Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов контроля точности репликации ДНК у дрожжей с помощью аналога оснований 6-N-гидроксиламинопурина

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов контроля точности репликации ДНК у дрожжей с помощью аналога оснований 6-N-гидроксиламинопурина"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ КОНТРОЛЯ ТОЧНОСТИ РЕПЛИКАЦИИ ДНК У ДРОЖЖЕЙ С ПОМОЩЬЮ АНАЛОГА ОСНОВАНИЙ 6-АГ-ГИДРОКСИЛАМИНОПУРИНА

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1997

Работа выполнена на кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета

Научный руководитель:

ведущим научный сотрудник, кандидат биологических наук ' Ю. И. ПАВЛОВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т. Р. СОЙДЛА доктор биологических наук В. А. ЛАНЦОВ

Ведущее учреждение:

Государственный НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов

,00 час. на

Защита дисертации состоится " UWUJI 1997 г. в ^ заседании Диссертационного совета Д 063.57.21 по защите диссертаций на соискан ученой степени доктора биологических наук в Санкт-Петербургском Государствен! университете (Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, кафедра генетики и селекции, аудитория №1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского Государственного университета.

Автореферат разослан "/</ " 1997 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л. А. МАМОН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Точное воспроизведение наследственной информации -необходимое условие существования живых организмов. Основа воспроизведения генетического материала - репликация ДНК. Нарушения точности репликации ДНК у прокариот и эукариот приводят к увеличению частоты мутаций. У человека это может инициировать развитие наследственных и неиаследственных форм рака. Высокая точность репликации ДНК у Exoli достигается последовательным действием трех механизмов, включающих подбор комплементарных матрице нуклеотидов ДНК-полимеразой III, коррекцию ошибок с помощью 3'—>5' экзонуклеазной активности ЦНК-полимеразы III и пострепликативную репарацию неспаренных оснований. О механизмах контроля точности репликации ДНК эукариот известно значительно меньше. В частности, неясно, какова роль ДНК-полимераз е и 8 и ассоциированных с ними 3'-»5' экзонуклеаз в контроле точности репликации генома. Ряд современных моделей организации реплисомы эукариот предполагают, что в синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК участвуют разные ДНК-полимеразы, но ни одна из моделей не была подтверждена экспериментально. . .

В нашей работе для выявления различий в контроле точности репликации пидирующей и отстающей нитей ДНК у дрожжей использована оригинальная модельная система, в которой синтез ДНК in vivo происходит в присутствии мутагенного аналога пуриновых оснований б-Л'-гидроксиламинопурина (ГАП).

Задачи исследования. Аналоги оснований, не обладающие строгой '' специфичностью образования комплементарных пар с другими основаниями, провоцируют ошибки ДНК-полимеразы, приводящие к мутациям. Добавление ГАП в :реду для роста дрожжей увеличивает частоту мутаций за счет ошибок репликации на несколько порядков, что позволяет изучать роль различных компонентов аппарата репликации в возникновении этих специфических ошибок.

Были поставлены следующие задачи:

- Охарактеризовать спектр мутаций, индуцированных ГАП в гене URA3.

- Изучить роль репликагавных ДШС^пояимераз, экзонуклеазной коррекции и репарации неспаренных оснований в индуцированном ГАП мутагенезе.

- Используя ГАП, изучить механизмы контроля точности синтеза лидирующей и отстающей нитей ДНК.

Научная новизна. Впервые проведен прямой анализ индуцированных ГАП изменений нуклеотидных последовательностей и показано, что ГАП индуцирует в дрожжевом гене URA3 транзиции GC—>АТ и AT—»GC; горячими точками тракзиций ЗС—>АТ являются последовательности ДНК типа AGA и монотонные повторы G-C пар. Впервые исследована роль репликативных ДНК-полимераз в индуцированном ГАП мутагенезе у дрожжей и показано, что: 1) Мутации в генах ДНК-полимераз a, S и г подавляют индуцированный ГАП мутагенез за счет снижения частоты мутаций в 'горячих точках"; 2) 3'—>5' экзонуклеазы, ассоциированные с ДНК-по'лиМеразами'8 и 5, участвуют в коррекции индуцированных ГАП ошибок репликации. Впервые у

эукариот обнаружены различия в контроле точности репликации лидирующей и отстающей нитей ДНК in vivo: 1) Индуцированные ГАП ошибки возникают с разной частотой при репликации лидирующей и отстающей нитей ДНК; 2) 3'—>5' экзонуклеазы ДНК-полимераз 5 и б корректируют индуцированные ГАП ошибки при репликации разных нитей ДНК.

Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные в нашей работе данные об участии ДНК-полимераз 5 и е в коррекции ошибок при репликации разных нитей ДНК необходимо учитывать при создании моделей организации аппарата репликации ДНК, в экспериментах по реконструкции процесса репликации в бесклеточных системах, при изучении механизмов контроля точности репликации ДНК. Результаты исследования генетического контроля индуцированного ГАП мутагенеза могут быть использованы при изучении механизмов мутагенного действм других аналогов оснований, например, эндогенного аналога 8-оксигуанина. Данные о молекулярной специфичности действия ГАП открывают возможность использования этого мутагена для направленного мутагенеза. Набор интегративных плазмид с мутантными аллелями гена URA3, полученный в нашей работе, используется в лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ для конструирования миссенс- и нонсенс-мутаций в штаммах дрожжей с любым заданным генотипом.

Апробация работы. По результатам работы сделаны сообщения на конференциях "Gordon Research Conference (Genetic Toxicology)" (New Hampshire, USA, July 1993); "Gordon Research Conference (Mutagenesis)" (Plymouth State College, New Hampshire, USA, June 1994); "Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting" (University of Washington, Seattle, USA, August 1994); "5th International Conference on Mechanisims of Antimutagenesis and Anticarcuiogenesis" (Okayama University, Japan, December 1996); на научной сессии, посвященной 75-летию кафедры генетики СП6П> (Санкт-Петербург, ноябрь 1994) и на семинарах лаборатории физиологической генетики БиНИИ СПбГУ.

Объем диссертации. Диссертация изложена на m страницах, состоит из введения, обзора данных литературы из трех частей, глав "Материалы и методы", "Результаты" и "Обсуждение результатов", и выводов. Работа содержит 16 таблиц, 14 рисунков, список литературы из 4ч?/ наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы. Штамм ES63-17D {МАТa ade2-l iysl-1 lrp5-48 his3-l¡, 15 [HIS3 LEU2 URA3] Ieu2-3,112 игаЗЛ) использован для получения мутантов по гену URA3. Штамм содержит полную делецию гена URA3 в хромосоме К и плазмиду с дрожжевыми генами HIS3, LEU2 и URA3, интегрированную в локус HIS3 в хромосоме XV.

На основе штаммов L1-CG379 (MATaadeS-l Íys2-Tn5-13 írpl-289 his7-2 Ieu2-3,112 ura3-52) и L1-XAM8A (мутантpol2-4 штамма L1-CG379) созданы серии изогенных штамов, различающиеся аллелями генов POLI, POL2, POL3, PMS1 и URA1 Для этого хромосомные аллели соответствующих генов дикого типа замещали

s

утантными аллелями с помощью интеграции в хромосому плазмид с мутанткыми мелями и последующей эксцизии плазмид с аллелями дикого типа, а также методом эдношаговой замены" хромосомных аллелей мутантными аллелями, находящимися в эставе рестрикционных фрагментов плазмидной ДНК.

Методы генной инженерии. Стандартные методы генной инженерии, епользованные в работе, описаны в руководстве Сэмбрука с соавторами (Sambrook et , 1990). Трансформацию дрожжей проводили по методу Ито с соавторами (Ito et al, Э83) с модификациями (Gietz et al, 1995). Мутантные аллели гена URA3, полученные штамма ES63-17D при действии ГАП, клонировали методом эвикции плазмид с утантными аллелями из хромосомы XV. Для анализа нуклеотидных оследовательностей ревертантов Ura+, необходимые фрагменты гена иплифицировали ПДР, Секвенирование двунитевой ДНК проводили методом энджера с модифицированной ДНК-полимеразой бактериофага Т7 (Tabor and ichardson, 1987).

Генетические методы. В работе использованы стандартные методы генетики зожжей (см. Захаров и др., 1984; Rose et al, 1990). Для индукции мутаций ГАП зожжи выращивали до стационарной фазы в среде YAPD (см. Инге-Вечтомов, 1971), )держащей 50 или 100 мкг/мл ГАП, затем высевали на селективные среды и икубировали 3-6 дней до появления колоний мутантов. Для индукции ревертантов эд действием ЭМС стационарные культуры дрожжей обрабатывали ЭМС в знцентрации 2% в течение часа, промывали водой и высевали на селективную среду 1я отбора ревертантов. Для индукции ревертантов УФ-светом дрожжи высевали на шективную среду, облучали УФ-светом в дозе 60 J/m2 и затем инкубировали до эявления колоний ревертантов. Для количественного измерения частот здуцировашшх мутантов и ревертантов из обработанных мутагенами культур после ¡обходимых разведений клетки высевали также на среду YAPD для оценки числа изнеспособных клеток в культуре, и затем определяли отношение числа мутантов к гелу жизнеспособных клеток.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ спектра мутаций, индуцированных ГАП в гене URA3. Клонированы и аквенированы 29 мутантных аллелей гена URA3, полученных независимо при ¡йствии ГАП. Результаты анализа обнаруженных изменений нуклеотидной юледовательности приведены в таблице 1. Все мутации оказались заменами пар шований, большинство из них (21 мутация) - транзициями GC-»AT. Обнаружены ¿оке пять транзиций AT->GC и три трансверсии GC-»TA. В распределении 1анзиций в гене URA3 выявлены три закономерности:

