Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма формирования везикулярных структур при реконструкции мембран

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма формирования везикулярных структур при реконструкции мембран"

ОА

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ♦ЮНКО-ТЕХНИЧЕСКИ!! ИНСТИТУТ

На правах рукописи

УДК г>77 . 352 . 2

ПОЛОЗОВА Алла Ивановка

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ФОРМИРОВАНИЯ ВЕЗИКУЛЯРНЫХ СТРУКТУР ПРИ РЕКОНСТРУКЦИИ МЕМБРАН

оз.оо.ог-Биофиэика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

\

»

Москва

1993

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Б.А.Овчинникова Российской академии наук

Научный руководитель:

кандидат химических наук Я.И.Барсуков

Официальные оппонент:

доктор Физико-математических наук А.Н.Кузнецов кандидат биологических наук Г.В.Архмпова

Ведущая1 организация: Московский институт тонкой химической технологии им. М'.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится Q июня 1993 года в 15 часов на заседании-Специализированного ученого совета k-063.91.10 при Московском- оизико-техническом институте по адресу, нпоо, Мо с ко вс*ая> область, г-Долгопрудный, Институтский пер., >, МФТИ, aya- 1&Г.К.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МФТИ.

Автореферат разослан "8 " мая 1993 года.

Учения секретарь Специализированного ученого сов кандидат физико-математических

I.ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность. Успехи в понимании структуры и функция

биологических мембран, в значительной мере были обусловлены возможностью их солюбилиэации детергентами, что позволяет выделять в индивидуальном состоянии нерастворимые в воде компоненты мембран и переводить их в термодинамически стабильные мииеллярные растворы с целью дальнейшего изучения с помоиыо мощного арсенала разнообразных физико-химических методов, в настоящее время разработан также ряд эффективных методов реконструкции мембран. в основе которых лежит способность мембранных компонентов к самосборке при удалении детергента из исходных мицеллярных солюоилизатов. Но несмотря на широкое использование этих подходов, механизм процессов, протекающих при солюбилиэации и самосборке мембран, во многом еще не ясен. Поэтому в настоящее время активно проводятся работы по выяснению различных аспектов взаимодействия детергентов с фосфолипидамй, являющимися одним из важнейших структурных элементов биологических мембран. Особый интерес в этом отношении представляют смешанные системы, состоящие иэ фосфолипидов к солеи желчных кислот, поскольку последние чаче всего применяются в качестве Детергентов при солюбилиэации и реконструкции мембран.

Исследования, проведенные в этой области, выявили сложную картину липид-детергентных взаимодействия, обусловленную возможностью формирования разнообразных молекулярных агрегатов, различающихся по своей структуре и морфологии. Хотя в настоящее время основные типы надмолекулярных структур. образуемых липидами и детергентами уже охарактеризованы, по прежнему остается открыть« основной вопрос о механизме их взаимопревращения и, в частности, о том, каким образом

мицеллярные структуры трансформируются в замкнутые мембранные ■ везикулы, представляющие для исследователей повышенный интерес как конечный продукт в процессе реконструкции мембран.

Цель работы. Настоящая работа посвящена изучению процессов

трансформации мицеллы ламеллярные везикулы на примере смешанных систем, состоящих из насыщенных фосфатидилхолиноя (дипальмитоил- и димиристоилфосфатидилхолина) и холата. натрия.

Выбор этих систем в качестве объекта исследований основан на обнаруженных нами особенностях их термотропного поведения, связанных с переходом мицелл в ламеллярные структуры и позволяющих охарактеризовать различные состояния смешанных систем на отдельных этапах трансформации.

Основными задачами представленной работы являлись детальное описание свойств и поведения изучаемых липид-детергентных систем с помощью комплекса физико химических методов и рассмотрение на основе полученных данных возможных механизмов трансформации мицелл в везикулярный мембранные структуры.

Научная новизна и практическая ценность_работн

Методами турбидиметрии. дифференциальной сканирующей калориметрии, электронной микроскопии и ядерного магнитного резонанса охарактеризованы смешанные системы, образуемые насыщенными фосфатидилхолинами и холатом натрия. Обнаружены новые, ранее не описанные особенности термотропного поведения этих смешанных систем.

Впервые показано, что в определенных условиях в таких смешанных системах под воздействием температуры может происходить обратимая трансформация мицеллы - ламеллярные структуры без изменения соотношения детергент/липид в инкубационной среде.

. . ь

Изучено влияние фазового перехода гель жидкии кристалл на агрегацию молекул в янпид-детергентных системах. Показано, что именно изменение фазового состояния липида индуцирует превращение мицелл 8 ламеллярные структуры.

Обратимость процессов, протекающих в изученных смешанных системах, а также возможность Формирования различных переходных стуктур на отдельных этапах трансформации делают эти системы исключительно удобной моделью для изучения механизмов самосборки мембран при реконструкции.

Показано, что гермоиндуцированная трансформация мицелл в ламеллярные структуры может быть использована в качестве нового нетода получения замкнутых мембранных везикул, в тем числе и для реконструкции мембранных белхов. Изучение свойств смешанных систем и особенностей взаимолеиствия фосфолипидов с солями желчных кислот имеет важное значение и для понимания ряда Физиологических процессов, связанных с образованием и секрецией желчи в организме.

• Апробация. Материалы диссертации были доложены на

I Совегско Японском симпозиуме по структуре и функциям рецепторов • (Пущино, 17-22 июля 1 вч г.); Международной конференции по структуре и 'функциям биологических мембран (Индия, Калькутта, :<к ноября и декабря г>8'> г.); vi Советско-Швейцарском симпозиуме по структуре и функциям биологических мембран (Швейцария, Нешатель, )1 11 сентября '.чч\> г.)

Публикации- Основные материалы работы изложены в 1

печатных работах.

Структура . диссертации. Диссертация состоит из введения,

обзора литературы; экспериментальной части. результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы.

II. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ В обзоре литературы рассмотрены основные принципы самоассоциации амфифильных молекул и современные представления о повелении смешанных систем, состоящих иэ липидов и детергентов. Анализ существующих представления о структуре смешанных мицелл и теоретических моделей трансформации мицелл в ламеллярные структуры показывает, что удовлетворительной теории, описывающей механизм этих трансформация, в настоящее время не существует. Сложный характер липид-детергентных взаимодействия и многообразие формирующихся переходных структур значительно затрудняют исследования в этой области. Поэтому многие свойства смешанных систем и особенности их поведения пока еще недостаточно изучены.

Раздел "Результаты" посвящен изложению исследования поведения смешанных систем, состоящих из холата натрия и насыщенных фосфолипидов (димиристоил- и дипальмитоил-фрсфатидилхолина), методами турбидиметрии, дифференциальной сканирующей калориметрии, электронной микроскопии и ЯМ?. Показано, что при определенных условиях в таких смешанных системах происходят глобальные структурные перестройки, обусловленные термоиндуцированной трансформацией мицелл в ламеллярные структуры разного типа. С целью детального изучения этого нового, ранее не описанного явления, в ходе работы решались следующие задачи: 1) выявить те смешанные системы, которые способны к трансформациям такого рода; 2) установить Факторы, определяющие протекание структурных перестроек; л) охарактеризовать типы структур, формирующихся при температурных воздеяствиях на смешанные системы: 3) выяснить возможность использования ' термоиндуцированного перехода смешанных мицелл в ламеллярные! структуры для реконструкции

• ч .';■»' , * i .i i .» . ■ ■ ■ .

мембран, в том числе и с участием мембранных белков: 1) на основе полученных экспериментальных данных построить теоретическую модель, описывающую механизм трансформации мицелл в ламеллярные структуры.

Турбидиметрические исследования

Метод турбидиметрии широко используется для изучения процессов агрегации молекул в липид-детергентных системах.- При избытке детергента такие системы находятся в мицеллярном состоянии с частицами малых размеров, которые слабо рассеивают свет в видимой области, и поэтому выглядят практически прозрачными. Переход мицеллярных структур в ламеллярные сопровождается резким увеличением светорассеяния за счет образования частиц более крупных размеров.

При постоянной температуре поведение изученных нами смешанных систем, состоящих из насыщенных фосфатидилхолинов и холата натрия, ничем не отличается от поведения других липид-детергентных систем. Так. при уменьшении концентрации детергента наблюдается увеличение мутности в области, где происходит переход мицеллярных структур в ламеллярные. Однако, е определенном и достаточно узком диапазоне соотношений детергент/липид мицёлдярнье системы начинают вести себя неожиданным образом, резко меняя свою мутность даже при сравнительно небольшом повышений'температуры.

На рис.1 показаны типичные изменения светорассеяния образцов в зависимости от температуры. Характерная особенность большинства полученных кривых - скачкообразное возрастание светорассеяния при повышении температуры- образца всего на 1-2 'С, при-этом" оптическая плотность, как правило, достигает значений, соответствующих типично ламеллярным структурам.

I 4 50 ¡450

т,<с

рис.1 Оптическая плотность (1« а о) смесей холата натрия с ДПФХ (а) и ДМФХ (в) в зависимости от температуры. Скорость изменения температуры о. 33 К/мин. Концентрация ДПФХ и ДМФХ -20 мМ. Концентрация ХН: а. 1 - 7 мМ, 2 - 9 мМ, 3-10 мМ. 1 11 мМ. 12 мН; в. 1 - 4 мМ. 2 - Ь мМ, 3-6 мМмМ - 9 мМ.

5 - 11 мМ.

В то же время, светорассеяние мицеллярных систем практически не зависит от температуры (рис.1, кривые 5), а для заведомо ламеллярных структур нас..«дается небольшое уменьшение светорассеяния з области фазового перехода гель - жидкий кристалл (рис.1, кривые I).

Скачкообразные изменения мутности образцов обратимы-, -».при понижении температуры их светорассеяние вновь возвращается к значениям, характерным для исходных мицеллярных систем. Кривые,-отвечающие нагреванию и охлаждению образца, полностью совпадают, если скорость изменения температуры не превышает 0,3.1 °С/мин. Это означает, что в указанных условиях такие

системы находятся в квазистационарном состоянии и успевают , ; : . прияти в равновесие в процессе температурного сканирования.

ВИД турбид«метрических кривых и их положение вдоль оси температур зависят от концентрации детергента в смеси. При . - медом содержании холата натрия они имеют плавный характер (см. кривые 2 на рис*1) и растянуты по температурной вкале. При увеличении концентрации детергента изменения мутности Происходят более резкой в меньшем температурном диапазоне. При этом наблюдается поступательное смещение всех кривых в область боиее высоких температур (см. кривые з и 4 на рис.1). В случае ДПФХ все полученные кривые попадают в интервал за-п «С. близкий к температуре основного Фазового перехода гель - жидкий кристалл липида (41.5 «С). В то же время для смесей ДМФХ -холат натрия лишь кривые, отвечающие малому содержанию детергрйта <а и з на рис.16), находятся в области фазового перехода этого липида (23,5 0С>. тогда хак остальные сильно смещены в сторону Солее высоких температур, в некоторых случаях превышающих температуру Фазового перехода ДМФХ почти на 20°С-

Таким образом, турОидиме-трические измерения показали, что в определенном диапазоне соотношения детергент/липид в смешанных системах, состоящих из насыщенных фосфатидилхолинов и холата натрия, увеличение температуры индуцирует значительные изменения их светорассеяния, по-видимому. связанные с глобальными Структурными перестройками и изменением характера агрегации молекул между собой. Поскольку метод турбидиметрии не дает прямой структурной информации, она была получена при помощи лазерной корреляционой спектроскопии и электронной микроскопии.

Лазерная корреляционная. спектроскопия..и электронная микроскопия

По данным кваэиупругого лазерного светорассеяния образец, состоящий из смеси 20 мМ ДПФХ и ю мМ холата натрия, при 20«С содержит частицы со средним диаметром около ю нм, что соответствует по порядку величины размеру смешанных мицелл. После нагревания до 45»С тот же образец содержит две популяции более крупных частиц, имеющих размеры 70 км <Я5%) и 250 нм (15%).

По данным электронной микроскопии тот же образец, негативно контрастированныя при 20°С, дает неструктурированную \артину. характерную для типично мицеллярных систем, на которой не просматриваются какие-либо ламеллярные образования. В то же время на микрофотографиях образца, нагретого до 45»С, ясно видны такие структуры, ограниченные замкнутым липидным бислоем, причем их размеры соответствуют данным, полученным при помощи лазерной корреляционной спектроскопии. Следует отметить, что на микрофотографиях препаратов, зафиксированных как при 20», так и при 45»С обнаруживаются неламеллярные структуры, имеющие вид плотных цилиндров.

Более сложная картина имеет место для образцов, содержащих ДМФХ. Так, на микрофотографиях нагретых образцов, обладающих сильным светорассеянием, в зависимости от соотношения детергент/липид обнаруживаются различные типы лзмеллярных •структур. При малом содержании детергента наблюдаются преимущественно моноламеллярные везикулы, а при большей концентрации холата натрия наряду с везикулами присутствуют большие мультиламеллярные структуры. Еще более любопытны необычные, ранее не описанные небислойные образования, напоминающие клубки и сети длинных извивающихся нитей

бимолекулярной толщины, а также различные циллиндрические структуры.

Наряду с негативным контрастированием для более полного и надежного структурного анализа изученных систем был применен метод замораживания-скалывания. Благодаря сочетанию этих двух методов удалось уменьаить вероятность оаибочной интерпретации результатов, связанной • с возможностью появления артефактов в процессе приготовления препаратов для электронно-микроскопического исследования.

На электронных микрофотографиях платиноуглеродных реплик сколов образцов, чувствительных к температуре, которые были быстро заморожены при 20*С (прозрачное состояние). в случае смеси ДМФХ с холатом натрия каких-либо ламеллярных структур не обнаружено (рис.2а), что согласуется с данными, полученными методом негативного контрастирования. В то же время на репликах сколов, полученных при замораживании от 45°С (мутное состояние) присутствуют моноламеллярные везикулы, имеющие выраженную иероховатую поверхность (рис.2Ь). На микрофотографиях препаратов смеванных систем с больвим содержанием детергента .. обнаружены также сетчатые структуры, аналогичные тем, которые были найдены в случае негативно контрастированных препаратов. Наряду с сетчатыми структурами, видны и циллиндрические образования. обладающие характерной продольно-полосатой микроструктурой-

Таким образом, электронно-микроскопические исследования подтвердили. что термоиндуцированные изменения мутности смеванных систем, состоящих из насыщенных фосфатидилхолинов и холата натрия, действительно обусловлены трансформацией мицелл в ламеллярные структуры преимущественно везикулярной конфигурации. В то же время эти исследования выявили довольно

рис.2 Электронные микрофотографии плaтинo^/леродных реплик скалов препаратов смешанной системы, содержащей Ю иН ДМФХ и з мМ холата натрия, замороженных от 2и (а) и 4Ь»С (Ы .

сложную картину происходящих структурных перестроек. Оказалось, что тип образующихся ламеллярных структур зависит от содержания детергента. Более того, при высокой содержании холата натрия наряду с везикулами и мультислоями присутствуют также различные неламеллярные образования. В связи с этим возникает вопрос о последовательности формирования тех или иных структур, поскольку было не ясно, кахие иэ них являются промежуточными формами, а какие конечными структурами в ходе термоиндуцированной трансформации. Для изучения

последовательности структурных превращения в смешанных липид-детергентных системах нами был использован ЯИР на ядрах "Р. который является одним из наиболее информативных методов при исследовании полиморфных превращении фосфолипидных систем.

Ядерный иа гнитныв сеарданс

Типично мицеллярные смешанные системы, образуемые ДМФХ с холатом натрия в исследованном температурном диапазоне, дают изотропный сигнал Э,Р-ЯМР как при 20», так и при 4ь»С, химический сдвиг которого не зависит от температуры. Сигнал а1Р-ЯМР от заведомо ламеллярных липид- детергентных смесей имеет характерную ассиметричную форму с "плечом", расположенным в слабом поле и также практически не меняется при повышении температуры. Однако, спектры промежуточных смешанных систем, претерпевающих турбидиметрический переход, по мере повышения температуры подвергаются значительным изменениям.

На рис.з представлены спектры "Р--ЯМР смешанных систем с различным содержанием холата натрия. При 20°с обе системы дают симметричный узки« сигнал, отвечающий мицеллярному состоянию фосфолипидов. В случае смеси с меньшим содержанием детергента в момент начала турбидиметрического перехода при 24ес в спектре ЯМР появляется второй сигнал, смещенный в сторону сильного

температуры.

паля, который по мере повывения температуры становится единственным и, по-видимому, отвечает везикулярным структурам. Изменения в спектре ЯМР смешанной системы, содержащей 20 мМ ДМ*Х и 8 мН холата натрия, начинаются при более высокой температуре (31*), так же соответствующей началу турбидиметрического перехода. Эти изменения выражаются в уаирении сигнала, однако затем сигнал снова становится узким и, как в предыдущем случае, смещается в сторону сильного поля. При, 42« на фоне этого сигнала появляются еще два, которые по мере повышения температуры становятся доминирующими. При этом, один из сигналов приобретает признаки, характерные для протяженных бислойных структур.

Таким образом, термоиндуцированные превращения смешанных систем сопровождаются значительными изменениями химического окружения липидных молекул. Данные ЯМР подтверждают результаты, полученные методом электронной микроскопии и свидетельствующие о том, что в смешанных системах происходят глобальные структурные перестройки, в ходе которых могут формироваться различные типы структур. При этом, при малом содержании детергента, процесс, по-видимому, протекает в одну стадию, тогда ках в смесях с большим содержанием детергента термоиндуцированные перестройки происходят, по меньшей мере, в два этапа.

ДиФЧереициадьиая сканирующая калориметрия

Поскольку температурный интервал мицеллярно-ламеллярнои трансформации перекрывается с диапазоном фазового перехода липида гель-жидкия кристалл, представляло интерес выяснить, в . какой мере происходящие при этом процессы сопряжены с плавлением углеводородных цепей липидных молекул.

На рис.4 представлены полученные методом ДСК термограммы смешанных систем, состоящих иэ ДНФХ с различным содержанием холата натрия. Плавление чистого фосфолипида характеризуется узким острым пиком, которому предаествует небольшой пик. соответствующий предпереходу (рис.4а). В случае смешанной системы, содержащей всего 0,5 мМ холата натрия, предпереход уже не наблюдается, а пик основного перехода значительно меняется (рис.4ь). На фоне основного пика появляется более широкий пик, несколько сдвинутый в область высоких температур.

По мере дальнейшего увеличения содержания холата натрия в смеси картина плавления липида становится еце более сложной. Так, на термограмме смешанной системы, содержащей з мН холата натрия можно выделить уже три компоненты фазового перехода, которые разнесены по .температурной шкале более чем на 20' (рис.4<1). В смешанных системах с более высоким содержанием холата натрия компоненты в области высоких температур исчезают, а остальные смещаются в низкотемпературную область. Следует отметить, что калориметричесхая энтальпия тепловых переходов с ростом концентрации детергента значительно снижается. Аналогичные изменения кривых теплопоглощения в присутствии холата натрия наблюдаются в случае ДПФХ.

Кривые теплопоглощения были получены для смешанных систем различного типа: как заведомо ламеллярных и мице?лярных. так и переходных, претерпевающих в ходе температурного сканирования турбидиметрический переход. Оказалось, что Форма этих кривых определяется прежде всего составом смешанной системы и в меньшей степени состоянием агрег—дии липидных молекул- Так, плавление углеводородных цепей липида в составе смешанной системы 10 мМ ДМФХ - 2 мМ холата натрия, находящейся по данным турбидиметрии и электронной микроскопии в заведомо ламеллярном

I г

^__

ГО 30 40 ьо

т.*с

1400

—1

V-

J__I

о ю го зо <0 го 60 т.°С

о ю го эо «о ео во т°с

рис.4 (1) Кривые теплопоглоиения смешанных систем,

содержащих Ю мН ДНФХ и различные концентрации холата

натрия: а) - О; Ь) - 0.5; с) -2; с» - 3; о) 7; Г) 9 мМ. (2) Турбидиметрические кривые.

состоянии имеет достаточно сложный характер. причем на термограмме можно выделить не менее трех компонент теплового перехода (рис.4с, кривая 1 - теплопоглощение, кривая 2 -изменения мутности). Увеличение концентрации детергента на 1 мМ не приводит к более четкому раэреоению этих компонент (рис.4(1), причем судя по данным турбидиметрии и электронной микроскопии состояние агрегации изменяется: при 20* эта система находится в мицеллярном состоянии, а при 45*С - в ламеллярном. Трудно выделить также какие-либо характерные различия между кривыми теплопоглоцения смесей, находящихся в заведомо мицеллярном состоянии и близких к ним переходных смешанных систем (ср. рис.4е и 41). Сопоставление термограмм и соответствующих турбидиметрических кривых (кривые 1 и 2, соответственно на рис.4), показывает, что положение последних вдоль оси температур на связано с какими-либо характерными компонентами термограмм. Отсюда следует, что термо-индуцированные трансформации сами по себе не дают значительных тепловых эффектов, которые были бы сравнимы с энергоемкостью плавления углеводородных цепей.

Таким образом, результаты калориметрических исследовании показали, что для смешанных систем, претерпевающих термоиндуцируемый турбидиметрический переход, плавление хотя бы части липидной фазы является необходимым у-човием начала трансформационных процессов. При малом содержании детергента рост мутности может происходить по ходу плавления оставшейся части липида. в то время как при его большем содержании -только после полного завершения фгэового перехода. Обсуждение .^езультамв

Проведенные в настоящей работе исследования показали, что смешанные системы, образуемые насыщенными фосфатидилхолинами и

холатом натрия, в определенном диапазоне соотношения детергент/липид претерпевают термоиндуцированную мицеллярно-ламеллярную трансформацию. На диаграмме в координатах детергент-липид такие системы занимают область, ограниченную прямыми линиями (рис.5). В целом, эта диаграмма сходна с типичными фазовыми диаграммами, описывающими трансформацию мицеллы - ламеллярные структуры для липид-детергентных смесей, находящихся избытке воды. Коэффициент наклона фазовой границы на диаграммах такого рода интерпретируется как критическое эффективное соотношение детергент/липид (я*) в смешанных структурах, при которых происходит переход системы из мицеллярного состояния в ламеллярное, а точка пересечения фазовой границы с осью детергента отвечает концентрации детергента в водной среде в момент этого перехода.

С'. гт.М

I о

рмс.5 Фазовые диаграммы для смесей холата натрия с ДПФХ (а) и ДМФХ (в). I и II - нижняя и верхняя границы систем (2), чувствительных к изменениям температуры. 1 и 3 - мицеллярные и ламеллярные, соответственно, системы, нечувствительные к изменениям температуры-

Линии I и II. ограничивающие область переходных систем, которые способны к термоиндуцированным трансформациям, соответствуют фазовым границам при разных температурах. Тот Факт, что линии I и II сходятся по направлению к оси детергента, говорит о том, что в процессе термоиндуцированных трансформация не происходит существенных изменения концентрации свободного детергента. Поэтому общее распределение детергента между водной и липидной фазой практически не меняется, но. по-видимому, происходит существенное изменение его солюбилиэирующея способности по отношению к липидной фазе, претерпевающей переход из гелевого в жидкокристаллическое состояние.

Ножно предположить, что изменение солюбилиэируюшей способности детергента вызвано увеличением объема, приходящегося на липидную молекулу. при плавлении углеводородных цепея. Определенную роль может играть и уменьшение жесткости бислояных стуктур в результате плавления, поскольку в жидко-кристаллическом состоянии бислоя является более пластичным и легче подвергается искривлению, необходимому для формирования замкнутых бислояных структур.

Анализ калориметрических данных, проведенный путем разложения кривых теплопоглощения на отдельные функции Вант-Гоффа, подтверждает, что для инициирования процесса образования ламеллярных структур действительно необходимо предварительное плавление хотя бы части липидной фазы. На основании разложения были выделены три основных компоненты термограмм. Соответственно их положению относительно температуры Фазового перехода чистого липида (Те), они были обозначены как основная, низкотемпературная и высокотемпературная компоненты

(I, и и иг на рис.в). Наложение турбидиметрических кривых на обработанные таким образом термограммы (рис.6) показало, что плавление липидной фазы, соответствующей низкотемпературной компоненте, является необходимым условием, а плавление хотя бы части липидов, относящихся к основной компоненте, достаточным условием начала перехода мицелл в ламеллярые структуры.

Представляло интерес провести отнесение отдельных компонент Фазового перехода смешанных липид-детергентных систем к определенным типам липидных доменов. Важным параметром в этом отношении является температура плавления (Те). отвечающая каждой из наблюдаемых компонент. Так, основная компонента характеризуется практически одинаковой температурой плавления для всех изученных смешанных систем, которая близка к температуре плавления чистых фосфолипидов (рис.7). Более того, эта компонента присутствует во всех изученных системах, а энтальпия, приходящаяся на ее плавление, как правило, составляет не менее 50\ общей энтальпии фазового перехода. Отсюда можно предположить, что основной компоненте отвечают микродомены, состоящие преимущественно из липидных молекул в минимальной степени подверженных воздействию детергента, причем характер их упаковки, по-видимому, близок к состоянию молекул в чистом липидном бислое.

В случае низкотемпературной компоненты т. уменьшается с ростом эффективного соотношения н». Снижение температуры фазового перехода обычно свидетельствует о присутствии примесных соединений в составе липидной фазы и, как правило, обусловлено нарушением регулярной упаковки углеводородных цепей липидных молекул. На основании этого можно предположить, что состав микродоменов, отвечающих низкотемпературной компоненте.

а

г

1.3

t

as о

Ср. fccat/tk.M

:о зо «о so во r.t

о ю го .'з «о so

К*

Ср kcjl/kfV b 1

I (V

i

in I

----1,

_______J

10 30 40 ьо во '.•с

е "И /У

'¿Л*! ч Ж

.......... .......

о ю 2o 30 40 50 т."с

Ср. Ьс&1/И«м

о 10 20 у! 40 £3 ьо

т.*с

рис.6 (1) Кривые теплопоглоиеиия смешанных cuctsm. содержащих ДПФХ (а-о) и ДМФХ Cd-£) и холат натрия, имеющие различные эффективные соотношения детергент/липид в смешанных структурах (tut: а) - о, 15; ы - 0,25? с) -0,35; d> - 0,14; н) - 0,26; I) - 0,28; и СООТВвТСТВУЮКИе компоненты их разложения на отдельные функции Вант-ГоС$а: I - основная, tl низкотемпературная, rir - высоко температурная, (й) Турбидиметрические кривые.

02

меняется по мере увеличения общего содержания детергента в смешанных системах

55,—

I а

I Г: 31

14

......Ч !

Ь 0,1 0,1 С ,ъ ЬА С,5

50'"' АС1

ю;

1®: о-

щ

0,1

I

.г о.'Ъ оа

е

рис.7 Зависимость Тс выделенных компонент от эффективного соотношения и. смешанных систем ДПФХ (а) к ДМФХ (в) с кола том натрия- I - основная , и - низкотемпературная и ш -высокотемпературная компоненты.

Поскольку основная и низкотемпературная компоненты присутствуют на термограммах всех изученных смешанных систем, (даже при низких концентрациях детергента, когда липид находится в заведомо ламеллярном состоянии во всем исследованном диапазоне температур). то это означает, что ламеллярные и мицеллярные структуры в целом имеют сходный характер упаковки молекул. Лучше всего этой ситуации отвечает известная модель "смешанного диска", согласно которой липид-детергентная мицелла представляет из себя фрагмент бислоя, окруженный по периметру молекулами детергента. Согласно этой модели считается, что детергент может находится не только на периферии, но и внутри смешанной мицеллы. Мольное отношение детергент/липид во внутренней области бислонного фрагмента одинаково для всех смеванных мицелл данного типа и определяется растворимость» детергента в гидрофобной области бислоя, что

хорошо соответствует липидноя фазе основной компоненты. В то же время, мольное отношение детергент/липид на периферии диска должно зависеть от его размера и оно будет повышаться по мере роста общего содержания детергента в смеси. На этом основании липидная фаза на периферии диска может быть отнесена к низкотемпературной компоненте.

Высокотемпературная компонента появляется на кривых теплопоглощения только при определенных липид/детергентных соотношениях. Повышенная по сравнению с чистым липидом температура ее плавления свидетельствует о более плотной упаковке углеводородных цепей липидных молекул. Обычно рост температуры плавления связывают с усилением взаимодействия примесных соединений с полярными головками липидных молекул. Наилучшие условия для этого создаются в случае липидных молекул, организованных в небислояные структуры, которые в наших исследованиях могут быть соотнесены с циллиндрическими образованиями, обнаруженными на электронных микрофотографиях.

Как показали данные ЯМР, образование моноламеллярных везикул происходит, по-видимому, в одну стадию, без участия каких-либо промежуточных структур, в то время как Формирование мультислоев, имеющее место при больших концентрациях детергента, является более сложным процессом, сопряженным, по-видимому, с Формированием везикул. В рамках модели смешанного диска можно предложить следующую схему протекания .термоиндуцированноя трансформации смешанных систем: 1) По мере плавления периферического липида. соответствующего низкотемпературной компоненте, возрастает объем, приходящийся на липидную молекулу; 2) Поскольку имеющегося детергента уже не достаточно для эффективного экранирования гидрофобных углеводородных цепей липидных молекул, то это ведет к быстрой

агрегации смешанных мицелл; 3) По мере дальнейшего повышения температуры происходит плавление липидных доменов, отвечающих основной компоненте, которое, благодаря уменьшению жесткости бислойных фрагментов сопровождается их замыканием в везикулярные структур"• Что касается мультислоев, то на первой стадии их формирования образуются структуры, напоминающие .везикулы,• которые впоследствии трансформируются в сетчатые образования, дающие в конечном счете мультислои. Возможно, что Формирование мультислоев происходит по типу перехода нормальная гексагональная фаза к> - ^амеллярная фаза.

Заключение

Данные настоящей работы показывает. что процесс трансформации мицелл в организованные бислои является более сложным, чем это представлялось ранее.- Он включает широкий набор различных переходных состояний и промежуточных структур. Формирующихся за счет предшествующей реорганизации исходных мииеллярных агрегатов. В этом отношении обнаруженная аномалия в термотропном поведении липид детергентных систем представляет особый интерес, так как дает уникальную возможность изучать эти структуры и их превращения на различных этапах трансформации за счет простого варьирования температуры при заданном соотношении компонентов исходной смеси. Обычно для проведения такой трансформации приходится прибегать к более глубоким и необратимым воздействиям на изучаемую систему, сопряженным с удалением детергента при помощи диализа, гель-фильтрации или адсорбции на гидрофобных смолах, что приводит к значительному нарушению равновесия, искажению кинетики процесса и невозможности выделить его отдельные стадии для более детального изучения.

Представляет также интерес дальнейшее изучение этого явления с целью разработки нового подхода к реконструкции мембран. Так. проведенные нами предварительные исследования показали, что методом терцотропнои трансформации мицеллы-бислои могут быть получены протеолипосомы. содержащие функционально * ахтивныя бактериородопсин.

Выводы

1. Негодами турбидиметрии, дифференциальной сканирующей калориметрии, электронной микроскопии и ядерного магнитного резонанса изучен процесс формирования ламеллярных структур из насыщенных фосфолипидов (днмиристоил- и дипальмитоилфосфа-тидилхолина), солюбилиэированных холатом натрия.

2. Впервые установлено, что в определенных условиях такие системы подвергаются обратимой термоиндуцированноп мицеллярно -.ламеялнрной трансформации, что делает их удобной моделью для изучения механизмов самосборки мембран.

3. Совместный анализ термограмм и тубидиметрических кривых выявил сложный характер взаимодействий между липидными и детергентными молекулами в изученных бинарных системах. Обнаружена ранее не описанная небислойная липидная Фаза, образующаяся в таких системах при определенных соотношениях детергент/липид и проявляющаяся в виде характерного пика на кривых теплопоглощения.

4. На основе данных электронной микроскопии и ядерного магнитного резонанса установлено, что в ходе термоиндуцированноп трансформации мицеллярных систем формируется широкий набор надмолекулярных структур, природа которых во многом определяется соотношением детергент/липид в исходной смеси.

5. На основании полученных экспериментальных данных рассмотрен механизм формирования различных ламеллярных структур из лилид-детергентноя смеси.

6. Показано, что способность изученных систем к мицеллярно - ламеллярной транформации может быть успешно использована для реконструкции мембран. Проведена реконструкция

бактериородопсина в везикулах методой термоиндуцированной трансформации мйцеллярных солюбйяизатов.

Материалы, диссертации. рпубЛ11крваныв_след;(^их_работах:„

1. Барсуков Л-И.. Симонова Т.Н.. Полозова ft.И. Регуляция самосборки мембран в процессе реконструкции.- I Советско-Японский симпозиум "Рецепторы: структура и функции", тезисы докладов, 17-22 ИЮЛЯ 1981 г, Пучино. стр.35.

2. Si monova T.N., Polozova A.I.. Barsukov L.I. Control of the vesicle formation during membrane reeonstitution.-International Conference on Structure and Functions of Biomembranea, November 28 - Deeember 2, 1989, Baao Institute, Calcutta, India, abstracts, p.7

3. Barsukov L.I., Slnonova Т.Н., Polozova A.I. Influence of lipid and protein nuclear phases on the-vesicular bilayer self-assembly.- Vlth Soviet-Swiss Symposium: "Biological Membranes: Structure and Functions", 11-14 September 1990, Neuchatel, Switzerland, p.18

4. Полозова A.M.. Дубачев Г.Э., Симонова Т.Н.. Барсуков Л.И. Аномальное термотропное поведение бинарных смесей иасыпенных ФосФатидилхолинов с холатом натрия.- Биоорганическая химия,

1993, Т.19, N 6, стр.655-663

нсрти a Of. >•< ™ 'OOJK*