Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам обратной транскриптазы

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам обратной транскриптазы"

На правах рукописи

Николепко Галина Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ВИЧ-1 К ИНГИБИТОРАМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПТАЗЫ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

005044224

Кольцово- 2012

1 7 МАЙ 2072

005044224

Работа выполнена в Национальном Институте Рака Национальных Институтов Здоровья (США) и ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор Ильичев Александр Алексеевич. Официальные оппоненты:

Воевода Михаил Иванович - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, директор НИИ терапии СО РАМН;

Карпова Галина Георгиевна - доктор химических наук, профессор, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, заведующая лабораторией структуры и функции рибосом;

Щелкунов Сергей Николаевич - доктор биологических наук, профессор, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор», заведующий отделом геномных исследований и разработки методов ДНК-диагностики поксвирусов.

Вед)пцая организация:

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Защита состоится « 8 » июня 2012 года в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: р.п. Кольцово, Новосибирской области, Новосибирского р-на, 630559, тел. (383)

336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан «_»

2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета

Трошкова Г.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) - инфекционный агент, вызывающий Синдром Приобретенного Иммунодефицита человека (СПИД). Глобальная эпидемия СПИДа, которая распространяется вот уже более 30 лет, вовлекая в ряды инфицированных ежегодно более 2 миллионов человек, является серьезной проблемой мирового здравоохранения. По последним данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире число ВИЧ-инфицированных составляет около 34 млн. человек, причем количество вновь инфицированных продолжает расти и в 2010 году составило 2.7 млн., а число умерших - 1.8 млн. человек (wvwv.unaids.org).

В последние годы достигнуты значительные успехи в разработке новых терапевтических агентов и стратегии лечения ВИЧ-инфекции. Основными мишенями разрабатываемых лекарственных препаратов против ВИЧ-1 служат жизненно-важные ферменты вируса: обратная транскриптаза, протеаза и ингеграза, - а также белки оболочки и рецепторы на поверхности Т-лимфоцитов. В период с 1987 г. по 2008 г. разрешено применение 18 лекарственных препаратов, ингибирующих обратную транскриптазу ВИЧ-1 -это нуклеозидные и ненуклеозидые ингибиторы, с 1995 по 2006 г.г. - 11 препаратов, ингибирующих протеазу, с 2003 по 2007 г.г. - 2-х препаратов, препятствующих проникновению вируса в клетку; в 2007 г. - ингибитор интегразы. В настоящее время в США официально используется около 30 различных терапевтических препаратов (http://www.fda.gov/oashi/aidsV На начальной стадии лечения рекомендуется использовать комбинации одного или двух нуклеозидных аналогов, одного ненуклеозидого и/или одного ингибитора протеазы (http://aidsinfo.nih.gov'). Лекарственные препараты против ВИЧ-1 инфекции не могут излечить заболевание, однако существенно замедляют патологические процессы, улучшают качество жизни больных и снижают уровень смертности (Palella et al., 1998). В глобальном масштабе, постоянное расширение спектра анти-ВИЧ-1 препаратов, позволило достигнуть значительных успехов. Так, обеспечение лечением нуждающихся увеличилось с 7% в 2003 г. до 42% в 2008 г., передача' вируса от матери ребенку была снижена за эти же годы с 90% до 55% (www.unaids.org).

Несмотря на существенный прогресс в разработке и использовании лекарственных препаратов против ВИЧ-1, вызываемые ими побочные эффекты, а именно: непереносимость и токсичность при длительном применении, а также несоблюдение режима приема препаратов - сильно снижают эффективность их действия. Другая проблема связана с особенностями

жизненного цикла вируса, обусловливающими высокую скорость его адаптации. Вирус

ю

размножается в организме взрослого человека с высокой скоростью - до 10 вирусных частиц в день (Perelson et al., 1996). При этом уровень ошибок при обратной транскрипции

-5

достигает 5x10 , - что приводит примерно к одной мутации на каждый цикл репликации (Mansky, 1996; Svarovskaia et al., 2003). Не стоит забывать, что ВИЧ-1 обладает весьма высокой частотой рекомбинации (Hu et al., 2003). Учитывая размер генома вируса (около 10000 нуклеотидов) при выполнении простых вычислений, можно предположить, что каждый день в организме взрослого пациента могут генерироваться все возможные точечные мутации, и в присутствии противовирусного препарата неизбежно произойдет отбор лекарственно-устойчивых вариантов вируса (Coffin, 1995). Дополнительные трудности в борьбе с инфекцией возникают из-за трансмиссии лекарственно-устойчивых штаммов ВИЧ, причем в отдельных регионах 10-20% вновь инфицированного контингента заражено именно такими штаммами (SPREAD Programme, 2008).

Около половины всех лекарственных препаратов против ВИЧ-1 ингибируют полимеразную активность обратной транскриптазы. Разработка лекарственных препаратов, направленных на специфическое блокирование активности вирусной РНКазы, продолжается не один год, но до сих пор не увенчалась успехом из-за их высокой токсичности (Schultz and Champoux, 2008). Используемые ингибиторы обратной транскриптазы подразделяют на две группы: нуклеозидные аналоги (NRTI), и ненуклеозидые аналоги (NNRTI).

Интенсивные исследования механизмов лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы начались в 1987 году вскоре после внедрения первых антиретровирусных препаратов в клиническую практику. К началу данной работы было описано два основных механизма лекарственной устойчивости к нуклеозидным аналогам -дискриминация (Gao et al., 2000; Sarafianos et al., 1999) и фосфоролиз (Arion et al., 1998; Meyer et al., 1998). В соответствии с механизмом дискриминации лекарственно-устойчивые мутации образуют пространственные препятствия для включения трифосфорилированной формы ингибитора, NRTI-TP, в растущую ДНК-цепь. В соответствии с механизмом фосфоролиза лекарственно-устойчивые мутации обратной транскриптазы способствуют удалению 3'-терминирующего NRTI в присутствии физиологических концентрациий пирофосфата или АТР, который служит акцепторным субстратом реакции.

Несмотря на то, что описанные механизмы лекарственной устойчивости представляли обоснованную теоретическую и практическую базу, все предыдущие исследования

ограничивались только Ы-концевым участком фермента, содержащим его полимеразный домен. С-концевой район фермента при этом оставался мало изученным с этой точки зрения. Отчасти это было обусловлено ограничениями коммерческих генотипических и фенотипических тест-систем, не включающих этот район в стандартные тесты (Ре&ороиЬз й а1., 2000; 8ЬаГег е1 а1., 2001; Тига1 е1 а1., 2002), вследствие чего исследователям была доступна весьма ограниченная информация о последовательности этого района обратной транскриптазы. Таким образом, для прогнозирования результатов лечения и развития антивирусных препаратов нового поколения, которые позволят значительно усовершенствовать стратегии лечения ВИЧ- инфицированных, необходимо понимание функционирования обратной транскриптазы как единого целого, поэтому более углубленное исследование свойств обратной транскриптазы и механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Настоящая работа посвящена изучению свойств обратной транскриптазы ВИЧ-1, обеспечивающих высокую адаптогенность вируса, а именно способности генерировать мутации и активно рекомбинировать, а также исследованию механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, позволяющих вирусу избегать воздействия лекарственных препаратов.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные

задачи:

- Разработать ПЦР анализ, позволяющий определять количество копий специфической цепи ДНК вируса, реплицирующегося в культуре клеток и первичных лимфоцитах человека.

- Проанализировать с его использованием ранее недоступные для анализа параметры обратной транскрипции ВИЧ-1: скорость синтеза «минус»-цепи вирусной ДНК, переноса «минус»- и «плюс»-цепи ДНК, инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК.

- Проанализировать влияние ингибиторов обратной транскриптазы ВИЧ-1 на синтез «минус»- и «плюс»-цепи ДНК.

- Разработать новые тесты для определения частоты смены матрицы и частоты мутирования обратной транскриптазой ВИЧ-1 на культуре клеток.

- Сконструировать мутантные вирусы и выявить функциональные и структурные детерминанты изменения частоты смены матрицы и частоты мутирования.

- Исследовать влияние мутаций С-концевого района обратной транскриптазы на лекарственную устойчивость ВИЧ-1.

- Сравнить лекарственную устойчивость референс-формы ВИЧ-1, принадлежащего подтипу В и CRF01_AE.

- Сконструировать вирусы, содержащие обратную транскриптазу из вирусов пациентов, прошедших антиретровирусную терапию и наивных относительно лечения.

- Проанализировать эти вирусы на чувствительность к ингибиторам обратной транскриптазы и провести сравнительный анализ последовательности обратной транскриптазы.

- Идентифицировать мутации С-концевого района обратной транскриптазы из вирусов пациентов, ответственные за усиление лекарственной устойчивости.

- Провести теоретическое обоснование механизма лекарственной устойчивости, обеспечиваемое новыми мутациями обратной транскриптазы.

- Проверить основные положения предложенного механизма лекарственной устойчивости в экспериментах на культуре клеток и биохимических экспериментах.

Научная новизна и практическая значимость работы

Разработан новый ПЦР анализ для определения количества копий специфической ДНК цепи, представляющий собой уникальный подход к анализу репликации ВИЧ-1. С его использованием впервые определена скорость синтеза «минус»-цепи ДНК для ВИЧ-1 в культуре клеток и первичных CD4+T клетках, а также скорость переноса «минус»- и «плюс»-цепи ДНК и инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК; впервые показано ex vivo, что инициация «плюс»-цепи ДНК ВИЧ-1 осуществляется на множественных сайтах. Впервые показано влияние ингибиторов обратной транскриптазы на кинетику синтеза «минус»-цепи ДНК.

Впервые исследованы структурные детерминанты обратной транскриптазы ВИЧ-1, отвечающие за изменение частоты смены матрицы и частоты мутирования. Показано, что замедление полимеризации как путем воздействий химическими соединениями, так и при мутации определенных участков фермента, участвующих в связывании с субстратом, приводит к увеличению частоты смены матрицы; снижение активности РНКазы снижает частоту смены матрицы. Показана корреляция между изменением частоты смены матрицы и частоты мутирования.

Предложен и обоснован новый механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным аналогам, обусловленный мутациями С-концевого района обратной

транскриптазы, который отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и NRTI-фосфоролизом /NNRTI-диссоциацией.

Впервые идентифицированы мутации в коннекторе обратной транскриптазы из вирусов пациентов, проходящих антивирусную терапию, которые обладают лекарственной устойчивостью как к NRTI, так и к NNRTI. Показано, что мутации коннектора ответственны за различия в лекарственной устойчивости референс-форм вируса, принадлежащего подтипу В и CEF01_AE.

Новый механизм лекарственной устойчивости прошел тестирование и подтверждение на культуре клеток с использованием модельных мутаций вируса, мутаций, идентифицированных в обратной транскриптазе от вирусов пациентов, а также на биохимическом уровне.

Положения, выносимые на защиту:

- Новый ПЦР анализ позволяет определять количество копий специфической цепи ДНК ВИЧ-1, реплицирующегося в культуре клеток и первичных лимфоцитах человека.

- Скорость синтеза «минус»-цепи вирусной ДНК ex vivo составляет 68-70 нуклсотидов в минуту, перенос «минус»-цепи ДНК - 4 минуты, инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК на полипуриновом тракте - 9 минут, и перенос «плюс»-цепи ДНК - 26 минут.

- Инициация синтеза «плюс»-цепи ДНК ВИЧ-1 осуществляется на множественных сайтах.

- Ингибиторы обратной транскриптазы ВИЧ-1 замедляют синтез «минус»-цепи ДНК.

- Созданные нами новые тесты на культуре клеток позволяют определять частоту смены матрицы и частоту мутирования обратной транскриптазы ВИЧ-1.

- Замедление полимеризации как путем воздействий химическими соединениями, так и при мутации определенных участков фермента, участвующих в связывании с субстратом, приводит к увеличению частоты смены матрицы; снижение активности РНКазы снижает частоту смены матрицы.

- Мутации в захватывающем праймер участке РНКазы ВИЧ-1 не меняют частоту мутирования за исключением позиции Q475A (увеличение частоты мутирования в 2 раза), в то время как четыре аминокислотные замены (S557A, A558V, Q559L и Y586F) в обратной транскриптазе другого ретровируса - вируса лейкемии мыши (MLV), увеличивают частоту мутирования от 2.1 до 5.4 раз.

- Мутации каталитически важных аминокислотных остатков РНКазы, а также захватывающего праймер участка РНКазы существенно снижают чувствительность

вируса к ингибиторам обратной транскриптазы; сочетание этих мутаций с классическими лекарственно-устойчивыми мутациями ТАМ полимеразного домена приводит к кооперативному эффекту в увеличении лекарственной устойчивости к NRTI.

- Мутации коннектора обратной транскриптазы селектируются в ответ на лечение NRTI и NNRTI и усиливают лекарственную устойчивость.

- Мутации коннектора отвечают за различия в уровне лекарственной устойчивости референс-формы вируса подтипа В и CRF01_AE.

- Мутации коннектора обратной транскриптазы обуславливают перекрестную устойчивость к разным классам ингибиторов обратной транскриптазы.

- Молекулярный механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы, обусловленный мутациями С-концевого района обратной транскриптазы, отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и ЫКТ1-фосфоролизом/№ЖТ1-диссоциацией.

Апробация работы

Представленные в диссертации результаты были доложены на различных конференциях и симпозиумах, в том числе на: Международных симпозиумах HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance (США, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008), International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications (CILIA, Испания 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009); 5th International Workshop on HIV Transmission (2009, Cape Town, South Africa); 13th HIV Dynamics and Evolution Meeting (2006, Woods Hole, MA, USA); Международных конференциях Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting (США 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), 47th InterScience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (2007, Chicago, IL, USA), The Eleventh East Coast Retrovirus Meeting (2004, Palm Spring, CA, USA).

Работа выполнена в 2001-2011 годах в Национальном Институте Рака Национальных Институтов Здоровья США в рамках научного обмена и по грантам государственных научно-технических программ, а также в отделе биоинженерии ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор». На разных этапах ее выполнения в ней приняли участие как научные консультанты V.K. Pathak, заведующий подразделением вирусных мутаций (Chief of Viral Mutation Section, HIV Drug Resistance Program, National Cancer Institute), J.M. Coffin, академик, профессор, советник директора программы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (Special Advisor to Director, Center

for Cancer Research, National Cancer Institute), S.H. Hughes, директор программы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 (Director, HIV Drug Resistance Program National Cancer Institute), а также K.A. Delviks-Frankenberry, E.C. Сваровская, D.A. Thomas, J.L. Mbisa, E.A. Воронин, R. Barr, R. B. Lengruber и другие сотрудники, которым автор приносит искреннюю благодарность. По материалам диссертации опубликовано 20 работ в научных журналах, две из которых были названы в числе 5 ключевых публикаций в данной области исследований (PLOS Medicine, 2007 V 4(12), е346, р.2). Настоящая работа была отмечена дважды как выдающаяся Комитетом Национального Института Здоровья в 2007 и 2008 годах (Fellows Award for Research Excellence in Recognition of Excellence in Biomedical Research, National Institutes of Health), а также завоевала награды за лучшую презентацию в 2006 и 2007 годах (10th and 11й1 Spring Research Festival, NCI-Frederick, 2006 and 2007).

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из семи разделов: «Общая характеристика работы», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 182 станицах машинописного текста и включает 68 рисунков, 13 таблиц и список литературы, содержащий 308 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка нового ЦС-ПЦР анализа для определения количества копий специфической ДНК цепи. Приложение разработанной технологии к обратной транскрипции ВИЧ-1 и механизму действия антивирусных препаратов

Ретровирусы имеют сложный процесс репликации, преобразуя геномную РНК вируса в двуцепочечную ДНК, содержащую последовательности для контроля транскрипции и ДНК интеграции. Обратная транскриптаза - это фермент, который осуществляет репликацию генома ВИЧ-1, используя в качестве матрицы как РНК, так и ДНК, и расщепляя РНК в составе РНК-ДНК гибрида. Репликация генома ВИЧ-1 включает в себя синтез «минус»- и «плюс»-цепи нуклеиновой кислоты, которые невозможно было различить с помощью доступных на данный момент методов ПЦР. Мы разработали новый метод количественного ПЦР анализа, ЦС-ПЦР (Цепь Специфичная ПЦР) для детальной харакгеризации процесса

обратной транскрипции ВИЧ-1 в инфицированных клетках, который позволяет специфически амплифицировать и детектировать «минус»- или «плюс»-цепь ДНК.

«Замок»-проба

..ЛИ, ШГ^т

«Замок»-проба

лиг mr

Д.

йТиЗ I |U3|R

------сРРТ РРТ

1~ание РР I 2RCA EL_____ДВ ШВ

I

Амплификация

"Т"

с РРТ

"Г*"....."шГ

:РРТ РРТ*»

3. ПЦР iL__JJ ' ТЩИ"

Ч v>— —'"У PBS

IV- inblni » I __ _ MusIR I

в реальном

времени \J

Рис. 1. А. Схематическое изображение ЦС-ПЦР анализа. 1. Лигирование «замок»-пробы, комплементарной специфическому району одноцепочечной ДНК, в циклической реакции с использованием термостабильной Taq-ДНК-лигазы. 2. Амплификация кольцевой «замок»-пробы в реакции катящегося кольца (RCA) с использованием Bst-LF ДНК-полимеразы. 3. Определение количества копий амплифицированного продукта с использованием тех же праймеров н меченной с двух концов флуоресцентной пробы методом ПЦР в реальном времени. Б. Локализация «замок»-проб на геноме ВИЧ-1. Обратная транскрипция показана схематически. Голубая стрелка изображает синтез <шинус»-цепи ДНК, красная - «плюс»-цепи ДНК. Также показаны некоторые цис-элементы участвующие в репликации и транскрипции: R - повторяющийся район; U5 - уникальный 5' район; U3 -уникальный 3' район; PBS - сайт связывания праймера; РРТ - полипуриновый тракт; сРРТ - центральный полипуриновый тракт; CTS - центральная терминирующая последовательность. Синтез «минус»-цепи показан синим цветом, «плюс»-цепи- красным.

ЦС-ПЦР анализ основан на использовании одноцепочечных «замок»-проб, устроенных по принципу висячего замка (padlock), которые сначала специфически гибридизуются к ДНК цепи-мишени своими 3'- и 5'- концами, затем концы сшиваются, формируя кольцевую ДНК-пробу, которая далее амплифицируется в каскадной реакции амплификации - RCA (rolling-circle amplification). Количество копий продукта этой реакции определяется методом ПЦР в реальном времени с использованием меченной флуоресцентной пробы (рис. 1 а).

В нашей работе было разработано 12 «замок»-проб, позволяющих измерять различные параметры репликации ВИЧ-1: кинетику переноса «минус»-цепи ДНК (проба 1 и 2), элонгации «минус»-цепи ДНК (проба 3, 4, 5 и 6), инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК с полипуринового тракта - РРТ (polypurine tract; проба 2 и 7), и альтернативного центрального полипуринового тракта- сРРТ (central polypurine tract; проба 5 и 7), переноса «плюс»-цепи ДНК (проба 6 и 8), элонгации «плюс»-цепи ДНК (проба 8,9,11 и 12) и количественный анализ синтеза ДНК в районе центрального ДНК-флэпа (central DNA flap; проба 10), критичного для транспорта вирусной ДНК в клеточное ядро (рис. 1 б).

