Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизмов анергии на антигены микобактерий в эксперименте

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов анергии на антигены микобактерий в эксперименте"

РГО од

2 3 11Ю11 1S33

МИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КОЧУБИНСКИЙ Валентин Витальевич

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНЕРГИИ НА АНТИГЕНЫ Ш1К0БАКТЕРИЙ В

ЭКСПЕРИМЕНТЕ

03. 00. 07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

МИНСК 1993

Работа выполнена на кафедре микробиологии с вирусологией и иммунологией Минского государственного медицинского института.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Л. П. Титов Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Новиков Д. К. кандидат медицинских наук, доцент Кукулянский А. А.

Ведущая организация: Гродненский медицинский институт

Защита состоится УдуОИ9>_ 1993 г. в 1 ^

часов на заседании специализированного совета К 077.01.06 при Минском государственном медицинском институте по адресу: 220116 г. Минск, пр. Дзержинского 83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Минского медицинского института.'

Автореферат разослан ^и1»_ 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета,

кандидат медицинских наук, /

доцент ',/. ^ - ^ И. А. Крылов

, 'I * -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В области прикладной и экспериментальной иммунологии за последнее десятилетие открыты важнейшие закономерности функционирования иммунной системы, новые возможности и перспективы, намечены ' пути поиска решений в области регуляции функций Т- и В-систем лимфоцитов, их субпопуляций, факторов естественной резистентности организма и других звеньев иммунной системы, более полно раскрывающие роль иммунной системы в норме и патологии. Разработан и получил дальнейшее развитие комплексный подход к изучению функционирования иммунной системы,' как наи-.более адекватный и всеобъемлющий для оценки естественных и приобретенных механизмов иммунологической реактивности, уровней интеграции и регуляции системы ( Петров Р. В. с соав., 1984; Кузник Б. К с соав. , 1989; Лебедев А. И. , 1990; Титов JL IL , 1991 ).

Актуальность настоящего исследования обусловлена рядом факторов. Во-первых, это довольно высокая ( от 10 до 30%) частота выявления состояния анергии у лиц больных туберкулезом и инфицированных микобактериями (Верещагин В. К., 1983; Титов Л. П. , 1991; Varidevenne et al. , 1987). Во-вторых, помимо мико-бактериозов, имеется широкий спектр заболеваний бактериальной, вирусной и протозойной природы, онкозаболевания и другие, при которых отмечается формирование состояния анергии, и при которых анергия является важным звеном патогенеза ( Адамбеков Д. А. с соав. , 1989; Титов Л. II , 1989, Вахидова Г. А. с соав. , 1991; Avrion N. , 1989). Кроме того, рост уровня заболеваемости туберкулезом, отмечающийся в последнее время, также указывает на ее актуальность (согласно сведениям ВОЗ ежегодно регистрируется свыше 400 тысяч новых случаев туберкулеза и 40 тысяч случаев смерти). По словам Генерального директора ВОЗ'X. Накадзи-ма, туберкулез и в XX веке остается социально-экономической болезнью. Увеличение заболеваемости туберкулезом в странах Западной Европы в период с 1988 по 1990 годы варьирует от 3 до 33 % ( Press release WHO, 1992). Серьезной проблемой является сочетание туберкулеза и СПИДа. Формирование анергии у детей, вакцинированных ЩЖ, представляет чрезвычайно существенную

- 4 - '

проблему на пути достижения успеха в иммунопрофилактике туберкулеза во всем мире.

. Раскрытие механизмов, определяющих анергию, выявление взаимосвязей между различными звеньями системы иммунитета, участвующими в ее формировании, позволят получить важные результаты не только теоретического, но и практического . плана, разработать методы коррекции и отмены анергии, ее поддержания.

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы явилось выяснение особенностей функционирования и взаимосвязи количественных и функциональных параметров основных звеньев иммунной системы в процессе формирования анергии, вызванной введением вакцины ЕЦЖ, а также поиск путей коррекции этого состояния. Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Отработать модель формирования анергии и развития иммунного ответа на БЦЖ у мышей, генетически различающихся по чувствительности к микобактериальным антигенам.

2. Изучить в динамике развитие клеточного и гуморального иммунного ответа в процессе развития анергии и нормального иммунного ответа на вакцину БЦЖ.

3. Исследовать характер взаимосвязей между показателями различных звеньев иммунной системы при изучаемых состояниях.

' 4. Исследовать влияние теофиллина, как универсального модулятора функции иммунокомпетентных клеток и межклеточных взаимодействий, на формирование ГЗТ и анергии.

Научная новизна результатов проведенного исследования состоит в установлении межлинейных различий в уровнях функциональной активности компонентов комплемента у мышей линий СБА и гибридов Fl. Установлены различия функциональной активности компонентов комплемента при развитии состояния анергии и нормального иммунного ответа у линий животных, различающихся по чувствительности к М. bovis. Выявлено изменение уровня внутрисистемных связей белков комплемента при развитии анергии и нормального иммунного ответа.

Впервые установлена разнонаправленность, в зависимости от уровня исходной иммунореактивности, действия теофиллина при использовании его для модуляции внутрикожных реакций ГЗТ при

- 5 -

сочетанием введении с туберкулином.