(1) Около четверти всех транзиций GC~»AT являются заменами "G" в шожении 271. Мутации в этом положении не характерны для спектров спонтанных ,таций в гене URA3 (Lee et al, 1988; von Borstel et al, 1993; Morrison and Sugino, !94), следЬвательно, этот сайт может быть горячей точкой индуцированных ГАП (Таций.

Таблица

Мутации, индуцированные ГАД в гене иЯАЗ.

Мутантная Номер аллель_нуклеотида1

Последовательность ДНК в _районе мутации2_

Замена аминокислоты

Транзиции GC —> AT игаЗ-27 98

ига3-36 155

ига3-35 268

игаЗ-2 271

игаЗ-6 271

игаЗ-7 271

игаЗ-18 271

игаЗ-28 271

игаЗ-15 345

ига3-31 345

ига3-43 437

игаЗ-5 591

игаЗ-16 591

игаЗ-40 591

игаЗ-4 605

игаЗ-З 701

701

игаЗ-19 706

706

игаЗ-21 768

мш5-25 768

Транзиции AT -> GC ura3-29 257

278

мгаЗ-ЗЗ 281

ura3-22 440

ura3-26 710

Трансверсии GC -» ТА urai-7 93

игаЗ-20 93

ига3-34 340

ААС TTG TGT GCT ТСА Cys -> Туг

GCA ТТА GGT ССС AAA Gly Asp

СТС TTC GAA GAC AGA Glu-»Lys

TTC GAA GAC AGA AAA Asp Asn

TTC GAA GAC AGA AAA Asp -» Asn

TTC GAA GAC AGA AAA Asp -> Asn

TTC GAA GAC AGA AAA Asp Asn

TTC GAA GAC AGA AAA Asp-»Asn

GCA GAA TGG GCA GAC Tip -» опал

GCA GAA TGG GCA GAC Trp-»опал

CCT AGA GGC CTT TTG Gly -» Asp

TAC GAT TGG TTG ATT Trp -» опал

TAC GAT TGG TTG ATT Trp -> опал

TAC GAT TGG TTG ATT Tip -» опал

ATG АСА CGC GGT GTG Pro -» Leu

ATT GTT GGA AGA GGA Gly -> Glu

ATT GTT GGA AGA GGA Gly -» Glu

GGA AGA GGA СТА TTT Gly-»Arg

GGA AGA GGA СТА TTT Gly -» Arg

GCA GGC TGfi GAA GCA Trp -> опал

GCA GGC TGG GAA GCA Trp-»опал

TAC AAT TTT ТТА CTC Phe -» Ser

GAC AGA AAA TTT GCT Lys -» Arg

AGA AAA TTT GCT GAC Phe-»Ser

AGA GGC CTT TTG ATG Leu Pro

AGA GGA СТА TTT GCA Leu Pro

CAA АСА ААС TTG TGT Asn-»Lys

CAA АСА AAÇ TTG TGT Asn-»Lys

ATA GCA GAA TGG GCA Glu -» охр

Нумерация нуклеотидов от первого кодона открытой рамки считывания гена ¡ЛИАЗ.

2 Приведена последовательность аллели дикого типа, подчеркнут нуклеотид в точке мутации.

(2) Среди транзиций, возникших вне горячей точки, ~85% произошли в монотонных повторах О-С или А-Т пар, преимущественно в середине или 3' положении повтора пуринов. Низкую частоту встречаемости замен 5' концевого нуклеогида повтора нельзя объяснить невозможностью выявить такие замены в данной системе селекции. По крайней мере нонсенс-мутации, возникающие главным образом за счет транзиций СС->АТ в триптофановых кодонах ТОО, могут являться результатом замен как второго, так и третьего нуклеотида ко дона, однако, замены были обнаружены только в третьем положении.

