforce intestinal homeostasis. Immunity. 2009 Sep 18;31(3):401-411.

30. Bassler BL, Losick R. Bacterially speaking. Cell. 2006 Apr 21;125(2):237-246.

31. Bates JM, Akerlund J, Mittge E, Guillemin K. Intestinal alkaline phosphatase detoxifies lipopolysaccharide and prevents inflammation in zebrafish in response to the gut microbiota. Cell Host Microbe. 2007 Dec 13;2(6):371-382.

32. Becker A, Katzen F, Puhler A, Ielpi L. Xanthan gum biosynthesis and application: a biochemical/genetic perspective. Appl Microbiol Biotechnol. 1998 Aug;50(2): 145-152.

33. Beg AA, Ruben SM, Scheinman RI, Haskill S, Rosen CA, Baldwin AS Jr. I kappa B interactswith the nuclear localization sequences of the subunits of NF-kappa B: a mechanism for cytoplasmic retention. Genes Dev. 1992 0ct;6(10):1899-1913.

34. Beg AA, Baldwin AS Jr. The I kappa B proteins: multifunctional regulators of Rel/NF-kappa B transcription factors. Genes Dev. 1993 Nov;7(ll):2064-2070.

35. Beltrán CJ, Candía E, Erranz B, Figueroa C, Gonzalez MJ, Quera R, Hermoso MA. Peripheral cytokine profile in Chilean patients with Crohn's disease and ulcerative colitis. Eur Cytokine Netw. 2009 Mar;20(l):33-38.

36. Bhavsar MD, Amiji MM. Oral IL-10 gene delivery in a microsphere-based formulation for local transfection and therapeutic efficacy in inflammatory bowel disease. Gene Ther. 2008 Sep;15(17): 1200-1209.

37. Blaschitz C, Raffatellu M. Thl7 cytokines and the gut mucosal barrier. J Clin Immunol. 2010 Mar;30(2): 196-203.

38. Bolotin A, Wincker P, Mauger S, Jaillon O, Malarme K, Weissenbach J, Ehrlich SD, Sorokin A. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 2001 May; 11(5):731-753.

39. Bommireddy R, Doetschman T. TGFbetal and Treg cells: alliance for tolerance. Trends Mol Med. 2007 Nov;13(ll):492-501.

40. Bowie A, O'Neill LA. The interleukin-1 receptor/Toll-like receptor superfamily: signal generators for pro-inflammatory interleukins and microbial products.J Leukoc Biol. 2000 Apr;67(4):508-14.

41. Braat H, Peppelenbosch MP, Hommes DW (2003) Interleukin-10-based therapy for inflammatory bowel disease. Expert Opin Biol Ther 3:725-731

42. Broekaert IJ, Nanthakumar NN, Walker WA (2007) Secreted probiotic factors ameliorate enteropathogenic infection in zinc-deficient human Caco-2 and T84 cell lines. Pediatr Res 62:139

43. Briistle A, Heink S, Huber M, Rosenplanter C, Stadelmann C, Yu P, Arpaia E, Mak TW, Kamradt T, Lohoff M. The development of inflammatory T(H)-17 cells requires interferon-regulatory factor 4. Nat Immunol. 2007 Sep;8(9):958-966.

44. Caldas, T. D., A. El Yaagoubi, and G. Richarme. 1998. Chaperone properties of bacterial elongation factor EF-Tu. J. Biol. Chem. 273:11478-11482.

45. Candela M, Bergmann S, Vici M, Vitali B, Turroni S, Eikmanns BJ, Hammerschmidt S & Brigidi P (2007) Binding of human plasminogen to Bifidobacterium. J Bacterid 189: 5929-5936.

46. Cario E, Podolsky DK. Differential alteration in intestinal epithelial cell expression of toll-like receptor 3 (TLR3) and TLR4 in inflammatory bowel disease. Infect Immun. 2000 Dec;68(12):7010-7017.

47. Carmody RJ, Chen YH. Nuclear factor-kappaB: activation and regulation during toll-like receptor signaling. Cell Mol Immunol. 2007 Feb;4(l):31-41.

48. Cash HL, Whitham CV, Behrendt CL, Hooper LV. Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. Science. 2006 Aug 25;313(5790):1126-1130.

49. Chamaillard M, Girardin SE, Viala J, Philpott DJ. Nods, Nalps and Naip: intracellular regulators of bacterial-induced inflammation. Cell Microbiol. 2003 Sep;5(9):581-592.

50. Chamekh M, Phalipon A, Quertainmont R, Salmon I, Sansonetti P, Allaoui A. Delivery of biologically active anti-inflammatory cytokines IL-10 and IL-lra in vivo by the Shigella type III secretion apparatus. J Immunol. 2008 Mar 15;180(6):4292-4298.

51. Chassaing B, Michaud AD The Commensal Microbiota and Enteropathogens in the Pathogenesis of Inflammatory Bowel Diseases GASTROENTEROLOGY 2011;140:1720 -1728:

52. Chen ZJ, Parent L, Maniatis T. Site-specific phosphorylation of IkappaBalpha by a novel ubiquitination-dependent protein kinase activity. Cell. 1996 Mar 22;84(6):853-862.

53. Chen Lf, Fischle W, Verdin E, Greene WC. Duration of nuclear NF-kappaB action regulated by reversible acetylation. Science. 2001 Aug 31;293(5535):1653-1657.

54. Collier-Hyams LS, Sloane V, Batten BC, Neish AS. Cutting edge: bacterial modulation of epithelial signaling via changes in neddylation of cullin-1. J Immunol. 2005 Oct 1;175(7):41944198.

55. Corr S, Li Y, Riedel C, O'Toole P, Hill C, Gahan C. Bacteriocin production as a mechanism for the antiinfective activity of Lactobacillus salivarius UCC118. PNAS. 2007 May; 104(18):7617-7621.