Впервые установлено модулирующее действие теофиллина при развитии анергии к вакцине БЦЖ. Теофиллин, назначаемый животным системно в разные периоды формирования иммунного ответа, предупреждал развитие анергии или отменял ее, оказывал модулирующее действие на пролиферативную активность клеток селезенки и тимуса, систему комплемента

Установлено наличие корреляционных связей между величиной реакции ГЗТ на туберкулин и функциональной активностью белков системы комплемента, у животных, иммунизированных вакциной БЦЖ. Показано, что большинство компонентов классического и альтернативного путей активации ( уровень их функциональной активности) имеют отрицательные связи с величиной реакции ГЗТ.

На защиту выносятся следующие положения диссертации:

- животные, различающиеся генетически детерминированной чувствительностью к антигенам М. bovis, отличаются уровнями иммунологической реактивности как исходно, так и в процессе развития иммунного ответа на разные дозы вакцины БЦЖ;

- формирование анергии на вакцину БЦЖ сопровождается значительными изменениями состояния клеточного звена иммунитета ( снижение отвечаемости in vivo и in vitro на туберкулин), функциональной активности системы комплемента (повышением общей активности и снижением активности отдельных белков системы комплемента) и отсутствием существенных различий в функционировании гуморального звена иммунитета;

- локальное и системное применение теофиллина вызывает гак предупреждение, так и отмену состояния анергии, а также указывает на иммуномодулирующий эффект препарата при развитии нормального иммунного ответа на введение БЦЖ.

Практическая значимость работы.

Полученные данные позволяют рекомендовать теофиллин в качестве препарата для отмены состояния анерпш на микобактери-альнпе антигены при постановке проб с туберкулином с целью вы-HiiJi"Hiiii скрытой механизмами анергии сенсибилизации организма и, соответстг.мши, улучшении иммунодиагностики туберкулеза. ÍV.4H».mí.:Ч--ти-• pai.'iriG'.'TaHH'jj'o подхода М'л'лт найти широкое при-

менение в животноводстве для выявления животных (крупного и мелкого рогатого скота), инфицированных микобактериями, с лож-ноотрицательными реакциями на туберкулин. Теофиллин также может быть рекомендован для комплексной терапии больных разными формами туберкулеза с целью снижения интенсивности гиперэрги-ческих эффекторных иммунологических механизмов и, соответственно, иммунологического повреждения тканей.

Данные об участии системы комплемента в процессах формирования анергии, о взаимосвязях ее с функционированием Т-звена иммунитета, о возможности проведения иммунокоррекции используются в учебном процессе на кафедре микробиологии с иммунологией и вирусологией МГМИ и могут быть рекомендованы в качестве учебно-методического материала для студентов медицинских и биологических ВУЗов республики.

Подходы и методики определения интенсивности реакции гиперчувствительности замедленного типа, определения функциональной активности белков системы комплемента используются при проведении научно-исследовательской работы по проблемам изучения механизмов ГЗТ лабораторией иммунологии детского возраста ЦШЛ, кафедрой микробиологии, кафедрой гигиены труда, кафедрой нормальной физиологии, кафедрой радиационной медицины и экологии МГМИ.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на III международном конгрессе по ветеринарной иммунологии ( Будапешт, 1992 г.); заседании кафедры микробиологии МГМИ (1993 г.); международной конференции " Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней ( Харьков, 1993).

По результатам работы имеется 6 публикаций, из них две в зарубежной печати.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 134 страницах, включая 18 таблиц и 46 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 3-х глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 98

отечественных и 92 источника зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Работа выполнена.на мышах инбредных линий СВА; C57BL/6; гибридах-первого поколения ( CBA*C57BL/6)F1 и беспородных, полученных из питомника "Рапполово", и мышах линии BALB/c, предоставленных виварием ОХП ИБОХ АН Беларуси. Использовались животные весом 15-22 грамма обоего пола в возрасте трех месяцев. Выбор данных линий животных обусловлен их различиями в восприимчивости к инфекции, вызываемой микобактериями С Воробьев К. В. с соавт. , 1983; Авербах M. М. с соавт. , 1985; Schrier D.J. et al., 1982; Buschman E. et al., 1989).

Состояние анергии (неотвечаемости) моделировали внутривенным введением 1,0-1,5 мг живой вакцины БЦЖ ( Ставропольского и Ташкентского НПО). "Нормэргия", модель нормального иммунного ответа - животные, которым в подушечку задней лапы вводилось 0,15 мг БЦЖ, контроль - животные, которым внутривенно вводился физиологический раствор (0,5 мл). Изучение изменений показателей иммунной системы проводили на 7, 11, 15, 25, 35 и 60 сутки от момента иммунизации.

Для воспроизведения ГЗТ мышам в подушечку задней левой лапы вводили 5 ТЕ туберкулина в объеме 25 . мкл с последующей регистрацией .на 24 и 48 часов величины инфильтрата ( контролем служил размер той л® лапы, измеренный до введения). Измерение реакции проводили с помощью специально разработанного устройстве!.

Для определения функциональной активности белков системы комплемента сыворотку мышей для полного анализа разводили в соотношении 1:9 физиологическим раствором. Тестирование общей активности классического пути (СН50) проводили в системе с эритроцитами кролика в концентрации 0,75ЕЗ , сенсибилизированными крысиной антисывороткой против эритроцитов кролика ( сыворотку получали после внутривенной иммунизации крыс эритроцитами кролика по схеме, предложенной Кэботом Е. (1908)), общую активность альтернативного пути (АР50) в системе с несенсиби-лиоировашшми щюлич! ими эритроцитами в той же концентрации.