(3) Замены в—>А распределены асимметрично по отношению к кодирующей и транскрибируемой нитям ДНК.' 20 из 21 транзиции СС—>АТ являются результатом замены пурина в кодирующей нити.

Роль экзонуклеазной коррекции и репарации неспаренных оснований в индуцированном ГАП мутагенезе. Мы сравнили частоты встречаемости индуцированных ГАП мутантов, устойчивых к канаванину, у штаммов ро12-4 иро!3-01 с дефектами 3'->5' экзонуклеазной активности ДНК-полимераз е и 5, соответственно, штамма рт$1 с нарушением репарации неспаренных оснований и изогенного штамма дикого типа (Таблица 2). Увеличение частоты индуцированных мутаций у штаммов ро12-4 и ро13-01 по сравнению со штаммом дикого типа свидетельствует о том, что 3'->5' экзонуклеазы ДНК-полимераз е и 5 исправляют часть индуцированных ГАП ошибок репликации. Статистически достоверного

Таблица 2. .

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП мутантов Сапг у штаммов ро12-4, ро13~01, ртз] и изогенного штамма дикого типа.

Мутаторная Частота мутантов Частота мутантов при Частота мутантов при аллель без обработки ГАП дозе ГАП 50 мкг/мл дозе ГАП 100 мкг/мл _(хЮ'1) _ (х 10'5)_(х 10'5)_

(штамм 0.10 4.1 30.0

дикого типа) (0.08-0.15) (3.2-5.3) (22.2-40.1)

ро12-4 0.86 24.9 . / . ,125.6

(0.42- 1.30) (20.1-33.4) ' ,(109.? -159,5)

ро!3-01 9.0 17.5 73.0

(4.4-11.4) (16.0 - 24.6) (62.3 - 98.0)

ртз1 3.3 ' НА 34.5

_(1.5-4.9)_;_(31.3-41.0) '

Приведены медианные значения частот мутантов, измеренные в 9-18 независимых * культурах. В скобках указан 95% доверительный интервал. НА - не анализировали. '

эффекта мутации pmsl на индуцированный Г АЛ мутагенез не выявлено, следовательно, пострепликативная репарация гетеродуплексов не участвует в коррекции пар оснований, содержащих ГАП.

Для изучения роли ДНК-полимераз е и 6 в коррекции ошибок репликации, индуцированных включением ГАП при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК, мы создали систему штаммов, позволяющих анализировать влияние мутаций ро12-4 и polS-01 на частоту возникновения реверсий миссенс-мутаций в гене URA3. Мы использовали две аллели, игаЗ-24 и игаЗ-29, ревертирующие за счет транзиций GC-»AT, опосредованных включением ГАП в кодирующую (игаЗ-24) или транскрибируемую (игаЗ-29) нити ДНК, и две аллели, игаЗ-4 и игаЗ-2, ревертирующм за счет транзиций AT-»GC, опосредованных включением ГАП в кодирующую (игаЗ-2) или транскрибируемую (игаЗ-4) нити (Таблица 1). Механизм возникновения индуцированных ГАП реверсий этих мутаций схематически изображен на рисунке 1. Для того чтобы убедиться, что реверсии возникают в результате специфических транзиций, восстанавливающих последовательность ДНК гена URA3 дикого типа, мы определили нуклеотидные последовательности аллелей гена URA3 более чем у 90 независимых ревертантов Ura+, включая спонтанные и индуцированные ГАП ревертанты, полученные у штаммов ро12-4, ро13-01 и штамма дикого типа. Мутации игаЗ-24, игаЗ-4 и игаЗ-2 ревертировали только за счет истинных обратных мутаций. Реверсии мутации игаЗ-29 возникали за счет двух типов замен: транзиций CG-+TA, восстанавливающих последовательность гена дикого типа, и трансверсий CG-»AT в том же сайте. Доля трансверсий была выше среди спонтанных реверсий (7 из 17 реверсий), чем среди индуцированных ГАП (2 из 17 реверсий), в соответствии с наблюдением, что ГАП индуцирует преимущественно транзиции.

Анализ влияния мутаций ро12-4 и ро13-01 на частоту индуцированных ГАП реверсий выявил два класса аллелей игаЗ. Частота реверсий мутаций игаЗ-24 и игаЗ-4 была увеличена по сравнению с контролем только у штаммаро12-4, а частота реверсий мутаций июЗ-29 и игаЗ-2, наоборот, была увеличена только у штамма ро13-01 (данные приведены в диссертации).

Повышенная частота реверсий у штаммов с нарушением корректорской функции одной из ДНК-полимераз свидетельствует о том, что ошибки репликации, приводящие к реверсиям, корректируются этой ДНК-полимеразой у штаммов дикого типа. Следовательно, реверсии мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29, возникающие за счет одного и того же типа транзиций, GC—>АТ, являются результатом ошибок репликации, корректируемых разными ДНК-полимеразами: Pole в случае игаЗ-24 и Ро18 в случае игаЗ-29. Ошибки репликации, приводящие к реверсиям мутаций игаЗ-4 и игаЗ-2 за счет транзиций AT—»GC, также корректируются разными. ДНК-полимеразами: Pole в случае игаЗ-4 и PolS в случае игаЗ-2. Мы предположили, что роли Pole и Ро15 в предотвращении каждого конкретного типа реверсий определяют« тем, в какую нить ДНК происходит включение ГАП при возникновении этих реверсий.

игаЗ-29

игаЗ-24

игаЗ-4

игаЗ-2

А.

-с-

-<3~

-с-

н-

-н>

-с-

-т-

-А-

-Т-

-н-

-А-

-Т-

-т-

Б.

-Т1

-н-

-н-

-т-

У

-С1

-н-

-н-

-с-

В.

-т-

7

-А >

-Т-

-Со

-с—

се — ТА ОС — АТ ТА— ее АТ—«* вС

Рисунок 1. Механизм возникновения индуцированных ГАП реверсий миссенс-мутаций в гене иИАЗ. Тонкие и жирные линии обозначают транскрибируемую и кодирующую нити ДНК, соответственно. "Н" - ГАП. А. Включение ГАП. Б. Репликация содержащей ГАП матрицы. В. Фиксация реверсии.

Для подтверждения этого предположения мутантные аллели игаЗ-24, игаЗ-29, игаЗ-4 и игаЗ-2 были встроены в хромосому Ш в двух ориентациях на расстоянии ~4,4 т. п. н. от активного ориджина репликации ARS3 Об. Это позволило изучить влияние мутаций ро12-4 и poI3-0J на возникновение ошибок репликации, опосредованных включением Г АЛ при синтезе лидирующей или отстающей нити в одном и том же контексте ДНК (Таблица 3; Рисунок 2). Ориентацию гена URA3, в которой 5' конец кодирующей нити ДНК расположен ближе к ARS306, обозначали LR, а противоположную ориентацию - RL. Влияние мутаций ро12-4 и pol3-0¡ на частоты возникновения ревертантов Ura+ у штаммов с ориентацией мутантных аллелей, обозначаемой LR, практически не отличалось от влияния этих мутаций на ревертирование мутаций игаЗ при естественном положении мутантных аллелей в хромосоме V: частоты реверсий мутаций игаЗ-24 и игаЗ-4 увеличены у штаммаро!2-4, а частоты реверсий мутаций игаЗ-29 и игаЗ-2 увеличены у штаммаро13-01. У штаммов с ориентацией аллелей июЗ, обозначаемой RL, влияние мутаций ро12-4 и ро13-01 было полностью противоположным: частоты реверсий мутаций игаЗ-24 и игаЗ-4 были увеличены у мутантов pol3-0l и почти не изменены у мутантов ро!2-4. Частоты реверсий мутаций игаЗ-29 и игаЗ-2, наоборот, были увеличены у мутантов ро12-4.

Так как ГАП образует комплементарные пары только с цитозином или тиыином, можно определить, в какую нить ДНК происходит включение ГАП при возникновении каждого типа реверсий. Однако, коррекция неспаренностей за счет экзонуклеазной активности ДНК-полимераз может происходить как на этапе включения ГАП в ДНК, так и во время репликации содержащей ГАП матрицы (см. рис. 1), поэтому нельзя однозначно идентифицировать нить, в которой происходит коррекция ошибки. Необходимо рассматривать две возможности. Если ГАП по способности образовывать комплементарные пары с другими основаниями in vivo имеет большее сходство с аденином, чем с гуанином, то, вероятно, ДНК-полимеразы преимущественно включают ГАП напротив "Т" и корректируют "неправильную" пару ГАП-С. Если, наоборот, ГАП используется в большинстве случаев как аналог гуанина, то ДНК-полимеразы могут узнавать и корректировать "неправильную" пару ГАП-Т.

Если преимущественно корректируется пара ГАП-С, то в случае транзиций GC->AT наблюдаемый эффект мутаций ро!2-4 и ро13-01 отражает роль Pols и Ро15 в коррекции ошибок на этапе включения ГАП, а в случае транзиций AT~»GC - на этапе репликации содержащей ГАП матрицы. Анализ данных таблицы 3 показывает, что во всех случаях, когда к реверсиям приводит включение ГАП напротив С или включение С напротив ГАП при синтезе лидирующей нити ДНК, коррекцию ошибок осуществляет Pole, а если эти события происходят при синтезе отстающей нити ДНК,

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП ревертантов ига* у штаммов с разными ориентациями аллелей иЯАЗ.

Таблица 3.

Ориентация Ц?. Ориентация М-

Аллель Тип Мутаторная Частота ига* ревертантов при дозе ГАП, х 10 4 Частота ига* ревертантов при дозе ГАП, х 10"*

1ЖАЗ реверсии аллель 0 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл 0 мкг/мл 50 мкг/мл 100 мкг/мл

игаЗ-24 вС -> АТ - <2 (4) 51 ±5 (5) 267 ±24 (5) <1 (4) 7±1 (4) 30 ±3 (4)

ро12-4 4 ± 1 (4) 873 ±75 (6) 3666 ± 343 (6) <1 (4) 19 ±3 (4) 62 ±6 (4)

ро13-01 9 ± 3 (4) 85 ±11 (б) 357 ±17 (5) 4 ± 1 (3) 135 ±11(3) 283 ±11 (3)

игаЗ-29 СО -»ТА - <2 (4) 32 ±2 (6) 119 ±5 (5) <3 (6) 160 ± 10 (6) 387 ±15 (6)

ро!2-4 30 ±7 (4) 58 ±9 (4) 129 ± 10 (3) 43 ± 9 (4) 686 ± 13 (4) 1460 ±85 (4)

ро!3-01 6« ± 13 (4) 118±7 (4) 539 ±45 (4) 40 ± 7 (3) 228 ±23(3) 320 ±20 (3)

игаЗ-4 ТА-» Св - <2 (4) 50 ±4 (4) 141 ±8 (4) <1 (8) 13 ± 1 (8) 21 ±1 (8)

ро12-4 <1 (3) 248 ±15 (3) 456 ±44 (3) <1 (6) 22 ±2 (6) 40 ±3 (6)

ро13-01 10 ±2 (4) 60 ±7 (4) 129 ±13 (4) <1 (3) 42 ±2 (3) 168 ±20 (3)

игаЗ-2 АТ-» вС - <1 (4) 19 ±2 (б) 61 ±8 (5) <1 Ю 6±1 (5) 11 ±1 (5)

ро!2~1 <1 (4) 29 ±3 (6) 64 ±4 (6) <1 (4) 150 ± 13 (6) 404 ±33 (6)

ро!3-01 <1 (4) 164 ± 12 (6) 460 ±35 (6) 4±1 (4) 49 ±4 (6) 123 ±11 (5)

Приведены средние значения частот ревертантов. В скобках указано число независимых измерений.

hcoo

ЪОоО-

¿ООО-

§ У

а » О. я iOCO-

5 §

К л i 1

дикий р012-4 ро13-01

3* а

ТИП

дикий ро13-01

тип

Рисунок 2. 3 '—>5' экзонуклеазы ДНК-полимераз 6 и е корректируют индуцированные ГАП ошибки при репликации разных нитей ДНК. В верхней части рисунка схематически изображена вилка репликации и показаны места включения ГАП при реверсии мутации игаЗ-24 в .разных ориентациях (обозначенных Ш и КЬ). В нижней части рисунка приведены частоты индуцированных ревертантов у штамма дикого типа и у штаммов с дефектами экзонуклеолитической коррекции в ориентациях ЬЯ и ИЬ (по данным Таблицы 3, доза ГАП -100 мкг/мл).

коррекцию осуществляет Ро18. Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют, что Pole и Ро15 корректируют индуцированные ГАП ошибки при синтезе лидирующей и отстающей нитей ДНК, соответственно.

Если преимущественно корректируется пара ГАП-Т, то, наоборот, о15 корректирует ошибки в лидирующей нити ДНК, a Pole - в отстающей ити.

Индуцированные ГАП ошибки возникают с разной частотой при епликации лидирующей и отстающей нитей ДНК. ГАП индуцирует евгрсии мутаций игаЗ-24, игаЗ-29 и игаЗ-4 в 5-10 раз чаще в той риентацин мутантной аллели, в которой ошибки репликации, приводящие к еверсии, корректируются Pols (Таблица 4). В то же время частоты еверсий, индуцированных ЭМС и УФ-светом, действие которых не посредовано ошибками репликации, не зависят от ориентации мутантной ллели. Следовательно, изменение ориентации аллели не влияет на ероятность возникновения или выявления ревертантов Ura+ посредством :акого-либо механизма, не связанного с репликацией ДНК, и зависимость [астоты индуцированных ГАП реверсий от ориентации аллели игаЗ пражает различия в контроле точности репликации лидирующей и ртстающей нитей ДНК. Это согласуется с наблюдением, что 92% шдуцированных ГАП прямых мутаций в гене URA3 являются результатом 1шибок репликации в одной нити ДНК. Одним из объяснений этой [симметрии может быть предположение о репликации лидирующей и »тстающей нитей разными ДНК-полимеразами, одна из которых чаще юпускает ошибки при синтезе ДНК в присутствии ГАП. Если полагать, что ('-»5' экзонуклеазы корректируют преимущественно ошибки тех ДНК-юлимераз, с которыми они ассоциированы, то большинство шдуцированных ГАП мутаций возникает в результате ошибок репликации, юпущенных Pole.

Мутации, нарушающие полимеразную активность ДНК-полимераз а. 5 и ё снижают частоту индуцированных ГАП мутаций в "горячих точках" мутагенеза. Реверсии мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29 являются результатом замен 'G" в последовательности AGA, которая соответствует последовательности горячей точки мутагенеза, обнаруженной при анализе прямых мутаций игаЗ. Высокая частота ревертирования мутаций игаЗ-24 и игаЗ-29 наблюдается только в том случае, если мотив AGA находится в составе лидирующей нити ЦНК (ориентация LR для аллели игаЗ-24 и ориентация RL для аллели игаЗ-29). Изменение ориентации аллели, в результате которого AGA оказывается в отстающей нити ДНК, приводит к снижению частоты реверсий в 7-10 раз [Таблицы 4 и 5).

Мутацииpol2-3991, pol3t и ро11-1 снижают частоты реверсий преимущественно в той ориентации, в которой реверсии возникают на порядок чаще (Таблица 5; результаты экспериментов с мутантами pol3 t и poll-] приведены в диссертации). У мутантов с дефектами ДНК-полимераз разница между частотами реверсий в двух ориентациях значительно меньше, чем у штаммов дикого типа, или полностью отсутствует. Мутация ро!2-3991

нарушает взаимодействие каталитического полипептида Pole с другими субьединицами этой лолимеразы (Morrison and Sugino, 1993). Мутация poll-1 нарушает стабильность комплекса каталитической субьединицы Pola с ДНК-праймазой (Lucchini et al, 1990). Биохимический дефект, вызываемый мутациейроШ, не исследован. Сходство влияния мутаций в генах разных. ДНК-полимераз на индуцированный ГАП мутагенез позволяет предположить, что все эти мутации вызывают один и тот же функциональный дефект аппарата репликации, который приводит к исчезновению "горячих точек", в то время как частота ошибок в других сайтах, не являющихся "горячими точками", не изменяется при этом или изменяется менее значительно. Следовательно, существование "горячих точек" может быть обусловлено особьм свойством аппарата репликации, которое не требуется для возникновения мутаций в других сайтах и отсутствует у мутантов с дефектами компонентов репликативного комплекса. Мы предполагаем, что этим свойством может быть высокая процессивность или стабильность реплисомы. Как правило, включение "ошибочного" нуклеотида вызывает временное торможение репликации (см. Johnson, 1993). Высокая процессивность ДНК-полимеразы облегчала бы продолжение синтеза после включения ГАП, а снижение процессивности, наоборот, увеличивало бы вероятность диссоциации реплисомы от ДНК в тех местах, где полимеризация затрудняется вследствие включения ГАП.

Таблица 4.

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП, ЭМС и УФ-светом ревертантов Ura+ у штаммов с разными ориентациями аллелей URA3.

Аллель Мутаген1 Частота индуцированных ревертантов, xIÖ

URA3 Ориентация LR Ориентация RL

игаЗ-24 ГАП 388 ±3(6) 53 ±3(6)

ЭМС 352 ±24 (6) 325 ±24 (6)

УФ-свет 185 ± 23 (3) 123 ±20(3)

игаЗ-29 ГАП 119 ±24 (6) 1030 ±32 (6)

ЭМС 291 ±23 (6) 166 ±12 (6)

УФ-свет .,. 40 ±3(3) 46 ± 6 (3)

игаЗ-4 ГАП " 109 ± 5 (6) 23 ± 3 (6)

УФ-свет 26 ±4(3) 32 ± 5 (3)

Приведены средние значения частот индуцированных ревертантов. В скобках указано число независимых измерений. Частоты спонтанных ревертантов во всех экспериментах не превышали 2x10"8.

1 Доза ГАП составляла 100 мкг/мл. Частоты ревертантов, индуцированных ЭМС и УФ-светом измерены, как описано в разделе "Материалы й методы".

Таблица 5.

Частоты спонтанных и индуцированных ГАП реверсий мутации игаЗ-24 у лтаммов Ро1+ и ро!2-3991.

Ориентация LR_Ориентация RL

Аллель Частота Частота Частота Частота

POL2 ревертантов без обработки ГАП (х 10 8) ревертантов при дозе ГАП 100 мкг/мл (х 10"8) ревертантов без обработки ГАП (х 10"8) ревертантов при дозе ГАП 100 мкг/мл (х 10"8)

- <2 318 (213 - 339) <1 33.1 (20.2 - 56.7)

ро12-3991 <4 49.1 (24.8 - 74.7) <3 27.3 (21.2 - 37.5)

Приведеш.1 медианные значения частот ревертантов, измеренные в девяти независимых культурах. В скобках указаны 95% доверительные интервалы.

Диссоциация ДНК-полимеразы после включения ГАП, в свою очередь, увеличивала бы время, в течение которого ГАП находится на 3' конце праймера и может быть удален из ДНК одной из корректирующих ДНК-полимераз или какой-либо автономной экзонуклеазой, что снижало бы вероятность возникновения индуцированных ГАП мутаций.

ВЫВОДЫ

1. ГАП индуцирует в дрожжевом гене ЦЯАЗ транзиции ОС-»АТ и АТ-ЮС; горячими точками возникновения транзиций СС->АТ являются последовательности ДНК типа АСА и монотонные повторы О-С пар.

2. Индуцированные ГАП ошибки возникают с разной частотой при репликации лидирующей и отстающей нитей ДНК.

3. Мутации в генах ДНК-полимераз а, 5 и с подавляют индуцированный ГАП мутагенез за счет снижения частоты мутаций в "горячих точках".

4. 3'—>5' экзонуклеазы ДНК-полимераз 5 и е корректируют индуцированные ГАП ошибки при репликации разных нитей ДНК.

5. репарация неспаренных оснований, осуществляемая с участием продукта гена РМБ1, не исправляет индуцированные ГАП ошибки репликации.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Shcherbakova P. V., Pavlov Y. 1. Mutagenic specificity of the base analog 6-jV-hydroxylaminopurine in the URA3 gene of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mutagenesis, 1993, v. 8, p. 417-421.

2. Shcherbakova P., Pavlov Y. I. Base analog 6-Af-hydroxylaminopurine mutagenesis in yeast: the role of exonucleolytic proofreading. In: Abstracts of 1994 Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Washington, Seattle, USA, August 16-21, p. 197.

3. Щербакова П. В. Мутагенное действие аналогов оснований у дрожжей: роль экзонуклеазной коррекции. Материалы I съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров (ВОГИС). Саратов, 20-24 декабря 1994. Генетика, 1994, т. 30, приложение, с. 186.

4. Shcherbakova P. V., Pavlov Y. I. Base analog 6-N-hydroxylaminopurine as a tool to study DNA replication mechanism in yeast. Keystone symposium "Repair and processing of DNA damage", Taos, New Mexico, March 10-14, 1995. J. Cell. Biochem., 1995, Abstract Suppl. 21 A, p.302.

5. Shcherbakova P. V., Pavlov Y. 1. 3'—>5' exonucleases of DNA polymerases e and S correct base analog induced DNA replication errors on opposite DNA strands in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 1996, v. 142, p. 717-726.

6. Shcherbakova P. V., Noskov V. N., Pshenichnov M. R., Pavlov Y. 1. Base analog 6-W-hydroxylaminopurine mutagenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae is controlled by replicative DNA polymerases. Mutation Res., 1996, v. 369, p. 33-44.

7. Noskov V. N.. Staak K., Shcherbakova P. V., Kozmin S. G„ Negishi K., Ono B-C., Hayatsu H., Pavlov Y.l. HAM J, the gene controlling 6 -N-hydroxylaminopurine sensitivity and mutagenesis in the Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 1996,12, 17-29.

8. Shcherbakova P. V., Pavlov Y. 1. The effects of mutations in DNA polymerases a, 8, and б on DNA strand-specific replication errors. In: Abstracts of 1996 Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, University of Wisconsin, Madison, USA, August 6-11, p. 165.

9. Shcherbakova P. V., Noskov V. N., Pavlov Y. I. Mutations in the yeast DNA replisome component genes exert an antimutator effect on the base analog induced replication errors. In: Abstracts of 5th International Conference on Mechanisms of Antimutagenesis and Anticarcinogenesis, Okayama University, Okayama, Japan, December 2-6, 1996, p. 97.