Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физиологических свойств и структурно-функциональной организации бифидобактерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физиологических свойств и структурно-функциональной организации бифидобактерий"

АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ Институт микробиологии

На правах рукописи

ЛАЗАРЕВА Галина Ивановна

ИЗУЧЕНИЕ ШШОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И СТРУКГУНЮ-ШКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ШЗЗДОБАКГЕШ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1991

Работа выполнена д Институте микробиологии Академии наук Беларуси.

Научный руководитель: доктор биологических наук

Т. Г. Зименко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В. И. Бирюзова

доктор ветеринарных наук,

профессор

Р. В. Тузова

Ведущая организация: Институт микробиологии и вирусологи: им. Д. К. Заболотного АН Украины

Защита диссертации состоится усЖё/Я- 1591г. в " /3 часов на заседании специализированного совета по присуждении степени кандидата биологических наук в Институте микробиологии АКБ по адресу: 22005?, г. Минск, Академгородок, ул. дсдинская, 2. -

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АНБ.

Автореферат разослан 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кавдидат биологических наук

Н. В. ОБРАЗЦОВА

ОБЩАЯ ХАРАКГЕРИСПКА РАБОТУ

Актуальность темы. Микроорганизмы рода В1£1с1оЪасгег1ит -представители нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных. Они является основой лечебно-профилактических препаратов, способствующих формированию и стабильности индигенной кишечной микрофлоры. С деятельностью бифидобактерий связаны повышение системной резистентности слизистой к инфицированию условно-патогенными и патогенными микроорганизмами, нормализация белкового, жирового, минерально-солевого обмена, иммунологического и аллергологического статуса организма (Гончарова, 1986; Квасников, Нестеренко, 1975; Лянная и соавт., 1986; БЬоо! ег а1., 1932).

В условиях острого дефицита лекарственных средств особую актуальность приобретает разработка новых и модернизация существующих технологий получения бифидуютрепаратов (Кузнецова. Никитин, 1986; Поспелова и соавт., 1986). В производстве про-биотиков для сельского хозяйства перспективно создание высокоэффективного жедкого бифидумпрепарата (Платонов, 1905; Тараканов,. 1987). Такой препарат должен содержать живые, физиологически активные, структурно и функционально дифференцированные клетки бифидобактерий, потенциально способные к репродукции и приживлению в желудочно-кишечном тракте.

Создание препарата требует фундаментальных исследований в области физиологии и цитологии бифидобактерий. Целесообразно изучение закономерностей роста и кислотообразования бифидобактерий, антагонистической активности по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственных животных, а также разработка принципов длительного сохранения жизнеспособности бифидобактерий и их биологически ценных свойств (Иванова, 1951; Лянная, Гон'!арова, 1975; Семенова, 1983; Сундукова, 1966; Цуцаева и соавт.,1988).

Исследование развивающихся популяций бифидобактерий на клеточном и субклеточном уровнях позволив судить о структурно-физиологической дифференциации составляющих их клеток. Необходимо изучение направленности процессов морфогенеза, особенностей ультраструктуры клеток в цикле развития популяций, цитоар-хитектоники колоний и организации поверхностных структур клеточной стенки. Имеющиеся литературные сведения по этим вопро-

сод крайне недостаточны (Вайсман, 1981; Лянная и соавт.,1979; Bauer et al., 1975; Zani, Severi, 1982). Полученные данные могут служить основой научного управления биотехнологическими процессами при использовании физиологически активных популяций бифидобактерий на определенных: стадиях развития.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена изучению физиологических свойств и структурно-функциональной организации бифидобактерий. Для достижения этой цели мы поставили следующие задачи:

1. Изучить совокупность физиологических свойств бифидобактерий (активность роста и кислотообразования, антагонистическую активность, сохранение жизнеспособности при субкультивировании) , отобрать штамм, перспективный для создания жидкого би-фидуыпрепарата.

2. Исследовать особенности физиологии отобранного штамма бифидобактерий: рост й кислотообразование на синтетических средах с различными источниками углеводного питания, динамику роста и кислотообразования на типовой и производственной питательных средах, антагонистическую активность к циркулирующим серотипам п. coli, сохранение антагонистической активности при субкультивировании и жизнеспособности при ультразаыораксивании и лиофилизации.

3. Изучить на клеточном и субклеточном уровнях изменение морфологии и деление клеток бифидобактерий в цикле развития популяций.

4. Исследовать ультраструктуру клеток бифидобактерий при развитии популяций. .

5. Изучить цитоархитектонику популяций и структурные основы когезии клеток бифидобактерий.

6. Получить опытные образцы жидкого бифидумпрепарата, содержащего физиологически активные, структурно и функционально дифференцированные клетки бифидобактерий, потенциально способные к репродукции и приживлению в желудочно-кишечном тракте.

Научная новизна. Впервые на клеточном и субклеточном уровнях исследованы закономерности развития популяций бифидобактерий. Доказано, ЧТО развитие В. adoleseentis UC-4-2 И Б. bifi-duE в -1 сопровождается морфологической и структурной дифференциацией клеток. Предложена схема морфологической трансформации клеток в цикле развития популяций: транзиторные (палочковидные и коккоидные) формы »почкующиеся и ветвящиеся культи-

септированные особи (МСО) •* элементы фрагментации МСО, потенциально способные к репродукции, и юс ретрансформация в тран-зиторные формы. Структурная дифференциация клеток сопряжена с формированием внутрицитоплазматического мезосомального комплекса, правильных цепочек полирибосом, связанных с мембранными структурами, интенсивньы накоплением полифосфатных и полиглю-козидных включения. Популяции бифидобактерий представляют собой высокоорганизованные структуры мицелиального типа. Межклеточные контакты осуществляются за счет слияния наружных слоев клеточных стенок, продуцируемого клетками фибриллярного поли-сахаридного матрикса (капсулы), экстрацеллюлярных тяжистых и глобулярных структур. Получены новые данные о физиологии бифидобактерий. Выполнено кинетическое моделирование развития популяций бифидобактерий в режиме ингибирования продуктами метаболизма. Установлена высокая антагонистическая активность бифидобактерий к знтеропатогенным для сельскохозяйственных животных серотипам Е. coli. Показана возможность длительного сохранения жизнеспособности и антагонистической активности бифидобактерий при оптимальных условиях субкультивирования, криокон-сервации и лиофилизации.