56. Cronin M, Morrissey D, Rajendran S, El Mashad SM, van Sinderen D, O'Sullivan GC, Tangney M. Orally administered bifidobacteria as vehicles for delivery of agents to systemic tumors. Mol Ther. 2010 Jul;18(7):1397-407.

57. Dale C and Moran N. Molecular Interactions between Bacterial Symbionts and Their Host. Cell. 2006 DOI: 10.1016j.cell.2006.07.014.

58. DiDonato J, Mercurio F, Rosette C, Wu-Li J, Suyang H, Ghosh S, Karin M. Mapping of the inducible IkappaB phosphorylation sites that signal its ubiquitination and degradation: Mol Cell Biol. 1996 Apr;16(4):1295-1304.

59. Di Giacinto C, Marinaro M, Sanchez M, Strober W, Boirivant M. Probiotics ameliorate recurrent Thl-mediated murine colitis by inducing IL-10 and IL-10-dependent TGF-beta-bearing regulatory cells. J Immunol. 2005 Mar 15;174(6):3237-3246.

60. Dubey AP, Rajeshwari K, Chakravarty A, Famularo G. Use of VSL3 in the treatment of rotavirus diarrhea in children: preliminary results. J Clin Gastroenterol. 2008 Sep;42 Suppl 3 Pt l:S126-9.

61. Duncan S, Richardson A, Kaul P, Holmes R, Allison M, Stewart C. Oxalobacter formigenes and Its Potential Role in Human Health. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. 2002 Aug; 68(8): 38413847.

62. Eckburg P, Bik E, Bernstein C, PurdomvE, Dethlefsen L, Sargent M, Gill S, Nelson K, Relman D. Diversity of the Human Intestinal Microbial Flora. Science. 2005 June 10; 308(5728): 16351638.

63. Elson CO, Cong Y, Weaver CT, Schoeb TR, McClanahan TK, Fick RB, Kastelein RA. Monoclonal anti-interleukin 23 reverses active colitis in a T cell-mediated model in mice. Gastroenterology. 2007 Jun;132(7):2359-2370.

64. Eto A, Muta T, Yamazaki S, Takeshige K. Essential roles for NF-kappa B and a Toll/IL-1 receptor domain-specific signal(s) in the induction of I kappa B-zeta. Biochem Biophys Res Cornmun. 2003 Feb 7;301(2):495-501.

65. Ewaschuk JB, Walker JW, Diaz H, Madsen KL (2006) Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. J Nutr 136:1483-1487

66. Ewaschuk JB, Diaz H, Meddings L, Diederichs B, Dmytrash A, Backer J, Looijer-van Langen

67. M, Madsen KL. Secreted bioactive factors from Bifidobacterium infantis enhance epithelial cell barrier function. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2008 Nov;295(5):G1025-34.

68. Falk PG, Hooper LV, Midtvedt T, Gordon JI. Creating and maintaining the gastrointestinal ecosystem: what we know and need to know from gnotobiology. Microbiol Mol Biol Rev. 1998 Dec;62(4):l 157-1170.

69. Fava F, Danese S. Intestinal microbiota in inflammatory bowel disease: friend of foe? World J Gastroenterol. 2011'Feb 7;17(5):557-66.

70. Favier C, Vaughan E, De Vos WM, Akkermans A. Molecular Monitoring of Succession of Bacterial Communities in Human Neonates. APPL. ENVIRON. MICROBIOL. 2002 Jan; 68(l):219-226.

71. Feagan BG. Maintenance therapy for inflammatory bowel disease. Am J Gastroenterol. 2003 Dec;98(12 SuppI):S6-S17.

72. Fitzgerald KA, Rowe DC, Barnes BJ, Cafifrey DR, Visintin A, Latz E, Monks B, Pitha PM, Golenbock DT. LPS-TLR4 signaling to IRF-3/7 and NF-kappaB involves the toll adapters TRAM and TRIF. J Exp Med. 2003 Oct 6;198(7):1043-1055.

73. Fujimori M. Genetically engineered bifidobacterium as a drug delivery system for systemic therapy of metastatic breast cancer patients. Breast Cancer. 2006;13(1):27-31.

74. Fujino S, Andoh A, Bamba S, Ogawa A, Hata K, Araki Y, Bamba T, Fujiyama Y. Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease. Gut. 2003 Jan;52(l):65-70.

75. Fukuhara A, Irie K, Yamada A, Katata T, Honda T, Shimizu K, Nakanishi H, Takai Y. Role of nectin in organization of tight junctions in epithelial cells. Genes Cells. 2002 0ct;7(10):1059-1072.

76. Fukushima K, Sasaki I, Ogawa H, Naito H, Funayama Y, Matsuno S (1999) Colonization of microflora in mice: mucosal defense against luminal bacteria. J Gastroenterol 34:54-60

77. Ganchi PA, Sun SC, Greene WC, Ballard DW. A novel NF-kappa B complex containing p65 homodimers: implications for transcriptional control at the level of subunit dimerization. Mol Cell Biol. 1993 Dec;13(12):7826-7835.

78. Gassier N, Rohr C, Schneider A, Kartenbeck J, Bach A, Obermiiller N, Otto HF, Autschbach F. Inflammatory bowel disease is associated with changes of enterocytic junctions. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2001 Jul;281(l):G216-28.

79. Geijtenbeek TB, Engering A, Van Kooyk Y. DC-SIGN, a C-type lectin on dendritic cells that unveils many aspects of dendritic cell biology. J Leukoc Biol. 2002 Jun;71(6):921-31.