и

Эффективность и фоновый сигнал определяли в ЦС-ПЦР для каждой пробы индивидуально. Количество копий специфического ДНК-продукта достигало максимума к 6 часам после инфекции (2 х10б - 6х10б) для всех проб. Фоновый сигнал для точки 0 часов составлял 100-1000 копий ДНК и не превосходил 1% специфического сигнала для всех проб. Для контроля эффективности и воспроизводимости очистки ДНК из каждого образца, использовали коррекцию на количество копий клеточного генома (PBDG ген). Воспроизводимость ЦС-ПЦР анализа была достаточно высока, и для большинства экспериментов разброс не превышал 20%. Для анализа и сравнения данных, полученных в независимых экспериментах, использовались стандартные кривые, генерируемые путем амплификации известного количества ДНК. Коэффициент корреляции стандартной кривой был > 0.99 для всех проб. Это говорит о том, что исходящий сигнал находится в линейной зависимости от количества внесенной в реакцию ДНК. Количества копий ранних продуктов синтеза вирусной ДНК, соответствующих району R-U5, были одинаковыми для ЦС-ПЦР и традиционного ПЦР в реальном времени. Исключение составляла точка 0 ч. Это связано с тем, что фоновый сигнал нашего теста варьировал от 100 до 1000 копий, а его чувствительность не позволяла определить менее 1000 копий ДНК.

Для изучения кинетики обратной транскрипции ex vivo культуру клеток инфицировали вирусом. Инфицированные клетки собирали каждые 30 минут в течение 6 часов для последующего выделения клеточной ДНК и анализа продуктов обратной транскрипции. В качестве контроля фонового сигнала использовали времешгую точку 0 ч. Количество продукта обратной транскрипции выражали относительно 6-часовой точки, принятой за 100%. Те значения, которые соответствовали менее чем 1%, принимали за 1% при построении графика в логарифмическом масштабе. Расстояние между кривыми для соответствующих пар проб, отражающими кинетику накопления продуктов обратной транскрипции, представляет оценку среднего времени, необходимого для копирования матрицы между двумя пробами. Среднее расстояние между линейными участками кривых определяли путем измерения расстояния при накоплении продукта в количествах 5,10,20 и 30% относительно максимального.

Характерный график кинетики синтеза «минус»-цепи ДНК показан на рис. 2. Горизонтальные линии между двумя кривыми соответствуют времени, необходимому для синтеза продукта размером в 7031 нуклеотид, которое составляет в среднем 104-105 минут, т.о. средняя скорость синтеза вирусной ДНК для данного примера составляет 67-68 нуклеотидов в минуту.

В результате анализа обратной транскрипции с использованием описанных выше проб, мы определили скорость синтеза «минус»-цепи ДНК в клетках 293Т и активированных человеческих СОА+ Т-лимфоцитах, которые являются главной мишенью ВИЧ-1. По результатам трех и более независимых экспериментов скорость синтеза составляла 68±17 и 70±3 нуклеотидов в минуту, соответственно. При определении времени переноса

1,OOOj----

293Т клетки СД4+ Т-клетки

S loo ........ .....—»—- «-"-р"-*

О f™................скорость скорость

о Ю £----------:.у синтеза ' -~~f" синтеза

х Г--------105 минут = /Я........У 104 минуты -

§ I 67 н./мин. / !t 68 н./мин.

* 1 -----т-1/.--р. - -

О 2 4 6 О 2 -4 в 8

Время, часы Время, часы

Рис. 2. Кинетика синтеза «минус»-цепи ДНК в культуре клеток 293Т и в первичных CD4+ Т-клетках. Накопление продуктов обратной транскрипции представлено как процент относительно количества продуктов аккумулированных в б-ти часовой точке. Расстояние между двумя кривыми, соответствующими пробе 3 и 6, представляет собой время, необходимое для синтеза продукта размером 7031 н.

«минус»- и «плюс»-цепи ДНК на противоположный конец генома нами было показано, что перенос «минус»-цепи занимает около 4 мин, а перенос «плюс»-цепи требует более продолжительного времени — 26 мин. Мы также определили время, необходимое для инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК с главного сайта инициации - РРТ сайта, что составляет 9 мин. Инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК с другого сайта - с центрального РРТ, требует больше времени и достигает 28 мин.

Данные по измерению скорости синтеза «плюс»-цепи ДНК явились для нас основанием четко заявить о наличии множественных сайтов инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК, что подтверждает более ранние наблюдения (Klarmann et al., 1997; Miller et al., 1995). Принято, что существует два основных сайта инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК: РРТ и сРРТ. Мы пранализировали скорость накопления продуктов синтеза «плюс»-цепи ДНК на участке генома между пробами 11 и 12, прилежащими к РРТ и пробами 8 и 9, прилежащими к сРРТ. Она была очень схожа, хотя расстояние между пробами существенно отличается и составляет 4000 н.о. и 2700 и.о., соответственно. Это говорит о наличии дополнительных сайтов инициации. Подтверждением этому служит также тот факт, что для вируса с мутированным сРРТ скорость накопления продуктов синтеза «плюс»-цепи ДНК упала только для пробы, расположенной в непосредственной близости от сРРТ, но не для более отдаленной,

293Т клетки СД4+ Т-клетки

j^lZñ.............скорость скорость

г—..............4 105 минут = ............— -............—у ..... сиктеза •- ......-.................V 104 минуты = Д 68 н./ мин.

для которой не существует классических сайтов инициации. По-видимому, праймерами дополнительных сайтов инициации «плюс»-цепи ДНК служат фрагменты РНК достаточной длины, которые все еще остаются связанными с «минус»-цепью ДНК. Однако в настоящее время остается неизвестным, сколько дополнительных сайтов инициации существует, представляют ли они специфические последовательности или РНК фрагменты, случайным образом ассоциированные с «минус»-цепью ДНК, и каким образом они избегают вытеснения ДНК синтезом, инициированным с вышенаходящихся сайтов.

Проба 10 была разработана для анализа центрального ДНК-флэпа, который участвует в транспорте преинтегразных комплексов в клеточное ядро (Sirven et al., 2000; Zennou et al., 2000). Мы продемонстрировали, что продукт ДНК, соответствующий пробе 10, синтезируется в количестве, превышающем остальные исследованные районы в 2-3 раза, что согласуются с формированием ДНК-флэпа. Эти данные подтверждают то, что разработанный нами новый тесг является количественным методом детекции центрального ДНК-флэпа и может быть использован для анализа эффективности вытесняющего ДНК-синтеза в других районах генома ВИЧ-1.

В нашей работе мы впервые показали влияние антивирусных агентов на синтез «плюс»- и «минус»-цепи ДНК в клетках. Мы проанализировали три нуклеозидных аналога AZT, d4T и ddl и ненуклеозидный ингибитор EFV в концентрациях ингибирования вирусной репликации до 97-99%. Все использованные в этом исследовании ингибиторы оказывали минимальный эффект на ранний продукт синтеза «минус»-цепи ДНК (определенный с помощью пробы 3). В противоположность, поздний продукт синтеза «минус»-цепи ДНК (определенный с помощью пробы 6) накапливался по-разному, при обработке AZT и d4T, наблюдалось только 5% продукта относительно контроля, для ddl и EFV- 55 и 15%, соответственно. Таким образом, синтез «минус»-цепи ДНК значительно ингибировался AZT и d4T, в средней степени EFV, и минимально ddl. Ингибирование вирусной репликации было 97-99% для изученных ингибиторов, причем для AZT и d4T 95% ингибирования происходило при синтезе «минус»-цепи ДНК. Для ddl и EFV ингибирование при синтезе «минус»-цепи ДНК составляло 45% и 85%, соответственно, указывая на то, что эти соединения также в значительной степени должны ингибировать и синтез «плюс»-цепи ДНК.

ЦС-ПЦР анализ обратной транскрипции ВИЧ-1, разработанный нами в данном исследовании, представляет собой новый инструмент для изучения ранее недоступных для анализа аспектов вирусной репликации, связанных со специфической цепью ДНК. Этот метод значительно дополняет возможности всех ранее разработанных количественных ПЦР

технологий для измерения числа копий вируса (Cesaire et al., 2001; Palmer et al., 2003), копий интегрированного вирусного генома (Butler et al., 2001) и кинетики обратной транскрипции (Butler et al., 2001; Karageorgos et al., 1995; Victoria et al., 2003). На примере данного

pis CPPÇ" „И»"

Рис.З. Влияние ингибиторов обратной транскриптазы на синтез «минус»-цепи ДНК. Показано накопление продуктов обратной транскрипции, определенных с помощью проб 3 и 6 в течение 6 часов, в отсутствии ингибитора и в присутствии ингибиторов в концентрациях блокирующих инфекцию на 95-99%.

исследования мы видим, что разработанный нами анализ открывает широкие перспективы для изучения влияния на кинетику обратной транскрипции специфических мутаций в вирусных белках (RT, NC, Vif, Vpr, Nef и т.д.), а также cis-элементов ( PBS, PPT, cPPT, CTS и т.д.). Он также может быть успешно использован для детального изучения репликации других вирусов.

2. Структурные и функциональные детерминанты обратной транскриптазы,

влияющие на частоту смены матрицы и частоту мутирования

Обратная транскриптаза не имеет корректирующей активности в процессе элонгации, поэтому ВИЧ-1 обладает высоким уровнем мутирования, что приводит к формированию генетического разнообразия внутри ретровирусной популяции. Другим важных механизмом возникновения генетического разнообразия и эволюции ретровирусной популяции является рекомбинация во время вирусной репликации (Burke, 1997; Temin, 1991). В результате рекомбинации и селективного давления значительная часть циркулирующих штаммов ВИЧ-1 являются рекомбинантами (Ни et al., 2003; McCutchan et al., 1992; Peeters and Sharp, 2000; Robertson et al., 1995). Рекомбинация приводит к быстрому возникновению вирусов, несущих множественные лекарственно-устойчивые мутации (Kellam and Larder, 1995; Moutouh et al., 1996; Zhuang et al., 2002). Рекомбинация происходит во время обратной транскрипции, когда обратная транскриптаза перепрыгивает с одной упакованной РНК на другую в процессе

синтеза ДНК (Ни and Temin, 1990). В нашей работе мы исследовали свойства обратной транскриптазы, влияющие на частоту смены матрицы и точность копирования. Для решения этой задачи нами были разработаны новые тесты для определения частоты смены матрицы и частоты мутирования в инфицированных клетках. Протокол этих тестов схематически изображен на рис. 4.

Рис. 4. Схематическое изображение ВИЧ-1 векторов и протокол тестов, использованных для изучения частоты смены матрицы и частоты мутирования обратной транскриптазы ВИЧ-1. Вектора содержат длинные концевые повторы (LTR) и цис-элементы ВИЧ-1, необходимые для его функционирования. Гены GFFP/lacZ и устойчивости к антибиотикам транскрибируются с LTR или раннего промотора цитомегаловируса человека (CMV), экспрессия hygro/neo регулируется внутренним рибосомсвязывающим сайтом вируса энцефаломиокардита (IRES). Клеточная линия, экспрессирующая ВИЧ-1 вектор, трансфецируется плазмидами для продукции белка оболочки (pHCMV-G) и pCMVDR8.2, кодирующей все белки ВИЧ-1, за исключением белка оболочки. Полученным вирусом инфицируют клетки мишени 293Т, которые далее селектируют на устойчивость к гидромицину/0418. Во время обратной транскрипции происходит смена матрицы внутри гомологичного F повтора, приводящая к восстановлению функционального гена GFP, или мутирование lacZ, приводящее к его инактивации и потере голубой окраски. Селектированные колонии анализируют путем проточной цитометрии или подсчета колоний; пропорция клеток зеленого фенотипа служит количественной оценкой частоты смены матрицы, а пропорция клеток белого фенотипа служит измерением частоты мутирования.

В нашей работе мы проанализировали ряд факторов, которые могут влиять на частоту смены матрицы и частоту мутирования ВИЧ-1. Сначала было проанализировано влияние мутаций в каталитически активном сайте обратной транскриптазы, которые осуществляют ряд важных контактов с субстратом, на частоту смены матрицы. Связывание обратной транскриптазы с входящим dNTP и надлежащее спаривание с матрицей важны для формирования фермент-субстратного комплекса. Вирусы с такими мутациями в гене обратной транскриптазы, обладающие лекарственной устойчивостью, можно выделить как из пациентов в ответ на лечение, а также путем селекции in vitro. Наши результаты показали, что снижение связывания с субстратом посредством введения мутаций в фермент увеличивает частоту смены матрицы (рис. 5 а). Мы протестировали также одиночные мутации лекарственной устойчивости к нуклеозидным аналогам и их комбинации, которые расположены в отдалении от dNTP-связующего сайта. Большая часть из них также

pKD- Ш V-G FFP-I Ну

^ pKD-HTV-lacZ-IN

IlTF^St^REHCMVII lacZ ~H"lRES7i^j| LTr|

Котраисфекцчя pCMVMS.2, pHCMV-G

GN-HIV-GFFP

\ /

ES-HIV-lacZ

0o o° О О

293T клетки у/ ^ 293T клетки

Проточная цитометрия

Инфекция и С }

селекция к ^Ssr........

. eudpoMuiiuiiy/G418

I X-Gal окраска

Определение частоты реконституции GFP/инактивации lacZ частота смены матрицы частота мутирования

увеличивала частоту смены матрицы (рис. 5 б). Это указывает на то, что селекция лекарственно-устойчивых мутаций может влиять на уровень рекомбинации и эволюцию вируса. Мутации в каталитическом сайте РНКазы, наоборот, приводили к снижению частоты смены матрицы (рис. 5 в).

Л „а > лР-А

V ^ ///

Ж

Рис. 5. Влияние мутаций обратной транскриптазы ВИЧ-1 на частоту смены матрицы. А. Частота смены матрицы, наблюдаемая для обратной транскриптазы, содержащей мутации аминокислот, участвующих в непосредственном контакте с праймером, матрицей или входящим с1ЫТР в районе каталитического сайта полимеразы. Контакты аминокислот с субстратом показаны на вставке. Б. Частота смены матрицы, наблюдаемая для лекарственно устойчивых мутаций к тимидиновым аналогам и М184V. В. Частота смены матрицы для мутаций каталитического сайта РНКазы.

Чтобы напрямую продемонстрировать, как изменение количественного соотношения полимеразной и РНКазной активности влияет на способность обратной транскриптазы к смене матрицы, мы сконструировали фенотипически смешанные вирионы с измененным соотношением полимеразной и РНКазной активностей, как было описано ранее (Вгтса! е1 а1., 2002). Для продукции таких вирусных частиц использовали разные пропорции вирусной плазмидной ДНК, кодирующей обратную транскриптазу дикого типа и содержащую мутацию каталитически важной аминокислоты полимеразного или РНКазного каталитического сайта (ОПОЕ и Е478С>, соответственно). Анализ таких вирионов показал, что снижение полимеразной активности приводит к увеличению частоты смены матрицы, а РНКазной - к снижению. Воздействие на процесс полимеризации гидроксимочевиной, которая истощает нуклеотидный пул, а также использование ингибитора обратной транскрипции А2Т и <14Т (данные не представлены), приводило к увеличению частоты смены матрицы (рис. 6), как и в случае снижения полимеразной активности в описанных выше экспериментах. Таким образом, в данной работе мы продемонстрировали, что существует взаимосвязь между полимеразной и РНКазной активностями, и соотношение количества этих активностей является важным

фактором, определяющим частоту смены матрицы, что согласуется с механизмом динамического выбора матрицы (5уагоузка1а е( а1., 2000).

45 80

3 п

I 60

i 50

3 40 3

г зо

и

Е 20

Е"

ез ? 0

,111

ш - ни

сз +HU

\VT M184V K65R L74V D549NH539N

Q.05 0.1 0.5 5.0 10.0 Концентрация AZT (иМ)

Рис. 6. Влияние гидроксимочевины (А) и АгТ (Б) на частоту смены матрицы ВИЧ-1. А. Черные столбцы представляют собой среднюю частоту смены матрицы в отсутствии гидроксимочевины, а белые - в присутствии 0.2 мМ гидроксимочевины для 2-6 независимых экспериментов. В эксперименте использовали фермент дикого типа (\УТ), а также содержащий мутации полимеразного (М! 84У, К6511 и Ь74У) и РНКазного (0549Ы, Н539М) доменов. Б. Изменение частоты смены матрицы в присутствии возрастающих концентраций для обратной транскриптазы дикого типа.

С использованием теста для определения частоты мутирования мы выявили, что изменение соотношения активностей полимеразы и РНКазы также влияет на частоту мутирования. Снижение доли полимеразной активности приводило к снижению частоты мутирования ВИЧ-1, а снижение доли РНКазной активности не оказывало на нее влияния (рис. 7 а).

При выполнении этой части работы мы нашли высокую степень отрицательной корреляции между частотой смены матрицы и частотой мутирования для вирусов, содержащих мутации в каталитическом сайте полимеразы. Например, мутации Q151N, K65R и M184I увеличивали частоту смены матрицы в 6, 2.7 и 2 раза, соответственно, при этом снижали частоту мутирования в 13, 8.1 и 4 раза, соответственно. Уровень корреляции между изменением частоты смены матрицы и частоты мутирования in vivo и in vitro составлял 89% и 88%, соответственно (рис. 7 б). Таким образом, снижение эффективности полимеризации увеличивает частоту смены матрицы и снижает частоту мутирования.

Мы сравнили захватывающий праймер участок РНКазы двух ретровирусов - ВИЧ-1 и вируса лейкемии мыши (MLV) - в тесте, определяющем частоту мутирования. Замены аминокислот захватывающего праймер участка РНКазы ВИЧ-1 не приводили к изменению частоты мутирования, за исключением мутации Q475A, в присутствии которой частота мутирования возрастала в 2 раза. Наоборот, замены четырех аминокислот захватывающего праймер участка РНКазы MLV приводили к существенному увеличению частоты

мутирования от 2.1 до 5.4 раз. Исследование природы мутаций, вызываемых двумя мутантами MLV - Y586F и S557A, обнаружило большое количество замен в пределах 18 нуклеотидов от последовательностей АААА, ТТТТ или ААТТ,

Рис. 7. А. Зависимость частоты мутирования от изменения пропорции функциональной полимеразной или РНКазной активности в фенотипически смешанных вирионах. Б. Линейная регрессия относительного увеличения частоты смены матрицы и относительного уменьшения частоты мутирования обратной транскриптазы ВИЧ-1. Увеличение частоты смены матрицы выражено относительно таковой дикого типа. Уменьшение точности копирования измерено в in vitro и in vivo тестах с использованием a-пептида р-галактозидазы (Svarovskaia et al., 2004). Использованы данные для мутантов Q151N, Q151M, V184Y, V184I, F116Y, FI 16W, Y115F, L74V, K65R и E89G.