'Практическая ценность работы. Экспериментальные данные о физиологии и цитологии бифидобактерий использованы при разработке нормативно-технической документации на производство опытной партии препарата."Энтеробифидин". Препарат испытан в ряде хозяйств Витебской области , расчетный экономический эффект - 4,2 рубля на I рубль затрат. По результатам исследований получено авторское свидетельство № I6744II "Способ профилактики нитратных токсикозов и диареи у телят".

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Республиканской конференции "Проблемы идентификации микроскопических грибов и других микроорганизмов" (Неринга, >1987); II Республиканской научно-технической конференции "Применение электронной микроскопии в науке и технике" (Минск, 1987); Конференции молодых ученых "Клинико-лабораторные аспекты исследований инфекционной патологии" (Москва, 1988); Конференции молодых ученых по проблемам биохимии, физиологии и молекулярной генетики микроорганизмов Шущино, 1988); Всесоюзной школе-семинаре молодых ученых по проблемам эволюции и систематике•про-

кариот (Пущино, 1908); 1У Республиканской научно-теоратическо конференции молодых ученых к специалистов-микробиологов "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов* (Ташкент, .1969); Научно-практической конференции "шзрмектные препараты в ветеринарки и животноводстве" (Каунас, 1989)} Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных* (Ташкент, 1939); Всесоюзной конференции "Микробиологические процессы при промышленной перерабо тке сельскохозяйственного сырья" (Пучина, 1990); Всесоюзной конференции "¡микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства" (Алма-Ате 1990); Республиканской научно-производственной конференции "Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных" (Витебск, 1990).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы II i приняты в печать 2 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы и приложения, {¿атериалы изложены на 170 страницах машинописного текста, включая 140 кш рофотографий, II рисунков, 14 таблиц. В списке литературы 269 наименований работ, из них 108 отечественных и 161 иностранных.

Место проведения работы. Работа выполнена в лаборатория: микробиологии почв и биохимии микроорганизмов Института микр< биологии АН Б. Электронно-микроскопические исследования пров< дяди в отделе цитологии микроорганизмов Института микробиояо) АН СССР под руководством зав. отделом, доктора биологических наук В. й»'Дуды и старшего научного сотрудника, кандидата медицинских наук В. Б. Высоцкого.

Объекты и методы исследований

Исследовали штаммы Bilidobacteriun "bifiduu И № 791 Bifid¿bacterias aialesaeatis MC-42 и П)-13, Bifidüoaeterium langua В37ЗД, ящгще*.ние из БНИККИ и ШИИЗД им. Г. К. Габрич> ткаго. Для культивирования бифидобактерий использовали плот иве, полужидкие к лсвдюяе питательные среди Блаурокка (Siauro 1939), Хенеля Шваснжов, Нестеренко, 1975), Игла (1У-42274-81), кукурузн®-лактоакр> (Кй) (АС СССР К' 1271872, 1986), гид релизатно-молочхгую (П$ (Семенова, I9S3), сывороточную (СС) (АС СССР» IOS 1550, 19Ш, дрожже-сыворсточкую (ДС) (ИвйТру

ция по изготовлению биопрепарата ПАБК, 1977), а также обрат (ОБ) и обрат с кукурузным экстрактом (ОКЭ) (Инструкция по приготовлению сухой закваски бифидобактерий, 1984). Применяли глубинное культивирование и выращивание в анаэростате. Для определения числа колониеобразующих единиц (KDE) использовали метод предельных разведений в полужидких средах (Методы общей бактериологии, 1983). Кинетические параметры роста (igx.yv, v, с) и содержание сухой биомассы определяли по общепринятом формулам (Варфоломеев, 1987; Шлегель, 1987).

Морфологию и ультраструктуру бифидобактерий изучали с помощью методов световой (СМ: фазово-контрастной и люминесцентной, КБИ-16) и электронной (Ж: растровой (РЭ1.0 и трансмиссионной (ТЗЮ, JEJ-1оосх-11) микроскопии. Тотальные препараты для СМ готовили по стандартные методикам и окрашивали по Граму в модификации Хукера, по Гиссу, реактивами Леффлера, Шиффа (Методы общей бактериологии, 1983). Для ЗМ-изучения объекты подвергали обработке 4 % глутаровым альдегидом (ГА) и I л Qs04 на буфере Михазлиса; 3 % уранилацетатом (УА) в 30 % этаноле. Обезвоживали в градиенте ацетона - 70-90-100 %. Заливку объектов в дюркупан производили по прописи, рекомендованной специалистами фирмы "Beichert". УТ-срезы окрашивали 3 % УА в 30 % этаноле или цитратом свинца по Рейнолдсу (Гайер, 1974).

Актиекость кислотообразования определяли титрометрическим (°Т) и потенциометрическим (pH) методами. Идентификацию и количественное определение (вес %) уксусной кислоты и этанола производили на газовом хроматографе ХР0ш-5. Концентрацию молочной кислоты рассчитывали исходя из баланса брожения глюкозы по Lauer, Handler (1976).