80. Gewirtz AT, Navas TA, Lyons S, Godowski PJ, Madara JL. Cutting edge: bacterial flagellin activates basolaterally expressed TLR5 to induce epithelial proinflammatory gene expression. J Immunol. 2001 Aug 15;167(4): 1882-1885.

81. Ghosh S, Karin M. Missing pieces in the NF-kappaB puzzle. Cell. 2002 Apr;109 Suppl:S81-96.

82. Gilad O, Svensson B, Viborg AH, Stuer-Lauridsen B, Jacobsen S. The extracellular proteome of Bifidobacterium animalis subsp. Iactis BB-12 reveals proteins with putative roles in probiotic effects. Proteomics. 2011 Apr 6. doi: 10.1002/pmic.201000716.

83. Golenbock DT, Hampton RY, Qureshi N, Takayama K, Raetz CR. Lipid A-like molecules thatantagonize the effects of endotoxins on human monocytes. J Biol Chem. 1991 Oct 15;266(29): 19490-19498.

84. Gonzalez JE, Keshavan ND. Messing with bacterial quorum sensing. Microbiol Mol Biol Rev. 2006 Dec;70(4):859-875.

85. Guglielmetti S, Tamagnini I, Mora D, Minuzzo M, Scarafoni A, Arioli S, Hellman J, Karp M, Parini C. Implication of an outer surface lipoprotein in adhesion of Bifidobacterium bifidum to Caco-2 cells. Appl Environ Microbiol. 2008 Aug;74(15):4695-4702.

86. Hamer HM, Jonkers D, Venema K, Vanhoutvin S, Troost FJ, Brummer RJ. Review article: the role of butyrate on colonic function. Aliment Pharmacol Ther. 2008 Jan 15;27(2):104-119.

87. Haller D, Bode C, Hammes WP, Pfeifer AM, Schiffrin EJ, Blum S (2000) Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut 47:79-87

88. Hart AL, Lammers K, Brigidi P, Vitali B, Rizzello F, Gionchetti P, Campieri M, Kamm MA, Knight SC, Stagg AJ. Modulation of human dendritic cell phenotype and function by probiotic bacteria. Gut. 2004Nov;53(ll):1602-1609.

89. Hausmann M, Kiessling S, Mestermann S, Webb G, Spottl T, Andus T, Scholmerich J, Herfarth H, Ray K, Falk W, Rogler G. Toll-like receptors 2 and 4 are up-regulated during intestinal inflammation. Gastroenterology. 2002 Jun;122(7):1987-2000.

90. He F, Morita H, Ouwehand AC, Hosoda M, Hiramatsu M, Kurisaki J, Isolauri E, Benno Y, Salminen S (2002) Stimulation of the secretion of pro-inflammatory cytokines by Bifidobacterium strains. Microbiol Immunol 46:781-785

91. Hedin C, Whelan K, Lindsay JO. Evidence for the use of probiotics and prebiotics in inflammatory bowel disease: a review of clinical trials. Proc Nutr Soc. 2007 Aug;66(3):307-15.

92. Helgeland L, Vaage JT, Rolstad B, Midtvedt T, Brandtzaeg P. Microbial colonization influences composition and T-cell receptor V beta repertoire of intraepithelial lymphocytes in rat intestine. Immunology. 1996 Dec;89(4):494-501.

93. Heuvelin E, Lebreton C, Grangette C, Pot B, Cerf-Bensussan N, Heyman M (2009) Mechanisms involved in alleviation of intestinal inflammation by Bifidobacterium breve soluble factors. PLoS One. doi:10.1371/journal.pone.0005184

94. Hickman, C. How have bacteria contributed to the evolution of multicellular animals?. In: McFall-Ngai, MJ., editor. The influence of cooperative bacteria on animal host biology. Cambridge University Press; New York: 2005. p. 3-32.

95. Hill MJ. Intestinal flora and endogenous vitamin synthesis. Eur J Cancer Prev. 1997 Mar;6 Suppl l:S43-5.

96. Hoarau C, Lagaraine C, Martin L, Velge-Roussel F, Lebranchu Y (2006) Supernatant of Bifidobacterium breve induces dendritic cell maturation, activation, and survival through a Toll-like receptor 2 pathway. J Allergy Clin Immunol 117:696-702.

97. Hoffmann A, Baltimore D. Circuitry of nuclear factor kappaB signaling. Immunol Rev. 2006 Apr;210:171-186.

98. Hong S, Lee HJ, Kim SJ, Hahm KB (2010) Connection between inflammation and carcinogenesis in gastrointestinal tract: focus on TGF-beta signaling. World J Gastroenterol 16:2080-2093.

99. Hooper LV, Wong MH, Thelin A, Hansson L, Falk PG, Gordon JI (2001) Molecular analysis of commensal host-microbial relationships in the intestine. Science 291:881-884.

100. Hooper LV, Stappenbeck TS, Hong CV, Gordon JI. Angiogenins: a new class of microbicidal proteins involved in innate immunity. Nat Immunol. 2003 Mar;4(3):269-273.

101. Inagaki-Ohara K, Chinen T, Matsuzaki G, Sasaki A, Sakamoto Y, Hiromatsu K, Nakamura-Uchiyama F, Nawa Y, Yoshimura A. Mucosal T cells bearing TCRgammadelta play a protective role in intestinal inflammation. J Immunol. 2004 Jul 15;173(2):1390-1398.

102. Ivanov D, Emonet C, Foata F, Affolter M, Delley M, Fisseha M, Blum-Sperisen S, Kochhar S, Arigoni F. A seipin from the gut bacterium Bifidobacterium longum inhibits eukaryotic elastase-like serine proteases. J Biol Chem. 2006 Jun;28(25): 17246-17252.

103. Ivanov II, McKenzie BS, Zhou L, Tadokoro CE, Lepelley A, Lafaille JJ, Cua DJ, Littman DR. The orphan nuclear receptor RORgammat directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 2006 Sep 22;126(6):1121-1133.