Оункциональную активность компонентов и факторов комплемента исследовали гемолитическим методом (использовались комерческие реагенты), с определением числа эффективных молекул каждого компонента ( Козлов Л. В. , 1982; Титов Л. П. с соав. , 1990). Определение- производили микрометодом в 96-луночных планшетах с измерением оптической плотности ( длина волны 414 нм) на спектрофотометре.

Определение содержания иммуноглобулинов (1ц) производили методом простой радиальной иммунодиффузии ( Мапспги Б. е1 а1. , 1965).

Определение титра специфических антител производили в реакции ПГА с эритроцитарным диагностикумом.

Реакция бластной трансформации (РБТЛ) выполнялась микрометодом с использованием мнтогенов фитогемагглютинина П и М (ФГА), конканавалина А (Кон А), липополисахарида Е. соН (ЛПС), покквида (МФ) и туберкулина (РРД)( Костромин А. П., 1980; Хоробрых В. В. с соавт. , 1983; Найт С. ,1990). .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение иммунного статуса у мышей различных линий при формировании анергии.

• Полученные данные свидетельствуют, что к 15-м суткам после введения вакцины БЦЖ регистрируются достоверные различия величины реакции ГЗТ на туберкулин ( 5 ТЕ) у животных с анергией и нормальным иммунным ответом всех использованных в эксперименте линий ( Р<0,05 и выше). Сопоставляя уровень имму-нореактивности животных с нормальным иммунным ответом с уровнем реактивности животных с анергией, установлено, что наибольший по силе ответ развивается у животных линии Вб ( ответ животных с нормэргической реакцией в 6,21 раза превосходит уровень отлета животных с анергией), далее идет линия СБА ( 3,76 раза), и наименьший ответ наблюдается у гибридов П ( 2,87 раза) (Рис 1).

Сравнивая ответ животных контрольной группы, не подвергшихся иммунизации, с ответом животных, которым внутривенно вводилась БЦЖ в дозе 1,0 мг, выявлено отсутствие достоверных различий в величине реакции ГЗТ между этими группами.

Рис. 1 Величина инфильтрата ГЗТ у животных линий СБА, С57В1/6, гибрида Fl при анергии и нормальном иммунном ответе.

Изменение выраженности реакции ГЗТ в динамике изучено на гибридах Fl. Достоверные различия ГЗТ между опытными группами регистрируются с 11 суток. У животных с нормэргией максимальный по силе ответ в реакции ГЗТ регистрируется на 25 сутки и сохраняется на высоком уровне до 60 суток. У животных с анер-. гией не отмечено достоверных изменений реакции ГЗТ на протяжении всего периода наблюдения, уровень ответа в реакции не превышал его значений у животных контрольной группы. Наиболее инертной к развитию как анергии, так и нормального иммунного ответа ( степени его проявления в реакции ГЗТ), была гетерогенная популяция животных - беспородные мыши. У них развитие нормального иммунного ответа на М. bovis при тестировании в реакции ГЗТ регистрируется только к 45-60 суткам. Большей выраженностью реактивности и менее короткими сроками формирования ГЗТ характеризовались мыши линии BALB/c и самки линии СБА. Очевидно, что выявленные различия в способности организма животных развивать иммунный ответ на введение БЦЖ объясняются, генетически предопределенным уровнем синтеза различных медиаторов иммунного ответа и особенностями активации различных субпопуляций клеток Т-хелперов, связанной со строением Н-2 комплекса. Имеются сведения, что у мышей линий В6, BALB. BIO (Н-2Ь) при ответе на микобактерии происходит преимущественная активация Thl, а у мышей линии BALB\c (H-2d) - клетки Th2, которые в меньшей степени отвечают за развитие гранулематозной реакции ( Huygen К. et al. , 1990, 1992). Наиболее чувствитель-

ными к М. bovis были мыши линии С57В1/6. У животных этой линии в 100% случаев регистрировалось как формирование анергии, так и развитие нормального иммунного ответа в более короткие сроки от момента иммунизации.

Анализ полученных данных показал отсутствие различий в содержании иммуноглобулинов G, М, А классов и титров специфических антител в группах животных с развитием нормального иммунного ответа и у животных с анергией. Это позволяет сделать предположение как о различных механизмах регуляции ГЗТ и гуморального иммунного ответа, так и, возможно, о второстепенной роли, которую играет образование специфических антител и иммуноглобулинов в защите организма против инфекции.

К моменту существенного усиления иммунного ответа в реакции ГЗТ у животных с нормальным иммунным ответом и значительного снижения данного типа ответа у животных с анергией в системе комплемента происходит ряд существенных изменений. Так, СН50 у животных линии СБА в опытной и контрольных группах достоверно не различалась (28,76+4,37 - нормальный иммунный ответ; 37,7+6,0 - анергия; 45,17+8,01 - контроль, р>0,05) (Рис 2). Наибольшее снижение активности зарегистрировано у животных с нормальным иммунным ответом. У гибрида Fl направленность изменений СН50 была такой же, как у СБА. Достоверные различия выявлены мевду уровнем СН50 у животных с анергией и нормальным иммунным ответом ( 102,3+7,19 и 69,12+6,66; р<0,001). Иная направленность изменений СН50 зарегистрирована у животных линии В6 - снижение уровня СН50 у животных с анергией в сравнении с его уровнем у животных с нормальным иммунным ответом ( 106,4+7,00 И 122,6+7,01; р<0,05).

Характер изменений АР50 диаметрально противоположен изменениям СН50. У мышей линии Б6 с нормальной реактивностью отмечено достоверное снижение АР50 ( 83,52+6,59, при ее уровне у животных с анергией 110,1+6,83; р<0,02), а для линий СБА и гибрида Fl установлена тенденция к снижению активности альтернативного пути у животных с анергией.

Представленные данные позволяют предположить различные механизмы функционирования основных путей активации системы комплемента у мышей генетически разных линий при анергии и формировании нормального иммунного ответа. У животных линий СБА, С57Б1/6 и Fl имеются различия в активности классического

166 149 133 116

«

. 99.8

С 83.2 Н

566.5

1

49.9 33.2 16.6 0

E3"anef>rn»

П"НОРНЭРГМЯ

сея

C5VBL/6 линия животных

СЭ-КОИТРОЛЬ

i\\#f ш

Рис 2. Изменение общей активности классического пути активации комплемента у животных разных линий при анергии и нормальном иммунном ответа на БЦЖ.

пути: более чувствительные к М. bovis животные линии Б6 отвечают малозначительными изменениями активности классического пути, а линии, более устойчивые (СБА, а в особенности гибрид Fl), более существенным изменением активности данного пути. Направленность изменений активности компонентов классического пути у гибрида Fl и линии Вб подобна и отличается от направленности изменений у мышей линии СБА. Для мышей Вб и Fl характерно снижение функциональной активности большинства компонентов в сравнении с данными группы контроля и снижение по отношению к их уровню у животных с нормальным иммунным ответом, достоверное для Вб по Clq, С1 и С5 компонентам ( 2,81+0,32 и 5,29+1,22, р<0,05; 2,56+0,21 И 5,92+1,26, р<0,03; 2,58+0,27 И 4,78+1,04, р<0,01) и для Fl по Clq, С1, С4, С5 компонентам ( 1,3010,12 И 1,85+0,21, р<0,05; 1,48+0,17 и 2,69+0,44, р<0,03; 0,99+0,09 и 1,34+0,17, р<0,05; 1,12+0,11 И 1,97+0,30, р<0,01). При этом обращает на себя внимание значительное (в 4 раза) снижение функциональной активности Clq субкомпонента как у животных с нормальным иммунным ответом, так и, еще в большей мере, у животных с анергией. Изменение уровня активности Clq, что, возможно, касается и других компонентов, при данных процессах можно объяснить рядом причин: 1) торможением или блокированием биосинтеза, вызванным специфическим действием на клетки-продуценты непосредственно микобактерий или продуктов их распада (_Вахидова Г. А. с соав. , 1988); 2) фиксацией Clq иммунными комплексами; 3) снижением диссоциации Clq из состава

иммунных комплексов СЗб фрагментом ввиду исходно низкого его уровня в сыворотке мышей ( Тарханов И. А. с соав. , 1988; Вахи-дова Г. А. с соав., 1988); 4) нарушением белково-биосинтети-ческих процессов в клетках и органах, ответственных за биосинтез компонентов, при повреждении их в процессе развития анергии. Кроме того, возможны и другие механизмы, в том числе, им-муносупрессия Т-клетками, опосредовано действующими на экспрессию генов и межклеточную кооперацию.

У животных линии СБА направленность изменений активности компонентов иная. Отмечено, что уровень функциональной активности С1 компонента выше у животных с анергией (12,39+1,95, р<0,02). Сопоставляя уровень СН50 и активности компонентов классического пути у животных линии СБА, можно отметить адекватную реакцию у обеих опытных групп: животные, в большей или меньшей степени подвергшиеся контакту с антигеном, прореагировали значительным увеличением активности системы комплемента, причем в большей степени животные с нормальным иммунным ответом. Активность факторов альтернативного пути и АР50 также согласуются. Это также можно рассматривать как результат влияния факторов резистентности. У животных выявлено более интенсивное изменение активности факторов В и Л, нежели С1 компонента. В отношении линии В6 следует отметить соответствие уровней активности компонентов и СН50 в классическом пути ( более высокий уровень у животных с нормальным иммунным ответом) и отсутствие такового между активностью факторов и АР50 в альтернативном пути.

Анализируя изменения активности системы комплемента у животных этих двух линий при анергии, можно заключить, что альтернативный путь активации, как наиболее эволюционно приспособленный для взаимодействия с широким спектром бактериальных антигенов, изменяется в большей степени, а компенсаторные механизмы, реализуемые, очевидно, на уровне регуляции активности генов, более успешно справляются со своей задачей у резистентных животных и менее эффективны у чувствительных.

Система комплемента у гибридов первого поколения этих линий реагирует по-иному. Направленность изменений альтернативного пути соответствует таковой линии СБА, также отмечается согласованность в изменении уровня активности факторов и АР50. В классическом пути зафиксирована разнонаправленность измене-

ний активности отдельных компонентов ( снижен уровень всех компонентов у животных с анергией ) и СН50 ( повышена по сравнению с контролем и уровнем у животных с нормальным иммунным ответом). Описанные изменения свидетельствуют о большей степени нарушений в функционировании классического пути активации комплемента, что также подтверждается полным отсутствием корреляционных связей мевду компонентами и СН50 и отличным характером связей между компонентами классического пути и общей,активностью альтернативного.

Таким образом, нами установлены существенные изменения функциональной активности белков системы комплемента при развитии состояния анергий и нормального иммунного ответа. Животные с различной чувствительностью к М. bovis отличаются не только исходно разным уровнем активности белков комплемента, но и различными вариантами реагирования системы комплемента в ответ на введение вакцины БЦЖ. Наблюдение в динамике выявило стабильное снижение уровня активности компонентов классического и альтернативного путей активации и АР50 у животных с анер-. гией. СН50, достигая существенного уровня различий в начальные сроки после иммунизации ( снижена у животных с нормальным иммунным ответом и повышена при анергии), выравнивается к 35 суткам. Значительным изменениям подвергаются внутрисистемные связи активности белков комплемента. Для животных с нормальным' развитием иммунного ответа характерно постепенное нарастание напряженности взаимосвязей внутри системы с последующим ( к 35-м суткам) возвращением их к исходному уровню. В процессе формирования анергии отмечена иная динамика: количество связей резко нарастает в начальный период развития, а затем имеет место значительное снижение их числа.'

Все вышеизложенное позволяет предположить, что белки системы комплемента, равно как и их продукты, образующиеся на промежуточных стадиях активации, оказывают существенное влияние на развитие как нормального иммунного ответа, так и состояния анергии, а также то, что функционирование системы комплемента в значительной мере находится под контролем клеток и органов иммунной системы, ответственных за развитие этих процессов.

Корреляционный анализ всей совокупности экспериментальных данных показал наличие достоверных отрицательных связей вели-

чины реакции ГЗТ с функциональной активностью С1с] компонента ( г=-0,134; р<0,001), С4 компонента (г=-0. 077; р<0,05), фактора В (г=-0,167; р<0,0001), фактора Б (г=-0,130; р<0,002). Значительные различия выявлены при сопоставлении результатов корреляционного анализа ( ранговая корреляция Кендала) между группами животных с анергией и нормальным иммунным ответом по всем линиям животных. При нормальном иммунном ответе между величиной реакции ГЗТ и активностью белков системы комплемента регистрируется положительная направленность связей, достоверная для С1 (г=+0,129; р<0,04), С2 (г=+0,122; р<0,05), С5 (г=+0,125; р<0,05) компонентов, В (г=+0,1б1; р<0,01), Б (г=+0,134; р<0,03) факторов и АР50 (г«+0,128; р<0,05). При развитии анергии знак связи полностью меняется на отрицательный, возрастает количество и сила связи в сравнении с результатами анализа всей совокупности данных. Кроме связей с С1ч, С4, В и Э компонентами, возникают дополнительно достоверные связи с активностью С1 (г—0,121; р<0,04), С2 (г—0,206; р<0,001), СЗ (г—0,28; р<0,001), С5 (г=-0,1396; р<0,016) компонентов, увеличивается сила взаимосвязи с В (г=-0,394; р<0,0001) и 0 (г=-0,244; р<0,0001) факторами, появляется связь с АР50 (г=-0,227; р<0,001).

Множественный регрессионный анализ также показал высокий уровень зависимости величины реакции гиперчувствительности замедленного типа от активности белков системы комплемента обоих путей активации (Р-28,047; р<0,0001). Вклад каждого компонента распределился следующим образом: отрицательное влияние на величину реакции ГЗТ оказывают компоненты С^, С4 (Р=3,00; р<0,004), СЗ, СН50, Б, АР50; положительное компоненты С2, С5 (Р-3,59; р<0,003), фактор В ( Р=130,75; р<0,00001). При обработке данных с помощью многофакторного анализа вариант было установлено влияние интенсивности процессов ГЗТ на уровень функциональной активности компонентов комплемента. Показано: отсутствие достоверно значимого эффекта Г^Т на активность компонентов С1, П4, С2, СЗ, С5, АР50; наличие эффекта в отношении активности С1д субкомпонента, фактора В ( Р=5,28; р<0,022), Ю (Р=8,58; р<0,0037), СН50 (Р=11,21; р<0,009). Таким образом, приведенные данные показывают наличие тесной взаимосвязи между клеточным звеном иммунитета и одной из наиболее важных систем неспецифической защиты организма - системой белков комплемента.

- 15 -

II. Иммунокоррекция состояния анергии. ■

Эффективное применение иммунокорригирующей терапии возможно при использовании в практике препаратов, влияющих на ключевые регуляторные биохимические процессы в клетке. С целью коррекции состояния анергии нами в качестве иммуномодулятора был использован один из представителей метилксантинов - теофиллин (1,3-диметилксантин).

В исследовании использовалось локальное и системное назначение препарата. В случае местного применения теофиллин ( 0,036% раствор в объеме 0,0125 мл) вводился совместно со специфическим антигеном РРБ (5 ТЕ), при системном - вводился внутривенно в различные сроки формирования иммунного ответа.

Изучение местного влияния теофиллина проводилось в трех группах животных: 1 - анергия; 2 - нормальный иммунный ответ; 3 - контроль. На 15 сутки после иммунизации животным всех групп под плюсневый апоневроз задней лапы вводили: в левую -туберкулин 5 ТЕ, в правую - туберкулин в смеси с теофиллином в равных объемах. Измерение реакции ГЗТ проводилось через 24,.48 и 72 часа.

У животных в состоянии анергии отмечено увеличение размера инфильтрата реакции ГЗТ в пробе с теофиллином (р<0,01), в то . время как введение только туберкулина не вызвало реакции у тех же животных (р>0,05 по сравнению с контролем). У животных группы контроля достоверные различия величины ГЗТ между пробами на обеих лапах отсутствуют, (р>0,05). Сопоставляя данные этих двух групп животных, видно, что введение теофиллина привело к отмене анергии ( по реакции ГЗТ) у животных опытной группы. Эти данные совпадают с результатами, полученными при использовании теофиллина у больных туберкулезом с отрицательной реакцией Манту ( Титов Л. П. , 1989, 1992).

Обращают на себя внимание результаты реакции ГЗТ в группе животных с нормальным иммунным ответом. У мышей этой группы отмечена противоположная направленность ответа: теофиллин, введенный совместно с туберкулином, вызвал достоверное снижение ответа по сравнению с реакцией этих же животных на туберкулин ( р<0,04). Это позволяет сделать предположение о том, что теофиллин воздействует не на какую-то определенную популяцию клеток, а его эффект, вероятно, направлен на те клетки,

преимущественная активация или функциональная активность которых преобладает в данный период в месте развития процесса: в случае развития анергии в большей степени проявляют свою активность клетки супрёссорного ряда, при развитии нормального ответа на введение вакцины ВЦЖ преимущественно активируются клетки, ответственные за развитие гранулематозной реакции.

Экспериментальное изучение влияния теофиллина на формирование состояния анергии при системном введении выполнено на животных с генетически обусловленной чувствительностью к М. bovis - мышах линии C57BL/6. Теофиллин вводился внутривенно в объеме 0,25 мл из расчета 40 мг/кг веса животного, ежедневно в течении 6 дней в различные сроки по отношению к введению ВЦЖ: группа N3 -• за 6 дней до инъекции БЦЖ; группа N4 - одновременно с иммунизацией; группа N5 - спустя 9 дней после иммунизации БЦЖ Контролем служили группы животных с анергией'( гр N1) и с нормальным иммунным ответом ( гр N2).

При использовании данных схем иммунокоррекции нами ставилась задача выявления влияния теофиллина на различные 'стадии формирования иммунного ответа: экспрессии, индукции и пролиферации.

У животных опытных групп N4 и-N5 с состоянием анергии и теофиллиновой коррекцией отмечено изменение реактивности: по уровню реакции ГЗТ нет различий в сравнении с группой животных с нормальным иммунным ответом ( р>0,05 для rpN2, N4, N5) . Наибольший по силе выраженности ответ развивается у животных, получавших теофиллин до иммунизации БЦЖ ( р<0,05 по отношению К гр N2) (Рис. 3).

Введение теофиллина не изменило уровня продукции антител к М. tuberculosis у животных всех опытных групп. Концентрация IgQ также не изменилась. Но среди групп животных, получавших препарат в различные периоды, обнаружены различия в его содержании в сыворотке. Так, наибольшее снижение концентрации Ig В отмечено у животных гр N3 (0,955+0,05 мг/мл). В группах животных, получивших теофиллин после иммунизации, концентрация Ig G достоверно выше (гр N4 1,37+0,16; гр N5 1,48+0,12 р<0,05). Отмечено увеличение концентрации Ig М в сыворотке животных всех групп, получивших теофиллин, по сравнению с группами животных с анергией и нормальным иммунным ответом (

¡18.9

N 15.1 113.2 ¡11.3 ¡9.47

ь7-57

15.68 р

аЗ.78 II.89

И-НСГМ35ГИЯ

И-ГР з

СЗ-гр 4

Ж.

Э'зчрргмя

Ш-гр 5

\ \ \\

К \\\4

ж

24 часа 48 часов

часу от момента введения тчЕеркчднн

Рис 3. Величина реакции ГЗТ у животных линии В6 при кор- • рекции теофиллином.

р<0,05). Различий в содержании М между группами животных, получавших теофиллин в разные сроки иммунного ответа, не выявлено.

В зависимости от периода проведения иммунокоррекции, раз-, личные изменения активности зафиксированы и в системе комплемента. АР50 снижена в 2 и более раз в группах животных с коррекцией по сравнению с АР50 у животных с анергией ( р<0,001 и менее), независимо от срока ее проведения. . Наиболее высокий уровень активности факторов В и Р отмечен в группе животных с иммунокоррекцией в стадию индукции иммунного ответа ( В -0,143+0.04; 0 - 0,146+0,03). У животных, получавших теофиллин до иммунизации и в продуктивную фазу иммунного ответа, уровень активности фактора В незначительно снижен (в большей степени у животных гр N5). Активность фактора Б, так же как и фактора В, не различалась в группах животных с анергией и нормальным иммунным ответом, но обнаружены различия в активности фактора О в группах животных с иммунокоррекцией в зависимости от времени ее проведения: до иммунизации - 0,059+0,01; одновременно с иммунизацией - 0,146+0,03; в продуктивную фазу - 0,07+0,01.

Наиболее высокий уровень СН50 зарегистрирован у животных с нормальным иммунным ответом (122,6+7,01). Коррекция, проведенная после инфицирования, не изменила уровня активности этого пути ( анергия - 106,4+7,00; гр N4 - 101,5+13,9; гр N5 -114,1+10,6; р>0,05). В группе животных, получавших теофиллин до введения БЦЖ, СН50 достоверно снижена ( 49,48+8,49; р< 0,001). Самая низкая активность компонентов комплемента от-

мечена у животных при проведении коррекции до иммунизации (уровень активности компонентов достоверно снижен по сравнению с активностью их в группах животных с анергией, с нормальным иммунным ответом, и с группой животных, которым проводили коррекцию в продуктивную фазу иммунного ответа). Значения функциональной активности компонентов классического пути у животных с анергией и животных при коррекции в индуктивную фазу иммунного ответа не различаются. Отсутствуют также различия в уровнях активности компонентов в группе животных с нормальным иммунным ответом и в группе животных, которым коррекцию осуществляли в продуктивную фазу иммунного ответа.

Рис 4. Пролиферативный ответ клеток селезенки на митогены и. туберкулин у мышей линии Вб при коррекции.

Проводимая иммунокоррекция изменяла пролиферативную активность клеток селезенки и тимуса в ответ на митогены. При проведении коррекции независимо от времени введения теофиллина зарегистрировано достоверное ( в два и более раз) снижение пролиферативного ответа (ИО, индекс стимуляции) на Кон А ( гр. 3 - 2,00+0,46; гр. 4 - 1,40+0,50; гр. 5 - 1,46+0,20; р<0,05) (Рис. 4). Изменения пролиферативного ответа на митогены МФ и ЛПС имеют одинаковую направленность и силу выраженности: наибольшее значение ИС отмечено в группе животных с нормальным иммунным ответом, ИС снижен во всех группах с коррекцией и у животных с анергией. Пролиферативный ответ спленоцитов на туберкулин во всех группах с коррекцией и у вакцинированных животных достоверно превышает значения ИС в группе животных с анергией (р<0,05). Наибольшая величина ИС отмочена ь группе животных, которым теофиллин вводили дс иммунизации (р<0,004 по

- 19 - /

сравнению с группой животных с .анергией). Различия в пролифе-ративном ответе тимоцитов на неспецифические митогены менее выражены. ИС тимоцитов в ответе на туберкулин был равен в группах животных с нормальным иммунным ответом и с коррекцией до и сразу после иммунизации и снижен (р<0,03).в группах животных с анергией и при проведении коррекции в пролиферативную фазу ответа.

Оценку изменений ответа в PBTJI на специфический антиген 1 туберкулин, и влияние на него теофиллина в системе in vitro мы проводили с использованием анализа вариант. В ходе анализа выявлено отсутствие влияния фактора индивидуальной иммунореак-тивности (что позволяет судить о генетической однородности животных, использованных для исследования); незначимым оказался и фактор дозы специфического антигена (при использовании доз 2 и 5 мкг/мл туберкулина); значительное влияние на пролифератив-ный ответ оказало состояние животных ( анергия, нормэргия, коррекция) (F=5,424); наиболее значимым было влияние дозы теофиллина ( 5, 15, 30 мкг/мл) (F=74,279).

Наименьший ИС спленоцитов зарегистрирован у животных с анергией - 1,44+0,10, в то время как в группе вакцинированных животных он равен 2,38+0,2, ИС в группе с коррекцией в пролиферативную фазу - 2,02+0,3, в группах с иммунокоррекцией до и сразу после иммунизации он составил 2,81+0,33 и 2,42+0,23, соответственно. Добавление в культуру спленоцитов теофиллина оказывало супрессивное действие: ИС в пробах без теофиллина равен 2,19+0,11; при дозах 5, 15, 30 - 1,11+0,04; 1,13+0,04 и 0,98+0,03, соответственно.

Почти аналогичные данные зафиксированы в изменении ИС культуры тимоцитов: 1,05+0,11; 1,40+0,13; 1,39+0,09; 1,27+ 0,13; 1,07+0,11, соответственно, для групп 1- 5. Внесение теофиллина в культуру тимоцитов также вызывало снижение ответа: на дозы 5, 15, 30 мкг/мл - 0,63+0,09; 0,88+0,08; 0,77+0,06, соответственно, при ИС в контроле - 1,24+0,05.

■ Данные, полученные в результате эксперимента по использованию в качестве иммуномодулятора теофиллина, показывают, что препарат проявляет свое действие как на местном, так и на системном уровне. Постановка кожных проб с использованием комбинации антиген( митоген)+теофиллин позволяет путем модуляции ответа в коже вьивить состояние сенсибилизации у организ-

мов с анергией и в определенной степени провести дифференциацию механизмов формирования патологического процесса во всем организме в целом. Системное назначение теофиллина в различные стадии развития иммунного ответа предотвращает формирование в организме мышей состояния анергии, индуцированное введением вакцины БЦЖ.

ВЫВОДЫ.

1. Введение животным высокой дозы антигенов микобактерий (живая вакцина БЦЖ) индуцирует формирование состояния анергии, характеризующееся резким угнетением интенсивности реакции ГЗТ ( неотвечаемостью), снижением лролиферативной активности клеток селезенки и тимуса в ответ на туберкулин.

2. У линий мышей, различающихся чувствительностью к М. bovis, отмечен исходно разный уровень активности белков системы комплемента Чувствительные к М. bovis мыши линии Вб характеризуются высокой общей активностью классического пути активации комплемента и меньшим содержанием гемолитически активных молекул компонентов по сравнению с линией СБА, устойчивой к М. bovis.

3. Выявлены разнонаправленные изменения функциональной активности белков системы комплемента в процессе развития нормального иммунного ответа и анергии у животных с разным уровнем чувствительности к микобактериальным антигенам.

4. Состояние анергии характеризуется повышением общей активности классического пути активации, снижением числа функционально активных молекул компонентов классического пути.

5. Состояния нормального иммунного ответа и анергии различаются уровнем и характером внутрисистемных взаимосвязей активности компонентов комплемента, что, вероятно, указывает на значимую роль системы комплемента в развитии изучаемых иммунологических процессов.

6. Установлено наличие взаимного влияния между функциональной активностью белков системы комплемента и процессами, опосредующими развитие реакций гиперчувствительности замедленного типа при ответе организма на введение вакцины БЦЖ.

7. Изменение иммунореактивности организма в процессе формирования анергии к микобактериальным антигенам, вызванной введением большой дозы БЦЖ, внргикается л преимущесты'нной ак-

- 21 -

тивации супрессорных механизмов.

8. Локальная иммунокоррекция теофиллином , при одновременной постановке внутрикожных проб с туберкулином и теофиллином, позволяет выявить скрытую сенсибилизацию организма мико-бактериальными антигенами, что может быть использовано в целях иммунодиагностики при микобактериозах и других хронических инфекциях и инвазиях, сопровождающихся снижением отвечаемости организма.

9. Системная иммунокоррекция теофиллином, осуществляемая в различные фазы формирования анергии, позволяет скорректировать иммунологическую реактивность и, тем самым, повысить от-вечаемость организма на антигены микобактерий. Назначение препарата в дозе 40 мг/кг веса животного в течение недели отменяет развитие анергии на микобактериальные антигены.

10. Иммунокоррекция теофиллином иммуносупрессированных животных оказывает существенное влияние на функционирование системы комплемента ( выявлено значительное снижение общей активности альтернативного пути активации, количества функционально активных молекул факторов В и 0 при введении теофиллина до инфицирования мышей и в продуктивную фазу иммунного ответа; снижение активности компонентов классического пути при введении его до инфицирования и повышение их активности при проведении коррекции в продуктивную фазу ответа).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ.

Разработанный методический подход к формированию состояния анергии на микобактериальные антигены ( вакцина БЦЖ) в эксперименте может быть рекомендован для использования в научно-исследовательской практике.

С целью повышения диагностической значимости внутрикожных тестов рекомендуется дополнительная постановка внутрикожных проб туберкулин+теофиллин, в случаях сомнительных или отрицательных результатов реакции Манту у больных туберкулезом людей и животных, с целью выявления инфицирования и сенсибилизации организма, обусловленной механизмами анергии.

В целях иммунокоррекции состояния анергии больных туберкулезом и другими хроническими инфекциями предлагается использование в клинике теофиллина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Кочубинский В. В. , Титов Л. П. Устройство для измерения результатов ГЗТ в эксперименте // Тез. докладов I иммунологического съезда Белоруссии "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии". - Минск. - 1990. - С. 32.

2. Кочубинский В. В. , Стрельцова М. А. Оценка Т-системы иммунитета экспериментальных животных in vivo // Тез. докладов I иммунологического съезда Белоруссии "Экологические проблемы иммунологии и аллергологии". -. Минск. - 1990. - С. 33.

3. Титов Л. П. , Батян А. Е , Кочубинский В. В. , Заяц Р. Г. Совершенствование методов кожного тестирования сенсибилизации организма к бактериальным и другим аллергенам // Тез. докл. Международной конференции " Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней". - Харьков, - 1993.

4. Кочубинский R Е , Титов Л. П. Использование теофиллина как иммуномодулятора при анергии на микобактериальные антигены // Тез. докл. Международной конференции " Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней". - Харьков, - 1993.

5. Titov L. Р., Kochubinsky V. V. Study the delayed type hypersensitivity reaction and complement system of immuned by Mycobacterium bovis(BCQ) mice // 3rd International Veterirary Immunology Symposium. Budapest, - 1992, August 17-20, - P. 80.

6. Kochubinsky V. V., Titov L. P. The abolition of the anergy to antigens of mycobacteria by theophylline in mice immuned by vaccina BCG // First Asian Congress of Allergology and Immunology. Bangkok, - Thailand. - November 22-26, - 1992.

Подписано в печать 25.0S.93r. Формат 60x81/16. Объем I печ.л. Заказ 105, тираж 100. Бесплатно. ,

Отпечатано ни ротапринте МГМИ. г.Минск, ул.Ленинградская, 6.