Антагонистическую активность бифидобактерий по отношению к энтеропатогенным для сельскохозяйственных животных серотипам Е. coli (08; 086; 015; 0115; 0101; 33; 34; 56; 80; 114), staphylococcus aureus 209p, Ptcteus vulgaris 102 определяли методом совместного культивирования in vitro (Лянная, Гончарова, 1975).

Для хранения бифидобактерий использовали методы субкультивирования, криоконсервации и лиофилизации. Жизнеспособность выражали в единицах К0Е/мл. или %. Биологический контроль препарата осуществляли с привлечением следующих показателей:- а) внешний вид, цвет и посторонние примеси; б) 'цитология; в) жизнеспособность клеток; г) активность кислотообразования; д) ан-

■Еагонксткческая активность; е) специфическая стерильность; к) безвредность.

Статистическую обработку результатов выполняли по программе расчетов средних значений сравнения выборок "ЭТАТ-Тгз", разработанной в отделе автоматизации исследований ИПК и К АН Украины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Физиологические свойства бифидобактерий

Исследованы активность роста, спирто- и кислотообразования антагонистические свойства и жизнеспособность при хранении кулы тур бифидобактерий, перспективных для создания жидкого бифидум-препарата. Установлена высокая активность роста и кислотообразования 3. 'Diíiduai № 791, 3. adolescer-t,is МС-42 И ГО-13, Б. Ion-г.ix* В379Ы в сравнении с 'типовкм штаммом в. tifidua № I на средах Блаурокка, Хенеля, KJI, ГС, ДС, ОБ, ОКЭ (табл. I). С целью

Таблица I

Физиологические свойства бифидобактерий Штамм |Актив-jАктивность спирто- и кислото-i Антагонистическая

¡HQCTb

образования

активность» 96

îS^n ' ! г ! pH ¡ацетат, ^'этанол, %\ Е. ;?r.vui-;staph. Г-тШ' ! ! ! ! ! coli!carie ¡aursu! ^йУкл, ; ¡_;_? ,'102 ,'209?

B.bxfx- 0,09 49,4 6,0 0,112 0,030 63,0 80,4 47,5

dum IT 1

B.-bifi- 2,1 82,4 4,8 0,122 0,062 96,5 81,6 81,9

dum U 791

Б. ado- 3,8 61,5 4,8 0,290 0,108 98,2 87,2 83,2

lessen—

tis MO-42

В. ado- 2,9 72,3 4,8 0,074 0,034 96,9 -84,7 81,3

lescen-tis Г0-13

B. Ion- 0,52 43,3 5,6 0,144 0,003 94,6 82,8 81,1

gum • B379M

отбора технологичного штамма в эксперименте использовали иноку-лят третьей генерации с сокращением срока культивирования до 12 часов.. Максимальными показателями ростовой, спирто- и кислотообразующей активности, в частности способность® к интенсивном!' продуцировании ацетата и этанола, отличался штамм в. adoiescen-

из КС-42. Оптимальными для 3. ааоЗ-еасепгхз МС-42 были среда Хенеля (КОЕ/мл = 5,8хЮ9; °Т = 68,7; рН = 4,8; СК3СООН = 0,255.Й; С^Н^ОН = 0,122 %) и кукурузно-лактозная среда (КОЕ/ мл = 4,7хЮ9; °Т = 81,3; рН = 4,7; СН3СООН = 0,398^; С^ОН = 0,187 %). На средах с сывороткой и обратом титр Б. асЗо1езсеп-из КС-42 составил 2,1 (СС) - 9,4 (ОБ) х Ю9 КОЕ/мл, при соответствующих показателях титруемой и активной кислотности 72-42 °Т и рН 5,2-5,0. В качестве производственных отобраны кукурузно-лактозная и сывороточная среды.'

Доказана целесообразность использования синтетической среды Игла для вкрацквания и изучения культуральных свойств бифи-добактерий. Показана возможность ассимиляции декстрана и целло-биозы 3. а(5о1е5сепИ5 МС-42 и 3. МГхйиш № I и гликогена В. айоХегсеп-Из ЫС-42 при росте на среде Игла (табл. 2).

Таблица 2

Активность роста, спирто- и кислотообразования бифидобактерий на синтетической среде Игла с углеводами*

Среда} ЫПйлгв К "1 } В. аас1езсепгхз

I КОЕ/мл {°Т ]рН |СНзС00Н,|С2Н50К,| КОЕ/мл ;оТ|рН|СНзС00Н^С2Н50Н, ! ! ! \ % \ % \ ! ! ! % \ % ■

Игла 4,МО7 50,0 6,6 0,133 0,099 -2,бхЮ940,0 5,1 0,194 0,082

Игла 2,1хЮ1054,0 4,2 0,208 0,130 2,2хЮ1050,0 4,5 0,213 0,083

декстран

Игла 2,2хЮ1064,0 3,9 0,246 0,107 1,6хЮ1040,0 5,1 0,132 0,112

+

целлобиоза

Игла - - - 2,4хЮ1054,0 4,2 0,195 0,181

+

гликоген

* - для штамма МС-42 через 24 часа, для штамма № I - через

72 часа культивирования 1

(-) - не определяли

Выполнено моделирование кривых роста, спирто- и кислотообразования В. аао1еБоепгхз МС-42 и В. № I на средах Елаурокка и КЛ (рис. I, 2). Кривые роста штаммов Ь'С-42 и № I

7 ОЛ

КС-42,

_^

Í.:G-42, 2

МС-42, 2

О в 1в £4 32 40 4в М ВрвМЯ, О в 16 24 32 40 4в ¿в ВрвМЯ,

I • часы 1 часы

Рис. I. Динамика спирто- и кислотообразования В. а<Зо1евсепгха МС-42 и В. ЬШйиа № I на средах Блаурокка (I) и Ю1 (2): °Т, -«— рН,----ацетат, — лактат, - этанол, %