104. Jeffery, C. J. (2003). Moonlighting proteins: old proteins learning new tricks. Trends Genet 19, 415-417.

105. Jespers LS, Roberts A, Mahler SM, Winter G, Hoogenboom HR. Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen. Biotechnology (NY). 1994 Sep;12(9):899-903.

106. Jin MS, Kim SE, Heo JY, Lee ME, Kim HM, Paik SG,Lee H, Lee JO. Crystal Structure of the TLR1-TLR2 Heterodimer Induced by Binding of a Tri-Acylated Lipopeptide. Cell. 2007 Sept; 130:1071-1082.

107. Johansson ME, Phillipson M, Petersson J, Velcich A, Holm L, Hansson GC. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 30; 105(39): 15064-15069.

108. Kaila M, Isolauri E, Saxelin M, Arvilommi H, Vesikari T. Viable versus inactivated lactobacillus strain GG in acute rotavirus diarrhoea. Arch Dis Child. 1995 Jan;72(l):51-53.

109. Kawagoe T, Sato S, Matsushita K, Kato H, Matsui K, Kumagai Y, Saitoh T, Kawai T, Takeuchi O, Akira S. Sequential control of Toll-like receptor-dependent responses by IRAKI and IRAK2. Nat Immunol. 2008 Jun;9(6):684-91.

110. Kawai T and Akira S. TLR signaling. Cell Death and Differentiation (2006) 13, 816-825.

111. Keane J, Gershon S, Wise RP, Mirabile-Levens E, Kasznica J, Schwieterman WD, Siegel JN, Braun MM. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent: N Engl J Med. 2001 Oct 11;345(15): 1098-1104.

112. Kelly D, Campbell JI, King TP, Grant G, Jansson EA, Coutts AG, Pettersson S, Conway S. Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear-cytoplasmic shuttling of PPAR-gamma and RelA. Nat Immunol. 2004 Jan;5(l):104-112.

113. Kelsall BL. Innate and adaptive mechanisms to control corrected. pathological intestinal inflammation. J Pathol. 2008 Jan;214(2):242-259.

114. Kempeni J. Preliminary results of early clinical trials with the fully human anti-TNFalpha monoclonal antibody D2E7. Ann Rheum Dis. 1999 Nov;58 Suppl 1:170-2.

115. Khailova L, Dvorak K, Arganbright KM, Halpern MD, Kinouchi T, Yajima M, Dvorak B. Bifidobacterium bifldum improves intestinal integrity in a rat model of necrotizing enterocolitis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2009 Nov;297(5):G940-9.

116. Kitamura H, Kanehira K, Okita K, Morimatsu M, Saito M. MAIL, a novel nuclear I kappa B protein that potentiates LPS-induced IL-6 production. FEBS Lett. 2000 Nov 17;485(l):53-56.

117. Klijn A, Mercenier A, Arigoni F. Lessons from the genomes of bifidobacteria. FEMS

118. Microbiol Rev. 2005 Aug;29(3):491-509.

119. Kobayashi K, Hernandez LD, Galán JE, Janeway CA Jr, Medzhitov R, Flavell RA. IRAK-M is a negative regulator of Toll-like receptor signaling. Cell. 2002 Jul 26; 110(2): 191-202.

120. Kohno M, Suzuki S, Kanaya T, Yoshino T, Matsuura Y, Asada M, Kitamura S. Structural characterization of the extracellular polysaccharide produced by Bifidobacterium longum JBL05. Carbohyd Poly. 2009 77:351-357.

121. Kühn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, Müller W. Interleukin-10-defícient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 1993 Oct 22;75(2):263-74.

122. Kumar A, Wu H, Collier-Hyams LS, Kwon YM, Hanson JM, Neish AS. The bacterial fermentation product butyrate influences epithelial signaling via reactive oxygen species-mediated changes in cullin-1 neddylation. J Immunol. 2009 Jan l;182(l):538-546.

123. Kurasawa K, Hirose K, Sano H, Endo H, Shinkai H, Nawata Y, Takabayashi K, Iwamoto I. Increased interleukin-17 production in patients with systemic sclerosis. Arthritis Rheum. 2000 Nov;43(ll):2455-2463.

124. Lawrence T, Bebien M, Liu GY, Nizet V, Karin M. IKKalpha limits macrophage NF-kappaB activation and contributes to the resolution of inflammation. Nature. 2005 Apr 28;434(7037):1138-1143.

125. Lay C, Rigottier-Gois L, Holmstrem K, Rajilic M, Vaughan E,de Vos W, Collins M, Thiel R, Namsolleck P, Blaut M, Dore J. Colonic Microbiota Signatures across Five Northern European Countries, appl. environ. microbioL. 2005 July; 71(7):4153-4155.

126. Lee SK, Kim YB, Ji GE. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis. J Appl Microbiol. 1997 Sep;83(3):267-272.

127. Levin A, Shibolet O. Toll-like receptors in inflammatory bowel disease-stepping into uncharted territory. World J Gastroenterol. 2008 Sep 7;14(33):5149-53.

128. Ley R, Lozupone C, Hamady M, Knight R, Gordon J. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nat Rev Microbiol. 2008 Oct; 6(10): 776-788. doi:10.1038/nrmicrol978.

129. Li MO, Sanjabi S, Flavell RA. Transforming growth factor-beta controls development, homeostasis, and tolerance of T cells by regulatory T cell-dependent and -independent mechanisms. Immunity. 2006 Sep;25(3):455-71.

130. Li MO, Flavell RA. Contextual regulation of inflammation: a duet by transforming growth factor-beta and interleukin-10. Immunity. 2008 Apr;28(4):468-476.