12 10 8 6 4 относительное уменьшение частоты мутирования in vitro

называемых также A-тракт последовательности. Кроме того, большое количество мутаций было связано с прыжками обратной транскриптазы, включая значительную пропорцию делеций между PBS (primer binding site) и нижележащими последовательностями. Используя ПЦР в реальном времени мы показали, что мутанты Y586F и S557A обладают дефектом при переносе «плюс»-цепи ДНК на другой конец генома, что приводит к возникновению делеций в процессе их репликации.

Повышенная склонность к ошибкам, проявляемая MLV мутантами Y586F и S557A, по-видимому, вызвана специфической конформацией субстрата, на котором обратная транскриптаза не способна функционировать корректно. Этот субстрат представляет собой РНК-ДНК-сшивку, согнутую в районе стыка ДНК и РНК, которая приводит к преждевременной терминации полимеризации этими мутантами. Это предположение подкрепляется тем фактом, что подобная же согнутая конформация свойственна протяженным последовательностям A-трактов (АААА, ТТТТ, ААТТ) (Crothers et al., 1990). Количество ошибок, совершаемых изученными мутантами в пределах 18 нуклеотидов от А-трактов, было значительно увеличено до 69% и 60% по сравнению с диким типом (50%) и случайным распределением (39%).

ВИЧ-1 и MLV значительно различаются между собой в отношении связывающего праймер участка РНКазы и его роли в точности копирования. Причиной таких различий, по-

видимому, служит структура обратной транскриптазы, которая является гетеродимером у ВИЧ-1 и мономером у MLV. ВИЧ-1 менее чувствителен к изменениям структуры связывающего праймер участка РНКазы, поскольку малая субъединица обратной транскриптазы ВИЧ-1 служит дополнительным структурным компонентом, обеспечивающим корректную третичную структуру. По-видимому, она также способствует коррекции различных конформаций нуклеиновых кислот и минимизации их влияния на конечный продукт обратной транскрипции. Интересно отметить, что частота встречаемости A-трактов в геноме MLV существенно ниже, чем в геноме ВИЧ-1, что, по-видимому, связано с различными способностями полимераз этих вирусов безошибочно преодолевать подобные последовательности.

Таким образом, разработанная нами система позволяет тестировать влияние различных факторов на частоту смены матрицы и частоту мутирования m vivo, которые являются важными свойствами обратной транскриптазы, влияющими на рекомбинацию и эволюцию вируса. Измерения частоты смены матрицы позволяют также оценить, полимеразная или РНКазная активности изменены относительно друг друга в интересующем нас условии или мутантном варианте вируса. Мы продемонстрировали, что изменение баланса между полимеразной и РНКазной активностью является причиной изменения частоты смены матрицы и частоты мутирования; снижение полимеризации увеличивает как частоту смены матрицы, так и точность копирования.

3. Новый механизм лекарственной устойчивости к NRTI и NNRTI

Обратная транскриптаза - многофункциональный фермент, в котором не только полимеразная, но и РНКазная активность выполняет важную роль в осуществлении и завершении репликации. Совокупность литературных данных о роли РНКазы в обратной транскрипции, а также результаты, полученные нами при изучении цепь-специфических аспектов репликации ВИЧ-1 и исследовании частоты смены матрицы привели нас к гипотезе, что РНКазная активность должна играть роль в развитии лекарственной устойчивости к ингибиторам обратной транскриптазы. Мы обнаружили, что такие ингибиторы как AZT и d4T, более подверженные фосфоролизу, терминируют вирусную репликацию в основном во время РНК-зависимой ДНК полимеризации. Мы также показали, что присутствие AZT и d4T увеличивает частоту смены матрицы, что означает изменение баланса между скоростью полимеризации и деградации РНК. Мы выдвинули гипотезу о том, что взаимодействие между включением ингибитора в ДНК-цепь, его фосфоролизом и активностью РНКазы критично как

для прерывания ВИЧ-1 репликации, так и продолжения репликации, или устойчивости к NR.II.

Нами был предложен новый механизм, который утверждает, что баланс между полимеризацией, РНКазной активностью и фосфоролизом является важной детерминантой лекарственной устойчивости (рис. 8). Согласно предложенной гипотезе, действию ЫЯТ1 противостоят мутации обратной транскриптазы, «работающие» в соответствии с механизмом фосфоролиза, и тогда баланс между активностью РНКазы и эффективностью фосфоролиза становится важной детерминантой лекарственной устойчивости к этим препаратам. Реакция фосфоролиза включенного в ДНК нуклеозидного аналога - это критическая стадия, определяющая дальнейший успех обратной транскрипции в присутствии и, как

следствие, выживаемость вируса. Поскольку фосфоролиз - это кинетически медленная реакция, обратная транскрипция останавливается до момента ее завершения, а в это время РНКаза продолжает разрушать РНК-матрицу. В зависимости от конкретного соотношения между активностью РНКазы и эффективностью фосфоролиза события могут развиваться по следующим сценариям.

Если РНК разрушена до такой степени, что фермент уже не может оставаться связанным с субстратом - РНК-ДНК-дуплексом - и реинициировать полимеризацию, то дуплекс диссоциирует и полимеризация прекращается, что приводит к гибели вируса (рис. 8, левая панель - чувствительный фенотип). Если фермент содержит мутации, ускоряющие фосфоролиз, то при завершении фосфоролиза полимераза еще связана с РНК-ДНК-дуплексом и полимеризация продолжается после разблокирования З'-конца праймера, что приводит к устойчивому фенотипу для фермента, содержащего ТАМ. Мутации, снижающие активность РНКазы, увеличивают время жизни РНК-ДНК-дуплекса и тем самым позволяют продолжать полимеризацию после разблокирования праймера (рис. 8, правая панель - устойчивый фенотип). Таким образом, снижение активности РНКазы увеличивает пребывание блокированного полимеризационного комплекса в необходимой для возобновления полимеризации конформации - вплоть до завершения реакции фосфоролиза.

Для тестирования предложенного механизма были использованы модельные мутации каталитического сайта РНКазы обратной транскриптазы 0549Ы и Н539Ы, которые снижали активность РНКазы. Кроме этого, мы проверили нашу гипотезу с использованием фенотипически смешанных вирусных частиц, в которых активность РНКазы была снижена относительно полимеразной активности.

наннннаанавв ааввааваавва

I ДНК 1 днк

* встраивание встраивание МР!Т1

да инвнивйнвна аваавваааввва

1 РНКаза | РНКаза

'ГГГО-. (замедленная)^

ававввааевдвв двввввввавввв

| Диссоциация I фосфоролиз ЫРТ

лраимера и матрицы

<Ш,................

ааваааавааааввааааав

остановка продолжение

полимеризации полимеризации

Чувствительный фенотип Резистентный фенотип

Рис. 8. Механизм устойчивости к нуклеозидным ингибиторам. Схематически изображены этапы важные для прерывания синтеза «минус»-цепи ДНК в присутствии нуклеозидного аналога. Эти этапы включают в себя включение аналога, разрушение матрицы с помощью активности РНКазы и диссоциацию праймера и матрицы. Для фермента дикого типа (чувствительный фенотип), формирование заблокированного полимеризационного комплекса приводит к его диссоциации при деградации РНК. Для мутантного фермента (резистентный фенотип), снижение активности РНКазы позволяет удалить аналог и продолжить полимеризацию до того критического момента, когда матрица и праймер диссоциируют.

Результаты тестирования этих вирусов в культуре клеток показаны на рис. 9. Вирусы, содержащие мутации каталитического сайта РНКазы, 0549Ы и Н539Ы (рис. 9 а и б), а также фенотипически смешанные вирусы с относительно сниженной пропорцией активности РНКазы (рис. 9 в) обладают повышенным уровнем лекарственной устойчивости к АгТ и с!4Т, сравнимым с уровнем устойчивости вируса, содержащего ТАМ. Совмещение в одном и том же ферменте мутации 0549Ы, снижающей активность РНКазы, и лекарственно-устойчивых мутаций ТАМ, усиливающих эффективность фосфоролиза, приводило к кооперативному эффекту увеличения резистентности (рис. 9 г и д). Так, комбинация ТАМ и Б549Ы приводила к увеличению А2Т-устойчивости до 1000 раз по сравнению с устойчивостью, обусловленной индивидуальными мутантами - в 23 и 12 раз, соответственно. Аналогичный эффект наблюдался и для с14Т устойчивости, обусловленной теми же самыми мутациями и их комбинацией: для комбинации ТАМ и 0549Ы она увеличивалась в 12.5 раз, а для индивидуальных мутантов - только в 2.4 раза (рис. 9).

А Б В

Г Д

Рис. 9. Феиотипическое тестирование ВИЧ-1 мутантов H539N и D549N каталитического сайта РНКазы обратной транскриптазы ВИЧ-1 (а,б,г,д) и фенотипически смешанных вирионов со сниженной пропорцией РНКазы (10%) (в) в ходе одного раунда репликации. Показаны представительные графики зависимости репликации вируса от концентрации ингибиторов. Ось Y - процент ингибирования вирусной репликации относительно репликации в отсутствие лекарства, ось X - концентрация ингибитора. В качестве контроля использованы вирус дикого типа (wild type) и с ТАМ мутациями устойчивости к тимидиновым аналогам (AZT-R).

Известно, что не только РНКазный домен, но и коннектор важен для активности РНКазы in vitro. Аминокислоты захватывающего праймер участка РНКазы расположены в коннекторе и в РНКазном домене обратной транскриптазы, для которых ранее было показано, что их мутирование приводит к сниженному уровню вторичного гидролиза РНК, изменению специфичности гидролиза в районе РРТ, замедляя кинетику его удаления (McWilliams et al., 2006; Rausch et al., 2002). В соответствии с описанным нами механизмом, мутации, снижающие активность РНКазы, потенциально способны усиливать устойчивость к нуклеозидным аналогам. Мы исследовали влияние мутаций в этом районе на лекарственную устойчивость. Результаты нашего тестирования показали, что замены аминокислот, контактирующих с комплексом матрица-праймер, приводят к значительному увеличению устойчивости к AZT, в контексте ТАМ (до 243 раз по сравнению с ТАМ контролем - 9 раз) (рис. 10).

Мы выдвинули предположение, что аминокислотные замены обратной транскриптазы, снижающие активность РНКазы, и проявляющие повышенную лекарственную устойчивость должны присутствовать в вирусах, выделенных от прошедших терапию ВИЧ-инфицированных. С большей долей вероятности эти замены должны быть локализованы в тех участках фермента, изменения в которых могут снижать активность РНКазы: в РНКазаном

устойчивость. Столбцы представляют собой среднее значение измерений 50% ингибирующей концентрации А2Т (от 2 до 11 независимых измерений). Цифры над столбцами показывают, во сколько раз увеличена устойчивость к ХГХ относительно дикого типа (1х). Знак * показывает статистически достоверные различия относительно ТАМ или дикого типа, соответственно ( Р<0.05, М"ест).

домене или коннекторе, содержащем захватывающий праймер участок РНКазы. Тот факт, что лекарственно-устойчивые мутации в С-концевом участке фермента не были ранее выявлены в вирусах от пациентов, экспонированных нуклеозидным аналогам, можно объяснить тем, что стандартные генотипические и фенотипические тест-системы анализируют только концевую часть обратной транскриптазы, исключающую коннектор и РНКазный домен.

В сотрудничестве с клиницистами мы провели анализ 2-х групп ВИЧ-инфицированных (по 7 пациентов в каждой): прошедших антивирусную терапию и наивных относительно лечения пациентов. Мы создали конструкции для продукции и тестирования рекомбинантных вирусов. Первая группа конструкций содержала С-концевой район гена обратной транскриптазы, выделенный из вируса пациентов, в составе плазмидной ДНК, схематически представленной на рис. 11 а. Вторая группа конструкций содержала С-концевой район гена обратной транскриптазы, выделенный из вируса пациентов, и полимеразный домен обратной транскриптазы, содержащий ТАМ мутации. Результаты фенотипического тестирования показали, что вирусы, содержащие С-концевой район обратной транскриптазы от прошедших терапию пациентов обладали увеличенной устойчивостью к AZT, по сравнению с вирусами, содержащими С-концевой район обратной транскриптазы от наивных относительно лечения пациентов (рис. 11 б). Особенно примечательно то, что как и в случае модельных вирусов со сниженной активностью РНКазы, комбинация ТАМ с С-концевым доменом обратной транскритпазы от прошедших терапию пациентов оказывала кооперативный эффект на лекарственную устойчивость. Как видно из рис. 11 б, уровень устойчивости к А2Т этих вирусов был выше в 200-400-раз, чем у вируса

дикого типа, в то время как вирус, содержащий только ТАМ, был лишь в 12 раз устойчивей вируса дикого типа.

Для того чтобы определить, какая часть С-концевого района обратной транскриптазы вызывает увеличение лекарственной устойчивости, мы сконструировали серию векторов, которые содержали: 1) обратную транскриптазу из вируса пациента с коннектором и РНКазным доменом дикого типа, 2) обратную транскриптазу из вируса пациента с РНКазным доменом дикого типа, и 3) полноразмерную обратную транскриптазу из вируса пациента.

Mscl

EC047III

LTR-

gag

PR

pol

pel Clal

rh

IN

lue

LTR

WT

1 СП I rh I

прошздшиетерапию

наивные относительно течения

S 1 о

О 1

О

1

у у ;

» Tf Ю (О СО СП CNJ Tj 2 Г- г- г- TJ- TJ- С|4 CN < 2 2 2 2 2 2 2

|67N70R215Y219Q| СП | fh [

51 <0.1

прошздшие терапию

1

наивные относительно лечения

=100 -

Рис.11. Фенотипическое тестирование рекомбинантных вирусов на устойчивость к AZT. А. Схематическое представление ВИЧ-1 вектора, использованного для фенотипического тестирования. Указаны сайты рестрикции для клонирования полимеразного (pol), коннектора(сп) и RH(rh) доменов обратной

транскриптазы. Luc- репортер ген, кодирующий люциферазу, также обозначены длинные концевые повторы (LTR) и сегменты, кодирующие gag, протеазу (PR) и интегразу (IN). Б. Результат тестирования

рекомбинантных вирусов, содержащих С-концевой фрагмент обратной транскриптазы из вирусов от пациентов прошедших терапию (левая часть) и наивных относительно лечения (правая часть). Верхняя панель представляет рекомбинантные вирусы, в которых С-концевой фрагмент обратной транскриптазы из вирусов пациентов объединен с полимеразным доменом дикого типа, нижняя панель — с полимеразным доменом, содержащим ТАМ (мутации D67N, K70R, T215Y, K219Q). Горизонтальная линия обозначает соответствующий уровень базовой устойчивости к AZT. Ось Y-50% ингибирующей концентрации AZT, ось X - название вируса, где Т означает его происхождение от прошедшего терапию, а N-наивного пациента.

Сравнительный анализ этих конструкций показал, что лекарственная устойчивость

возрастает примерно в 10 раз, если к полимеразному домену клинического происхождения

добавляется его же коннектор, что согласуется с его ролью в лекарственной устойчивости, в

то время как добавка РНКазного домена не меняет или оказывает минимальное влияние на

усиление резистентности. С использованием группы других конструкций, состоящих из

полимеразного домена, содержащего ТАМ, и С-концевого района, происходящего от

5 1

Л

W-tfinCD СО CT) N

¿z^z zzz z

прошедшего терапию пациента, а также содержащего либо только коннектор, либо только РНКазу из вируса пациента, было подтверждено, что коннектор играет главную роль в увеличении резистентности.

Следующий этап работы был посвящен выявлению аминокислотных замен в коннекторе обратной транскригггазы, вызывающих столь значительное увеличение лекарственной устойчивости. На основе сравнения аминокислотных последовательностей обратной транскриптазы из вирусов, выделенных от пациентов прошедших лечение, и пациентов наивных относительно лечения (рис.12), мы выделили группу аминокислот-кандидатов, которые с большой долей вероятности могли бы увеличивать устойчивость к нуклеозидным аналогам.

Ее о1?ГЛ2Я1 312 326 315 3« 1 3«» 369 163 311 316 £ре!

"II.! л и г-п.: г..".:-"..*: .-.|тмкт'^-ул-^^тп'.т;' к

Т-4 -----1--К-------------И..............................................в-1----------V.........-..................г.........-......-.....-.......

Т-8 -----I-----------------Я--------------У--------------------------------------------V—'ДН--------1-й------------И----------------------------Е-

т-ю -----Г--к-----------------------------------------Г--------I---------к.у---------------т-------------Р-------------------------------------------

Рис. 12. Выравнивание последовательности коннектора обратной транскриптазы выделенных из вирусов прошедших терапию пациентов (Т-1 - Т-10) и наивных относительно лечения (N-14 - N-22). Верхняя строка представляет собой последовательность референс-формы NL4.3. Указаны сайты рестрикции Есо47Ш и Spei, использованные для клонирования коннектора в ВИЧ-1 вирус для тестирования лекарственной устойчивости. Красным цветом указаны аминокислотные замены и их координаты, которые присутствуют в коннекторе от прошедших терапию пациентов, но не наивных относительно лечения.

Чтобы выявить роль каждой индивидуальной аминокислотной замены в лекарственной устойчивости, были использованы два противоположных и взаимно дополняющих подхода. В первой группе конструкций, содержащей обратную транскриптазу с коннектором вирусного происхождения, индивидуальную аминокислоту или группу аминокислот-кандидатов заменяли на таковые дикого типа. Снижение уровня лекарственной устойчивости при фенотипическом тестировании вирусов этой группы подтверждало важность введенной аминокислотной замены. Во второй группе конструкций, содержащих обратную транскриптазу дикого типа, вводили аминокислотные замены, которые могли бы увеличивать уровень лекарственной устойчивости. Увеличение уровня лекарственной устойчивости подтверждало роль введенной аминокислотной замены в обеспечении резистентности.

Было создано и протестировано на лекарственную устойчивость около 50 мутантных вирусов. Детальный анализ результатов привел нас к выводу, что 8 мутаций обратной транскриптазы в шести различных позициях коннектора ответственны за наблюдаемое

увеличение лекарственной устойчивости. Это мутации Е312СЗ, 0335СЛЗ, N3481, А360У/Г, У3651, А3765.

Для более детального понимания механизма, обеспечивающего устойчивость описанных мутаций к нуклеозидным аналогам, мы обратились к биохимическому анализу.

Т-З Т-6 Т-8 Т-10 ТЛ

ТАМэ АВС АБС А В С А В С АБС

14/15

— !52А_Ь2_ Т-6 Т-8 Т-10 Т-4

5 ,-I |-1 | | | | |

1 RH- WT TAMs ABC ABC ABC ABC ABC

15— м * m ш <m <m Ф ■mm- ш • m -1 9 m ft Щ, * ФФ*.