11 КОЕ

О 10 20 ЭО 40 60 ВО 70 60 80 100 110

t время,

часы

Рис. 2. Кривые роста бифидо-бактерий на средах Блаурокка ( -а- - ЫС-42, -о- - Jr" I) и КД ( -А- - МС-42)

срок хряне-

^ния, сутки Рис. 3. Изменение антагонистической активности бифидобактерий к E.coli CD, Vi. vulgaris 102 (KS) и Staph, aureus 209p ( ) при хранении: I, 2, 3 - соотношение бифидобактерий и тест-культур - 1:10 (Е. coli), 1:2 ( Pr. vulgariB и Staph, aureus); 4, 5 - 1:1

TT

XI

характеризовались продолжительностью low-фазы - 12 и 48 часов, фазы замедления скорости роста - 4 и 15 часов, стационарной фазы - 35-40 часов. Кинетические параметры leg-роста бифидобактерий третьей генерации следующие: № I - jt = 0,33; g = 2,17; ■lgx « 3,86; МС-42 - ß = 0,50; g = 1,4; Is* « 3,1.

Развитие популяций бифидобактерий сопровождалось интенсивным накоплением кислых продуктов метаболизма. Экспериментальные кинетические кривые роста и кислотообразования согласуются друг с другом. В условиях проявления осложняющих эффектов характер роста бифидобактерий монет быть идентифицирован как икгибированне процесса продуктами метаболизма. (Варфоломеев, 1987).

Установлена'высокая антагонистическая активность~90-95 % В. Mfiduii № 791, В. adolescentis МС-42 И ГО-13, В. longum В379М (в сравнении с в. Mfidum № I - 30-50 %) к энтеропато-генкым для сельскохозяйственных животных серотипам е. coli (08, 085, 015, 0115, 0101), а также Stapb. avLreus209p и p.c. vulgaris 102 (табл. I). Более высокий уровень антагонизма наблюдался по отношению к Б. coli~96,5 %, чем к Рг. vulgaris 102 ~ 84,1 % и sispb. aureus 209p~8I,8 %. Максимальной антагонистической способностью обладал итанм в. adoiescentis МС-42: группа Б. coli ~53,2 Pr. vulgaris Ю2~87,2 Staph., aureus 209p~tí3,2 %. Штимм 1.Ю-42 антагонистически активен (-100,0 %) также к высоковирулентным циркулирующим серотипам Е. coli (33, 34, 56, 80, 114), Еыделонным из патологического материала телят. Различия в /ропне антагонизма в значительной степени обусловлены различиями в активности роста, спирто- и кислотообразования' бифидобактерий.

Сохранение физиолого-биохимических свойств бифидобактерий колет быть достигнуто за счет обратимого торможения метаболизма при субкультизирсвании, ультразаиоратквании и лиофилиэации (Цуцаева, 1982; Шурда, 1983). Установлена достоверная зависимость уровня жизнеспособности бифидобактерий при субкультивировании от степени нейтрализации органических кислот, температуры хранения, используемой поддержи ващей среды и штамыовой принадлежности. Показана возможность длительного сохранения жизнеспособности лхешов № 791, МС-42 и ГО-13, В37® в условиях умеренной гипотермии (~4°С) при нейтрализации продуцируемых органических кислот (10 % líeHCOj до pH 7,0) на средах КЛ и СС. Оптимальные сроет хранении: на среде КЛ - для КС-42 - 200 суток при уровне жизнеспособности 1,7x10е К0Е/мл, для ГО-13 - 130 суток, 3,9*

Ю8 КОЕ/мл; на среде СС - для МС-42 - 60 суток, 2,6хЮ10 КОЕ/ мл, для № 791 - 160 суток, 5,0x107 ИОЕ/лл, для В379Ы - 160 суток, 1,0хЮ7 КОЕ/мл. Максимально устойчив при субкультивировании штамм В. асШеБсеп-Ыз МС-42 (табл. 3).

Таблица 3

■Жизнеспособность* бифидобактерий при хранении на средах КЛ и СС

Вари- ¡Максимальный срок хранения, сутки/уровень жиэнеспособнос-ант { ти, КОЕ/мл

хране-1-

ния { штамм

í № I { № 791 j МС-42 | ГО-13 j B379LI

I КЛ 30/1,3кЮ4 - 20/5, ОжЮ7 - 60/1,ОхЮ6

СС 30/1,Зх104 30/1, ОхЮ5 30/7, ОхЮ6 60/3, ОхЮ5 30/2,IxIO4

II КЯ 60/1,7x10* 130/8,ТхЮ8 200/1, ТхЮ8 130/3,9хЮ6 60/5, ОхЮ7

СС' 60/6,7хЮ4 <7 160/5,0x10 60/2,6хЮ10 ' 60/7,9хЮ7 1б0/1,0хЮ7

III КЛ - - - ЭЭ/4,0хЮ5

f>rs Uw — - - »/г, osio6 -

1У КЛ 60/1,2хЮ4 60/5, ОхЮ6 60/2,IxIO6 60/5,ОхТО7 60/5, ОхЮ7

СС Х/3,0хЮб 30/6,8хЮ8 30/6,4хЮ8 30/2,ОхЮ7 33/3,IxIO8

I и III - t « 4°С и 24°С соответственно, рН-5,1, °Т~91,2, CIlgCOOH" 0,563 II и 1У - t = 4°С и 24°С соответственно, нейтрализация органических кислот 10 % Ыансс^ до рН 7,0; к - исходный уровень жизнеспособности ~10 - 10*® КОЕ/мл, (-) - срок хранения менее 30 суток.