131. Lich J, Ting J. CATERPILLER (NLR) Family. Members as Positive and Negative Regulators of Inflammatory Responses. Proc Am Thorac Soc. 2007; 4:263-266;

132. Lodes MJ, Cong Y, Elson CO, Mohamath R, Landers CJ, Targan SR, Fort M, Hershberg RM. Bacterial flagellin is a dominant antigen in Crohn disease. J Clin Invest. 2004 May; 113(9): 12961306.

133. Lopez P, Gueimonde M, Margolles A, Suarez A (2010) Distinct Bifidobacterium strains drive different immune responses in vitro. Int J Food Microbiol 138:157-165

134. MacConaill LE, Fitzgerald GF, Van Sinderen D. Investigation of protein export in Bifidobacterium breve UCC2003. Appl Environ Microbiol. 2003 Dec;69(12):6994-7001.

135. Mack DR, Michail S, Wei S, McDougall L, Hollingsworth MA. Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducing intestinal mucin gene expression. Am J

136. Physiol. 1999 Apr;276(4 Pt l):G941-50.

137. Macpherson AJ, Gatto D, Sainsbury E, Harriman GR, Hengartner H, Zinkemagel RM (2000) A primitive T cell-independent mechanism of intestinal mucosal IgA responses to commensal bacteria. Science 288:2222-2226

138. Macpherson AJ, Uhr T. Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria. Science. 2004 Mar 12;303(5664):1662-1665.

139. Mariat D, Firmesse O, Levenez F, Guimaráes VD, Sokol H, Doré J, Corthier G, Furet J-P. The Firmicutes/Bacteroidetes ratio of the human microbiota changes with age. BMC Microbiology. 2009 9(123). doi:10.1186/1471-2180-9-123.

140. Maynard CL, Weaver CT. Intestinal effector T cells in health and disease. Immunity. 2009 Sep 18;31(3):389-400.

141. Mayo B and van Sinderen D. Bifidobacteria: Genomics and Molecular Aspects. Caister Academic Press. 2010

142. Mazmanian S, Liu CH, Tzianabos A, Kasper D. An Immunomodulatory Molecule of Symbiotic Bacteria Directs Maturation of the Host Immune System. Cell. 2005 July; 122:107-118.

143. IMazmanian SK, Round JL, Kasper DL. A microbial symbiosis factor prevents intestinal inflammatory disease. Nature. 2008 May 29;453(7195):620-625.

144. McFall-Ngai M. Identifying 'prime suspects': symbioses and the evolution of multicellularity.Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2001 Jul; 129(4):711-23.

145. McFall-Ngai M. Unseen Forces: The Influence of Bacteria on Animal Development. Developmental Biology. 2002 242:1-14.

146. McFarland LV. Meta-analysis of probiotics for the prevention of traveler's diarrhea. Travel Med Infect Dis. 2007 Mar;5(2):97-105.

147. Menard S, Candalh C, Bambou JC, Terpend K, Cerf-Bensussan N, Heyman M (2004) Lactic acid bacteria secrete metabolites retaining anti-inflammatory properties after intestinal transport Gut 53:821-828.

148. Meyer-Hoffert U, Hornef MW, Henriques-Normark B, Axelsson LG, Midtvedt T, Ptitsep K, Andersson M. Secreted enteric antimicrobial activity localises to the mucus surface layer. Gut. 2008 Jun;57(6):764-771.

149. Miettinen M, Vuopio-Varkila J, Varkila K. Production of human tumor necrosis factor alpha, interleukin-6, and interleukin-10 is induced by lactic acid bacteria. Infect Immun. 1996 Dec;64(12):5403-5405.

150. Moore KW, O'Garra A, de Waal Malefyt R, Vieira P, Mosmann TR. Interleukin-10. Annu Rev Immunol. 1993;11:165-190.214: Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol. 2001;19:683-765.

151. Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J Immunol. 1986 Apr l;136(7):2348-2357.

152. Mosser DM, Zhang X (2008) Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine. Immunol Rev 226:205-218.

153. Mottet C, Uhlig HH, Powrie F. Cutting edge: cure of colitis by CD4+CD25+ regulatory T cells. J Immunol. 2003 Apr 15;170(8):3939-3943.

154. Mueller C, Macpherson AJ. Layers of mutualism with commensal bacteria protect us from intestinal inflammation. Gut. 2006 Feb;55(2):276-84.

155. Murphy KM, Ouyang W, Farrar JD, Yang J, Ranganath S, Asnagli H, Afkarian M, Murphy TL. Signaling and transcription in T helper development. Annu Rev Immunol. 2000;18:451-494.

156. Mylonaki M, Rayment NB, Rampton DS, Hudspith BN, Brostoff J. Molecular characterization of rectal mucosa-associated bacterial flora in inflammatory bowel disease. Inflamm Bowel Dis. 2005 May;ll(5):481-7.

157. Nagaoka M, Hashimoto S, Watanabe T, Yokokura T, Mori Y. Anti-ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides. Biol Pharm Bull. 1994 Aug;17(8): 1012-1017.

158. Naik S, Kelly EJ, Meijer L, Pettersson S, Sanderson IR. Absence of Toll-like receptor 4 explains endotoxin hyporesponsiveness in human intestinal epithelium. J Pediatr Gastroenterol

159. Nutr. 2001 Apr;32(4):449-453.

160. Nakamura K, Honda K, Mizutani T, Akiho H, Harada N. Novel strategies for the treatment of inflammatory bowel disease: Selective inhibition of cytokines and adhesion molecules. World J Gastroenterol. 2006 Aug 7;12(29):4628-4635.

161. Neish AS, Gewirtz AT, Zeng H, Young AN, Hobert ME, Karmali V, Rao AS, Madara JL. Prokaryotic regulation of epithelial responses by inhibition of IkappaB-alpha ubiquitination. Science. 2000 Sep 1;289(5484): 1560-1563.