% cleaved: 84 68 16 70 12 44 64 7 32 56 3! 34 83 2 78 91 5

Рис. 13. Сравнение устойчивости к АХТ с уровнем первичного гидролиза РНК. Верхняя панель: представлены ВИЧ-1 конструкции для тестирования активности РНКазы /в гНго. Три типа дополнительных векторов для каждого прошедшего терапию пациента представляют собой А-, В- и С-векгора, в которых участок серого цвета означает его происхождение из вируса пациента. А-вектора содержат последовательность коннектора из вируса пациента, В-вектора - последовательность коннектора из вируса пациента с изменением аминокислот, ответственных за увеличение устойчивости, на таковые дикого типа, С-вектора -последовательность коннектора дикого типа с мутациями устойчивости, характерными для обратной транскриптазы из вируса пациента. Средняя панель: Значение 50% ингибирующей концентрации к А2Т для векторов А, В и С каждого пациента, номер которого указан сверху над скобкой. Цифры над столбцами показывают, во сколько раз увеличена устойчивость к А2Л" относительно контроля (ТАМ). Нижняя панель: Радиограмма геля с продуктами гидролиза РНК-ДНК дуплекса, изображенного в левом верхнем углу, где звездочка означает метку радиоактивным фосфором, стрелка показывает сайт первичного гидролиза. Цифры под радиограммой показывают процент продукта шиной 14/15 нуклеотидов, являющегося результатом первичного гидролиза. I -контроль нанесения, КН - дефектный мутант РНКазы, WT - дикий тип.

Для анализа активности РНКазы, мы сконструировали и протестировали 3 группы конструкций: А-вектора, в которых обратная транскриптаза содержит ТАМ мутации и весь коннектор, В-вектора, в которых аминокислоты, ответственные за устойчивость, заменены на таковые дикого типа в контексте коннектора обратной транскриптазы из вируса пациента; С-вектора, в которых аминокислоты, увеличивающие устойчивость, помещены в контекст коннектора дикого типа (рис. 13).

Уровень лекарственной устойчивости для векторов А и С был высоким, а для вектора В - низким, как показано на рисунке 13. Для определения уровня активности РНКазы использовали РНК-ДНК субстрат размером 18 нуклеотидов. На этом субстрате в силу его размера РНКаза может осуществить только один разрез (первичный гидролиз). Мы показали ассоциацию интенсивности первичного гидролиза с уровнем лекарственной устойчивости. Низкий уровень гидролиза соответствовал высокому уровню устойчивости к AZT (вектор А, С), а высокий уровень гидролиза - низкому уровню устойчивости к AZT (вектор В) (рис. 13), что было верно для всех пяти групп конструкций Т-3, Т-6, Т-8, Т10 и Т-4.

Другой РНК-ДНК субстрат, содержащий РНК размером 41 нуклеотид, а ДНК - 77 нуклеотидов (рис. 14) был предназначен для анализа вторичного гидролиза, ассоциированного с движением фермента относительно субстрата. Аналогично полученным результатам предыдущего анализа, уровень вторичного гидролиза для векторов А, В и С согласовался с уровнем устойчивости: низкий уровень гидролиза соответствовал высокой устойчивости, а высокий уровень гидролиза - низкой устойчивости (рис. 14).

Одним из ключевых аспектов предлагаемого нами механизма является то, что мутанты, усиливающие лекарственную устойчивость должны обладать улучшенной способностью продолжать полимеризацию в присутствии ингибитора, причем это преимущество осуществляется на РНК-ДНК субстрате в силу взаимодействий между полимеризацией, РНК деградацией и фосфоролизом. Результаты биохимических экспериментов с использованием мутантных вариантов коннектора обратной транскриптазы подтверждают наше предположение. Мы продемонстрировали, что в сопряженной реакции нескольких циклов включения ингибитора, его фосфоролиза, и синтеза полноразмерного продукта мутантные ферменты превосходили контроль на РНК-ДНК субстрате как при использовании в качестве акцептора реакции фосфоролиза ATP, так и пирофосфата (рис. 15). На ДНК-ДНК субстрате не наблюдалось отличий между мутантами и контролем, за исключением одного из них Т-3.

Преимущества мутантов над контролем при использовании РНК-ДНК, но не ДНК-ДНК субстрата является показателем того, что влияние мутаций в коннекторе на устойчивость к AZT связано с влиянием этих мутаций на активность РНКазы. Нужно отметить, что хотя преимущества мутантов над контролем в сопряженной реакции не превышало двух раз, количество сайтов встраивания ингибитора равнялось 7, по сравнению с существованием около 2500 потенциальных сайтов на весь геном ВИЧ-1. Таким образом, наблюдаемое преимущество мутантов над контролем может быть более весомым при экстраполяции этого эффекта на весь геном ВИЧ-1. Поскольку количество конечного

А

f 3' RM*

WT TAMs RH- T-10A T-10B T-10C

т- н И? N O^^OQ min:

т" # # ■##* * 41 —► *m |im

18-» 15-» 8-»

10 15 20 25 30 35 time (min)

Рис. 14. А. Представительная радиограмма продуктов вторичного гидролиза РНК. Использованный в данном тесте РНК-ДНК гибрид с меченной с 5'-конца РНК-цепью (звездочка) показан схематически в верхней части. Стрелками указаны сайты гидролиза РНК, соответствующие продуктам размером 18 и 8 нуклеотидов. Радиограмма слева выполнена с использованием контрольных ферментов - дикого типа (WT), содержащего ТАМ и содержащего дефектную РНКазу - мутант D498N (RH-). Радиограмма справа - представительный анализ для трех вариантов обратной транскриптазы от пациента 10 (Т-10А, Т-10В и Т-10С). Цифры над гелем указывают время (в минутах, min), в течение которого проистекала ферментативная реакция. Графики под каждой радиограммой представляют собой количественную оценку продуктов вторичного гидролиза: количество продукта размером 8 нуклеотидов относительно общего количества субстрата. Б. Количественная оценка продуктов вторичного гидролиза для А-, В- и С- вирусов от пациентов Т-3, Т-4, Т-6 и Т-8.

продукта сопряженной реакции может зависеть не только от эффективности фосфоролиза, но и от эффективности полимеризации, мы протестировали эффективность полимеризации на том же РНК-ДНК и ДНК-ДНК субстрате в отсутствии ингибитора. Результаты кинетики синтеза полноразмерного продукта показали, что все мутанты не превосходили контрольный фермент в их полимеразной активности, исключая влияние полимеризации на преимущества

мутантов над контролем в сопряженной реакции нескольких циклов включения ингибитора, его фосфоролиза и полимеризации. Таким образом, мы подтвердили предположения нового механизма о том, что баланс между полимеразной и РНКазной активностями и фосфоролизом влияет на лекарственную устойчивость.

Мутации в коннекторе усиливают лекарственную устойчивость в присутствии ТАМ, а в отсутствии ТАМ их влияние на лекарственную устойчивость невелико (увеличение в 2-3 раза) в экспериментальных условиях, обеспечивающих один раунд репликации вируса в культуре клеток. Несмотря на это, даже относительно небольшое увеличение устойчивости может быть биологически значительным, если эти мутации возникают в начале лечения и до появления ТАМ. При анализе комбинированной группы из 920 последовательностей полноразмерной обратной транскриптазы, мы нашли, что мутации N3481 (Р=0.04б4), А360У/Т (Р=0.0219), Ы377У (Р=0.0192) и 0488Е (Р=0.0057) строго ассоциированы с лечением, и не зависят от присутствия ТАМ. Их возникновение в начале лечения может обеспечивать селективные преимущества во множественных циклах репликации вируса и способствовать последующей селекции ТАМ.

Вопрос о том, каким образом мутации в коннекторе обратной транскриптазы влияют на активность РНКазы или эффективность фосфоролиза (как в случае Т-ЗА) включенного нуклеозидного аналога, остается открытым. Для этого необходимы детальные исследования трехмерной структуры мутантных белков. Тем не менее, мы можем предположить, что аффинность обратной транскриптазы к гетеродуплексу матрица-праймер и точное положение гетеродуплекса относительно полимеразного и РНКазного каталитических сайтов может влиять на их активность. Кроме того возможно, что мутации могут также влиять и на формирование р66-р51 гетеродимера обратной транскриптазы и как следствие этого, оказывать воздействие на полимеразный и РНКазный сайты.

Важно отметить, что основная работа по дизайну лекарственных препаратов, исследованию клинических результатов и пониманию механизмов устойчивости проводится с использованием ВИЧ-1 варианта, принадлежащего к группе М, подтипу В, который распространен в США, Западной Европе и других развитых странах. Однако его глобальное представительство ограничено только десятью процентами. Для сравнения, подтип С составляет 50%, А - 12%, Р, в, Н, К - 7%, СЯР01_АЕ- 5%, СЯР02_АС- 5%, Б-3%, остальные - 8% (Неше1ааг е1 а1., 2006). Многочисленные данные указывают на то, что генетические барьеры для возникновения лекарственной устойчивости (Оитапз й а1., 2004), развитие

А RNA 3' - 19 23 2930 32 34 39 42 —AUCGAUCCCUAACAGAUGUGACUA 5'

TAMs Т-ЗА Т-4А Т-6А Т-8А Т-10А

min: ^воо«о ^ ООО ¡л о ц } ООО ю о ^ ООО IO О |

42« mm .mФШШ i - тффШ #<#«Nt Ффлт ^ é»msm

• I • ♦ * » - . Г . *** * &ÎX." #ift* г 2 t ? ' i тФ » • « -*•

19« л»

С S.70 Б |б0

РНК матрица

g 50 ^iTAMs

g 40

f 30 |20

S 10 8„, __-о WT

ДНК матрица

g 1.4

|„

m 1.0

5 0.8

é 0.6

£ 0.4

g 0.2

10 20 30 40 50 60 70 время (мин)

АТР-опосредованная реакция □ ДНК матрица * ■ РНК матрица

10 20 30 40 50 60 70 время (мин)

РР-опосредованная реакция □ ДНК матрица ■ РНК матрица

TAMs Т-ЗА Т-4А Т-6А Т-8АТ-10А

TAMs Т-ЗА Т-4А Т-6А Т-8АТ-10А

Рис. 15. Количественная оценка полноразмерного продукта синтезированного в сопряженной реакции фосфоролиза и полимеризации, проведенная с использованием АТР в качестве субстрата реакции фосфоролиза. А. Представительная радиограмма продуктов сопряженной реакции фосфоролиза и полимеризации Б. Левая часть - результат, полученный на РНК-ДНК субстрате, правая часть - на ДНК-ДНК субстрате для мутантов и контролей - дикого типа (WT) и ТАМ. В. Сравнительный анализ эффективности сопряженной реакции фосфоролиза и синтеза полноразмерного продукта, проведенной с использованием АТР (левая часть) или пирофосфата (правая часть) в качестве субстрата для фосфоролиза AZTMP-заблокированного праймера. Эффективность реакции для каждой мутантной обратной транскриптазы (Т-ЗА, Т-4А, Т-6А, Т-8А, Т-10А) и контроля (ТАМ, принята за 1) представлена белыми (ДНК-ДНК субстрат) и черными (РНК-ДНК субстрат) столбцами. Статистически достоверные различия относительно контроля (ТАМ) отмечены звездочками.

устойчивости при вертикальной трансмиссии (Eshleman et al., 2006; Eshleman et al., 2005), модуляция альтернативными мутациями, приспособленность и адаптационные свойства мутантных вирусов, а также успех лечения могут варьировать в зависимости от группы и подтипа вируса (Atlas et al., 2005; Ruelle et al., 2008). Хотя стандартные мутации устойчивости одинаковы, вклад новых мутаций, описанных для не В подтипов, нуждается в дальнейшем исследовании.

В нашей работе мы выявили, что подтип CRF01_AE менее чувствителен к AZT, чем подтип В. Кроме того, мы впервые показали, что вирус CRF01_AE, содержащий ТАМ, в 6 раз

более устойчив к AZT по сравнению с таким же вирусом подтипа В и что увеличение устойчивости главным образом происходит из-за присутствия треонина в позиции 400 коннектора подтипа CRF01_AE. Для вируса подтипа В ранее было показано, что треонин в позиции 400 более часто встречается в вирусах выделенных пациентах, прошедших NRTI терапию: он присутствует в 43% вирусов от наивных относительно лечения и в 69% от прошедших NRTI терапию пациентов (Santos et al., 2008). Селекция Т400 в подтипе В ассоциирована с приобретением NRTI-устойчнвых мутаций полимеразного домена. Мы проанализировали 140 доступных последовательностей обратной транскриптазы подтипа CRF01_AE (база данных Стэнфордского университета; Stanford University HIV Drug Resistance Database, http://hivdb.stanlord.edu). включающих коннектор, и обнаружили, что треонин 400 присутствует в 90% ферментов из вирусов выделенных от наивных относительно лечения пациентов и в 96% вирусов от прошедших терапию. Для других подтипов ВИЧ-1 представительство треонина в обратной транскриптазе в позиции 400: подтип А-78%, подтип С-63%, подтип D-65% и подтип F-81%. К сожалению, различия между вирусами от наивных относительно лечения и от прошедших терапию пациентов определить было невозможно в силу присутствия весьма ограниченного количества последовательностей вирсов выделенных от пациентов прошедших терапию, которые простирались бы до позиции 400.

Мы исследовали молекулярный механизм, с помощью которого Т400 увеличивает устойчивость к AZT и нашли, что в присутствии Т400 обратная транскриптаза обладает усиленной способностью к фосфоролизу и синтезу полноразмерного продукта в сопряженной реакции фосфоролиза-элонгации, причем как на РНК-ДНК, так и на ДНК-ДНК субстрате. Это указывает на то, что эта мутация непосредственно влияет на фосфоролиз. Однако, и снижение активности РНКазы также может способствовать устойчивости, поскольку замена треонина 400 на аланин приводила к снижению активности РНКазы. Интересно отметить, что обратная транскриптаза вируса одного из пациентов (Т-3) обнаруживала аналогичные свойства относительно фосфоролиза и активности РНКазы.

Чтобы понять, каким образом замена Т400 может непосредственно усиливать фосфоролиз, мы проанализировали ее расположение в обратной транскриптазе подтипа В. Аминокислота 400 большой субъединицы фермента довольно удалена от каталитического сайта полимеризации (50Ä), каталитического сайта РНКазы (32Ä), матрицы (20Ä) и праймера (24А). Однако та же самая аминокислота в позиции 400 малой субъединицы фермента находится на расстоянии только 5Á от К395 и 2.8Ä от Е396, которые принадлежат захватывающему праймер участку РНКазы и способствуют правильному расположению

субстрата в активном сайте РНКазы (Sarafianos et al., 2001). Основываясь на местоположении аминокислоты 400 относительно аминокислот захватывающего праймер участка РНКазы, мы полагаем, что Т400 малой субъединицы влияет на расположение Е396 и возможно К395 относительно цепи праймера, и в результате смещает расположение субстрата как в полимеразном, так и в РНКазном сайте. Мы полагаем, что изменение расположения субстрата может приводить как к более эффективному фосфоролизу, так и уменьшенной активности РНКазы, что в конечном итоге увеличивает резистентность вируса к AZT.

Коммерческие тесты на лекарственную устойчивость включают только полимеразный домен из вируса пациента, который клонирован в составе вектора, содержащего коннектор и РНКазный домен обратной транскриптазы подтипа В (Petropoulos et al., 2000; Shafer et al., 2001; Tural et al., 2002). Как следствие, потенциальный вклад в резиситентность С-концевого района РНКазы не учитывается. Наш результат показал, что смешивание в одном вирусе полимеразного домена от вируса одного подтипа с коннектором и РНКазным доменом из вируса другого подтипа может привести к недооценке уровня устойчивости к AZT. Эти наблюдения указывают на то, что для правильной оценки лекарственной устойчивости необходима разработка генотипического и фенотипического анализа специфичного для подтипа вируса.

Мы идентифицировали мутации коннектора, которые усиливают устойчивость к NRTI, мы также обнаружили, что те же самые мутации усиливают устойчивость к NNRTI (рис. 16). Модельные мутации в РНКазном каталитическом сайте и в захватывающем праймер участке РНКазы также усиливали устойчивость к NNRTI. Кроме того, группами независимых исследователей было найдено несколько дополнительных мутаций С-концевого района, имеющих перекрестную устойчивость к обоим классам ингибиторов: A360V/I, G335C, Q47SA, Y501A, D549N (Nikolenko et al., 2010), N3481 (Gupta et al., 2006; Hachiya et al., 2008; Hachiya et al., 2009; Nikolenko et al., 2010; Yap et al., 2007), A376S (Hachiya et al., 2009; Nikolenko et al., 2010), Q509L (Hachiya et al., 2009), T369I (Gupta et al., 2006), E399D (Gupta et al., 2006; Poveda et al., 2008).

Основываясь на экспериментальных данных и ранее предложенном нами механизме лекарственной устойчивости к NRTI, обусловленном мутациями коннектора, мы предложили новый универсальный механизм устойчивости к NRTI и NNRTI (рис. 17). Мы полагаем, что существуют аналогичные этапы в обратной транскрипции, на которые влияют как NRTI так и NNRTI, и оба класса ингибиторов блокируют обратную транскриптазу путем формирования некомпетентного к полимеризации комплекса обратной транскриптазы, ингибитора и

субстрата, который после деградации РНК матрицы распадается, что приводит к прерыванию процесса обратной транскрипции. Чтобы полимеризация продолжилась, включенный должен претерпеть фосфоролиз, а связанный №Л1Т1 - диссоциировать. Увеличение эффективности фосфоролиза, или снижение аффинности приводят к резистентности.

С другой стороны, снижение активности РНКазы также приводит к резистентности, поскольку субстрат остается недеградированным более длительное время и обратная транскриптаза способна реинициировать полимеризацию после высвобождения блокированного комплекса путем диссоциации или фосфоролиза ингибитора. Более существенный вклад в устойчивость вносит комбинация мутаций обратной транскриптазы, усиливающих фосфоролиз или снижающих аффинность и снижающих РНКазную активность. Таким образом, предлагаемый механизм объясняет, как одни и те же мутации С-концевого участка обратной транскриптазы, влияющие на активность РНКазы обеспечивают перекрестную устойчивость.

Анализ модельных мутаций, снижающих активность РНКазы, и их комбинации с мутациями МЫИП-связующего кармана (КМИЛ-ВР) показал, что аффинность КЫЯТ1 является важным фактором, определяющим, будет ли уменьшение активности РНКазы влиять на устойчивость. Так, мы показали, что дефектный в активности РНКазы мутант 0549Ы увеличивал устойчивость к делавирдину и невирапину (низкоаффинные соединения), но не к эфавирензу и этравирину (высокоаффинные соединения). Однако при его комбинации с мутациями полимеразного домена, снижающими аффинность к эфавирензу и этравирину, наблюдалось еще большее увеличение устойчивости к эфавирензу и этравирину (рис. 18). Таким образом, баланс между аффинностью ингибитора к обратной транскриптазе и деградацией РНК-матрицы является важным фактором лекарственной устойчивости.

Влияние снижения активности РНКазы на уровень лекарственной устойчивости к разным классам ингибиторов отличается. Например, только 2 из 10 мутаций захватывающего праймер участка РНКазы увеличивали устойчивость к №>Л1Т1 (С?475А и У501А), по сравнению с ЫЯТ1 (С359А, А360К, К390А, К395А, Е396А, Т473М, 0475А, К476А, У501А и 1505А). Мы показали, что для мутантов захватывающего праймер участка РНКазы существует корреляция увеличения уровня устойчивости с частотой смены матрицы, или снижением активности РНКазы. Мутанты 0475А и У501А, которые проявляли устойчивость к МЫЮТ, обладали самым высоким уровнем устойчивости к А2Т, указывая на то, что для усиления №Л1Т1 устойчивости необходимо существенное снижение активности РНКазы. Увеличение устойчивости к NN10"! мутациями коннектора намного ниже влияния

Т-4

1

1 1____LL

L. 1111 X360I

Т-8

1 1 1

II 1 1 1

1 III X376S

1 TAMs| |

III 1 taius и I +3481

1 TAMs IIU +348I.+335C

т-з

1TAMs | |

IV 1 TAMs III 1 X348I

1 TAMs llllll X348I, X335C

Т-10

1TAMs 1 1

V 1 TAMs III | X348I

1 TAMs llllll X348I, X360V

ЗН 1.4x1

100 1000 Nevirapine IC50, nM

1 10 Efavirenz IC„. nM

Рис. 16. Влияние отдельных мутаций коннектора обратной транскриптазы из вирусов прошедших терапию пациентов на устойчивость к невирапину и эфавирензу. Схематическое изображение структуры обратной транскриптазы тестируемых вирусов показано слева. Белая полоса внутри прямоугольника и знак х перед номером аминокислотной позиции означает присутствие аминокислоты дикого типа, а серая полоса внутри прямоугольника и знак + перед номером аминокислотной позиции означает присутствие мутантной аминокислоты. Стрелка рядом с цифрой напротив столбцов означает увеличение или уменьшение резистентности относительно соответствующего контроля (столбец черного цвета).

на устойчивость мутаций NNRTI-BP, как например K103N. Поэтому пока неизвестно, имеют ли эти мутации клиническое значение. Однако надо признать, что даже небольшое увеличение в устойчивости может обеспечивать вирусам селективное преимущество в присутствии ингибитора и способствовать селекции высокоустойчивых мутаций.

В нашей работе, а также в других исследованиях было показано, что стандартные мутации лекарственной устойчивости к NNRTI, расположенные в NNRTI-BP обладают сниженной активностью РНКазы (Archer et al., 2000; Archer et al., 2001; Fan et al., 1996; Gerondelis et al., 1999; Wang et al., 2006). Ранее предполагали, что снижение РНКазной активности этими мутантами снижает приспособленность вируса и супрессирует селекцию этих мутаций во время NNRT1 терапии. Мы полагаем, что наоборот, эти мутации селектируются также и по причине снижения ими активности РНКазы, что усиливает устойчивость к NNRTI. Мутации NNRTI-BP могут снижать активность РНКазы как через изменение связывания с субстратом, так и через влияние на расположение субстрата в каталитическом сайте РНКазы. Возможно также, что это влияние осуществляется мутациями NNRTI-BP, расположенными в малой субъединице фермента. Мы предполагаем, что

дикий тип

сниженная активность РНКазы

ба'ювпя РНКаза . базовая РНКаза . сниженная

I ЫЯТ1 фосфора л из / I активность РНКазы

полимеризации

Чувствительный фенотип Устойчивый фенотип Устойчивый фенотип

Рис. 17. Механизм ингибирования репликации ВИЧ-1, обусловленный действием нуклеозидных и ненуклеозидных ингибиторов. Для простоты последовательные этапы обратной транскрипции в присутствии ЫЯТ1 и NN11X1 показаны на одной схеме. ДНК-праймер и РНК-матрица (черные и белые цепочки, соответственно), обратная транскриптаза, ОТ (большой серый овал), ЫЯТ1 и NN1^1 (серый квадрат и цилиндр, соответственно) показаны схематически. Толстая стрелка означает последовательные события во время ВИЧ-1 репликации в присутствии ингибитора. Однажды начавшись, полимеризация продолжается до тех пор, пока Ы11Т1Л^11Т1 не свяжется с комплексом обратная транскриптаза-субстрат, формируя блокированный полимеризационный комплекс (БПК). Левая панель представляет события, соответствующие дикому типу обратной транскриптазы, приводящие к лекарственно-чувствительному фенотипу. Средняя и правая панели представляют события, соответствующие обратной транскриптазе с усиленной способностью к фосфоролизу/сниженной афинностью к ЫЫЯТ1 и сниженной активностью РНКазы, соответственно, приводящие к лекарственно-устойчивому фенотипу. Последовательные этапы обратной транскрипции в присутствии ингибитора включают в себя формирование БПК, остановку полимеризации, РНК деградацию, и последовательную диссоциацию комплекса в случае лекарственно-чувствительного фенотипа или фосфоролиз/диссоциацию ингибитора и продолжение полимеризации в случае лекарственно-устойчивого фенотипа.

возникает большее количество мутаций, снижающих аффинность и увеличивающих резистентность, но предпочтительно селектируются те мутации, которые дополнительно снижают активность РНКазы, поскольку и снижение аффинности к ферменту, и снижение активности РНКазы увеличивает резистентность. Результаты нашей работы по исследованию лекарственной устойчивости мутаций С-концевого района обратной транскриптазы, анализа активности РНКазы и литературные данные по аффинности мутантных ферментов к ЬПМ1Ш подтверждают предлагаемый нами механизм устойчивости к NN11X1.

кгсзк, пыс

У181С

Рис. 18. Влияние снижения активности РНКазы на изменение М\;Г<Т1 резистентности. Столбцы представляют собой значение 50% ингибирующей концентрации. Цифры над ними показывают изменение резистентности относительно таковой дикого типа. Серые столбцы показывают значение резистентности в отсутствии D549N мутации, черные - в присутствии 0549Ы для каждой пары конструкций.

Таким образом, в нашей работе мы впервые целенаправленно обратились к поиску мутаций С-концевого участка обратной транскриптазы, ассоциированных с лечением и обладающих резистентностью к ингибиторам обратной транскриптазы. Мы впервые показали, что мутации коннектора селектируются в ответ на антиретровирусное лечение и это приводит к усилению лекарственной устойчивости. Следует отметить, что выбор группы пациентов, прошедших лечение и наивных относительно терапии, был случайным, тем более интересно то, что в пяти случаев из семи, нами было обнаружено увеличение лекарственной устойчивости, обусловленное мутациями С-концевого района обратной транскриптазы. Присутствие этих мутаций в коннекторе, а не в РНКазном домене, может объясняться, во-первых, небольшой выборкой пациентов, а во-вторых тем, что этот район, по-видимому, менее критичен для потери вирусом жизнеспособности, что благоприятствует селекции мутаций. С другой стороны, селекция мутаций в этом районе не противоречит предложенному механизму. В коннекторе расположены аминокислоты захватывающего праймер участка РНКазы, важные для правильного расположения субстрата в сайте РНК-гидролиза. Одна из привлекательных гипотез, каким образом эти мутации влияют на активность РНКазы - это изменение ими прямо или опосредованно захватывающего праймер участка РНКазы, который корректно устанавливает субстрат в активном сайте РНКазы. Так, исследование аланиновых замен 11 аминокислот захватывающего праймер участка РНКазы

показало, что 10 из них усиливают устойчивость к AZT в контексте полимеразного домена, содержащего ТАМ, достигая превышения в устойчивости до 243 раз по сравнению с ТАМ контролем, который был лишь в 9 раз более резистентным, чем вирус дикого типа.

Предлагаемый нами механизм перекрестной устойчивости к NRTI и NNRTI объясняет, каким образом те же самые мутации С-концевого района обратной транскриптазы увеличивают устойчивость к структурно и функционально различным ингибиторам обратной транскриптазы. Новый механизм лекарственной устойчивости отражает важную роль в обеспечении лекарственной устойчивости баланса между деградацией РНК-матрицы и NRTI-фосфоролизом/№ЖТ1-диссоциацией. Это подчеркивает важность взаимодействий между разными функциональными доменами обратной транскриптазы, которые играют значительную роль в эволюции лекарственной устойчивости.

ВЫВОДЫ

1. Разработан новый ЦС-ПЦР анализ для определения количества копий специфической цепи ДНК ВИЧ-1, который позволяет установить ранее недоступные для анализа параметры обратной транскрипции ВИЧ-1 на культуре клеток, с использованием которого впервые показано, что:

- скорость синтеза «минус»-цепи ДНК для ВИЧ-1 в культуре клеток 293Т и первичных С04+Т-лимфоцитах составляет 68-70 нуклеотидов в минуту;

- перенос «минус»-цепи ДНК составляет 4 минуты, а перенос «плюс»-цепи ДНК - 26 минут;

- инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК с главного сайта инициации РРТ составляет 9 минут; а с альтернативного сРРТ- 28 минут;

- инициация синтеза «плюс»-цепи ДНК осуществляется на множественных сайтах;

- ингибиторы обратной транскриптазы AZT и d4T замедляют главным образом кинетику синтеза «минус»-цепи ДНК.

2. Разработан новый тест на культуре клеток для определения частоты смены матрицы обратной транскриптазой ВИЧ-1, с использованием которого впервые показано, что смена матрицы ВИЧ-1 происходит по механизму динамического выбора, согласно которому снижение полимеразной активности приводит к увеличению частоты смены матрицы, а снижение РНКазной активности приводит к уменьшению частоты смены матрицы.

3. Впервые показано, что лекарственно-устойчивые мутации обратной транскриптазы ВИЧ-1 увеличивают частоту смены матрицы, что может способствовать приобретению множественных лекарственно-устойчивых мутаций.

4. Впервые показана высокая корреляция до 89% между частотой смены матрицы и точностью копирования in vivo и in vitro для мутаций каталитического сайта полимеразы ВИЧ-1.

5. Предложен и обоснован новый механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным аналогам, обусловленный мутациями С-концевого района обратной транскриптазы, который отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и К1Ш-фосфоролизом/№4ЯТ1-диссоциацией:

- присоединение NRTI к праймеру/связывание обратной транскриптазы с NNRTI приводит к остановке полимеризации и формированию некомпетентного к полимеризации комплекса;

- снижение активности РНКазы обеспечивает продление времени для осуществления ЖТ1-фосфоролиза/№даП-диссоциации и дальнейшей реинициации полимеризации;

- аффинность обратной транскриптазы к NNRTI является критическим фактором, определяющим, в какой степени снижение активности РНКазы за счет мутации может усиливать лекарственную устойчивость.

6. Впервые показано, что мутации С-концевого домена обратной транскриптазы, увеличивающие устойчивость к NRTI и NNRTI, селектируются в вирусах пациентов, проходящих антивирусную терапию; идентифицированы новые мутации в коннекгорном участке обратной транскриптазы от вирусов пациентов, способствующие лекарственной устойчивости к NRTI: E312Q, G335C/D, N3481, A360V/I, V365I, A376S, а также и к NNRTI: G335C, N3481, A360V/I и A376S.

7. Впервые показано, что новые мутации в коннекторном участке обратной транскриптазы обладают сниженной активностью РНКазы in vivo и in vitro и усиленной способностью к фосфоролизу на РНК матрице в соответствии с предложенным механизмом лекарственной устойчивости.

8. Впервые показано, что в контексте ТАМ лекарственная устойчивость к AZT референс-штамма вируса подтипа CRF01_AE в 6 раз выше чем референс-штамма вируса подтипа В ВИЧ-1, что обусловлено присутствием мутации коннектора А400Т.

9. Впервые показано, что мутации N3481, A360V/T, N377V и D488E ассоциированы с

лечением, а мутации N3481, R358K, G359S, A360V, V3651, A371V, K451R и K512R - с

присутствием ТАМ в группе прошедших терапию пациентов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Г.Н. Николенко, А.Т. Котелкин, С.Ф. Орешкова, А.А. Ильичев. Механизмы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.// Мол. Биология. 2011; 45(1): 108-26.

2. R. В. Lengruber, K.A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, J. Baumann, A. F. Santos, V. K. Pathak, and M. A. Soares. Phenotypic characterization of drug resistance-associated mutations in HIV-1 RT connection and RNase H domains and their correlation with thymidine analogue mutations. // J. Antimicrob. Chemotherapy. 2011. 66(4): 702-8.

3. G.N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, and V.K. Pathak. A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to Nucleoside and Nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors. // J.Virol. 2010. 84(10), p. 5238-49.

4. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak. The "Connection" Between HIV Drug Resistance and RNase H.// Viruses. 2010. 2(7). p. 1476-1503.

5. K.A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V. K. Pathak. Subtype-specific differences in the HIV-1 reverse transcriptase connection subdomain of CRF01_AE are associated with higher AZT resistance.// J.Virol. 2009. 83(17). p. 8502-13.

6. G.N. Nikolenko, K.A. Delviks-Frankenbercy, and V.K. Pathak. A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to Nucleoside and Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors.// Antiviral Therapy 2009;14: S123.

7. K.A. Delviks-Frankenberry, G.N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V.K. Pathak. Subtype-Specific Amino Acid Polymorphisms in the HIV-1 Reverse Transcriptase Connection Subdomain of CRF01_AE are Associated with Higher 3'-Azido-3'-Deoxythymidine Resistance.//Antiviral Therapy 2009; 14: S124.

8. K. A. Delviks-Frankenberry*, G. N. Nikolenko*, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105(31), p. 10943-8 * K.A.D-F. and G.N.N, share co-authorship of this paper.

9. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry , A.Jere, and V. K. Pathak. Mutations in the reverse transcriptase connection and RNAse H domains exhibit dual resistance to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. // Antiviral Therapy 2008;13: A55.

10. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision. // Antiviral Therapy 2008;13: A60.

11. G. N. Nikolenko*, K.A. Delviks-Frankenberry*, S. Palmer, F. Maldarelli, M. J. Fivash Jr., J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in the connection domain of HIV-1 reverse transcriptase increase 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007. 104(1). P. 317-322. *G.N.N. and K.A.D-F. share co-authorship of this paper.

12. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Probing the Mechanism by Which Connection Domain Mutations Enhance AZT Resistance: Mutational Analysis of the RNase H Primer Grip. // Antiviral Therapy 2007;12: S125.

13. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Mutations in human immunodeficiency virus type-1 RNase H primer grip enhance 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance.// J. Virol. 2007. v.81 (13). P.6837-45.

14. D.C. Thomas, Y.A.Voronin, G. N. Nikolenko, J. Chen, W. S. Hu, and V. K. Pathak. Determination of the ex vivo rates of HIV-1 reverse transcription using novel strand-specific amplification (SSA) analysis.// J. Virol. 2007. v.81 (9). P.4798-807.

15. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. The HIV-1 reverse transcriptase connection domain from treatment-experienced patients contributes to AZT resistance.// Antiviral Therapy 2006; 11 :S 142.

16. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mechanism for nucleoside analog-mediated abrogation of HIV-1 replication: balance between RNase H activity and nucleotide excision. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA 2005. V. 102 (6). P. 2093-2098.

17. J.L. Mbisa, G.N. Nikolenko, and V.K. Pathak. Mutations in the RNase H primer grip domain of murine leukemia virus reverse transcriptase decrease efficiency and accuracy of plus-strand DNA transfer.// J Virol. 2005. V. 79 (1). P. 419-427.

18. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. RNase H domains obtained from treatment-experienced patients increase resistance to AZT. //Antiviral Therapy 2005; 10:S89.

19. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in HIV-1 RNase H domain confer high-level resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors and provide novel insights into the mechanism of nucleotide excision-mediated drug resistance. // Antiviral Therapy 2004; 9:S26.

20. G N. Nikolenko, E.S. Svarovskaia, K. A. Delviks, and V. K. Pathak. Antiretroviral drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase increase template-switching frequency.// J. Virol. 2004. V. 78 (16) p. 8761-8770.

Подписано к печати 11 марта 2012г. Тираж 100 экз. Заказ № 020. Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Николенко, Галина Николаевна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1. Актуальность темы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3. Научная новизна и практическая значимость работы.

1.4. Положения, выносимые на защиту.

1.5. Апробация работы.

1.6. Структура и объем диссертации.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Обшая характеристика вируса иммунодефицита человека типа 1.

2.2. Структура и функции обратной транскриптазы ВИЧ-1.

2.3. Нуклеозидные и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы.

2.4. Механизмы лекарственной устойчивости к >П1Т1.

2.4.1. Механизм дискриминации и характерные лекарственно-устойчивые мутации.

2.4.1.1. М1841/У и ее роль в лекарственной устойчивости.

2.4.1.2. Ь74У и устойчивость к дидеоксинуклеотидным аналогам.

2.4.1.3. К6511 и устойчивость к тенофовиру.

2.4.1.4. Комплекс С? 151М и множественная лекарственная устойчивость.

2.4.2. Механизм фосфоролиза и характерные лекарственно-устойчивые мутации.

2.4.2.1. Молекулярные аспекты реакции фосфоролиза.

2.4.2.2. Мутации, специализирующиеся в реакции фосфоролиза.

2.4.3. Антагонизм мутаций, способствующих дискриминации нуклеозидного аналога, и мутаций с усиленной способностью к фосфоролизу.

2.5. Механизмы приобретения устойчивости к КЫЮТ и характерные лекарственно-устойчивые мутации.

2.6. Взаимодействие мутаций, селектированных к разным классам ингибиторов (ИИЛ и №ЛШ).

2.7. Роль вирусной РНКазы в лекарственной устойчивости к N1111 и

2.7.1. Функции вирусной РНКазы в процессе обратной транскрипции.

2.7.2. Новый механизм лекарственной устойчивости к ИЮТ, обусловленный мутациями в С-концевом районе обратной транскриптазы.

2.7.3. Механизм перекрестной лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидым аналогам, обеспечиваемый мутациями С-концевого района обратной транскриптазы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к ингибиторам обратной транскриптазы"

Вирус иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) - инфекционный агент, вызывающий Синдром Приобретенного Иммунодефицита человека (СПИД). Глобальная эпидемия' СПИДа, которая распространяется вот уже более 30 лет, вовлекая в ряды инфицированных ежегодно более 2 миллионов человек, является серьезной проблемой мирового здравоохранения. По последним данным Всемирной Организации Здравоохранения, в мире число ВИЧ-инфицированных составляет около 34 млн. человек, причем количество вновь инфицированных продолжает расти и в 2010 году составило 2.7 млн., а число умерших - 1.8 млн. человек (www.unaids.org).