Поскольку эффективность препарата во многом определяется уровнем антагонизма бифидобактерий к патогенной микрофлоре-, исследовано изменение антагонистической активности в. adolescentes МС-42 к тз. ooll, Рг. vulgaris, Staph, aureus при субкультивировании. Доказано, что антагонистические свойства бифидобактерий полностью сохраняются в течение 60 суток хранения (среда КЛ, II вариант). При хранении культуры в течение ICO суток восстановление антагонистической активности происходило лишь после

в г

Рис. 4. Зависимость жизнеспособности бифидобактерий от условий крио-консервации (а, б) и лиофилизации (в, г). Варианты~ жидкая культура (КЛ, КОЕ/мл = 9,4x10®)- то же + 10 % сахароза;^ . - концентрированная суспензия клеток (КОЕ/мл = 2,0хЮ10);|3 - то же + 10% сахароза + 3x10" % смесь витаминов Вр В^, В^[] - жидкая культура + сахарозс-яелатозная смесь—сыворотка—+ молоко

¡¿.остакратного пассирования на среде Хй и увеличения содержания бифидобактерий в 2-10 раз (рис. 3).

Во нашим даннш, жизнеспособность в. айо1еБсепъ1з ври криоконсервации и лиофилизации зависит от исходной концентрации бактерий в единице объема замораживаемой суспензии, применения протекторов, режима охлаждения. Отмечено возрастаниз выииЕаекости клеток бнфздобактерий в концентрационном градиенте ЮЕ/мя и введении в состав среда суспевдирозания сахарозы и витаминов группы В. При замораживании жидких культур и коице1Яф52рс ванных суспензий клеток с криопротектэроы оптимальной является медленная скорость - V 4° /мин, для концентрированных суспензий без криопротектора - быстрая -V » 400-Ю0°/мкн (рис. 4а, б, в). Гибель клеток бифидобактерий при лиэфилизации $;няяется следствием воздействия неблагоприятных факторов на этапах замораживания и сублимации льда, а также в процессе хранения и рэгидратации лиофилизированного материала. Длительному хранению можно подвергать лиофилизированные с использованием в качестве протекторов сахарозы к витаминов группы В концентрированные суспензии клеток бифидобактерий (рис. 4в). Для целей производства доступна и эффективна лиофилизация жидких культур бифидобактерий с. использованием защитных сред на основе сухого обезжиренного молока и сыворотки (рис. 4г).

Структурно-Функциональная организация бифидобактерий

В литературе полиморфизм бифидобактерий трактуется как следствие модификаций и (или) мутаций развивающихся клеточных ассоциаций при изменении физико-химических параметров росА'а (:гоо1та ег а1., 1970; Роирагс1 et а1., 1972). ЗМ-исследования морфологически гетерогенных, форы е. айоЗ веселив 42 л Б. Ъх£г<1ш1 № I показали, что в цикле развития популяций на оптимальной по составу среде Блаурокка бифидобактерии способны к значительной клеточной дифференциации в связи с реализацией репродуктивных потенций. В экспоненциальной и ранней стационарной фазах в популяции преобладают прямые или искривленные палочки с будавонидшыи утолщениями на концах, со Ездутиями и шишкообраз-ными расширениями в центре клетки, терминальной бифуркацией, коккоидные и гранулированные формы. Наряду с равновеликим бинарным делением наблюдается аполярная, множественная септация палочковидных клеток, результатом которой является образование

коккоидов типа 1 и II. Структура клеточной стенки коккоидов типа I аналогична структуре клеточной стенки материнской особи. Коккоиды типа II отличаются утолщенной клеточной стенкой (-•70 нм), состоящей из трех слоев: - "первичной" клеточной стенки исходной палочковидной формы; - широкого электронно-оптически-прозрачного слоя - "вторичной" клеточной стенки; - тонкого, электрснно-плотного слоя, прюдакаюцего к цитоплазмати-ческой мембране. Деление коккоидов осуществляется путем центростремительной инвагинации цитоплаз'матической мембраны, вдоль которой формируется септа или в случае коккоидов типа II -"первичная" и "вторичная" стенки. Репродукция коккоидов в большинстве случаев сопровождается их ретраисформвцией в палочковидные формы, которой, в случае коккоидов типа II, предшествует ферментная деградация "вторичной" стенки. Коккоиды типа II с резко утолщенными клеточными оценками и обильным накоплением гранул полифосфата и гликогена являются анабиотическими формами, способными к выживанию в экстремальных условиях.

Палочковидные и коккоидные формы являются "транзиторными" и в поздней экспоненциальной и стационарной фазах подвержены почкованию и дихотомическому, 2-4-6-8-латеральному ветвлению. Почкование и ветвление клеток бифидобактерий, сопровождащиеся синтезом клеточной стенки, распределением нуклеоида и выраженной асимметрией внутриклеточных структур, необходимо рассматривать как вариант неравновеликого бинарного деления и генетически детеркиькроьанную трансформацию "транзиторных" форм, направленную на максимальное накопление числа жизнеспособных особей на данном пространстве. Для в. айо1езсепг1з МС-42 и в.ыпаит № I характерно образование глобулярных и булавовидных форм, связанное с процессом латерального и терминального почкования. Вакуолизированные, аналогичные протопластам глобулярные формы являются признаком деградации и гибели культуры бифидобактерий.

В стационарной фазе наблюдали мультисептацио ветвящихся филаментов с образованием 2 типов поперечных перегородок: гомогенных, тлеющих структуру, аналогичную структуре клеточной стенки (тип I по йШатг е1 а!., 1973), к слоистых, в центральной части которых располагаются два тонких злектронно-оп-тически-плотных слся, разделенных одним электронно-прозрачным слоем (тип II). Мультисептация сопровождается блокированием репродухтизной активности на стадии отделения вновь образованных клеток, результатом чего является формирование конгломера-

'tun шкробнцх тег (бифкдопласт).