162. Nishimoto M, Kitaoka M. Identification of N-acetylhexosamine 1-kinase in the complete lacto-N-biose I/galacto-N-biose metabolic pathway in Bifidobacterium longum. Appl Environ Microbiol. 2007 C)ct;73(20):6444-6449.

163. Nouaille S, Ribeiro LA, Miyoshi A, Pontes D, Le Loir Y, Oliveira SC, Langella P, Azevedo V. Heterologous protein production and delivery systems for Lactococcus lactis. Genet Mol Res. 2003 Mar 31;2(1):102-111.

164. O'Connell Motherway M, Fitzgerald GF, Neirynck S, Ryan S, Steidler L, van Sinderen D. Characterization of ApuB, an extracellular type II amylopullulanase from Bifidobacterium breve UCC2003. Appl Environ Microbiol. 2008 Oct;74(20):6271-9.

165. Ohh M, Kim WY, Moslehi JJ, Chen Y, Chau V, Read MA, Kaelin WG Jr. An intact NEDD8 pathway is required for Cullin-dependent ubiquitylation in mammalian cells. EMBO Rep. 2002 Feb;3(2):177-182.

166. O'Hara A and Shanahan F. The gut flora as a forgotten organ. EMBO reports. 2006 7:688-693. doi: 10.1038/sj.embor.7400731.

167. O'Garra A, McEvoy LM, Zlotnik A. T-cell subsets: chemokine receptors guide the way. Curr Biol. 1998 Sep 10;8(18):R646-649.

168. O'Shea JJ, Murray PJ. Cytokine signaling modules in inflammatory responses. Immunity. 2008 Apr;28(4):477-487.

169. Otte JM, Podolsky DK. Functional modulation of enterocytes by gram-positive and gramnegative microorganisms. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2004 Apr;286(4):G613-26.

170. Owczarek D, Cibor D, Szczepanek M, Mach T. Biological therapy of inflammatory bowel disease. Pol Arch Med Wewn. 2009 Jan-Feb;l 19(l-2):84-88.

171. Park MS, Kim MJ, Ji GE (2007) Assessment of lipopolysaccharide-binding activity of Bifidobacterium and its relationship with cell surface hydrophobicity, autoaggregation, and inhibition of interleukin-8 production. J Microbiol Biotechnol 17:1120-1126

172. Park MS, Kwon B, Shim JJ, Huh CS, Ji GE (2008) Heterologous expression of cholesterol oxidase in Bifidobacterium longum under the control of 16S rRNA gene promoter of bifidobacteria. Biotechnol Lett 30:165-172

173. Peterson DA, McNulty NP, Guruge JL, Gordon JI. IgA response to symbiotic bacteria as a mediator of gut homeostasis. Cell Host Microbe. 2007 Nov 15;2(5):328-339.

174. Petrof EO, Kojima K, Ropeleski MJ, Musch MW, Tao Y, De Simone C, Chang EB (2004) Probiotics inhibit nuclear factor-kappaB and induce heat shock proteins in colonic epithelial cells through proteasome inhibition. Gastroenterology 127:1474-1487

175. Place RF, Noonan EJ, Giardina C. HDAC inhibition prevents NF-kappa B activation by suppressing proteasome activity: down-regulation of proteasome subunit expression stabilizes I kappa B alpha. Biochem Pharmacol. 2005 Aug l;70(3):394-406.

176. Potempa J, Korzus E, Travis J. The serpin superfamily of proteinase inhibitors: structure, function, and regulation. J Biol Chem. 1994 Jun 10;269(23):15957-15960.

177. Powrie F, Leach MW, Mauze S, Caddie LB, Coffinan RL. Phenotypically distinct subsets of CD4+ T cells induce or protect from chronic intestinal inflammation in C. B-17 scid mice, nt Immunol. 1993 Nov;5(ll):1461-1471.

178. Prud'homme GJ (2007) Pathobiology of transforming growth factor beta in cancer, fibrosis and immunologic disease, and therapeutic considerations. Lab Invest 87:1077-1091.

179. Pull SL, Doherty JM, Mills JC, Gordon JI, Stappenbeck TS. Activated macrophages are an adaptive element of the colonic epithelial progenitor niche necessary for regenerative responses toinjury. Proc Natl Acad Sei USA. 2005 Jan 4;102(1):99-104.

180. Qin J, Qian Y, Yao J, Grace C, Li X. SIGIRR inhibits interleukin-1 receptor- and toll-like receptor 4-mediated signaling through different mechanisms. J Biol Chem. 2005 Jul 1;280(26):25233-25241.

181. Quintana FJ, Basso AS, Iglesias AH, Korn T, Farez MF, Betteiii E, Caccamo M, Oukka M, Weiner HL. Control of T(reg) and T(H)17 cell differentiation by the aryl hydrocarbon receptor. Nature. 2008 May 1;453(7191):65-71.

182. Rajpal A, Beyaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R. A general method for greatly improving the affinity of antibodies by using combinatorial libraries. Proc Natl Acad Sei USA. 2005 Jun 14;102(24):8466-8471.

183. Rakoff-Nahoum S, Paglino J, Eslami-Varzaneh F, Edberg S, Medzhitov R. Recognition of commensal microflora by toll-like receptors is required for intestinal homeostasis. Cell. 2004 Jul 23;118(2):229-241.

184. Reyes Escogido ML, De Leon Rodriguez A, Barba de la Rosa AP (2007) A novel binary expression vector for production of human IL-10 in Escherichia coli and Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett 29:1249-1253.

185. Rhim SL, Park MS, Ji GE. Expression and secretion of Bifidobacterium adolescentis amylase by Bifidobacterium longum. Biotechnol Lett. 2006 Feb;28(3): 163-8.

