Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение лизогении типовых штаммов Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение лизогении типовых штаммов Bacillus thuringiensis"

МИКРОБИОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

* а опт да--

На правах рукописи

АЗИЗБЕК5Ш КАРИНА РУДОЛЬФОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ЛИЗОГЕНИИ ТИПОВЫХ ШТАШОВ ВАИШЕ ТН1Ш1Ш1ЕН313.

03. 00.07.- микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

г

Работа выполнена ь лаборатории вирусологии' Института микробиологии Российской Академии Наук. Руководитель лаборатории - академик Атабеков И.Г.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Добржанская Е.О.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Ильяшенко Б.Н. Кандидат биологических наук ' Яненко А:С.

Ведущая организация - Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской Академии Медицинских Наук.

б " /У " часов на заседании диссертационного совета при Институте Микробиологии РАН ( Москва, 117811, Проспект 60-летия Октября, д.7, кор.2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института Микробиологии РАН.

Реферат разослан "996 г.

Ученый секретарь Специализированного

совета кандидат биологических наук Никитин Л.Е.

Зажита диссертации состоится " б "

г.

Актуальность проблемы. Биологические инсектициды на основе энтомопатогенных бактерий Bacillus thuringiensis i'Bt) широко используются в системе мер борьбы с вредными насекомыми. Выделенные к настоящему времени штаммы Bt патогенны лишь для части вредных насекомых, что диктует необходимость поиска новых штаммов со специфической инсектицидной активностью. Кроме того, расширение масштабов производства экономически зажных инсектицидов выдвигает ряд технологических задач, а том числе и борьбу с фаговой инфекцией.

В связи с этим становится актуальным как изучение лизоге-нии штаммов Bt - потенциальных источников эндогенной фаговой инфекции, так и сравнительная характеристика фагов из культур Bt, выделенных в различных климато-географических зонах мира.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение фагов, источником которых являются типовые штаммы Bt. В связи с этим были сформулированы следующие задачи :

- оценить степень распространенности лизогении среди типовых штаммов Bt, выделенных в отдаленных зонах мира;

- с использованием различных методов индукции выделить из типовых штаммов, не изученных по признаку лизогении, фаги и провести их сравнительный анализ;

- характеризовать выделенные фаги по морфологии, физико-химическим параметрам (,'мол. массы ДНК, чувствительность фаговых ДНК к зндонуклеазам рестрикции, число кодируемых фаговым геномом белков и их мол.массы);

- использовать коллекцию выделенных из типовых культур фагов для выявления систем рестрикции-модификации у типовых штаммов Bt;

- с помощью новых фагов предложить схему фаготипирования Bt.

Научная новизна и практическая значимость работы.

- установлена лизогенность Ц ранее не исследованных штаммов Bt. По классификации Аккерманна фаги относятся к морфологической группе 31. По ультраструктуре выделенные фаги отнесены к двум подгруппам. Из штаммов Bt var.tcchigiensis,- vunnanensis. Shandongiensis и mexicanensis выделены фаги с поперечными дисками на хвостовом отростке, несвойственные для фагов, выделен-

них ранее иь культур Б1. По морфологии эти шаги не отличаются от ранее описанного шага ТЫО, выделенного при производстве биологического инсектицида "Битоксиоашшшна";

- на основе рестришшонного анализа и морфологических характеристик. изученные фаги разделены на 5 групп. ДНК фагов каждой группы образуют равное число фрагментов с одинаковой электрофо-ретической подвижностью при гидролизе рядом использованных рестриктаз;

- геномы разных фагов кодируют от 4 до 8 белков с молекулярными массами, рассчитанными по электрофоретической подвижности, от 12 кДа до 210 кДа. Обнаружена корреляция между морфологией фагов, характером рестрикции их ДНК и набором фаговых белков;

- с использованием коллекции новых фагов и на основе их спектра литического действия составлена схема фаготипирования. 5о типовых штаммов В1, принадлежащих к 45 серовариантам, распределены между 37 фаготипами;

- показано, что фаги, выделенные из штаммов уах. 1осМё1-епз1з, уиппапег^э и зйалйоп^егшБ, преодолевают иммунитет бактерии-хозяина и образуют негативные колонии на культурах, из которых они были выделены;

- обнаружено наличие системы модификации у двух штаммов Ей уаг. заропег^з и уаг. 1ееБ15 и продемонстрирована их специфичность .

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит ив введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части., заключения и выводов. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, включает ^¿таблиц и ^рисунков. Библиография состоит из /¿^¿наименований.

Апробация работи. Основные положения диссертации были представлены на 10-ой Международной конференции по глобальным аспектам прикладной микробиологии и биотехнологии (6-12 августа, 1995, Зльсинор, Дания, С. 97).

МАТЕРИАЛЫ И 1СТ0ДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использованы штаммы 3t различных серовариантов, полученные из института Пастера (Франция). 3 качестве индикаторных культур использовали штаммы Bacillus се-reus 569 и Bt var.galleriae ИПМ 1148 i'Spo" Cry~RifR 3trR), полученные из ГНИИгенетика.

Фаги и штаммы. Фаги, выделенные в ходе настоящей работы представлены в таблице 1. Фаг ТЫО получен из ГНИИгенетика.

Среды и растворы. Для роста бактериальных культур и титрования фагов в качестве полноценной среды использовали бульон и агар Хоттингера (1,551 и 0,7%) и мясо-пептонный бульон (МПБ) и агар (1,5Х). Для выделения ДНК фагов культуры выращивали в среде LB (Luria-Bertanib

Таблица 1.

Фаги, выделенные из типовых штаммов Bt.

Фаг Штамм и серотип Bt Страна, год

Kyul kyushuensis, Hila,11c Япония, 1979

Kunvl kumamotoensis, H18a,18b Япония, 1981

Tocl tochiguensis, H19 Япония, 1981

Yunl yunnanensis, H20a,2Gb Китай, 1979

Coli colmeri, H21 '' США, 1980

3hai shandongiensis, H22 Китай, 1988

Neol neoleonensis, H24a,C4b Мексика, 1988

Cor! coreanensis, H25 Корея, 1994

3111 silo, H26 Франция, 1994

Мех! mexicanensis, H27 Мексика, 1988

Tog'l toguchini, H31 Россия, 1994

Спонтанное выделение фагов. Для спонтанного выделения фагов культуры 61 инкубировали при 28° С в течении 4-х часов и далее анализировали надосадок двуслойным методом на индикаторных культурах.

Индукция |ага. Ночную культуру, выращенную в бульоне Хоттингера, разводили в 10 раз и инкубировали 4 часа. Далее клетки

- б -

культуры, ресуспендированные в физиологическом растворе, облучали ультрафиолетовым светом на установке "Хроматоскоп" или обрабатывали митомицином С, затем разводили в 2 раза свежей средой и инкубировали дополнительно 4 часа при 37° С в условиях, предотвращающих фотореактивацию. Наличие фага анализировали как титрованием, так и электронно-микроскопически.

Методы работы с фагами. Титрование фагов, определение спектра дитической активности, оценку адсорбционной способности фагов проводили согласно методике Адамса (1961).

Концентрирование и очистка препаратов фагов. Препараты фагов с высокой концентрацией получали методом сливного лизиса. Окончательная очистка достигалась центрифугированием в преформиро-аанном градиенте хлористого цезия (центрифуга "High Speed 25", Англия).

Определение адсорбционной способности фагов. Адсорбционную способность фагов оценивали по количеству неадсорбированного фага (Ацамс.1961).

Электронно-микроскопическое исследование ультраструктуры фагов проводили на микроскопе "Hitachi Н-300" (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ, используя для контроля фаг Т4 (Тихо-ненко, 1968).

Выделение фаговых ДНК осуществляли фенольным методом и методом термического шока. Наличие в препаратах фаговых ДНК определяли с помощью электрофореза. В качестве маркера использовали ДНК фагаАШаниатис и соавт. ,1984).

Гидролиз фаговых ДНК рестриктазами проводили согласно стандартным методикам (Маниатис и соавт.,1984). Молекулярные массы фрагментов ДНК определяли по электрофоретической подвижности в IX агароэном геле в трис-боратном буфере. В качестве контроля для подсчета молекулярных масс фрагментов исследуемых ДНК использовали EcoRI-, HindiII- и PstI- фрагменты ДНК фагад,по которым строили калибровочные кривые. Для анализа фаговых ДНК в работе использовали набор сайт-специфических рестриктаз, различающихся по сайтам и числу узнаваемых оснований ДНК.

Определение молекулярных масс фаговых белков. Молекулярные массы фаговых белков определяли методом электрофореза в полиак-риламидном геле ( Laemmli, 1970). В качестве маркеров использовали стандартный набор белков MW-30S-20Q Kit. Злектрофорети-

ческую подвижность белка ({?Л определяли как отношение расстояния миграции белка к общему размеру миграционного трека.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Морфологическая характеристика фагов, ведааенних из типовых культур Bacillus tburingiensis.

С целью анализа степени распространения феномена лизогении среди штаммов Bt использовали культуры, выделенные из различных источников в отдаленных климато-географических регионах мира. Выбор штаммов данных серотипов диктовался необходимостью исключить возможность генетического обмена между культурами.

Выделенные фаги были обозначены Kyul, Kuml, Tocl, Yunl, Coll, Shal, Neol. Corl, 3111, Mexl и Togl, соответственно. Фаги Togl и Coll были получены и размножены на индикаторном штамме Bt var. galleriae ИПМ 1148, остальные фаги - на Вас. cereus 569.

Изучалась возможность как спонтанного выделения фагов, так и индукция этих фагов с помощью УФ облучения, а также митомицином С.

Результаты исследования показали, что фаги Tocl, Shal и Sill спонтанно не выделяются. Эти фаги образуют негативные колонии на индикаторной культуре лишь при обработке клеток штаммов УФ-светом.

Фаг из культуры var. mexicanensls выделяется спонтанно, однако, при обработке клеток УФ- светом титр фага Mexl повышается на 4 порядка.

Фаги Kyul, Kuml, Coll, Togl, Corl, Neol и Yunl выделяются спонтанно. При УФ-облучении в использованных нами режимах увеличения титра фага по сравнению со спонтанной индукцией не наблюдалось .

При индукции митомицином С увеличения титра не наблюдается ни для одного фага.

На индикаторных культурах фаги образуют различные по размерам и форме негативные колонии. Некоторые из них образуют два типа негативных колоний (прозрачные и мутные).

Электронно-микроскопическое исследование фагов из отдельных негативных колоний показало, что все фаги по классификации Ак-

керманна откосятся к В1-ыорфотипу а имеют капсид в форме изометрического многогранника и несокращающийся отросток с хорошо выраженной поперечной исчерченностью. Однако, у фагов Tocl, Yunl, Shal и Mexl, в отличие от фагов Kyui, Kuml, Neol, Corl, Sill, Togl и Coll наблюдаются поперечные диски на хвостовом отростке размером 13 х 3 нм. Количество дисков варьирует от 2 до 8. По морфологическим характеристикам эти фаги не отличаются от описанного ранее фага Tbio, выделенного при производстве "Би-токсибациллина". Фаги Tocl, Yunl, Shal и Mexl объединены в одну группу и условно названы ТЫО-подобными ( Табл.2).

Таблица 2.

Морфологическая характеристика фагов.

Фаг Размеры фагов, нм Фаг Размеры фагов, нм

головка отросток головка отросток

Куш 58 200 X 16 Mexl 58 183 X 10

Kuml 58 200 X 16 Coll 66 200 X 10

Corl 58 200 X 16 Togl 62 185 X 10

Tocl 58 183 X 10 Neol 60 180 X 10

Yunl 58 183 X 10 Sill 57 172 X 10

Shal 58 183 X 10

Результаты проведенных нами исследований подтвердили наибольшую распространенность (фагов В1-морфотипа среди штаммов Bt и показали, что фаги, принадлежащие к одному морфотипу, могут иметь некоторые различия в морфологическом строении, например, наличие поперечных дисков на хвостовом отростке у ТМО - подобных Фагов.

2. Рестрикционний анализ ДНК фагов.

Для выявления степени родства фагов нами был использован рестрикционный анализ.

Рестрикционний анализ ТЫО - подобных фагов (Tocl, Yunl, Shal и Mexl) показал, что их ДНК гидролизуются рестриктазами на рав-

нов число фрагментов с одинаковой электрофоретической подвижностью. Молекулярная масса ДНК всех четырех фагов, расчитанная по сумме HindllI-фрагментов, оказалась одинаковой и составила 38,58 kb. Стоит отметить, что ДНК фага ТЫО при гидролизе различными рестриктазами имеет один дополнительный фрагмент по сравнению с фагами Tocl, Yunl, Shal и Mexl. Число и электрофо-ретическая подвижность остальных фрагментов ДНК фагов идентичны. ДНК ТЫО-подобных фагов и фага ТЫО устойчивы к рестрикта-зам Sali и KpnI. Фаги Tocl, Yunl, Shal. Mexl и ТЫО имеют не только одинаковое морфологическое строение, но и сходную структуру ДНК, что, вероятно, свидетельствует о близком родстве этих фагов (Табл.3).

Таблица 3.

Рострикционний анализ ДНК фагов.

Фаги Максимальное число фрагментов / рестриктаза Минимальное число фрагментов / рестриктаза Мол. масса, kb

Kyul, Corl Kuml, 16 / EcoRI 2 / Mspl 32,8

Tocl, Shal, ТЫО Yunl, Mexl 6 / Hind III 7 / Hindi 11 5 / Mlul '38,58 41,93

Neol, Sill 12 / Mval 3 / PstI, Xbal 38,58

Togl 14 / Hindi 11 2 / Mval 40,88

Coll 10 / Kpnl 5 / Sail 52,38

ДНК фага То&1 устойчива ко многим рестриктазам (5 из 9 использованных) . Обычно такая устойчивость характерна для фагов, выделенных из почвы. Возможной причиной резистентности к рестриктазам может быть метилирование оснований ДНК Фага Тог1 или замена оснований ДНК фага на иные, аномальные основания. Ос-

- to -

тальные рестриктазы расщепляют ДНК фага Togl на различное число фрагментов.

ДНК фагов Neol и Sill устойчивы только к рестриктаае Sail, а остальными рестриктазами гидролизуется на одинаковое число Фрагментов с равной молекулярной массой. Учитывая, что фаги Neol и 3111 имеют одинаковое морфологическое строение, а также сходную структуру геномов возможно их выделение в одну группу.

ДНК фага Coll расщеплялась всеми использованными эндонуклеа-зами.

3 отличии от вышеописанных фагов ДНК фагов Kyul, Kuml и Carl устойчивы к рестриктазе Hind III. Рестриктазы Kpni и Sali также не гидролизовали ДНК этих фагов, а остальные рестриктазы расщепляли ДНК на фрагменты, число и электрофоретическая подвижность которых, были одинаковы. Молекулярная масса ДНК фагов рассчитана по суше EcoRI-фрагментов. По размерам и молекулярным массам ДНК фаги Kyul, Kuml и Corl наиболее близки к описанным ранее фагам Bt того же В1-морфотипа.

Результаты проведенных исследований ДНК фагов показали, что все изученные фаги можно разделить на пять групп. К первой группе отнесены фаги Kyul, Kuml и Corl. Ко второй группе относятся ТЫО-подобные фаги : Tocl, Yunl, Shal и Mexl. К третьей группе относятся фаги Neol и Sill. Четвертая и пятая группа представлены фагами Togl и Coll, соответственно. Фаги, объединенные в одну группу, имеют одинаковые размеры и число фрагментов рестрикции, что свидетельствует об их, вероятно, близком родстве. Однако, ДНК фагов, принадлежащих к разным группам, значительно отличаются друг от друга. В качестве примера можно рассмотреть рестрикционный анализ ДНК представителей всех групп фагов рестриктазой HindiII (Табл.4).

Как видно из таблицы 4 представители 1-ой группы фагов устойчивы к Hindi 11, а ДНК остальных фагов гидролизуется этим ферментом на фрагменты, число и электрофоретическая подвижность которых различны. Таким образом, результаты анализа ДНК фагов показывают, что с помощью определенного набора рестриктаз можно выявить степень родства фагов.

- а

Таблица 4.

Молекулярные массы ШпЛП-фрагментов ДНК фагов.

N Фрагмента Группы фагов

I С ТЫО ¿45

IКуи1) ГЛШ) (МеоП »Со 11) (Тод!)

Молекулярные массы фрагментов ДНК , кЬ

1 не 14,50 14,50 ю, 25 14.00 5,23

о гид- 10,20 10,20 ■з, 44 10,20 4, ¿6

О ро- б, об 6,66 б, 21 3,44 4,00

4 ли- 3,52 о, 52 3, 52 5,52 3,76

о зу- 2,35 3,35 2, 30 4.17 3, о 2

о еТ- 1 ,о5 2,35 2, оО 2, .36 3,23

( ся 1,35 1. ¿5 2,35 2.36

о 1, 35 1,34 , С>3

3 1,52 2 27

10 1, Зо 2,00

И 1,32

1С 1.70

13 1,52

14 1,33

а. мол. масса 38.58 41,33 33,62 52,33 40.38

3. Анализ фаговых белков.

Учитывая, что характеристика фаговых белков Iчисло л мол.масса) имеет важное значение для классификации Фагов внутри вида, проведен анализ белков фагов (Табл.о).

Фаги, принадлежащие к первой группе, по составу Шаговых белков не различаются. 3 состав частиц входит по семь белков с одинаковыми молекулярными массами. Фаги первой группы :одержат наиболее высокомолекулярные белки.

ТЫО-подобные Фаги также содержат входные по составу йагоьые белки. Представленные данные показывают, что ваг Г1Л0 ло составу фаговых белков несколько отличается от ТЫО-подобных ьагов.

Однако, возможно и родство этих фагов, так как из семи представленных полипептидов три белка с молекулярными массами 102, '38 и 95 кДа были идентичны и у фага ТЫО и у фагов Yunl, Tocl, Shal и Mexl. Остальные белки различаются по молекулярным массам.

Наименьшее число белков (4) входит в состав частиц фагов Sill и Neol. Следует отметить, что из всех изученных нами фагов именно фаги Neol и Sill содержат наиболее низкомолекулярные белки с молекулярными массами 12 и 17 кДа, соответственно.

Фаг Coll содержит наибольшее количество белков - 8, молекулярные массы которых близки к молекулярным массам белков ТЫО-подобных фагов. Так, фаг Coll также как представители ТЫО-подобных фагов, содержит белки с молекулярными массами 76, 47 и 43 кДа. Белковый анализ фага Togl показал наличие 5 белков с молекулярной массой от 35 кДа до 145 кДа.

Таким образом, выявлена значительная разница белкового состава фагов В1-морфотипа. Обнаружена корреляция между морфологическими свойствами фагов, структурой их геномов и составом фаговых белков. Так, фаги, входящие в состав 1-ой и 2- ой групп, обладали равным числом белков с одинаковыми молекулярными массами, а фаги Neol и Sill, имеющие схожую морфологию и одинаковую структуру геномов, обладали равным количеством белков, но с различными молекулярными массами.

Таблица 5.

Характеристика фаговых белков.

Молекулярные массы фаговых белков, кДа

1-ая 2-ая группа группа (Kyul) (Mexl)

ТЫО 3-ая группа 4-ая 5-ая

_ группа группа

(Neol) (Sill) (Coll) (Togl)

210 154 116 100 37 79 66

102 98 35 76 59 47 43

102 113 100

98 91 93

35 43 35

91 12 17

33

110 145

101 100

92 39

76 62

61 35 57

47 43

4. Спектр логического действия фагов.

В работе определен спектр литического действия фагов, выделенных из культур В1, а также фага ТЫО на 58 типовых штаммах ВЬ. относящихся к 45 серотипам (Табл.6).

Таблица в.

Спектр литического действия фагов на типов их штаммах

Н-антиген Серотип Фаги

ККСУБТМТЬНЗТС

У и 0 и Ь о е 10 е 1 0 0

и ГП г п а с X 0 1 г 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 1Ьиг1пг1епз1з - - - - - - - + - - -

2 ИпШтиэ

3а,3с а1еэи

3а,3,ь,3с кигз1ак1 - - - + + + +

За.Зс! зшЦуозМегшз - - ч- - - +■ - - - - -

3a.3d.3e Гикиокаепз1з +

4а, 4Ь 50и0 - - - + + + +

4а, 4с кепуае - - - - - + - - - - - -

5а, 5Ь даПепае ■ь + + + + + +■ + + + +

5а,5с сапа£1епз1з

6 entoшocídus - - * - - - - - - - -

'1 1 а12ама1 + - - + + +

8а, 8Ь тогг15оп1 - +■ - + +■ + + - - - - +

8а, 8с оз^гиае + - + + +

8Ь,8ё п!гег1епз1з +

9 1о1иог1М - - - + + + + - - + -

Юа, 10Ь daгпlstadiens^s - - - - - - - + - - -

10а, Юс londгina

Иа.ИЬ 1оитапо£Т 1 - - ■ь + - - - - - +

На.11с куизйиег^з - - - - - + - - - -

12 1Ьотрзоп1

13 pakistani + - - - - + - - - - - -

14 israelensis + + -- *• + -+ - - + -

15 dakota - + + + - -- -

16 indiana + + + - - - -

17 tohokuensis --------

18a,18b kumamotoensis ---+++++ - - - -18a,18c yosoo -------19 tochigiensis ---+++-+ ---_ 20a, 20b yunnanensis + + + - - + -20a,20c pondicheriensis- +•- + --+- - - +• -

21 colmeri _ _ _ .

22 shanaongiensis --- + + +--- - -- -

23 japonensis - + + + + + - + ----

24a,24b neoleonensis -------- _ _ + _

24a,24c novosibirsk - _ - -

25 coreanensís ----+.--- _ _ + _

26 silo -- + +f-t----- + -

27 mexicanensis -++----- ----28a,28b monterrey ____ 28a,28c jegathesan -------- _ _ _ _

29 amagiensis -------- . _ _ _

30 medellin -------31 toguchini -------- --,+

32 cameroun

33 leesis - + -+.---- - -- -

34 konkukian -------- _ - _ _

35 3eoulensis -------36 malaysiensis - + +.----- _ . + _ 37 andaiousiensis ---+---- ---38 oswaldocruzi -------- -__-

39 brasiliensis -------- -__-

40 huazhongensis - + +• + + -- - + + - -

41 sooncheon -------- ____

42 jinghongiensis + + + -- + -- +-++

43 guiyangiensis -------- ---44 higo

45 roskildiensis -------+ --+-

Примечание: способность к лизису,

"-" отсутствие способности к лизису.

Как следует из таблицы б, исследуемые ijiarii различаются по спектру литического действия. Не обнаружено взаимосвязи между морфологией фагов и спектром литического действия. Наиболее широким спектром литического действия обладают фаги Yunl и Shal, относящиеся к группе ТЫО-подобных фагов. Они лизируют 20 из 58 типовых штаммов Bt, при этом круг лизируемых ими культур был различен. Фаг ТЫО лизирует значительно меньшее число культур, всего 9 из 58.

Наименьшим спектром литического действия обладают фаги Neol и Sill (они лизировали 4 и 3 штамма соответственно). Фаги Neol и Sill имеют сходные морфологические характеристики, одинаковую структуру ДНК, равное количество фаговых белков, и узкий круг хозяев, что служит еще одним подтверждением их возможного родства.

Только три фага: Tocl, Yunl и Shai, принадлежащие к группе ТЫО-подобных, образуют негативные колонии на культурах, из которых они были выделены.

Типовые штаммы, принадлежащие к 16 серовариантам Bt, оказались резистентными ко всем изученным фагам. Это может быть обусловлено либо неспособностью изучаемых фагов адсорбироваться на данных штаммах, либо с наличием системы рестрикции -модификации.

Таким образом, показано, что фаги, обладающие рядом одинаковых характеристик, таких как морфология, структура ДНК и состав фаговых белков, могут различаться по спектру литического действия, который, вероятно, является наиболее лабильной характеристикой фагов Bt.

5. Фаготипировакие.

В последние годы все более интенсивно ведутся работы как по поиску природных штаммов Bt известных серотипов, так и по выявлению новых. Поэтому представляется'целесообразным для первичного определения таксономического положения новых штаммов Bt использовать какой - либо универсальный метод. Этим методом может стать фаготипирование. Он достаточно прост, быстр, не дорог и не требует специального оборудования.

По результатам, полученным при определении спектра литнческо-

го действия новых фагов, нами была построена схема фаготипиро-вания типовых штаммов Bt (Тайл.7).

Таблица 7.

Фаготнпированме Bacillus tburingiensis.

Фаготип Фаги Штаммы Bt

К К С Y 3 Т М Tb N S т с

У и О U h О е 10 е i О О

и ш г п а с X 0 1 S 1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 + + + + + + + + + + + galleriae

о с. + + ■ь - - + - - + - - ■ь jinghongiensis

3 - - + + + + - - - - morrísoni

4 - - - - + + + + - + - tolworthi

5 + - - + + - + - - + - israelensis

6 - + + + + - + - - - - japonensis

7 - + + + + - - - + + - - huazhongensis

8 + + - + + + ostriniae

9 - + - + - + - - - - + toumanoffi

10 - + + -t- - - + - - - - indiana

11 - - - + + + - - - kumamotoensis

12 - - - + -t- + - - - + - yunnanensis

13 - - + + - - - - + - silo

14 - - - + + ■н kurstaki,sotto

15 -t- - - + + aizawai

16 - + + - - - + + - - - - dakota

17 - - - + л- + - + - - - - tochigiensis

18 - + - + - - + - - - + - pondicheriensis

19 - - - + + * Shandongiensis

20 - + + ■t- - malaysiensis

21 - - - - + - - - - + - higo

22 - - - - - - - - + + - roskildiensis

23 + sumiyoshiensis

24 - - - - - - - - - - + entomocidus

25 - - - + - - + - - - - - kyushuensis

26 + - - - - + - - - - - - Pakistani

27 + . - f. - coreanensis

28 - - mexicanensis

29 + - -- - ieesis

30 4------- - - fukuokaensis,

nigeriensis, thompsoni

31 andalousiensis

32 _ _ . _ monterrey,

colmeri

33 --_-.+-- _ . _ - kenyae,

novosibirsk

34 - - thuringiensis

35 -------- darmstadiensis

36 -------- _ _ v _ neoleonensls

37 -------- toguchini

Примечание: "+" способность к лизису,

"-" отсутствие способности к лизису.

Из представленных в таблице 7 данных следует, что 58 типовых штаммов Bt распределены между 37 фаготипами. Фаготипируемость, т.е. чувствительность хотя бы к одному фагу составляет 72,4 7.. Некоторые фаготипы включали в себя более одной культуры.

Полученные в работе данные подтверждают возможность использования метода фаготипирования наряду с другими способами для идентификации и внутривидовой классификации штаммов Bt, а также существенно расширяют и дополняют схему фаготипирования Bt (Аккерманн с соавт., 1995).

6. Выявление систем рестрикции - модификации у штаммов Bacillus thuringiensis.

В данной работе мы не ставили перед собой цели выявления причин фагоустойчивости культур или снижения эффективности посева (ЭП) фагов на исследуемых штаммах Bt. Однако для одного из фагов- Kuml- были изучены причины столь резкого ограничения развития фага на некоторых штаммах.

Как видно из таблицы 8 ЭП фага Kuml на чувствительных к нему штаммах снижена на несколько порядков по сравнению с индикатор-

ным штаммом Вас.сегеиэ 569.

Для выявления причин снижения эффективности развития фага на некоторых культурах (снижение адсорбционной способности или наличие в клетках эндонуклеаз рестрикциит.т.е. системы рестрикции-модификации (РМ)) были определены константы адсорбции фага Кит1 на штаммах, ограничивающих рост фага. На большинстве штаммов адсорбция фага была снижена, однако для двух культур уаг. заропепзхБ (Н23) и уаг. 1еез1з (НЗЗ) в сравнении со штаммом Вас.сегеиБ 569 константы адсорбции фага Кипи практически не различались и не могли обусловить столь резких различий в ЭП.

Таблица 8.

Эффективность посева фага Кит1

Типовые штаммы 81 Эффективность посева фага*

уаг. 05Ьг1п1ае 5,0 X 10~3 уаг. ]аропепз1Б 1,8 X 10" -3

уаг. тоггхзоги 2,0 X 10~3 уаг. техгсапепзхг 9,0 X 10" •5

уаг. 1оитапо!Т х 5,5 X Ю"4 уаг. 1еез1з 2,5 X 10" -3

уаг. 1згае1еп51з 3,2 X 10~б уаг. та1ауБ1епз1з 7,0 X 10" -8

уаг. с!асо1а 6,0 X Ю-3 уаг. ЬиагЬоп^епзхэ 1,2 X 10" -4

уаг. тсИапа 7,0 X 10~3 уаг. 3 ШдЬопд1еаз1з 3,1 X 10" -б

уаг. ропсИсЬег1епз1з 1,0 х 10 4

* За 1 принята эффективность посева фага на штамме Вас.сегеиэ

569.

Возможной причиной различий в ЗП могло быть наличие в клетках штаммов 61 уаг..]аропепз15 или 1ееБ1з систем РМ, которые ограничивали развитие фагов за счет разрушения их ДНК. Для проверки данного предположения, фаг Кшп1 размножали на штамме уаг.заро-пег^Б или уагЛееБ^э и вновь оценивали его ЭП на В.сегеиБ, з'а-ропегтэ или 1ее51з соответственно.

Как следует из таблицы 9, фаг после размножения на штаммах Заропепзхэ или 1ееБ13 при повторной инфекции тех же культур соответственно ими не ограничивался , что могло свидетельствовать о наличии системы модификации у этих штаммов. Вместе с тем, не наблюдался эффект модификации при перекрестном размножении фага на штаммах заропепз!з или 1ее51з, 'что могло говорить о наличии

различных систем модификации в клетках этих культур.

Таблица 9.

Эффективность посева фага Киш1 в зависимости от культуры, на которой размножался фаг*.

Фаг х культура, на которой Индикаторный штамм

он был размножен В. сегеиэ 81 уаг. 81 уаг.

ааропегшБ 1ее513

Kuml x B. cereus i 10~3 IQ"3

Kuml x japonensis l 1 10"-

Kuml x jap.x cer. 1 10"3 H/O

Kuml x jap.x jap. 1 1 H/O

Kuml x leesis 1 10~2 1

Kuml x lee.x cer. 1 HO Ш"2

Kuml x lee.x lee. 1 HO 1

л За 1 принята эффективность посева фага на штамме Вас.сегеиз 569. " но" - не определяли

Таким образом, выявлены системы модификации у штаммов Bt var.japonensis и var.leesis и продемонстрирована их специфичность .

вывода.

1. Выделены И новых фагов из типовых штаммов Bacillus thu-riniensis, обнаруженных в различных климато-географических регионах мира. Все фаги отнесены к В1-морфотипу и по ультраструктуре разделены на две подгруппы. Обнаружены фаги с поперечными дисками на хвостовом отростке, ранее не встречающиеся у фагоа, выделяемых их штаммов Bt.

2. Спектр логического действия фагов различен, не обнаружена корреляция между морфологией фагов и спектром литического действия.

3. На основе коллекции новых фагов Bt предложена схема фаго-типирования типовых штаммов Bt.

4. Молекулярная масса ДНК фагов варьировала от 32 до 52 kb. На основе рестрикционного анализа и морфологических ха-

рактеристик фаги отнесены к 5 группам.

5. Геномы разных фагов кодируют от 4 до 8 белков. Обнаружена корреляция между морфологией фагов, структурой геномов и составом фаговых белков.

5. С помощью фага Kuml показано наличие и специфичность систем модификации у штаммов Bt двух серотипов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ.

1. Азизбекян K.P., Кузин А.И., Добржанская Е.О. Изучение ли-зогении у типовых штаммов Bacillus thuringiensis.- Биотехнология, 1993. N10. С. 8-9.

2. Кузин А.И., Азизбекян K.P. Морфология и гетеродуплексный анализ ДНК фагов Bacillus thuringiensis.-13-ый Международный конгресс по электронной микроскопии, 17-22 июля, 1994, Париж, Франция.

3. Кузин А.И., Азизбекян K.P. Фаготипирование Bacillus thuringiensis.- Биотехнология, 1995. N 3-4. С. 7-10.

4. Азизбекян K.P., Кузин А.И., Добржанская Е.О. Лизогения типовых штаммов Bacillus thuringiensis.- 10-ая Международная конференция по глобальным аспектам прикладной микробиологии и биотехнологии, 6-12 августа,1995, Эльсинор, Дания, С. 97.

5. Азизбекян K.P., Кузин А.И., Добржанская Е.О. Изучение спектра литического действия фагов, выделенных из типовых штаммов Bacillus thuringiensis и использование фаготипирования для идентификации штаммов Bacillus thuringiensis. - Биотехнология, 1996, N 6, С. 1-5.

о. Азизбекян K.P., Кузин А.И., Шамшина Т.Н., Добржанская Е.О. Морфологическая характеристика и белковый анализ фагов выделенных из типовых штаммов Bacillus thuringiensis. - Микробиология, 1997 (в печати).

7. Азизбекян K.P., Кузин А.И., Добржанская Е.О. Рестрикцион-ный анализ ДНК фагов, выделенных из типовых штаммов Bacillus thuringiensis. - Микробиология, 1997 (в печати).