В последние годы достигнуты значительные успехи в разработке новых терапевтических агентов и стратегии лечения ВИЧ-инфекции. Основными1 мишенями разрабатываемых лекарственных препаратов против ВИЧ-1 служат жизненно-важные ферменты вируса: обратная транскриптаза, протеаза и интеграза, - а также белки оболочки и рецепторы на поверхности Т-лимфоцитов. В период с 1987 г. по 2008 г. разрешено применение 18 'лекарственных препаратов, ингибирующих обратную транскриптазу ВИЧ-1 - это нуклеозидные и ненуклеозидые ингибиторы, с 1995 по 2006 г.г. - 11 препаратов, ингибирующих протеазу, с 2003 по 2007 г.г. - 2-х препаратов, препятствующих проникновению вируса в клетку; в 2007 г. - ингибитор интегразы. В настоящее время в США официально используется около 30 различных терапевтических препаратов (http://www.fda.gov/oashi/aids). На начальной стадии лечения рекомендуется использовать комбинации одного или двух нуклеозидных аналогов, одного ненуклеозидого и/или одного ингибитора протеазы (http://aidsinfo.nih. govt. Лекарственные препараты против ВИЧ-1 инфекции не могут излечить заболевание, однако существенно замедляют патологические • процессы, улучшают качество жизни больных и снижают уровень смертности (Palella et al., 1998). В глобальном масштабе, постоянное расширение спектра анти-ВИЧ-1 препаратов, позволило достигнуть значительных успехов. Так, обеспечение лечением нуждающихся увеличилось с 7% в 2003 г. до 42% в 2008 г., передача вируса от матери ребенку была снижена за эти же годы с 90% до 55% (www.unaids.orgV

Несмотря на существенный прогресс в разработке и использовании лекарственных препаратов против ВИЧ-1, вызываемые ими побочные эффекты, а именно: непереносимость и токсичность при длительном применении, а также несоблюдение режима приема препаратов — сильно снижают эффективность их действия. Другая проблема связана с особенностями жизненного цикла вируса, обусловливающими высокую скорость его адаптации. Вирус размножается в организме взрослого человека с высокой скоростью — до ю

10 вирусных частиц в день (Perelson et al., 1996). При этом уровень ошибок при обратной

-5 транскрипции достигает 5x10 , — что приводит примерно к одной мутации на каждый цикл репликации (Mansky, 1996; Svarovskaia et al., 2003). Не стоит забывать, что ВИЧ-1 обладает весьма высокой частотой рекомбинации (Hu et al., 2003). Учитывая размер генома вируса (около 10000 нуклеотидов) при выполнении простых вычислений, можно предположить, что каждый день в организме взрослого пациента могут генерироваться все возможные точечные мутации, и в присутствии противовирусного препарата неизбежно произойдет отбор лекарственно-устойчивых вариантов вируса (Coffin, 1995). Дополнительные трудности в борьбе с инфекцией возникают из-за трансмиссии лекарственно-устойчивых штаммов ВИЧ, причем в отдельных регионах 10-20% вновь инфицированного контингента заражено именно такими штаммами (SPREAD Programme, (2008).

Около половины всех лекарственных препаратов против ВИЧ-1 ингибируют полимеразную активность обратной транскриптазы. Разработка лекарственных препаратов,, направленных на специфическое блокирование активности вирусной РНКазы, продолжается не один год, но до сих пор не увенчалась успехом из-за их высокой токсичности (Schultz and Champoux, 2008). Используемые для лечения ингибиторы обратной транскриптазы подразделяют на две группы: нуклеозидные аналоги (NRTI), и ненуклеозидые аналоги (NNRTI).

Интенсивные исследования механизмов лекарственной устойчивости к ингибиторам с обратной транскриптазы начались в 1987 году вскоре после внедрения первых антиретровирусных препаратов в клиническую практику. К началу данной работы было описано два основных механизма лекарственной устойчивости к нуклеозидным аналогам -дискриминация (Gao et al., 2000; Sarafianos et al., 1999) и фосфоролиз (Arion et al., 1998; Meyer et al., 1998). В соответствии с механизмом дискриминации лекарственно-устойчивые мутации образуют пространственные препятствия для включения трифосфорилированной формы ингибитора, NRTI-TP, в растущую ДНК-цепь. В соответствии с механизмом фосфоролиза лекарственно-устойчивые мутации обратной транскриптазы способствуют удалению 3'-терминирующего NRTI в присутствии физиологических концентрациий пирофосфата или АТР, который служит акцепторным субстратом реакции.

Несмотря на то, что описанные механизмы лекарственной устойчивости представляли обоснованную теоретическую и практическую базу, все предыдущие исследования ограничивались только N-концевым участком фермента, содержащим его полимеразный домен. С-концевой район фермента при этом оставался мало изученным с этой точки зрения. Отчасти это было обусловлено ограничениями коммерческих генотипических и фенотипических тест-систем, не включающих этот район в стандартные тесты (Рейх>рои1оз е1 а1., 2000; БИаГег е! а1., 2001; Тига1 е1 а!., 2002), вследствие чего исследователям была доступна весьма ограниченная информация о последовательности этого района обратной транскриптазы. Таким образом, для прогнозирования результатов лечения и развития антивирусных препаратов нового поколения, которые позволят значительно усовершенствовать стратегии лечения ВИЧ-инфицированных, необходимо понимание функционирования обратной транскриптазы как единого целого, поэтому более углубленное исследование свойств обратной транскриптазы и механизмов, лежащих в основе лекарственной устойчивости является актуальной задачей.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Николенко, Галина Николаевна

6. ВЫВОДЫ

1. Разработан новый ЦС-ПЦР анализ для определения количества копий специфической цепи ДНК ВИЧ-1, который позволяет установить ранее недоступные для анализа параметры обратной транскрипции ВИЧ-1 на культуре клеток, с использованием которого впервые показано, что:

- скорость синтеза «минус»-цепи ДНК для ВИЧ-1 в культуре клеток 293Т и первичных СБ4+Т-лимфоцитах составляет 68-70 нуклеотидов в минуту;

- перенос «минус»-цепи ДНК составляет 4 минуты, а перенос «плюс»-цепи ДНК — 26 минут;

- инициации синтеза «плюс»-цепи ДНК с главного сайта инициации РРТ составляет 9 минут; а с альтернативного сРРТ- 28 минут;

- инициация синтеза «плюс»-цепи ДНК осуществляется на множественных сайтах;

- ингибиторы обратной транскриптазы AZT и d4T замедляют главным образом кинетику синтеза «минус»-цепи ДНК.

2. Разработан новый тест на культуре клеток для определения частоты смены матрицы обратной транскриптазой ВИЧ-1, с использованием которого впервые показано, что смена матрицы ВИЧ-1 происходит по механизму динамического выбора, согласно которому снижение полимеразной активности приводит к увеличению частоты смены матрицы, а снижение РНКазной активности приводит к уменьшению частоты смены матрицы.

3. Впервые показано, что лекарственно-устойчивые мутации обратной транскриптазы ВИЧ-1 увеличивают частоту смены матрицы, что может способствовать приобретению множественных лекарственно-устойчивых мутаций.

4. Впервые показана высокая корреляция до 89% между частотой смены матрицы и точностью копирования in vivo и in vitro для мутаций каталитического сайта полимеразы ВИЧ-1.

5. Предложен и обоснован новый механизм лекарственной устойчивости к нуклеозидным и ненуклеозидным аналогам, обусловленный мутациями С-концевого района обратной транскриптазы, который отражает важную роль в лекарственной устойчивости ВИЧ-1 баланса между деградацией РНК-матрицы и NRTI-фосфоролизом/NNRTI-диссоциацией:

- присоединение NRTI к праймеру/связывание обратной транскриптазы с NNRTI приводит к остановке полимеризации и формированию некомпетентного к полимеризации комплекса; снижение активности РНКазы обеспечивает продление времени для осуществления МЯТЬфосфоролизаММЯТЬдиссоциации и дальнейшей реинициации полимеризации; аффинность обратной транскриптазы к NNRTI является критическим фактором, определяющим, в какой степени снижение активности РНКазы за счет мутаций может усиливать лекарственную устойчивость.

6. Впервые показано, что мутации С-концевого домена обратной транскриптазы, увеличивающие устойчивость к NRTI и NNRTI, селектируются в вирусах пациентов, проходящих антивирусную терапию; идентифицированы новые мутации в коннекторном участке обратной транскриптазы от вирусов пациентов, способствующие лекарственной устойчивости к NRTI: E312Q, G335C/D, N3481, A360V/I, V365I, A376S, а также и к NNRTI: G335C, N3481, A360V/I и A376S.

7. Впервые показано, что новые мутации в коннекторном участке обратной транскриптазы обладают сниженной активностью РНКазы in vivo и in vitro и усиленной способностью к фосфоролизу на РНК матрице в соответствии с предложенным механизмом лекарственной устойчивости.

8. Впервые показано, что в контексте ТАМ лекарственная устойчивость к AZT референс-штамма вируса подтипа CRF01AE в 6 раз выше чем референс-штамма вируса подтипа В ВИЧ-1, что обусловлено присутствием мутации коннектора А400Т.

9. Впервые показано, что мутации N3481, A360V/T, N377V и D488E ассоциированы с лечением, а мутации N3481, R358K, G359S, A360V, V365I, A371V, K451R и K512R - с присутствием ТАМ в группе прошедших терапию пациентов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации Публикации в научных журналах

1. Г.Н. Николенко, А.Т. Котелкин, С.Ф. Орешкова, А.А. Ильичев. Механизмы лекарственной устойчивости ВИЧ-1 к нуклеозидным и ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы.// Мол. Биология. 2011; 45(1):108-26.

2. R. В. Lengruber, К.А. Delvkis-Frankenberry, G. N. Nikolenko, J. Baumann, A. F. Santos, V. K. Pathak, and M. A. Soares. Phenotypic characterization of drug resistance-associated mutations in HIV-1 RT connection and RNase H domains and their correlation with thymidine analogue mutations.// J. Antimicrob. Chemotherapy. 2011. 66(4): 702-8.

3. G.N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, and V.K. Pathak. A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to Nucleoside and Nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors.//J.Virol. 2010. 84(10), p. 5238-49.

4. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak. The "Connection" Between HIV Drug Resistance and RNase H.// Viruses. 2010.2(7). p. 1476-1503.

5. K.A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V. K. Pathak. Subtype-specific differences in the HIV-1 reverse transcriptase connection subdomain of CRF01AE are associated with higher AZT resistance.// J.Virol. 2009. 83(17). p. 8502-13.

6. G.N. Nikolenko, K.A. Delviks-Frankenberry, and V.K. Pathak. A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to Nucleoside and Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors.// Antiviral Therapy 2009;14: S123.

7. K.A. Delviks-Frankenberry, G.N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V.K. Pathak. Subtype-Specific Amino Acid Polymorphisms in the HIV-1 Reverse Transcriptase Connection Subdomain of CRF01AE are Associated with Higher 3'-Azido-3'-Deoxythymidine Resistance.// Antiviral Therapy 2009; 14: S124.

8. K. A. Delviks-Frankenberry*, G. N. Nikolenko*, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2008, 105(31), p. 10943-8 * K.A.D-F. and G.N.N, share co-authorship of this paper.

9. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, A.Jere, and V. K. Pathak. Mutations in the reverse transcriptase connection and RNAse H domains exhibit dual resistance to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. // Antiviral Therapy 2008;13: A55.

10. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision.// Antiviral Therapy 2008; 13: A60.

11. G. N. Nikolenko*, K.A. Delviks-Frankenberry*, S. Palmer, F. Maldarelli, M. J. Fivash Jr., J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in the connection domain of HIV-1 reverse transcriptase increase 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007.104(1). P. 317-322. *G.N.N. and K.A.D-F. share co-authorship of this paper.

12. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Probing the Mechanism by Which Connection Domain Mutations Enhance AZT Resistance: Mutational Analysis of the RNase H Primer Grip.// Antiviral Therapy 2007;12: S125. A

13. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Mutations in human immunodeficiency virus type-1 RNase H primer grip enhance 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance.// J. Virol. 2007. v.81 (13). P.6837-45.

14. D.C. Thomas, Y.A.Voronin, G. N. Nikolenko, J. Chen, W. S. Hu, and V. K. Pathak. Determination of the ex vivo rates of HIV-1 reverse transcription using novel strand-specific amplification (SSA) analysis.// J. Virol. 2007. v.81 (9). P.4798-807.

15. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. The HIV-1 reverse transcriptase connection domain from treatment-experienced patients contributes to AZT resistance.// Antiviral Therapy 2006; 11:S142.

16. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mechanism for nucleoside analog-mediated abrogation of HIV-1 replication: balance between RNase H activity and nucleotide excision. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2005. V. 102 (6). P. 2093-2098. v

17. J.L. Mbisa, G.N. Nikolenko, and V.K. Pathak. Mutations in the RNase H primer grip domain of murine leukemia virus reverse transcriptase decrease efficiency and accuracy of plus-strand DNA transfer.// J Virol. 2005. V. 79 (1). P. 419-427.

18. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. RNase H domains obtained from treatment-experienced patients increase resistance to AZT.// Antiviral Therapy 2005; 10:S89.

19. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in HIV-1 RNase H domain confer high-level resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors and provide novel insights into the mechanism of nucleotide excision-mediated drug resistance.// Antiviral Therapy 2004; 9:S26.

20. G N. Nikolenko, E.S. Svarovskaia, K. A. Delviks, and V. K. Pathak. Antiretroviral drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase increase template-switching frequency.// J. Virol. 2004. V. 78 (16) p. 8761-8770.

Презентации Доклады

1. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision. // Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 19-24,2008. New York, USA.

2. G. N. Nikolenko and V.K.Pathak. Novel Mechanism of HIV-1 Resistance to Reverse Transcriptase Inhibitors.// SABiosciences. November 16, 2009. Frederick, MD, USA.

3. G. N. Nikolenko and V.K.Pathak. Novel Mechanism of HIV-1 Resistance to Reverse Transcriptase Inhibitors.// Meso Scale Diagnostics. November 10, 2009. Gaithersburg, MD, USA.

4. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak. HIV RT connection mutations decrease RNaseH cleavage and increase AZT resistance. //The Anual Think Tank Meeting of HIV Drug Resistance Program, 2008. NCI-Frederick, MD, USA.

5. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry and V. K. Pathak. Novel Mechanism of HIV-1 Drug Resistance: Mutations in the Reverse Transcriptase Connection Domain Exhibit Dual Resistance to NRTIs and NNRTIs.// 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. September 17-20,2007. Chicago, IL, USA.

6. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Probing the Mechanism by Which Connection Domain Mutations Enhance AZT Resistance: Mutational Analysis of the RNase H Primer Grip.// XVI International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 12-19,2007. Barbados.

7. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J. W. Mellors, J. M. Coffin and V. K. Pathak. C-Terminal HIV-1 Reverse Transcriptase Domains Obtained from Treatment-Experienced Patients Contribute to AZT Resistance. // Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 24-29.2006. New York.

8. Nikolenko, G.N. , K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J. W. Mellors, J. M. Coffin and V. K. Pathak. The HIV-1 Reverse Transcriptase Connection Domain From Treatment-Experienced Patients Contributes To AZT Resistance.// XV International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles and Clinical Implications, 2006. Spain.

9. G. N. Nikolenko and V.K.Pathak. Novel mechanism of HIV-1 resistance to nucleoside analogs: Balance between RNase H activity and nucleotide excision.// Center for Sickle Cell Disease, Howard University. February 9,2006. Washington, DC.

10. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry and V. K. Pathak. RNase H domains obtained from treatment-experienced patients increase resistance to AZT.// Sixth HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. November 13-16,2005. Chantilly, VA, USA.

11. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin," and V. K. Pathak. RNase H domains obtained from treatment-experienced patients increase resistance to AZT.// XIV International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 7-11,2005. Quebec City, Canada.

12. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mechanism for nucleoside analog-mediated abrogation of HIV-1 replication: Balance between RNase H activity and nucleotide excision.// Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 23-28,2005. CSH, USA.

13. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry and V. K. Pathak. A novel mechanism for nucleoside reverse transcriptase inhibitor-mediated abrogation of HIV-1 replication: interplay between RNase H activity and nucleotide excision.// Fifth HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. November 14-17,2004. Chantilly, VA, USA.

14. G. N. Nikolenko and V. K. Pathak.The role of HIV-1 RNase H in NRTI resistance.// NCI-Frederick Scientific Interdisciplinary Retreat. October 26,2004. Rocky Gap, WA.

15. D.C. Thomas, Y.A.Voronin, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak. Development of strand-specific amplification (SSA) for analysis of HIV-1 reverse transcription.// Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 25-30,2004. New York, USA.

16. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. A novel mechanism for nucleoside reverse transcriptase inhibitor-mediated abrogation of HIV-1 replication: interplay between RNase H activity and nucleotide excision.// The Eleventh East Coast Retrovirus Meeting. October 7-9,2004. Palm Spring, CA, USA.

17. G. N. Nikolenko and V. K. Pathak. The role of RNase H in NRTI-mediated abrogation of viral replication and NRTI resistance.// HIV Drug Resistance Program -Tufts University Join Meeting. August 25,2004.Frederick, MD.

18. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in HIV-1 RNase H domain confer high-level resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors and provide novel insights into the mechanism of nicleotide excision-mediated drug resistance.// Х1П International HIV Drug Resistance workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 8-12,2004. Tenerife, Canary Islands, Spain.

19. G. N. Nikolenko, E. S. Svarovskaia, K. A. Delviks and V. K. Pathak. HIV-1 and MLV reverse transcriptase exhibit differences in dynamic steady state between polymerase and RNase H activities and template switching.// Third HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. December 8-11,2002. Chantilly, VA, USA.

Постерные презентации

1. G.N. Nikolenko, К.A. Delviks-Frankenberry, and V.K. Pathak. A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to Nucleoside and Nonnucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors.// XVIII International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 9-13 2009. Fort Myers, Florida, USA Abstract S123.

2. K.A. Delviks-Frankenberry, G.N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V.K. Pathak. Subtype-Specific Amino Acid Polymorphisms in the HIV-1 Reverse Transcriptase-Connection Subdomain of CRF01AE are Associated with Higher 3'-Azido-3'-Deoxythymidine Resistance.// XVIII International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 9-13 2009. Fort Myers, Florida, USA. Abstract S124.

3. Bohrer Lengruber R, Delviks-Frankenberry K, Nikolenko G, et al. Phenotypic role of HIV-1 reverse transcriptase C-terminal mutations and their relation with classical thymidine analogue mutations. 5th IAS Conference on HIV Pathogenesis, Treatment and Prevention. July 19-22,2009. Cape Town, South Africa. Abstract WEPEA079.

4. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, and V. K. Pathak. Molecular mechanism of dual resistance to NRTIs and NNRTIs by connection and RNase H domain mutations of HIV-1 reverse transcriptase.// Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 18-23, 2009. CSH, USA. Abstract 86.

5. K.A. Delviks-Frankenberry, G.N. Nikolenko, F. Maldarelli, S. Hase, Y. Takebe, and V.K. Pathak. Subtype-Specific Differences in the HIV-1 Reverse Transcriptase Connection Subdomain of CRF01AE are Associated with Higher Resistance to 3'-Azido-3'-Deoxythymidine Compared to Subtype B. // Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 18-23,2009. CSH, USA. Abstract 45.

6. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, A.Jere, and V. K. Pathak. Mutations in the reverse transcriptase connection and RNAse H domains exhibit dual resistance to nucleoside and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors.// XVII International HIV Drug

Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 10-13, 2008. Sitges, Spain. Abstract A55.

7. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, P.L. Boyer, S.H. Hughes, J.M. Coffin, A. Jere, and V. K. Pathak. HIV-1 reverse transcriptase connection domain mutations reduce template RNA degradation and enhance NRTI excision. // XVII International HIV Drug Resistance Workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 10-13, 2008. Sitges, Spain. Abstract A60.

8. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry and V. K. Pathak. Mutations in the reverse transcriptase connection domains exhibit dual resistance to NRTIs and NNRTIs. // Eighth HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. November 11-14, 2007. Richmond, VA, USA. Abstract 58.

9. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, A.Jere and V. K. Pathak. Mechanism of HIV-1 drug resistance: characterization of novel mutations in the RNAse H primer grip and connection domain that enhance AZT resistance.// Eighth HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. November 11-14,2007. Richmond, VA, USA. Abstract 57.

10. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Mutations in human immunodeficiency virus type-1 RNase H primer grip enhance 3'-azido-3'-deoxythymidine resistance.// Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 22-26, 2007. CSH, USA. Abstract 90.

11. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry and V. K. Pathak. Novel Mechanism of HIV-1 Drug Resistance: Mutations in the Reverse Transcriptase Connection Domain Exhibit Dual Resistance to NRTIs and NNRTIs.// 47th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. September 17-20,2007. Chicago, IL, USA. Abstract 299.

12. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak Mechanism of HIV-1 Drug Resistance: Identification of Novel Mutations in the RNase H Primer Grip that Enhance AZT Resistance// FARE 2008 Award Ceremony, September 2007. Bethesda, MD, USA.

13. K. A. Delviks-Frankenberry, G. N. Nikolenko, R. Barr, and V. K. Pathak. Identification of Novel Mutations in the HIV-1 RNase H primer grip that enhabce AZT resistance.// 11th Spring Research Festival, NCI-Frederick. May 2007, Frederick, MD, USA.

14. .G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. A novel mechanism of HIV-1 drug resistance: mutations in the reverse transcriptase connection domain enhance AZT resistance.// FARE 2007 Award Ceremony, September 25,2006. Bethesda, MD, USA.

15. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J. W. Mellors, J. M. Coffin and V. K. Pathak. C-terminal Domains Obtained From Treatment-Experienced Patients Contributes to AZT Resistance.// 13th HIV Dynamics and Evolution Meeting, April 5-8, 2006. Woods Hole, MA, USA.

16. G. N. Nikolenko, K. A. Delviks-Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J. W. Mellors, J. M. Coffin and V. K. Pathak. Mutations in the Connection Domain of HIV-lReverse transcriptase Increase AZT Resistance.// HIV and Cancer Virology Faculty Retreat, 2006. Maryland.

17. G. N. Nikolenko, K. A. Frankenberry, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. A novel mechanism of HIV-1 drug resistance: mutations in the reverse tli transcriptase connection domain enhance AZT resistance.// 10 Spring Research Festival, NCI-Frederick. May 2006, Frederick, MD, USA.

18. G. N. Nikolenko, S. Palmer, F. Maldarelli, J.W Mellors, J.M. Coffin, and V. K. Pathak. Mutations in HIV-1 RNase H domain confer high-level resistance to nucleoside reverse transcriptase inhibitors and provide novel insights into the mechanism of nicleotide excision-mediated drug resistance. // XIII International HIV Drug Resistance workshop: Basic Principles & Clinical Implications. June 8-12, 2004. Tenerife, Canary Islands, Spain. Abstarct S26.

19. D.C. Thomas, Y.A.Voronin, G. N. Nikolenko, and V. K. Pathak. Strand-specific amplification (SSA) analysis of the effects of antiviral drugs on the kinetics of HIV-1 reverse transcription. // Fifth HIV DRP Symposium on Antiviral Drug Resistance. November 14-17,2004. Chantilly, VA, USA. Abstract 61.

20. G N. Nikolenko, E.S. Svarovskaia, K. A. Delviks and V. K. Pathak. HIV-1 and MLV reverse transcriptase exhibit differences in dynamic steady state between polymerase and RNase H activities and template switching.// Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 20-25,2003. CSH, USA. Abstract 189.

21. G N. Nikolenko, E.S. Svarovskaia, K. A. Delviks and V. K. Pathak. Structural determinants of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase affecting the frequency of template switching. // Cold Spring Harbor Retroviruses Meeting. May 21-26, 2002. CSH, USA. Abstract 220.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Николенко, Галина Николаевна, Кольцово

1. SPREAD Programme. (2008). Transmission of drug-resistant HIV-1 in Europe remains limited to single classes. Aids 22,625-635.

2. Abbondanzieri, E.A., Bokinsky, G., Rausch, J.W., Zhang, J.X., Le Grice, S.F., and Zhuang, X. (2008). Dynamic binding orientations direct activity of HIV reverse transcriptase. Nature 453, 184-189.

3. Allan, J.S., Coligan, J.E., Barin, F., McLane, M.F., Sodroski, J.G., Rosen, C.A., Haseltine, W.A., Lee, Т.Н., and Essex, M. (1985). Major Glycoprotein Antigens That Induce Antibodies In Aids Patients Are Encoded By Htlv-Iii. Science 228,1091-1094.

4. Anderson, J.A., Bowman, E.H., and Hu, W.S. (1998a). Retroviral recombination rates do not increase linearly with marker distance and are limited by the size of the recombining subpopulation. J Virol 72,1195-1202.

5. Anderson, J.A., Teufel, R.J., 2nd, Yin, P.D., and Hu, W.S. (1998b). Correlated template-switching events during minus-strand DNA synthesis: a mechanism for high negative interference during retroviral recombination. J Virol 72, 1186-1194.

6. Atlas, A., Granath, F., Lindstrom, A., Lidman, K., Lindback, S., and Alaeus, A. (2005). Impact of HIV type 1 genetic subtype on the outcome of antiretroviral therapy. AIDS Res Hum Retroviruses 21,221-227.

7. Basavapathruni, A., Bailey, C.M., and Anderson, K.S. (2004). Defining a molecular mechanism of synergy between nucleoside and nonnucleoside AIDS drugs. J Biol Chem 279, 6221-6224.

8. Boone, L.R., and Skalka, A.M. (1981). Viral DNA synthesized in vitro by avian retrovirus particles permeabilized with melittin. I. Kinetics of synthesis and size of minus- and plusstrand transcripts. J Virol 37,109-116.

9. Boyer, P.L., Imamichi, T., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Hughes, S.H. (2004). Effects of the Delta67 complex of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase on nucleoside analog excision. J Virol 78,9987-9997.

10. Boyer, P.L., Julias, J.G., Marquez, V.E., and Hughes, S.H. (2005). Fixed conformation nucleoside analogs effectively inhibit excision-proficient HIV-1 reverse transcriptases. J Mol Biol 345,441-450.

11. Boyer, P.L., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Hughes, S.H. (2001). Selective excision of AZTMP by drug-resistant human immunodeficiency virus reverse transcriptase. J Virol 75, 4832-4842.

12. Boyer, P.L., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Hughes, S.H. (2002a). The M184V mutation reduces the selective excision of zidovudine 5-monophosphate (AZTMP) by the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1. J Virol 76, 3248-3256.

13. Boyer, P.L., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Hughes, S.H. (2002b). Nucleoside analog resistance caused by insertions in the fingers of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase involves ATP-mediated excision. J Virol 76,9143-9151.

14. Brehm, J.H., Mellors, J.W., and Sluis-Cremer, N. (2008). Mechanism by which a glutamine to leucine substitution at residue 509 in the ribonuclease H domain of HIV-1 reverse transcriptase confers zidovudine resistance. Biochemistry 47,14020-14027.

15. Brincat, J.L., Pfeiffer, J.K., and Telesnitsky, A. (2002). RNase H activity is required for high-frequency repeat deletion during Moloney murine leukemia virus replication. J Virol 76, 88- » 71 95.?

16. Burke, D.S. (1997). Recombination in HIV: an important viral evolutionary strategy. Emerg "t-T Infect Dis 3,253-259.

17. Butler, S.L., Hansen, M.S., and Bushman, F.D. (2001). A quantitative assay for HIV DNA „ff integration in vivo. Nat Med 7,631 -634.

18. Canard, B., Sarfati, S.R., and Richardson, C.C. (1998). Enhanced binding of azidothymidine-resistant human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase to the 3'-azido-3-deoxythymidine 5'-monophosphate-terminated primer. J Biol Chem 273,14596-14604.

19. Cane, P.A., Green, H., Fearnhill, E., and Dunn, D. (2007). Identification of accessory mutations associated with high-level resistance in HIV-1 reverse transcriptase. Aids 21, 447455.

20. Clark, S.A., Shulman, N.S., Bosch, R.J., and Mellors, J.W. (2006). Reverse transcriptase mutations 1181, 208Y, and 215Y cause HIV-1 hypersusceptibility to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Aids 20,981-984.

21. Coffin, J.M. (1995). Hiv Population-Dynamics In-Vivo Implications For Genetic-Variation, Pathogenesis, And Therapy. Science 267,483-489.1

22. Crothers, D.M., Haran, T.E., and Nadeau, J.G. (1990). Intrinsically bent DNA. J Biol Chem 265, 7093-7096.

23. J Biol Chem 284,35092-35100. 1 Vit 11

24. Dau, B., Ayers, D., Singer, J., Harrigan, P.R., Brown, S., Kyriakides, T., Cameron, D.W., Angus, B., and Holodniy, M. (2010). Connection domain mutations in treatment-experienced patients in the OPTIMA trial. J Acquir Immune Deflc Syndr 54,160-166.

25. Davies, J.F., 2nd, Hostomska, Z., Hostomsky, Z., Jordan, S.R., and Matthews, D.A. (1991). Crystal structure of the ribonuclease H domain of HIV-1 reverse transcriptase. Science 252, 88-95.

26. Delviks-Frankenberry, K.A., Nikolenko, G.N., Barr, R., and Pathak, V.K. (2007). Mutations in human immunodeficiency virus type 1 RNase H primer grip enhance 3-Azido-3-deoxythymidine resistance. Journal Of Virology 81,6837-6845.

27. Domaoal, R.A., and Demeter, L.M. (2004). Structural and biochemical effects of human immunodeficiency virus mutants resistant to non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Int J Biochem Cell Biol 36, 1735-1751.

28. Dube, D.K., and Loeb, L.A. (1976). On the association of reverse transcriptase with polynucleotide templates during catalysis. Biochemistry 15,3605-3611.

29. Dumans, A.T., Soares, M.A., Machado, E.S., Hue, S., Brindeiro, R.M., Pillay, D., and Tanuri,

30. A. (2004). Synonymous genetic polymorphisms within Brazilian human immunodeficiency virus Type 1 subtypes may influence mutational routes to drug resistance. J Infect Dis 189, 1232-1238.

31. Earl, P.L., Doms, R.W., and Moss, B. (1990). Oligomeric Structure Of The Human Immunodeficiency Virus Type-1 Envelope Glycoprotein. Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America 87,648-652.

32. Ehteshami, M., Beilhartz, G.L., Scarth, B.J., Tchesnokov, E.P., McCormick, S., Wynhoven,

33. Fedoroff, O., Salazar, M., and Reid, B.R. (1996). Structural variation among retroviral primer-DNA junctions: solution structure of the HIV-1 (-)-strand Okazaki fragment r(gcca)d(CTGC).d(GCAGTGGC). Biochemistry 35,11070-11080.

34. Feng, J.Y., and Anderson, K.S. (1999). Mechanistic studies examining the efficiency and fidelity of DNA synthesis by the 3TC-resistant mutant (184V) of HIV-1 reverse transcriptase. Biochemistry 38,9440-9448.

35. Figueiredo, A., Zelina, S., Sluis-Cremer, N., and Tachedjian, G. (2008). Impact of residues in the nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor binding pocket on HIV-1 reverse transcriptase heterodimer stability. Curr HIV Res 6, 130-137.

36. Fisher, R.A., and F. Yates (1963). Statistical tables for biological, agricultural, and medical research. Hafner Publishing, Co, New York, NY 6th edition.

37. Furfine, E.S., and Reardon, J.E. (1991). Reverse transcriptase.RNase H from the human immunodeficiency virus. Relationship of the DNA polymerase and RNA hydrolysis activities. J Biol Chem 266,406-412.

38. Gao, H.Q., Boyer, P.L., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Hughes, S.H. (2000). The role of steric hindrance in 3TC resistance of human immunodeficiency virus type-1 reverse transcriptase. J Mol Biol 300,403-418.

39. Goff, S.P. (1990). Retroviral Reverse-Transcriptase Synthesis, Structure, And Function. Journal Of Acquired Immune Deficiency Syndromes And Human Retrovirology 3, 817-831.

40. Goldschmidt, V., Didieijean, J., Ehresmann, B., Ehresmann, C., Isel, C., and Marquet, R.2006). Mg2+ dependency of HIV-1 reverse transcription, inhibition by nucleoside analogues and resistance. Nucleic Acids Research 34,42-52.

41. Gopalakrishnan, V., and Benkovic, S. (1994). Effect of a thiobenzimidazolone derivative on DNA strand transfer catalyzed by HIV-1 reverse transcriptase. J Biol Chem 269,4110-4115.

42. Gotte, M., Arion, D., Parniak, M. A., and Wainberg, M. A. (2000). The M184V mutation in the reverse transcriptase of human immunodeficiency virus type 1 impairs rescue of chain-terminated DNA synthesis. J Virol 74,3579-3585.

43. Goulden, M.G., Cammack, N., Hopewell, P.L., Penn, C.R., and Cameron, J.M. (1996). Selection in vitro of an HIV-1 variant resistant to both lamivudine (3TC) and zidovudine. Aids 10,101-102.

44. Gu, Z., Gao, Q., Li, X., Parniak, M.A., and Wainberg, M.A. (1992). Novel mutation in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase gene that encodes cross-resistance to 2',3-dideoxyinosine and 2',3-dideoxycytidine. J Virol 66,7128-7135.

45. Hahn, B.H., Shaw, G.M., Arya, S.K., Popovic, M., Gallo, R.C., and Wongstaal, F. (1984). Molecular-Cloning And Characterization Of The Htlv-Iii Virus Associated With Aids. Nature 312,166-169.

46. Halvas, E.K., Svarovskaia, E.S., and Pathak, V.K. (2000a). Development of an in vivo assay to identify structural determinants in murine leukemia virus reverse transcriptase important for fidelity. J Virol 74,312-319.U

47. Hanrahan, J.P., Wormser, G.P., Maguire, G.P., Delorenzo, L.J., and Gavis, G. (1982). Opportunistic Infections In Prisoners. New England Journal Of Medicine 307,498-498.

48. Harrigan, P.R., Bloor, S., and Larder, B.A. (1998). Relative replicative fitness of zidovudine-resistant human immunodeficiency virus type 1 isolates in vitro. J Virol 72,3773-3778.

49. Harris, D., Kaushik, N., Pandey, P.K., Yadav, P.N., and Pandey, V.N. (1998). Functional analysis of amino acid residues constituting the dNTP binding pocket of HIV-1 reverse transcriptase. J Biol Chem 273,33624-33634.

50. Hehl, E.A., Joshi, P., Kalpana, G.V., and Prasad, V.R. (2004). Interaction between human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase and integrase proteins. J Virol 78, 50565067.

51. Hemelaar, J., Gouws, E., Ghys, P.D., and Osmanov, S. (2006). Global and regional distribution of HIV-1 genetic subtypes and recombinants in 2004. Aids 20, W13-23.

52. Hopkins, A.L., Ren, J., Milton, J., Hazen, R.J., Chan, J.H., Stuart, D.I., and Stammers, D.K. (2004). Design of non-nucleoside inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase with improved drug resistance properties. 1. J Med Chem 47,5912-5922.

53. Hsiou, Y., Ding, J., Das, K., Clark, A.D., Jr., Boyer, P.L., Lewi, P., Janssen, P.A., Kleim, J.P., Rosner, M., Hughes, S.H., et al (2001). The Lysl03Asn mutation of HIV-1 RT: a novel mechanism of drug resistance. J Mol Biol 309,437-445.

54. Hu, W.S., Bowman, E.H., Delviks, K.A., and Pathak, V.K. (1997). Homologous recombination occurs in a distinct retroviral subpopulation and exhibits high negative interference. J Virol 71, 6028-6036.

55. Hu, W.S., Rhodes, Т., Dang, Q., and Pathak, V. (2003). Retroviral recombination: Review of genetic analyses. Frontiers In Bioscience 8, D143-D155.

56. Hu, W.S., and Temin, H.M. (1990a). Genetic consequences of packaging two RNA genomes in one retroviral particle: pseudodiploidy and high rate of genetic recombination. Proc Natl Acad Sci U S A 87, 1556-1560.

57. Hu, W.S., and Temin, H.M. (1990b). Retroviral recombination and reverse transcription. Science 250,1227-1233.

58. Hu, Z., Giguel, F., Hatano, H., Reid, P., Lu, J., and Kuritzkes, D.R. (2006). Fitness comparison of thymidine analog resistance pathways in human immunodeficiency virus type 1. J Virol 80,7020-7027.

59. Huang, H.F., Chopra, R., Verdine, G.L., and Harrison, S.C. (1998). Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-I reverse transcriptase: Implications for drug resistance. Science 282, 1669-1675.

60. Huber, H.E., McCoy, J.M., Seehra, J.S., and Richardson, C.C. (1989). Human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase. Template binding, processivity, strand displacement synthesis, and template switching. J Biol Chem 264,4669-4678.

61. Huber, H.E., and Richardson, C.C. (1990). Processing of the primer for plus strand DNA synthesis by human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase. J Biol Chem 265,1056510573.

62. Jetzt, A.E., Yu, H., Klarmann, G.J., Ron, Y., Preston, B.D., and Dougherty, J.P. (2000). High rate of recombination throughout the human immunodeficiency virus type 1 genome. J Virol 74, 1234-1240.

63. Jochmans, D. (2008). Novel HIV-1 reverse transcriptase inhibitors. Virus Research 134, 171185.

64. Julias, J.G., Kim, T., Arnold, G., and Pathak, V.K. (1997). The antiretrovirus drug 3'-azido-3'-deoxythymidine increases the retrovirus mutation rate. J Virol 71,4254-4263.

65. Julias, J.G., and Pathak, V.K. (1998). Deoxyribonucleoside triphosphate pool imbalances in vivo are associated with an increased retroviral mutation rate. J Virol 72,7941-7949.

66. Karageorgos, L., Li, P., and Burrell, C.J. (1995). Stepwise analysis of reverse transcription in a cell-to-cell human immunodeficiency virus infection model: kinetics and implications. J Gen Virol 76 (Pt 7), 1675-1686.

67. Kati, W.M., Johnson, K.A., Jerva, L.F., and Anderson, K.S. (1992). Mechanism And Fidelity Of Hiv Reverse-Transcriptase. Journal Of Biological Chemistry 267,25988-25997.

68. Kawai, S., and Nishizawa, M. (1984). New procedure for DNA transfection with polycation and dimethyl sulfoxide. Mol Cell Biol 4,1172-1174.

69. Kellam, P., and Larder, B.A. (1995). Retroviral recombination can lead to linkage of reverse transcriptase mutations that confer increased zidovudine resistance. J Virol 69,669-674.

70. Kiernan, R.E., Ono, A., Englund, G., and Freed, E.O. (1998). Role of matrix in an early postentry step in the human immunodeficiency virus type 1 life cycle. J Virol 72,4116-4126.

71. Klarmann, G.J., Yu, H., Chen, X., Dougherty, J.P., and Preston, B.D. (1997). Discontinuous plus-strand DNA synthesis in human immunodeficiency virus type 1-infected cells and in a partially reconstituted cell-free system. J Virol 71,9259-9269.

72. Kohler, J.J., and Lewis, W. (2007). A brief overview of mechanisms of mitochondrial toxicity from NRTIs. Environ Mol Mutagen 48,166-172.

73. Kohlstaedt, L.A., Wang, J., Friedman, J.M., Rice, P.A., and Steitz, T.A. (1992). Crystal-Structure At 3.5 Angstrom Resolution Of Hiv-1 Reverse-Transcriptase Complexed With An Inhibitor. Science 256,1783-1790.

74. Krebs, R., Immendorfer, U., Thrall, S.H., Wohrl, B.M., and Goody, R.S. (1997). Single-step kinetics of HIV-1 reverse transcriptase mutants responsible for virus resistance to nucleoside inhibitors zidovudine and 3-TC. Biochemistry 36, 10292-10300.

75. Larder, B.A. (1994). Interactions between drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Gen Virol 75 (Pt 5), 951-957. •

76. Larder, B.A., Darby, G., and Richman, D.D. (1989). HIV with reduced sensitivity to zidovudine (AZT) isolated during prolonged therapy. Science 243,1731-1734.

77. Larder, B.A., Kemp, S.D., and Harrigan, P.R. (1995). Potential mechanism for sustained antiretroviral efficacy of AZT-3TC combination therapy. Science 269, 696-699.

78. Larder, B.A., Purifoy, D.J., Powell, K.L., and Darby, G. (1987). Site-specific mutagenesis of AIDS virus reverse transcriptase. Nature 327,716-717.

79. Levy, J.A., Hoffman, A.D., Kramer, S.M., Landis, J.A., and Shimabukuro, J.M. (1984). Isolation Of Lymphocytopathic Retroviruses From San-Francisco Patients With Aids. Science 225,840-842.

80. Lewis, W., Day, B.J., and Copeland, W.C. (2003). Mitochondrial toxicity of NRTI antiviral drugs: an integrated cellular perspective. Nat Rev Drug Discov 2,812-822.

81. Liu, S., Abbondanzieri, E.A., Rausch, J.W., Le Grice, S.F., and Zhuang, X. (2008). Slide into action: dynamic shuttling of HIV reverse transcriptase on nucleic acid substrates. Science 322, 1092-1097.

82. Llibre, J.M., Santos, J.R., Puig, T., Molto, J., Ruiz, L., Paredes, R., and Clotet, B. (2008). , Prevalence of etravirine-associated mutations in clinical samples with resistance to nevirapine . and efavirenz. J Antimicrob Chemother 62,909-913.

83. Luo, G.X., Sharmeen, L., and Taylor, J. (1990). Specificities involved in the initiation of retroviral plus-strand DNA. J Virol 64,592-597.

84. Majumdar, C., Abbotts, J., Broder, S., and Wilson, S.H. (1988). Studies on the mechanism of human immunodeficiency virus reverse transcriptase. Steady-state kinetics, processivity, and polynucleotide inhibition. J Biol Chem 263,15657-15665.

85. Mansky, L.M. (1996). Forward mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 in a T lymphoid cell line. Aids Research And Human Retroviruses 12,307-314.

86. Margot, N.A., Isaacson, E., McGowan, I., Cheng, A.K., Schooley, R.T., and Miller, M.D. (2002). Genotypic and phenotypic analyses of HIV-1 in antiretroviral-experienced patients treated with tenofovir DF. Aids 16, 1227-1235.

87. Margot, N.A., Waters, J.M., and Miller, M.D. (2006). In vitro human immunodeficiency virus type 1 resistance selections with combinations of tenofovir and emtricitabine or abacavir and lamivudine. Antimicrob Agents Chemother 50,4087-4095.

88. Mbisa, J.L., Nikolenko, G.N., and Pathak, V.K. (2005). Mutations in the RNase H primer grip domain of murine leukemia virus reverse transcriptase decrease efficiency and accuracy of plus-strand DNA transfer. Journal Of Virology 79,419-427.

89. McCutchan, F.E., Hegerich, P.A., Brennan, T.P., Phanuphak, P., Singharaj, P., Jugsudee, A., Berman, P.W., Gray, A.M., Fowler, A.K., and Burke, D.S. (1992). Genetic variants of HIV-1 in Thailand. AIDS Res Hum Retroviruses 8, 1887-1895.

90. Menendez-Arias, L. (2002). Targeting HIV: antiretroviral therapy and development of drug resistance. Trends Pharmacol Sci 23,381-388.

91. Menendez-Arias, L. (2008). Mechanisms of resistance to nucleoside analogue inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. Virus Research 134,124-146.

92. Meyer, P.R., Matsuura, S.E., Mian, A.M., So, A.G., and Scott, W.A. (1999). A mechanism of AZT resistance: an increase in nucleotide-dependent primer unblocking by mutant HIV-1 reverse transcriptase. Mol Cell 4,35-43.

93. Meyer, P.R., Matsuura, S.E., So, A.G., and Scott, W.A. (1998). Unblocking of chain-terminated primer by HIV-1 reverse transcriptase through a nucleotide-dependent mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 95,13471-13476.

94. Meyer, P.R., Smith, A.J., Matsuura, S.E., and Scott, W.A. (2004). Effects of primer-template sequence on ATP-dependent removal of chain-terminating nucleotide analogues by HIV-1 reverse transcriptase. J Biol Chem 279,45389-45398.

95. Miller, A.D., and Buttimore, C. (1986). Redesign of retrovirus packaging cell lines to avoid recombination leading to helper virus production. Mol Cell Biol 6,2895-2902.

96. Miller, M.D., Wang, B., and Bushman, F.D. (1995). Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes containing discontinuous plus strands are competent to integrate in vitro. J Virol 69,3938-3944.

97. Moutouh, L., Corbeil, J., and Richman, D.D. (1996). Recombination leads to the rapid emergence of HIV-1 dually resistant mutants under selective drug pressure. Proc Natl Acad Sci U S A 93,6106-6111.

98. Naeger, L.K., Margot, N.A., and Miller, M.D. (2002). ATP-dependent removal of nucleoside reverse transcriptase inhibitors by human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Antimicrob Agents Chemother 46,2179-2184.

99. Naldini, L., Blomer, U., Gallay, P., Ory, D., Mulligan, R., Gage, F.H., Verma, I.M., and Trono, D. (1996b). In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science 272,263-267.

100. Nikolenko, G.N., Delviks-Frankenberry, K.A., and Pathak, V.K. (2010). A Novel Molecular Mechanism of Dual Resistance to NRTIs and NNRTIs. J Virol.

101. Nikolenko, G.N., Svarovskaia, E.S., Delviks, K.A., and Pathak, V.K. (2004). Antiretroviral drug resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase increase template-switching frequency. J Virol 78, 8761-8770.

102. O'Doherty, U., Swiggard, W.J., and Malim, M.H. (2000). Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J Virol 74,10074-10080.

103. Onafuwa, A., An, W., Robson, N.D., and Telesnitsky, A. (2003). Human immunodeficiency virus type 1 genetic recombination is more frequent than that of Moloney murine leukemia virus despite similar template switching rates. J Virol 77,4577-4587.

104. Palaniappan, C., Fay, P.J., and Bambara, R.A. (1995). Nevirapine alters the cleavage specificity of ribonuclease H of human immunodeficiency virus 1 reverse transcriptase. J Biol Chem 270,4861-4869.

105. Pantaleo, G., Graziosi, C., and Fauci, A.S. (1993). New concepts in the immunopathogenesis of human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med 328, 327-335.

106. Parikh, U.M., Bacheler, L., Koontz, D., and Mellors, J.W. (2006). The K65R mutation in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase exhibits bidirectional phenotypic antagonism with thymidine analog mutations. J Virol 80,4971-4977.

107. Peeters, M., and Sharp, P.M. (2000). Genetic diversity of HIV-1: the moving target. Aids 14 Suppl 3, S129-140.

108. Peliska, J.A., and Benkovic, S.J. (1992). Mechanism of DNA strand transfer reactions catalyzed by HIV-1 reverse transcriptase. Science 258,1112-1118.

109. Perelson, A.S., Neumann, A.U., Markowitz, M., Leonard, J.M., and Ho, D.D. (1996). HIV-1 dynamics in vivo: Virion clearance rate, infected cell life-span, and viral generation time. Science 271, 1582-1586.

110. Poveda, E., de Mendoza, C., Pattery, T., Gonzalez Mdel, M., Villacian, J., and Soriano, V. (2008). Phenotypic impact of resistance mutations on etravirine susceptibility in HIV patients with prior failure to nonnucleoside analogues. Aids 22,2395-2398.

111. Price, H., Asboe, D., Pozniak, A., Gazzard, B., Fearnhill, E., Pillay, D., and Dunn, D. (2010). Positive and negative drug selection pressures on the N3481 connection domain mutation: new insights from in vivo data. Antivir Ther 15,203-211.

112. Radzio, J., and Sluis-Cremer, N. (2008). Efavirenz accelerates HIV-1 reverse transcriptase ribonuclease h cleavage, leading to diminished zidovudine excision. Molecular Pharmacology 73, 601-606.

113. Rausch, J.W., Lener, D., Miller, J.T., Julias, J.G., Hughes, S.H., and Le Grice, S.F. (2002). Altering the RNase H primer grip of human immunodeficiency virus reverse transcriptase modifies cleavage specificity. Biochemistry 41,4856-4865.

114. Ray, A.S., Yang, Z., Shi, J., Hobbs, A., Schinazi, R.F., Chu, C.K., and Anderson, K.S. (2002b). Insights into the molecular mechanism of inhibition and drug resistance for HIV-1 RT with carbovir triphosphate. Biochemistry 41,5\50-5162.

115. Reardon, J.E. (1993). Human immunodeficiency virus reverse transcriptase. A kinetic analysis of RNA-dependent and DNA-dependent DNA polymerization. J Biol Chem 268, 8743-8751.

116. Ren, J., Esnouf, R., Hopkins, A., Ross, C., Jones, Y., Stammers, D., and Stuart, D. (1995). The structure of HIV-1 reverse transcriptase complexed with 9-chloro-TIBO: lessons for inhibitor design. Structure 3, 915-926.

117. Ren, J., and Stammers, D.K. (2008). Structural basis for drug resistance mechanisms for nonnucleoside inhibitors of HIV reverse transcriptase. Virus Res 134,157-170.

118. Rezende, L.F.', Drosopoulos, W.C., and Prasad, V.R. (1998). The influence of 3TC resistance mutation Ml 841 on the fidelity and error specificity of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Nucleic Acids Res 26,3066-3072.

119. Robertson, D.L., Sharp, P.M., McCutchan, F.E., and Hahn, B.H. (1995). Recombination in HIV-1. Nature 374,124-126.

120. Robey, W.G., Safai, B., Oroszlan, S., Arthur, L.O., Gonda, M.A., Gallo, R.C., and Fischinger, P.J. (1985). Characterization Of Envelope And Core Structural Gene-Products Of Htlv-Iii With Sera From Aids Patients. Science 228,593-595.

121. Rothenberg, E., and Baltimore, D. (1977). Increased length of DNA made by virions of murine leukemia virus at limiting magnesium ion concentration. J Virol 21, 168-178.

122. Salazar, M., Fedoroff, O.Y., and Reid, B.R. (1996). Structure of chimeric duplex junctions: solution conformation of the retroviral Okazaki-like fragment r(ccca)d(AATGA).d(TCATTTGGG) from Moloney murine leukemia virus. Biochemistry 35, 8126-8135.

123. Sarafianos, S.G., Das, K., Tantillo, C., Clark, A.D., Jr., Ding, J., Whitcomb, J.M., Boyer, P.L., Hughes, S.H., and Arnold, E. (2001). Crystal structure of HIV-1 reverse transcriptase in complex with a polypurine tract RNA:DNA. EMBO J 20,1449-1461.

124. Sarafianos, S.G., Marchand, B., Das, K., Himmel, D.M., Parniak, M.A., Hughes, S.H., and Arnold, E. (2009). Structure and function of HIV-1 reverse transcriptase: molecular mechanisms of polymerization and inhibition. J Mol Biol 385,693-713.

125. Schinazi, R.F., Hernandez-Santiago, B.I., and Hurwitz, S.J. (2006). Pharmacology of current and promising nucleosides for the treatment of human immunodeficiency viruses. Antiviral Res 71,322-334.

126. Schultz, S.J., and Champoux, J.J. (2008). RNase H activity: Structure, specificity, and function in reverse transcription. Virus Research 134, 86-103.

127. Shafer, R.W., and Schapiro, J.M. (2008). HIV-1 drug resistance mutations: an updated framework for the second decade of HAART. AIDS Rev 10,67-84.

128. Short, J.M., Fernandez, J.M., Sorge, J.A., and Huse, W.D. (1988). Lambda ZAP: a bacteriophage lambda expression vector with in vivo excision properties. Nucleic Acids Res 16,7583-7600.

129. Sluis-Cremer, N., Arion, D., Kaushik, N., Lim, H., and Parniak, M.A. (2000). Mutational analysis of Lys65 of HIV-1 reverse transcriptase. Biochem J 348 Pt 1,77-82.

130. Sluis-Cremer, N., and Tachedjian, G. (2008). Mechanisms of inhibition of HIV replication by non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Virus Research 134,147-156.

131. Smith, A. J., and Scott, W.A. (2006). The influence of natural substrates and inhibitors on the nucleotide-dependent excision activity of HIV-1 reverse transcriptase in the infected cell. Current Pharmaceutical Design 12,1827-1841.

132. Smith, C.M., Smith, J.S., and Roth, M.J. (1999). RNase H requirements for the second strand transfer reaction of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcription. J Virol 73, 6573-6581.

133. Smith, J.S., Gritsman, K., and Roth, M.J. (1994). Contributions of DNA polymerase subdomains to the RNase H activity of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. J Virol 68, 5721-5729.

134. Spence, R.A., Anderson, K.S., and Johnson, K.A. (1996). HIV-1 reverse transcriptase resistance to nonnucleoside inhibitors. Biochemistry 35, 1054-1063.

135. Srivastava, S., Sluis-Cremer, N., and Tachedjian, G. (2006). Dimerization of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase as an antiviral target. Curr Pharm Des 12, 1879-1894.

136. Stevenson, M. (2003). HIV-1 pathogenesis. Nature Medicine 9, 853-860.

137. Svarovskaia, E.S., Cheslock, S.R., Zhang, W.H., Hu, W.S., and Pathak, V.K. (2003). Retroviral mutation rates and reverse transcriptase fidelity. Frontiers In Bioscience 8, D117-D134.

138. Svarovskaia, E.S., Delviks, K.A., Hwang, C.K., and Pathak, V.K. (2000). Structural determinants of murine leukemia virus reverse transcriptase that affect the frequency of template switching. J Virol 74,7171-7178.

139. Tachedjian, G., and Goff, S.P. (2003). The effect of NNRTIs on HIV reverse transcriptase dimerization. Curr Opin Investig Drugs 4,966-973.

140. Tachedjian, G., Moore, K.L., Goff, S.P., and Sluis-Cremer, N. (2005). Efavirenz enhances the proteolytic processing of an HIV-1 pol polyprotein precursor and reverse transcriptase homodimer formation. FEBS Lett 579,379-384.

141. Tachedjian, G., Orlova, M., Sarafianos, S.G., Arnold, E., and Goff, S.P. (2001). Nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors are chemical enhancers of dimerization of the HIV type 1 reverse transcriptase. Proc Natl Acad Sci U S A 98,7188-7193.

142. Temin, H.M. (1991). Sex and recombination in retroviruses. Trends Genet 7,71-74.

143. Tisdale, M., Alnadaf, T., and Cousens, D. (1997). Combination of mutations in human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase required for resistance to the carbocyclic nucleoside 1592U89. Antimicrob Agents Chemother 41, 1094-1098.

144. Tong, W., Lu, C.D., Sharma, S.K., Matsuura, S., So, A.G., and Scott, W.A. (1997). . Nucleotide-induced stable complex formation by HIV-1 reverse transcriptase. Biochemistry 36, 5749-5757.

145. Tural, C., Ruiz, L., Holtzer, C., Schapiro, J., Viciana, P., Gonzalez, J., Domingo, P., Boucher, C., Rey-Joly, C., and Clotet, B. (2002). Clinical utility of HIV-1 genotyping and expert advice: the Havana trial. Aids 16,209-218.

146. Unutmaz, D., KewalRamani, V.N., Marmon, S., and Littman, D.R. (1999). Cytokine signals are sufficient for HIV-1 infection of resting human T lymphocytes. J Exp Med 189, 17351746.

147. Veronese, F.D., Devico, A.L., Copeland, T.D., Oroszlan, S., Gallo, R.C., and Sarngadharan, M.G. (1985). Characterization Of Gp41 As The Transmembrane Protein Coded By The Htlv-Iii/Lav Envelope Gene. Science 229,1402-1405.

148. Wainberg, M.A., Hsu, M., Gu, Z., Borkow, G., and Parniak, M.A. (1996). Effectiveness of 3TC in HIV clinical trials may be due in part to the Ml84V substitution in 3TC-resistant HIV-1 reverse transcriptase. Aids 10 Suppl 5, S3-10.

149. Wang, D.P., Rizzo, R.C., Tirado-Rives, J., and Jorgensen, W.L. (2001). Antiviral drug design: computational analyses of the effects of the LI 001 mutation for HIV-RT on the binding of NNRTIs. Bioorg Med Chem Lett 11, 2799-2802.

150. Wei, X., Liang, C., Gotte, M., and Wainberg, M.A. (2003). Negative effect of the M184V mutation in HIV-1 reverse transcriptase on initiation of viral DNA synthesis. Virology 311, 202-212.

151. Wisniewski, M., Balakrishnan, M., Palaniappan, C., Fay, P.J., and Bambara, R.A. (2000). The sequential mechanism of HIV reverse transcriptase RNase H. J Biol Chem 275,2>166A-2>161\.

152. Wisniewski, M., Chen, Y., Balakrishnan, M., Palaniappan, C., Roques, B.P., Fay, P.J., and Bambara, R.A. (2002). Substrate requirements for secondary cleavage by HIV-1 reverse transcriptase RNase H. J Biol Chem 277,28400-28410.

153. Xia, Q., Radzio, J., Anderson, K.S., and Sluis-Cremer, N. (2007). Probing nonnucleoside inhibitor-induced active-site distortion in HIV-1 reverse transcriptase by transient kinetic analyses. Protein Sci 16, 1728-1737.

154. Yoo, H.W., Warner, C.A., Chen, C.H., and Desnick, R.J. (1993). Hydroxymethylbilane synthase: complete genomic sequence and amplifiable polymorphisms in the human gene. Genomics 15,21-29.

155. Zennou, V., Petit, C., Guetard, D., Nerhbass, U., Montagnier, L., and Charneau, P. (2000). HIV-1 genome nuclear import is mediated by a central DNA flap. Cell 101, 173-185.

156. Zhang, W.H., Hwang, C.K., Hu, W.S., Gorelick, R.J., and Pathak, V.K. (2002a). Zinc finger domain of murine leukemia virus nucleocapsid protein enhances the rate of viral DNA synthesis in vivo. J Virol 76, 7473-7484.

157. Zhuang, J., Jetzt, A.E., Sun, G., Yu, H., Klarmann, G., Ron, Y., Preston, B.D., and Dougherty, J.P. (2002). Human immunodeficiency virus type 1 recombination: rate, fidelity, and putative hot spots. J Virol 76, 11273-11282.