186. Ridlon J, Kang DJ, Hylemon P. Bile salt biotransformations by human intestinal bacteria. Journal of Lipid Research. 2006 DOI 10.1194/jlr.R500013-JLR200.

187. Ruas-Madiedo P, Gueimonde M, Margolles A, de los Reyes-Gavilán CG, Salminen S. Exopolysaccharides. produced by probiotic strains modify the adhesion of probiotics and enteropathogens to human intestinal mucus. J Food Prot. 2006 Aug;69(8):2011-1015.

188. Rutgeerts P, Van Assche G, Vermeire S: Review article: Infliximab therapy for inflammatory bowel disease—seven years on. Aliment Pharmacol Ther. 2006 Feb 15;23(4):451-463.

189. Sabbah A, Chang TH, Harnack R, Frohlich V, Tominaga K, Dube PH, Xiang Y, Bose S. Activation of innate immune antiviral responses by Nod2. Nat Immunol. 2009 Oct; 10(10): 10731080.

190. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

191. Sanchez, B., Bressollier, P. & Urdaci, M. C. (2008). Exported proteins in probiotic bacteria: adhesion to intestinal surfaces, host immunomodulation and molecular cross-talking with the host. FEMS Immunol Méd Microbiol 54, 1-17.

192. Sánchez B, Urdaci MC, Margolles A. Extracellular proteins secreted by probiotic bacteria as mediators of effects that promote mucosa-bacteria interactions. Microbiology. 2010 Nov;156(Pt ll):3232-3242.

193. Sansonetti PJ. War and peace at mucosal surfaces. Nat Rev Immunol. 2004 Dec;4(12):953-964.

194. Sasaki T, Fujimori M, Hamaji Y, Hama Y, Ito K, Amano J, Taniguchi S. Genetically engineered Bifidobacterium longum for tumor-targeting enzyme-prodrug therapy of autochthonous mammary tumors in rats. Cancer Sci. 2006 Jul;97(7):649-657.

195. Sato S, Sanjo H, Takeda K, Ninomiya-Tsuji J, Yamamoto M, Kawai T, Matsumoto K, Takeuchi O, Akira S. Essential function for the kinase TAK1 in innate and adaptive immuneresponses. Nat Immunol. 2005 Nov;6(ll): 1087-1095.

196. Schreiber S, Nikolaus S, Hampe J. Activation of nuclear factor kappa B inflammatory bowel disease. Gut. 1998 Apr;42(4):477-484.

197. Sharma R, Young C, Neu J. Molecular modulation of intestinal epithelial barrier: contribution of microbiota. J Biomed Biotechnol. 2010; doi:10.1155/2010/305879.

198. Shibolet O, Podolsky DK. TLRs in the Gut. IV. Negative regulation of Toll-like receptors and intestinal homeostasis: addition by subtraction. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2007 Jun;292(6):G1469-73.

199. Shkoporov AN, Efimov BA, Khokhlova EV, Kafarskaia LI, Smeianov VV. Production of human basic fibroblast growth factor (FGF-2) in Bifidobacterium breve using a series of novel expression/secretion vectors. Biotechnol Lett. 2008 Nov;30(l 1): 1983-1988.

200. Siegel CA, Sands BE. Review article: practical management of inflammatory bowel disease patients taking immunomodulators. Aliment Pharmacol Ther. 2005 Jul 1;22(1):1-16.

201. Smits HH, Engering A, van der Kleij D, de Jong EC, Schipper K, van Capel TM, Zaat BA,

202. Sokol H, Seksik P, Furet JP, Firmesse O, Nion-Larmurier I, Beaugerie L, Cosnes J, Corthier G, Marteau P, Doré J. Low counts of Faecalibacterium prausnitzii in colitis microbiota. Inflamm Bowel Dis. 2009 Aug; 15(8): 1183-9.

203. Sreekumar O, Hosono A. The antimutagenic properties of a polysaccharide produced by Bifidobacterium longum and its cultured milk against some heterocyclic amines. Can J Microbiol. 1998 Nov;44(ll):1029-1036.

204. Steidler L, Hans W, Schotte L, Neirynck S, Obermeier F, Falk W, Fiers W, Remaut E. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10. Science. 2000 Aug 25;289(5483): 1352-1355.

205. Steidler L. Gene exchange of thyA for interleukin-10 secures live GMO bacterial therapeutics. Discov Med. 2003 Dec;3(19):49-51.

206. Steidler L, Rottiers P, Coulie B. Actobiotics as a novel method for cytokine delivery. Ann N Y Acad Sci. 2009 Dec;1182:135-145.

207. Strachan D. Hay fever, hygiene, and household size. Br Med J. 1989 Nov; 299:1259-1260.

208. Sun SC, Ganchi PA, Ballard DW, Greene WC. NF-kappa B controls expression of inhibitor I kappa B alpha: evidence for an inducible autoregulatory pathway. Science. 1993 Mar26;259(5103): 1912-1915.

209. Suzuki N, Suzuki S, Yeh WC. IRAK-4 as the central TIR signaling mediator in innate immunity. Trends Immunol. 2002 0ct;23(10):503-506.

210. Suzuki T, Yasui K. Plasmid artificial modification: a novel method for efficient DNA transfer into bacteria. Methods Mol Biol. 2011;765:309-26.

211. Takata T, Shirakawa T, Kawasaki Y, Kinoshita S, Gotoh A, Kano Y, Kawabata M. Genetically engineered Bifidobacterium animalis expressing the Salmonella flagellin gene for the mucosal immunization in a mouse model. J Gene Med. 2006 Nov;8(ll):1341-1346.