Фрагментация мкцеяиальных фкяьыентов тгриводит к образовании дифференцированных репродуктивных форм - неравновеликих почкующихся фрагментов и коккоидов, обогащенных полифосфатаыи и гликогеном, с нормальными (тип I) и утолщенными (тип II) клеточными стенками, фрагментация сопровождается односторонним локальным разрывом капсулы, электронно-прозрачного слоя и внешней части клеточной стенки. В к&сте разрыва родительской капсулы у дочерних клеток осуществляется синтез собственных капсул, одновременно с которым происходит локальный лизис поперечной перегородки.

Последовательность предполагаемых трансформаций полиморф-Н1Ж клеточных форм в цикле развития популяций е. adoiesoentis IiC-42 к в. tiiidum № I представлена на схеме I. Предлагаемая для обсуждения схема сходна с циклом развития коринеформньгс бактерий. Механизм обособления клеток бифидобактерий аналогичен " sua;ipibr," - способу фрагментации корине- и нокардиеподобных бактерий. Доказательством родства микроорганизмов рода Bifidobacterium с представителями актиномицетов является образование при мультисеотации гомогенных и слсиптых перегородок (Нестерен-КО и соавт., I960; Crombacb, 1974; Willians et al.,-1975)-

Морфологическая гетерогенность клеток развивающихся популяций бифидобактерий коррелирует с особенностями их ультраструктуры. ¿ля Физиологически активных, делящихся клеток в. adoies-seb-tis МС-42 и В. bifidua № I в log -фазе роста характерно образование внутрицитоплазматического мембранного каьтлекса, представленного ламеллярными, миелиноподобными, везикулярными структурами, дифференцированного, согласно классификации Бирюзовой (1973), для выполнения геношой функции, а такяе функции контроля деления посредством координации синтеза Дг5К и септгции. Каналикулярные мембранные структуры, открывающиеся в периплазму, являются, вероятно, аналогами аппарата Гальдаи. Интенсификация синтеза белка сопровождается формированием правильных цепочек рибосом и полирибосом (d" I30-I50A0), связанных с мембранными структурами и являющихся аналогами ондоплазматического ретику-лума. Наблюдаемое усложнение мембранных структур 3. adolescen-ti и МС-42 при замедлении темпа деления в поздней экспоненциальной и ранней стационарной фазах роста объясняется, согласно ранее высказанной гипотезы Бирпзовой (1973), более высокой скоростью роста данного штамма в сравнении с в. bifidum asr 1.

Схема I. Морфологическая и структурная дифференциация клеток в цикле развития популяций В. adolescentiB1МС-42 И В. bifidum< № I: а - вегетативное размножение; 'Ь- литический цикл; -стадия транзиторнкх форм; £ - стадия ветвления

Нуклеокд представлен центральной с многочисленными ответвлениями или дисперсной осмиофобной зоной, содержащей нити коагулированной, иногда суперспираяизозанной ДНК 2-7 нм). Распределение нуклеоида детерминировано направленностью процессов морфогенеза - экчопочкованием, ветвлением и мультисептацией.На эдектрокнограымах выявляются многочисленные полифосфатные и по-лиглюкозидные включения. Более активное накопление полифосфатов я клеточном цикле в. асЮ1еасег;газ МС-42 свидетельствует о высокой интенсивности процессов метаболизма и значительном биологическом потенциале данного впаша. Болотин накаллиьается в ¿слстках экспоненциально растущей (и, частично, в стационарной фазе) популяции в. эао1иЕоепг1Е КС-42 перед делением и расхочется б процессе репродукции в данной генерации, либо сохраняйся в внаоиотичегких формах ыультисептированных особей.

Старение популяций бифидобактерий сопровождается перестройками ультраструктуры: суперсинтезом клеточных стенок, усложнением организации и увеличение!« объзма внутрицитоплазматкческого мемсшонного комплекса, изменением морфологии и компактности ядерного аппарата, накоплением и разрушением включений- Наряду с активно растущими и делящимися клетками характерно появление ¿ластеров покоя^досся и спонтанно лизирующихся особей, вплоть до тупиковых форм гетероморфизма - неяизнеспособних, с необратимыми изменениями структурно-функциональной организации (схема 1ь).

Адаптация к факторам внешней средь; обеспечивается механизмами, гарактиру;ащичи морфологическую и структурную стабильность микробного консорциума - связью клеток друг с другом (когезией) д прикреплением (адгезией) развивакдцхся ассоциаций к субстрату (ЗеЗ1. 1?76).

По нашим данным, дифференциация клеток бифидобактерий затрагивает характер их агрегации. Поьуляцки бифидобактьрий представляют высокоорганизованные структуры мицед/алънэго типа. По-дооный способ организации колонии определяется способом обособления клеток после деления и способствует, согласно ранее высказанного предположения, созданию градиента концентраций питательных веществ, опосредованного диффузией и активным транспортом субстратов через межклеточный матрикс (Пузырь, 1988). Ыев-.-шегочные контакты, принимающие участие в феномене когезии клеток а- ado3.esceiit.is МС-42 и В. Ьд^аиа $ I осуществляются, В основном, за счет слияния наружных слоев клеточных стенок, посредством капсулярных структур, в т.ч. тяжисть'Х морфологически

гетерогенных микрофибрилл, а также зкстрацеллюлярных шишкооб-разных электронных выступов, включая синтезируемый клеткой органический ыакромолекулярный матрикс.

Межклеточные контакты за счет слияния наружных слоев клеточных стенок обусловлены направленностью процессов морфогенеза - мультисептацией и блокированием репродуктивной активности на стадии отделения разделившихся клеток. Капсулярный компонент выявляется в виде радиально-концентрического полисахаридного матрикса, интегрированного в наружную поверхность клеточной стенки. Производными капсулы являются поливезикулярные, нитчатые, пучковые, трубчатые, пленочные и пилеподобные структуры (микрофибриллы). Глобулярные структуры, судя по реакции с ГА, Озо4, уд и цитратом свинца, можно интерпретировать как сформированные комплексы синтезируемых клеткой зкстрацеллюляркък амфифилов - лкпополисахаридов и гликопротеинов. Отдельные глобулярные структуры имеют, по-видимому, отношение к экстрацел-лэлярнкм энзиматкческкм комплексам. Поверхность клеток, внрос-оих на среде Игла без углеводов, не имела структурной орнаментации» в отличие от клеточной стенки особей, полученных на среде Игла с ди- и полисахаридами, игарегнированной глобулами, как к в случае применения среды Блаурокка. Морфологически такого рода образования идентичны целлалосомам бактерий (Мауег, 15ВЗ). Таким образом, в результате исследований получены новые данные о структуре поверхностных слоев клеточной стенки бифидобактерий к их участии в феномене когезии.

Получение препарата "Энтеробифидин"

Экспериментальные данные о физиологии и цитологии бифидобактерий использованы при получении опытных партий жидкого препарата "Знтеробифидин". Процесс его производства включает следующие этапы: приготовление питательных сред; репарацию лиофиль-но высуженной культуры в. айо1еБсеа11Б КС-42; глубинное культивирование в ферментерах; консервацию биокассы, разлив во флаконы и маркировку. '

При получении кидкого бкфидукпрепарата в качестве стартовой использована культура В. айо1езоепг1в МС-42 (Ш)Е/мл=2,6х 10®, // - 0,46, е т 1,52). Анализ кинетических закономерностей роста биф-лдобактеркй в ферментерах показал, что применение 10л инокулята позволяет существенно сократить сроки культивирова-

t время, часы

Рис. 5. Динамика роста и кислотообразования бифидобактерий в ферментерах на средах КЕ (I) и СС (2): -Q- - активность роста, le'КОЕ; - биомасса, г/л; -»- - титруемая кислотность, °Т; -а- - активная кислотность,,. рН; -в— концентрация уксусной кислоты, %

ния. Кривые роста характеризовались длительностью log -фазы на среде КЛ - 5 часов, СС - 8 часов, фазы замедления скорости роста - 2 часов, стационарной фазы на КЛ - 14 часов, на СС - 7 часов. Развитие культуры характеризовалось следующими кинетическими параметрами: КЛ - lgX = 1,65, J> = 0,69, е = 1,0; СС -IgX » 2,66, J4 = 0,71, g = 1,0. Характер кинетических кривых роста определялся интенсивностью кислотообразования (рис. 5). Консервацию биомассы осуществляли 10 % NaHCO^. Срок хранения препарата при t = 4°С - 60 (СС, KDE/мл = 2,6хЮ10) - 160 (КЛ, KDE/мл = 1,4хЮ9) суток.

Результаты биологического контроля препарата: цитология -популяции бифидобактерий.состоят из физиологически активных, интенсивно пролиферирующкх полиморфных клеток с ярко выраженными когезивнкми свойствами, потенциально способных к репродукции и приживлении в желудочно-кишечном тракте; жизнеспособность - КОЕ/мл- 109-101' , при содержании сухой биомассы 3,54,0 г/л; активность кислотообразования - °Т = 120-140, pH 4,34,5, СНдСООН = 0,5-0,75 %; антагонистическая активность к Б-coli, Рг. vulgaris, Staph, aureus -ч- 85-100 %; специфическая стерильность - посевы на ША, МПБ, средах Эндо и Сабуро стерильны в течение 8 суток; безвредность - препарат не обладает патогенными и токсическими свойствами, безвреден для белых мышей и кроликов.

Препарат "Знтеробифидин" обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью 66,7-80,0 % - по данным БелНИИЭВ и Витебского ветеринарного института) при диарее и нитратных токсикозах новорожденных телят.

ВЫВОДЫ

I. Исследованы физиологические свойства и структурно-функциональная организация культур бифидобактерий, перспективных для создания жидкого бифидумпрепарата. Установлено, что в. t>i-fidum i? 791, В. adolesoentis МС-42 и Г0-13, В. longum В37Ш в сравнении с в. tifidum $ I обладают высокой активностью роста и кислотообразования на различных питательных средах, антагонизмом к энтеропатогенннм для сельскохозяйственных живот-hex серотипам б. coli, staph.aureus и Pr. vulgaris, длительным сохранением жизнеспособности в условиях умеренной гипотермии и нейтрализации органических кислот.

2. На основании максимальной ростовой, кислотообразующей

и антагонистической активности, в т.ч. к циркулирующим возбудителям, длительного сохранения низнеспособности и антагонистических СВОЙСТВ ПРИ СубкулЬТИВИрОВаНИИ ОТОбраН ШТаММ В. adolescentes МС-42. йгамм способен к интенсивно^ продуцированию ацетата и этанола, ассимилирует декстран, целлобиозу, гликоген. Рост характеризуется высокими значениями кинетических параметров, сопряжен с эффектом ингибирования кислыми продуктами метаболизм ма.

3. Доказана целесообразность применения криоконсервации в жидком азоте и лиофилизации для длительного сохранения жизнеспособности и биологических свойств 3. adolescentis ¡<£-42. Установлено возрастание выживаемости клеток в концентрационном градиенте 10-10^® КОЕ/мл, при использовании оптимальных режимов охлаждения, протекторов на основе сахарозы, витаминов группы В, сыворотки и o6paT¿.

4. Популяционное развитие в. adolescentis КС-42 и Б. Ы-fidum К3 I сопряжено с морфологической и структурной дифференциацией клеток. Представлена схема морфологической трансформации клеток: транзиторкые - палочковидные и коккоидные формы почкующиеся и ветвящиеся мультисептированные особи (¡.'СО) элементы фрагментации LC0, потенциально способные к репродукции, и их ретрансформация б транзиторные формы.

5. Показано своеобразие реализации репродуктивных потенций 3. adolescentis 1ÚC-42 И В. Ъэ-Паи^ ¡f I при экзопочковакки И ветвлении, септации и фрагментации. Это: выраженная асимметрия внутриклеточных структур, распределение цуклеовда и синтез клеточной стенки на стадии экзопочкования и ветвления, образование гомогенных и слоистых перегородок, коккокдов типа I и II, отличающихся по структуре клеточной стенки и накоплению полифосфата, при септации. Механизм фрагментации многоклеточных структур аналогичен "sncppins" - способу обособления клеток нокардие- и коринеподобных бактерий.

6. Особенностями ультраструктуры клеток развивающихся популяций бифидобактерий являются формирование внутрицитоплазма-тического мезосомального комплекса, правильных цепочек рибосом и полирибосом, связанных с мембранными структурами, накопление далифосфатных и полиглюкозидных включений. Количественно кластеры клеток с обильным накоплением полифосфата встречаются в

популяциях в. аао1еесеЫ1з ЫС-42 значительно чаще, чем у в. ыг 1йит л 1.

7. Популяции бифидобактерий представляют собой высокоорганизованные структуры мицелиального типа, целостность которых опосредована когезией образующих их полиморфных клеток. Межклеточные контакты осуществляются за счет слияния наружных слоев клеточных стенок, капсул, экстрацеллюлярных тяжистых и глобулярных структур.

8. Получены опытные образцы жидкого препарата "Энтеробифи-дин", содержащего физиологически активные, структурно и функционально дифференцированные клетки В. айо1езсепиБ МС-42, потенциально способные к репродукции и приживлению в желудочно-кишечном тракте. Препарат обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью при желудочно-кишечных заболеваниях и нитратных токсикозах телят.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1. Лазарева Г. И., Сундукова М. Б. Исследование ультраструктуры В1паоЪас1ег1ит асЮ1еБсетав МС-42 // Материалы науч.-техн. конф. "Применение электронной микроскопии в науке и технике", Минск, 1988, с. 116-117.

2. Лазарева Г. И. Неспецифическая адгезия бифидобактерий // Тез. докл. 1У Респуб. науч.-теор. конф. мол. ученых и спец,-микробиологов "Биология, культивирование и биотехнология микроорганизмов", Ташкент, 1989, с. 15. •

3. Пилуй А. Ф., Кислякова 3. И., Лаппо Л. В., Иванов В. Е., Лазарева Г. И., Богдановская Ж. Н., Мельникова Н. В. Профилактическая эффективность жидкого бифидумбактерина при диспепсии новорожденных телят // Тез. докл. науч.-практ. конф. "Ферментные препараты в ветеринарии и животноводстве", Вильнюс, 1989, с. 71-72.

4. Зименко Т. Г., Буряко И. А., Лазарева Г. И. Подбор и использование микроорганизмов для консервации кормов и профилактики диспепсии у телят // Тез. докл. Всесоюз. конф. "{микроорганизмы - стимуляторы роста растений и животных", Ташкент, 1989, с. 77.

5. Лазарева Г. И. Морфологический критерий в систематике рода - В1П<1оЪасгег1иш// Тр. I Всесоюз. школк-конф. мол. ученых

"ЭёОЯщйя И систематика Прокариот", Пущино, 1988, с. 44-45.-ш ШИПЯ 25,01,95, & 511-В90.

- 6. Пилуй А. Ф., Кислякова 3. И., Лаппо Л. В., Иванов В. Б., Богдановская Ж. Н., Стефанович Л. И., Лазарева Г. И. Лечебная эффективность жидкого бифидуыбактерина при диспепсии телят // Тез. докл. Рёсп. науч,-проиэвод. конф. "Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных", Витебск, 1990, с. 74-75.

7. Лазарева Г. И., Богдановская Ж. Н., Гребенко В. В., Лаппо Л. В., Еилуй А. Ф., Кислякова 3. И. Антагонистическая активность бифидобактерий - компонента лечебно-профилактического препарата // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Ь^кробиологичес-кие и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства", Алма-Ата, 1990, с. 49.

8. Богдановская Ж. Н., Гребенко В. В., Стефанович Л. И., Лазарева Г. И., Карпуть И. У., Ульянов А. Г., Севркж И. 3., Зе~ лютков Е. Г. Получение и применение препарата энтеробифидин дня профилактики и лечения дисбактериозов у телят // Тез. докл. Всесоюз. конф. "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства", Алма-Ата, 1990, с. 12.

9. А.С. 1674411 МКИ5А 61.К 35/66. Способ профилактики нитратны! токсикозов у новорожденных телят / Карпуть И. М., Ульянов А. Г., Бабйн В. Н., Севрюк И. 3., Гребенко В. В., Богдановская К. Н., Стефанович Л. И., Лазарева Г. И. (СССР). -4722543/15; заявл. 08.06.89. ДСП.

10. Лазарева Г. И., Богдановская й. Н., Мельникова Н. В., Гребенко В. В., Лаппо Л. В., Пилуй А. Ф., Кислякова 3. И. Антагонистическая активность бифидобактерий и их профилактическая эффективность при диарее телят // Весц1 АН БССР, 1990, № 2, с. 105-107.

11. Высоцкий В. В., Лазарева Г. И., Рапопорт А. И. Визуализация межклеточных связей /когагии/ у некоторых представителей анаэробной микрофлоры с помощью растровой электронной микроскопии // Микробиология, т. 60, К' 2, с. 328-333.

За*.100. Тираж ХОО. ИГиГ.1991