212. Toomey S, Harhen B, Roche HM, Fitzgerald D, Belton O. Profound resolution of early atherosclerosis with conjugated linoleic acid. Atherosclerosis. 2006 Jul;187(l):40-49.

213. Totzke G, Essmann F, Pohlmann S, Lindenblatt C, Janicke RU, Schulze-Osthoff K. A novel member of the IkappaB family, human IkappaB-zeta, inhibits transactivation of p65 and its DNA binding. J Biol Chem. 2006 May 5;281(18):12645-12654.

214. Troy EB, Kasper DL. Beneficial effects of Bacteroides fragilis polysaccharides on the immune system. Front Biosci. 2010 Jan l;15:25-34.

215. Turpeinen A, Ylonen N, Willebrand E, Basu Si Aro A. Immunological and metabolic effects of cis-9, trans-11-conjugated linoleic acid in subjects with birch pollen allergy. British Journal of Nutrition. 2008 100:112-119. doi:10.1017/S0007114507886326.

216. Turpin P, Hay RT, Dargemont C. Characterization of IkappaBalpha nuclear import pathway. J Biol Chem. 1999 Mar 5;274(10):6804-6812.

217. Ventura M, Canchaya C, Tauch A, Chandra G, Fitzgerald G, Chater K, van Sinderen D. Genomics of Actinobacteria: Tracing the Evolutionary History of an Ancient Phylum. MICROBIOL. MOL. BIOL. REV. 2007 Sep; 71(3):495-548.

218. Vijay-Kumar M, Aitken JD, Sanders CJ, Frias A, Sloane VM, Xu J, Neish AS, Rojas M, Gewirtz AT. Flagellin treatment protects against chemicals, bacteria, viruses, and radiation. J Immunol. 2008 Jun 15;180(12):8280-8285.

219. Wang C, Deng L, Hong M, Akkaraju GR, Inoue J, Chen ZJ. TAK1 is a ubiquitin-dependentkinase of MKK and IKK. Nature. 2001 Jul 19;412(6844):346-351.

220. Weil R, Laurent-Winter C, Israel A. Regulation of IkappaBbeta degradation. Similarities to and differences from IkappaBalpha. J Biol Chem. 1997 Apr ll;272(15):9942-9949.

221. Weintraub A, Zahringer U, Wollenweber HW, Seydel U, Rietschel ET. Structural characterization of the lipid A component of Bacteroides fragilis strain NCTC 9343 lipopolysaccharide. Eur J Biochem.» 1989 Aug 1;183(2):425-431.

222. Weizman Z, Asli G, Alsheikh A. Effect of a probiotic infant formula on infections in child'care centers: comparison of two probiotic agents. Pediatrics. 2005 Jan; 115(1 ):5-9.

223. Wells JM, Wilson PW, Norton PM, Le Page RW. A model system for the investigation of heterologous protein secretion pathways in Lactococcus lactis. Appl Environ Microbiol. 1993 Nov;59(l l):3954-3959.

224. Wirtz S, Neufert C, Weigmann B, Neurath MF. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. NatProtoc. 2007;2(3):541-6.

225. Wong CK, Ho CY, Li EK, Lam CW. Elevation of proinflammatory cytokine (IL-18, IL-17, IL-12) and Th2 cytokine (IL-4) concentrations in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 2000;9(8):589-593.

226. Xia ZP, Sun L, Chen X, Pineda G, Jiang X, Adhikari A, Zeng W, Chen ZJ. Direct activation of protein kinases by unanchored polyubiquitin chains. Nature. 2009 Sep 3;461(7260): 114-119.

227. Xu D, Liu H, Komai-Koma M, Campbell C, McSharry C, Alexander J, Liew FY. CD4+CD25+ regulatory T cells suppress differentiation and functions of Thl and Th2 cells, Leishmania major infection, and colitis in mice. J Immunol. 2003 Jan l;170(l):394-399.

228. Xu J, Gordon JI. Honor thy symbionts. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Sep 2;100(18):10452-10459.

229. Yamamoto M, Sato S, Hemmi H, Uematsu S, Hoshino K, Kaisho T, Takeuchi O, Takeda K, Akira S. TRAM is specifically involved in the Toll-like receptor 4-mediated MyD88-independent signaling pathway. Nat Immunol. 2003 Nov;4(ll):1144-1150.

230. Yamamoto M, Takeda K. Role of nuclear IkappaB proteins in the regulation of host immune responses. J Infect Chemother. 2008 Aug;14(4):265-269.

231. Yamanaka T, Helgeland L, Farstad IN, Fukushima H, Midtvedt T, Brandtzaeg P. Microbial colonization drives lymphocyte accumulation and differentiation in the follicle-associated epithelium of Peyer's patches. J Immunol. 2003 Jan 15;170(2):816-822.

232. Yamasaki S, Ishikawa E, Sakuma M, Hara H, Ogata K, Saito T. Mincle is an ITAM-coupled activating receptor that senses damaged cells. Nat Immunol. 2008 0ct;9(10):1179-1188.

233. Yildirim Z, Winters DK, Johnson MG. Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J Appl Microbiol. 1999 Jan;86(l):45-54.

234. Zhang G, Ghosh S. Negative regulation of toll-like receptor-mediated signaling by Tollip. J Biol Chem. 2002 Mar l;277(9):7059-7065.

235. Zhang L, Su P, Henriksson A, O'Rourke J, Mitchell H. Investigation of the immunomodulatory effects of Lactobacillus casei and Bifidobacterium lactis on Helicobacter pylori infection. Helicobacter. 2008 Jim; 13(3): 183-90.

Информация о работе

Хохлова, Екатерина Викторовна
кандидата медицинских наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение механизмов противовоспалительной активности бифидобактерий и создание методами генетической инженерии штаммов бифидобактерий с усиленными противовоспалительными свойствами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы