Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение клеток с микроядрами в оценке возрастных закономерностей пролиферации эпителия щитовидной железы

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение клеток с микроядрами в оценке возрастных закономерностей пролиферации эпителия щитовидной железы"

На правах рукописи

в—я

003062192

КОРАБЛЕВА Татьяна Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В ОЦЕНКЕ ВОЗРАСТНЫХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЭПИТЕЛИЯ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2007

003062192

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук

профессор Алексей Владимирович Павлов

Официальные оппоненты доктор биологических наук

профессор Всеволод Яковлевич Бродский

член-корреспондент РАМН доктор медицинских наук профессор Виктор Васильевич Банин

Ведущее учреждение Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им академика И П Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

на заседании диссертационного совета Д 208 072 04 в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 117997, Москва, ул Островитянова, д 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ РОСЗДРАВА По адресу 117997, Москва, ул Островитянова, д 1

Автореферат разослан «_£__»_ 2007 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук профессор А И Щеголев

Защита диссертации состоится «_

2007 г в « » ч

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы Многие современные молекулярные теории старения рассматривают накопление повреждений генетического аппарата соматических клеток в качестве одной из ведущих причин развития возрастных нарушений их структуры и функции (Z A Medvedev,1990, G М Martin, 1991, Р S Timiras,1994, АА Мог1еу,1995)

Фолликулярный эпителий щитовидной железы (ЩЖ) характеризуется высокой лабильностью в ответ на воздействие различных эндогенных и экзогенных факторов (А И Кубарко,С Ямасита,1998), на протяжении постнатального онтогенеза закономерно изменяются основные гистофизиологические характеристики тиреоидной паренхимы, в том числе и ее пролиферативная активность (В JI Быков, 1979, М Habraand ,N J Sarlis,2005) Последний феномен проявляется не только в неодинаковой интенсивности процессов клеточного деления в разные возрастные периоды (Ю А Романов с соавт,1969, KChnstov et al,1973, Е Conde et al,1992), но и в постепенном накоплении нерепарируемых дефектов генома тироцитов, приводящих к развитию очаговых гиперпластических и неопластических изменений органа (S Manota et al ,1995, М Takaoka et al ,1995, К Krohn et al ,2005)

Ассоциированные с возрастом генетические повреждения, приводящие к развитию нестабильности хромосомного аппарата (РА Jacobs et al ,1961, В В Ganguly, 1993, A Wojda, М Witt,2003), могут быть визуализированы на светооптическом уровне при метафазном анализе делящихся клеток или с помощью цитогенетического метода анализа микроядер Последний основан на учете в популяции количества постмитотических интерфазных клеток с добавочными ядерными тельцами (микроядрами), образующимися из ацентрических фрагментов или целых хромосом в результате воздействия генотоксических факторов разной природы (W Schmid,1975, JAHeddle et al ,1991, А Д Дурнев, С Б Середенин,1998, М Fenech,2000)

В серии исследований, проведенных ранее на кафедре гистологии Ярославской государственной медицинской академии, показано, что

микроядерный тест на модели предварительно стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов в опытах ni vivo является информативным методом оценки интенсивности влияния генотоксичных агентов на тиреоидную паренхиму (А В Павлов с соавт, 2001,2006, М А Гансбургский, 2005)

Однако данные о возможности использования цитогенетического метода исследования микроядер для изучения возрастных перестроек популяции фолликулярных тироцитов в условиях естественного уровня клеточного обновления эпителия ЩЖ в литературе отсутствуют Продолжает оставаться недостаточно изученным ряд важных количественных характеристик пролиферативной активности тиреоидного эпителия, необходимых для понимания механизмов развития нестабильности генома при старении (возрастная динамика формирования хромосомных аберраций, величин суточного пролиферативного пула и плоидности паренхимы) Учитывая очаговый характер и неравномерную выраженность пролиферативных процессов на уровне органа (Р А Гибадулин, Ю А Романов, 1966, В А Глумова с соавт,1980, AFaggiano et al ,2004), существенный интерес представляет исследование возрастной динамики размножения железистых клеток в составе основных структурных компонентов тиреоидной паренхимы (фолликулы, интерфолликулярный эпителий)

Цель исследования - анализ возрастных закономерностей пролиферации фолликулярного эпителия щитовидной железы, приводящих к образованию клеток с микроядрами и проведение на этой основе оценки развития нестабильности генома данной клеточной линии при старении Задачи исследования.

1 Изучение возрастной динамики величин митотического индекса и суточного пролиферативного пула популяции фолликулярных тироцитов щитовидной железы лабораторных белых крыс

2 Исследование частоты патологических митозов железистых клеток в основные возрастные периоды

3 Анализ динамики содержания клеток с микроядрами в тиреоидной паренхиме на протяжении постнатального онтогенеза

4 Морфометрическое и цитофотометрическое (содержание ДНК) изучение ядерного аппарата микронуклеированных тироцитов

5 Изучение особенностей возрастной динамики пролиферации железистых клеток в составе основных структурных компонентов тиреоидной паренхимы

Научная новизна Впервые в рамках целостного исследования детально исследована возрастная динамика формирования микронуклеированных тироцитов во взаимосвязи с пролиферативными процессами в тиреоидной паренхиме Установлен закономерный фазовый характер феномена онтогенетического накопления тироцитов с микроядрами, выявлена прямая корреляция между интенсивностью процессов микронуклеации и частотой патологических митозов железистых клеток по мере старения организма

При цитофотометрическом и морфометрическом анализе ядерных структур аберрантных клеток впервые установлено, что возрастное формирование тироцитов с микроядрами связано с активизацией кластогенных механизмов повреждения генетического аппарата и не сопровождается процессами их полиплоидизации

Впервые определена величина суточного пролиферативного пула тироцитов на уровне тиреоидной паренхимы в целом и отдельных ее компонентов (фолликулы различных размерных классов, интерфолликулярный эпителий) в основные возрастные периоды постнатального развития крыс

Основные теоретические положения, выносимые на защиту

1 На протяжении постнатального онтогенеза крыс в фолликулярном эпителии увеличивается частота патологических митозов и клеток с микроядрами, наиболее интенсивно эти процессы выражены при старении

2 Связанное с возрастом формирование микронуклеированных тироцитов развивается в рамках сохранения диплоидного генома

3 В основе феномена усиленного формирования микронуклеированных тироцитов при старении лежат преимущественно кластогенные механизмы повреждения генома железистых клеток

Научно-практическая значимость Полученные результаты

конкретизируют механизмы и условия формирования клеток фолликулярного эпителия щитовидной железы с микроядрами в постнатальном онтогенезе, как чувствительного морфологического маркера развития возрастной нестабильности их генома Оценка интенсивности образования тироцитов с микроядрами в условиях естественного уровня клеточного обновления в тиреоидной паренхиме может быть использована для раннего выявления ассоциированных с возрастом нарушений пролиферации железистого эпителия в качестве одного из возможных морфологических критериев оценки риска развития неопластических поражений органа, а также при биомониторинге влияния антропогенных факторов на паренхиму щитовидной железы

Внедрение Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии Рязанского государственного медицинского университета, Смоленской государственной медицинской академии, а также в практику научных исследований отдела радиоэкологии Института биологии Коми НЦ УрО РАН

Апробация работы Материалы диссертации доложены и обсуждены на 7 и 8 Международных симпозиумах «Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки» (Архангельск,2005,2006), 5 Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле» (2006), VIII Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006)

Публикации по теме диссертации По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ

Структура и объем диссертации Диссертация объемом 92 страницы машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, методической главы, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов,

практических рекомендаций и библиографического указателя Работа содержит 6 таблиц и 25 рисунков (в том числе 55 микрофотографий, 15 графиков и диаграмм, часть иллюстраций дана в виде монтажей) Список литературы включает 159 источников, в том числе 115 иностранных

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Опыты выполнены на 156 белых крысах Вистар (самцы) разного возраста с точной датой рождения, выращенных в стандартных условиях кафедрального вивария, эвтаназию производили передозировкой паров эфира Распределение животных по возрастным группам и сериям наблюдений представлено в таблице 1

1 серия - на гистологических срезах (фиксация по Буэну, окраска гематоксилином с эозином) ЩЖ изучена возрастная динамика митотического индекса (МИ) фошшкулярных тироцитов

2 серия - авторадиографическое выявление ДНК-синтезирующих клеток (3Н-тимидин, удельная активность препарата 914 ГБк/ммоль, разовая доза -

з

30 Бк/г массы, внутрибрюшинное введение) 4 инъекции Н-тимидина с интервалом 7,5-8 ч , взятие материала - через 1 ч после последней инъекции изотопа, общая продолжительность опыта составила 24 ч

3 серия - на мазках изолированных тироцитов изучена возрастная динамика содержания клеток с микроядрами

4 серия - эксперименты по морфологическому и морфометрическому анализу микроядер тироцитов, образовавшихся при действии факторов с заведомо известными механизмами повреждений генетического аппарата

а) с целью моделирования кластогенного эффекта (И А Алов, 1972) 8 крысам проводили однократное гамма-облучение всего организма (48 ч после операции, аппарат «Рокус М», источник мощности дозы - 1,847 сГр/с, дозы 2,0 и 4,0 Гр),

б) для моделирования анеугенного эффекта через 48 ч после операции 6 крысам однократно внутрибрюшинно вводили 0,1% водный раствор колхицина в дозе 1 мг/кг массы (Т Vallanm-Kelly, Р Morales-Ramirez, 1998)

Таблица 1

Распределение животных по возрастным группам

Период постнатального развития крыс (Зстаднюк с соавт, 1974) Серии опытов

Изученные сроки 1 2 3 4 Beere

I Период молочного кормления -

а) новорожденные (1-3 сут) 1, 3 сут 6 4 6 - 16

б) сосуны (6-21 сут ) 6,9, 12, 15, 18,21 сут 18 - - - 18

II Период полового созревания а) инфантильные (22-50сут) 24,27, 30 сут 9 6 6 _ 21

б) ювенильные (51-120сут) 2, 3,4 мес 9 - 6 - 15

III Период репродуктивный

а) молодые (5-10 мес) 6, 7 мес 10 12 6 14 42

б) взрослые (11-18 мес) 12 мес 4 - 6 - 10

IV Период выраженных старческих изменений

а) предстарые (19-23 мес ) 19 мес - - 6 - 6

б) старые (24-30мес) 24,30 мес 10 6 6 - 22

в) предельно старые (31-40 мес) 32 мес - - 6 - 6

ИТОГО 156

Дня индукции пролиферации тироцитов использовали левостороннюю гемитироидэктомию (А В Павлов,Е М Антипанова, 1988, А Н Гансбургский с соавт ,2000) Операции проводили под общим гексеналовым наркозом, через 9-10 сут крыс забивали, контролем служила удаленная во время операции доля ЩЖ

Изолированные тироциты получали погружением фрагментов ЩЖ на 22,5 ч в 0,25% раствор коллагеназы для панкреатических островков (Sigma,USA) при 37°С Мазки фиксировали 96% этанолом, окрашивали по Фельгену (гидролиз в 5н HCl в течение 12 мин при 37°, окрашивание реактивом Шиффа 1 ч) или галлоцианин-хромовыми квасцами по Эйнарсону с подкраской цитоплазмы световым зеленым или нафтоловым желтым

Частоты (в %) микронуклеированных и двуядерных тироцитов определяли при подсчете 1-2 тыс клеток у животного, кроме того, рассчитывали среднее число микроядер в 1 аберрантной клетке Измерение размеров микроядер проводили после предварительного захвата изображений с помощью программно-аппаратного комплекса МИКМЕД-2-1600 (НПО ТелеМедТехника, Россия) Для измерений использовали программу анализа изображений UTSCSA Image Tool for Windows (version 3 0) Среднюю площадь микроядра выражали в относительных единицах (за 1,0 принимали общую площадь ядерных структур аберрантной клетки)

С помощью цитофотометра МИФ-К (МГУ) при длине волны 580 нм на мазках тироцитов, окрашенных по Фельгену, изучали плоидность популяции У каждого животного митотический индекс тироцитов определяли при подсчете 710 тыс клеток, величины индекса меченых ядер (ИМЯ) - при подсчете 1000 клеток в фолликулах каждого размерного класса и в интерфолликулярном эпителии

Количественные результаты обрабатывали на персональном компьютере класса Pentium IV с помощью программ Statistica (version 6 0) и GrafPad Pnzm for Windows (version 4 00)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На протяжении постнатального онтогенеза крыс в паренхиме ЩЖ выявляется устойчивая тенденция увеличения частоты тироцитов с микроядрами, средний темп прироста составляет 0,0013% в сутки (табл2) В ходе процесса можно выделить 3 основные фазы

а) Новорожденные-2 мес В этот период отмечено увеличение содержания микронуклеированных тироцитов в 2 раза по сравнению с исходным уровнем (р<0,05), темп прироста аберрантных клеток максимален - 0,003% в сут,

б) 2 мес —12 мес Концентрация аберрантных клеток стабилизируется на уровне 0,31-0,36%,

Таблица 2

Содержание тироцитов с микроядрами в паренхиме ЩЖ крыс в постнатальном онтогенезе (X + sx)

Возраст Частота клеток с микроядрами, % Среднее число микроядер в аберрантной клетке

Новорожденные 0,14 ±0,02 1,0

1 мес 0,24 ± 0,02 1,0

2 мес 0,31 ±0,03 ' 1,0

7 мес 0,30 ± 0,03 ' 1,0

12 мес 0,36 ±0,03 ' 1,06

19 мес 1,10 + 0,05 1,09

24 мес 1,09 ± 0,04 ; 1,05

32 мес 1,33 ±0,11 7 1,06

Примечание р < 0,05 по сравнению с новорожденными ( ' ) и предыдущей возрастной группой ( )

в) 19-24-32 мес У стареющих и старых животных отмечен выраженный рост содержания микронуклеированных тироцитов в 3-3,5 раза по сравнению с предыдущим периодом (р<0,05) и в 7,9 раза по сравнению с новорожденными (р<0,01), темп прироста количества аберрантных клеток достигает 0,0017% в сут Начиная с 12 мес появляются тироциты с 2 микроядрами, поэтому среднее число микроядер в расчете на аберрантную клетку возрастает до 1,05-1,09

В условиях содержания в стандартных условиях вивария, направленных на исключение (или, по крайней мере, минимизации) влияния повреждающих факторов внешней среды (химические мутагены, радиация и др), число образовавшихся тироцитов с микроядрами зависит не только от количества накопленных с возрастом нерепарируемых дефектов генома, но от интенсивности процессов клеточного деления в тиреоидной паренхиме

Выявленная в ходе выполнения настоящего исследования динамика пролиферативной активности тироцитов на протяжении постнатального развития крыс совпадает с данными литературы (К Chnstov et al ,1973, Е Conde et al ,1992, A G Saad et al ,2006) средние значения митотического индекса (МИ)

максимальны У новорожденных крыс (7,2%о) и плавно снижаются к концу 2 месяца (1,4%). В репродуктивном возрасте и при старении в ЩЖ сохраняется достаточный уровень клеточного размножения (МИ=1,3 %о у 7-месячных и 1,5%о у 30-месячных животных. Результаты прямого определения значений суточного п рол и ф ер эти вн о го пула тироцитов (Рс) повторными инъекциями 3Н-тимидина (2 серия) тесно коррелируют с результатами подсчета величин МИ: средневзвешенные значения Рс , рассчитанные с учетом п ро лиф ер атив ной активности фолликулов разной величины и их частот в тиреоидной паренхиме, у крыс в возрасте 1, 7 и 24 мес. составили соответственно 3,99; 1,15 и 0,94%.

У животных репродуктивного возраста и в период выраженных старческих изменений наблюдается прогрессирующий рост частоты патологических митозов тироцитов, связанных в большей мере с кластогепным (отставание и фрагментация хромосом в метафазе, набухание и слипание хромосом) и, в меньшей степени, с анеу генным (рассеивание хромосом в метафазе, трехгрупповая метафаза, многополюсный митоз, асимметричный митоз) механизмами повреждения их генетического аппарата (рис.1).

16

12

- я

■ ' 1

ст I 1

1,3/1,3 К 7.5.М

РЧ щ Г 1

а Повреждения хромосом

□ Повреждения митотического аппарата

1 мес, 7 мес, 30 мес.

Рис.1. Доля основных разновидностей патологических митозов в % от всех делящихся тироцитов у крыс разного возраста (ось абсцисс, мес). Количество митотических фигур в каждой возрастной группе принято за 100% (ось ординат).

Сохраняющийся у половозрелых и старых животных достаточно высокий уровень клеточного деления и нарастающая частота хромосомных аберраций являются объективными предпосылками для полноценной реализации механизма постмитотической микронуклеации, обеспечивающего перевод накопившихся с возрастом латентных повреждений генома тироцитов в морфологически идентифицируемые клеточные формы

Наблюдаемый в первые два месяца жизни крыс рост количества тироцитов с микроядрами может быть объяснен высоким уровнем митотической активности железистых клеток По достижении репродуктивного возраста и при старении пролиферация тиреоидного эпителия выходит на «плато» Поэтому, учитывая достаточно стабильный уровень клеточного размножения на протяжении большей части жизни половозрелых и старых животных, можно сделать обоснованное заключение выявленные особенности динамики содержания тироцитов с микроядрами в эти периоды постнатального развития реально отражают феномен возрастного накопления уровня нерепарируемых генетических повреждений ядерного аппарата железистых клеток ЩЖ

С данными морфологического анализа патологических митозов тироцитов хорошо согласуются результаты морфометрического изучения микроядер В ряде работ убедительно показано, что уровень клеток с крупными микроядрами тесно связан с патологией митотического аппарата, а мелких - в основном со структурными аберрациями хромосом (В Hogstedt,A Каг1ззоп,1985, N Котае ег а1,1997), при этом обнаруживается прямая связь между содержанием крупных и центромер-позитивных микроядер (К Уапс1егкегкеп й а1,1989)

Изучение распределения микроядер по размерным классам их относительной площади в модельных экспериментах однозначно показало, что для кластогенного и анеугенного эффектов характерен специфический характер гистограмм (рис 2,а) Более 95% экспериментальных точек при гамма-облучении находится в интервале 0,01-0,19, а при введении кохицина - в интервале 0,19-0,43 Поэтому уровень 0,19 выбран в качестве границы между двумя размерными классами микроядер - мелкими (А) и крупными (В)

Разработанные критерии явились объективной основой оценки соотношения выраженности основных механизмов повреждения генома тироцитов в разные возрастные периоды (рис 2,6)

а) новорожденные Среди аберрантных тироцитов преобладают (72,7%) крупные микроядра класса В с максимумом размерного класса 0,31 (27,2%)

б) 1-2 мес По сравнению с новорожденными происходит снижение частоты крупных микроядер класса 0,31 до 19,6% и выраженный роете 4,6% до 15,2% частоты мелких микроядер класса 0,13, в небольшом количестве появляются микроядра класса 0,04 (2,2%) Суммарная доля микроядер класса В снижается до 65,2%, а микроядер класса А — возрастает до 34,8%

в) 24 мес Частота микроядер класса 0,31 снижается до 4,5%, в то время как доля классов 0,04 и 0,13 продолжает возрастать (до 8,2% и 19,7%) Итогом вышеописанной тенденции является преобладание мелких микроядер (А) над крупными (В) - соответственно 60,7% и 39,3%

Вследствие этих изменений средняя площадь микроядер тироцитов у старых крыс уменьшается на 20% по сравнению с новорожденными животными (р<0,05) Данные наблюдения в сочетании с результатами анализа возрастного накопления патологических митозов тироцитов свидетельствуют, что усиленное формирование аберрантных клеток в паренхиме ЩЖ при старении связано с активизацией механизмов кластогенного повреждения их генома

По всей вероятности, эта закономерность характерна именно для фолликулярного эпителия в культуре стимулированных к бластгрансформации лимфоцитов при старении наблюдается обратный процесс - накопление крупных центромер-позитивных микроядер (М Fenech,A Morley,1985, JHNorppa, G С Falck,2003)

Полученные результаты подтверждают и конкретизируют применительно к рассматриваемой клеточной линии справедливость общей закономерности -роста количества повреждений генома клеток при старении, показанной ранее как для обновляющихся (гемопоэтические клетки - S М Smgh et al ,1986, S Sato et

Рис 2 Распределение микроядер тироцитов по классам площади (А - мелкие, В - крупные) в модельных опытах (а) и постнатальном онтогенезе крыс (б) По оси абсцисс - средняя площадь микроядра в относительных единицах (за 1,0 принята общая площадь ядерных структур аберрантной клетки), по оси ординат - % клеток каждого класса

а1, 1996, Б Натаск Ы а1,2003, лифоциты периферической крови -М РепесЬ,А Мог1еу,1985, С Во1о§пез1 е1 а1,1999), так и растущих (гепатоциты -И В Урываева, Г В Делоне,1992, И В Урываева с соавт ,1999) популяций В свете представлений о важной роли генетических повреждений тироцитов в инициации процессов их неопластической трансформации (в Та1Ьш,2002) полученные нами данные хорошо согласуются с наблюдениями М Такаока е1 а1 (1995) о росте частоты спонтанных опухолей ЩЖ у старых крыс

Несмотря на то, что популяция фолликулярных тироцитов интактных крыс на протяжении постнатального онтогенеза сохраняет преимущественно диплоидный характер, в течение всей жизни животных имеет место отчетливое увеличение количества полиплоидных (2с х 2) элементов, наибольшие темпы прироста отмечены к концу первого месяца жизни и у старых крыс (табл 3) Результаты цитофотометрии ДНК в аберрантных клетках свидетельствуют, что при старении организма нормальное течение хода митоза тироцитов, несущих в себе отделившиеся фрагменты хромосом или целые хромосомы и трансформирующиеся впоследствии в микроядра, не нарушается и заканчивается цитотомией Об этом говорит тот факт, что все железистые клетки, содержащие микроядра, являются диплоидными По всей вероятности, это связано с относительно невысокой генотоксичностью эндогенных факторов, накапливающихся в тироцитах при старении при действии супермутагена (метилнитрозомочевины) развивается блокада процессов цитотомии, приводящая к формированию тетраплоидных клеток (А В Павлов с соавт ,2005) Следовательно, тиреоидный эпителий, в зависимости от степени повреждения генома, за счет переключения внутриклеточных сигнальных путей способен формировать аберрантные тироциты различного уровня плоидности

Впервые проведенное в настоящем исследовании прямое определение величин суточного пролиферативного пула тироцитов после повторных инъекций 3Н-тимидина у ювенильных, половозрелых и старых животных (табл 4), позволило провести оценку пролиферативной активности фолликулов разной величины и интерфолликулярного эпителия в основные возрастные периоды

Таблица 3

Процентное содержание в популяции тироцитов с различным количеством ДНК у крыс разного возраста (в расчете на 1 клетку)

Возраст животного Тип клеток

Одноядерные Двухядерные Микро-нуклеированные

2с 4с 2с х 2 4с х 2 2с 4с

Новорожденные 99,70 0,04 0,12 - 0,14 -

1 мес 98,47 - 1,22 - 0,31 -

7 мес 98,13 - 1,57 - 0,30 -

12 мес 98,13 - 1,51 - 0,36 -

24 мес 97,17 - 1,74 - 1,09 -

32 мес 96,49 - 2,18 - 1,33 -

Показано, что основной вклад в суммарный пролиферативный пул тиреоидной паренхимы вносят мелкие фолликулы (класс А диаметр 15-39 мкм, 4-10 клеток на поперечном срезе), с возрастом степень их участия постепенно снижается с 85% у новорожденных до 49% у 2-летних животных Одновременно с 15 до 45% возрастает пролиферативный потенциал средних фолликулов (класс В диаметр 40-85 мкм, 11-30 клеток на поперечном срезе) Суммарный вклад более крупных фолликулов (классы С,О) невелик - он не более 8% у 7-месячных и 5,4% - у 24-месячных крыс

Большинство патологических митозов тироцитов (75% у 7-месячных и 62,5% у 24-месячных крыс) обнаруживается в составе мелких фолликулов, 2537,5% аберрантных фигур деления - в составе средних фолликулов В крупных фолликулах (классы С,О) аномальные митозы единичны

Значения Рс клеток интерфолликулярного эпителия не превышают таковых для тироцитов в составе микрофолликулов соответствующего возраста, это не подтверждает существующих представлений, что в тиреоидной паренхиме интерфолликулярные эпителиальные структуры выполняют роль своеобразных камбиальных зон (Ю А Романов, 1962, В А Глумова, 1986)

Таблица 4.

Суточный пролиферативный пул фолликулярных тироцитов крыс разного возраста (4 инъекции 3Н-тамидина на протяжении 24 ч., %, X + к

Возраст животного Классы фолликулов Интер-фолликулярный эпителий

мелкие (А) средние щ крупные (С) сверхкрупные Ф)

1 мес. 4,90+0,24 2,85+0,18 2 1,49±0,54?3 - 5,05+0,72 **

7 мес. 2,2210,22 1 0,66+0,15й 0,53^0,18/г 0,91 +0,4 \г 1,61+0,17^"

30 мес. 1,20+0,10 0,89+0,18 0,27±0;08" 0,90+0,12'' 0,87+0,35

Примечания: ' - р<0,05 по сравнению с предыдущей возрастной группой в том же размерном классе фолликулов; ^-р<0,05 по сравнению с мелкими фолликулами (А),.3 - р<0,05 по сравнению со средними фолликулами (В), 4 - р<0,03 по сравнению с крупными фолликулами (С) в той же возрастной группе.

Нов. 1 мес. 7 мес. 24 мес.

ОД ПБ □ С ИО

Рис.3. Рассчитанный вклад фолликулов различных размерных классов (Л-О) в суммарный пролиферативный пул тиреоидной паренхимы (принят за 100% в каждой возрастной группе, ось ординат). По оси абсцисс возраст животных, по оси ординат - значения показателей

2 Павлов А В, Кораблева Т В Значение процессов пролиферации тиреоидного эпителия в обеспечении морфогенетических преобразований тиреоидной паренхимы // Актуальные проблемы учения о тканях (Материалы научного совещания 14 апреля 2006 г) - Санкт-Петербург BMA, 2006 - с 77-78

3 Павлов А В, Кораблева Т В Влияние возраста на частоту клеток с микроядрами в фолликулярном эпителии щитовидной железы крыс // Бабухинские чтения в Орле (Материалы 5-й Всероссийской конференции, 5-7 июня 2006 г) - М Ретиноиды (Альманах) -2006 -Вып24 - с 36-38

4 Кораблева Т В, Беляков И Е Морфология аберрантных тироцитов в эксперименте и при узловой патологии щитовидной железы // Сборник научных работ студентов и молодых ученых ЯГМА Ярославль ЯГМА, 2006 - с 19-20

5 Кораблева Т В, Беляков И Е Морфометрический анализ микроядер в аберрантных тироцитах // Применение современных методов анализа в изучении структуры и функции клетки (8-й Международный научный симпозиум Северный государственный медицинский университет, 26-28 июня 2006 г) Архангельск СГМУ, 2006 - с 40-43

6 Павлов А В , Гансбургский А Н, Кораблева Т В , Ермакова О В , Миро Т JI, Беляков ИЕ Формирование клеток с микроядрами в паренхиме щитовидной железы под влиянием генотоксических агентов и при старении // Морфология -2006 - Т 129 - №4 - С 97

7 Павлов А В , Шашкина М В , Гансбургский М А , Кораблева Т В , Беляков И Е Получение изолированных клеток для цитологических и цитогенетических исследований эпителия щитовидной железы// Морфология - 2006 -Т130 -№6 -С 81-83

Лицензия ПД 00661 от 30 06 2002 г Печ л 1 Заказ 296 Тираж 100 Отпечатано в типографии Ярославского государственного технического университета г Ярославль, ул Советская, 14 а, тел 30-56-63

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кораблева, Татьяна Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ЗНАЧЕНИЕ ЦИГОГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА ИЗУЧЕНИЯ МИКРОЯДЕР В ОЦЕНКЕ ВОЗРАСТНЫХ ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ (обзор литераторы}

1.1. Молекулярные основы возрастных вменений клеточного генома.

1.2. Свойства н механизмы образования клеток с HHtpOUplMH

1.3. Возрастные особенности ибрвЮМШШ игакронуклеированиых клеток в специализированных популяциях. . .г,,,.

1-4, Клеточное деление, соматическая полиплоидия и нарушен 11ч генома фолликулярных тироцитов в онтогенезе.

Глам II МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава Ш. АНАЛИЗ КЛЕТОК С МИКРОЯДРАМИ В ОЦЕНКЕ ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ЗАКОНОМЕР1ЮСТЕЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ ФОЛЛИКУЛЯРНОГО ЭПИТЕЛИЯ

ЩИТОВИД НОЙ ЖЕЛЕЗЫ.

Ш-Е Микроскопически* ttpyttypa мнкроядер.

111.2. Возрастная динамика содержания микронуклеировлнных тироитов.

111.3. Морфометричеека* характеристика мнкроядер.

BL4. Плоидность тирсондной паренхимы.

111,5, Пролиферация фолликулярного эпителия в постнатииш! онтогенезе

1II 5.1 Митошчсскм ШГГИИНОСТЬ тироцитов.

IIL5.2. Синтез ДНК в фолликулярном и иигсрфоллнкуляриом эпителии.

IIL5J Формирование генетически поврежденных клеток п фолликулах р¡иного размера.

Глава IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение клеток с микроядрами в оценке возрастных закономерностей пролиферации эпителия щитовидной железы"

Люнщлежуяге яряД.-иг-чм Многие современные Молекулярные корим старения рассматривают накопление повреждений генетического аппарата соматических клеток в качестве одной vit ведущих причин развития №> цветных нарушений их структуры и функции {'L AMedvcdev,l99D, G M.Mnrlin.lWl, Physiological basis of aging aftd geriatrics, 199J; AA-Morley. 1995).

ФомшуИфИкй эпителий щитовидной жслеты (ЩЗК) хapaxTepiлустся высокой лабильностью в ответ на воздействие различных эндогенных и экзогенных факторов (Щитовидная железа: Фундаментальные аспекты, 199В), на цротнже1гаи поетниталыного онтогеием такоиомерно юнашпа основные гнстофипнолотческие ХИрбктернстикк тзгреоидной шренхкыы, в том числе и « пролнферлтнвная активность (В.Л.Быков, 1979; M Habraand.NJ,Sariis, 2003). Последний феномен проявляется не только в неодинаковой ннтсисив-itocni процессов клеточноги деления в разные возрастные периоды (Ю-А.Ромаяов с сОМт.,1%9; K Christov et al.,1973; E.Conde el al ,¡992), но н в постепенном накоплении неренарнруемых дефектов генома пгроцнтов, Прщтл'Щчл к развитию очаговых iitiiepíuiacTUHccKHX и неоцластичсских изменений органа (SAfañotti et ¡ti,1995; MTakaofca et at. [99$; KXrohn et al.JOOS).

Ассоциированные с возрастом генетические повреждения. приводящие ü развитию нестабильности хромосомного аппарата (Р A Jacobs et a] ,1961, BSGangíiJ)', J 993; A.Wojlda, М.ОДаДШЭД могут быть шауыиЯфОМШ «a свегоолтнческом уровне при метвфдзном пилим делящихся клеток или с Помощью iMtoi еретического метода анализа мнкроядер- Последний основан Ha учете в популяции количества постмитотических интерфвзных клеток с добавочными ядерными тельцами (мнкроялрамн), образующимися из ацентрических фрагментов или целых хромосом в результате воздействия генотокснческих факторов разной природы {W.Schmid,197S; J A.Hcddlc d al. ,1991, А.ДДурнев. С.Б.Середеннл,1998, M.FencchJOOO).

В серии исследований, проведенных ранее «в кафедре пимолопги Ярославской государственной медицинокоЯ академии, покатано. что микроядериый тест на модели (фЩрюМЙ стимулированных к размножению фолликулярных тироцитов в опытах ¡n vivo является информативным методом оценки интенсивности влияния гснотоксичных агентов на шреоидпу» паренхиму (АВ-Павлов с соаат-, 2001Д006; М-А.Гоисбурзский, 2005).

Однако данные о возможности использования цитогеистичсекого метода исследования мнкроядер для изучения возрастных перестроек популяции фолликулярных тироцитов в условиях естественного урони клеточного обновлен«* эпителия ЩЖ ■ литературе отсутствуют. Продолжает «таиться недостаточно Изученным ряд важных количественных характеристик проли-фератнвиой я« нвиости тиреоилиого эпителия, необходимых для понимания механизмов развитая нестабильности генома нрн старении (возрастная динамика формирования хромосомны* аберраций, величин су-точного лролмфе-ратиаиого пула и плотности паренхимы). Учтивая очаговый характер и неравномерную выраженность пролиферд! и иных процессов На уровне oprnitn (РЛГнбиулян, Ю-А-Ромаков, 1966: В.Л.Глумова с еоавт.,1980; A Faggiano ct al.,2004), существенный интерес представляет исследование возрастной динамики размножении железистых клеток в составе основных структурных компонентов тиреоидной паренхимы (фолликулы, и i гтерфодл и кулярн ы й гкпи-телнй).

Или ucc.icitf>«aNiin • анадиз возрастных закономерностей пролиферации фолликулярного эпителия щитовидной железы, приводящих к образованию клеток с мнкроядрами и проведение на зтой основе оценки развития нестабильности цкома данной клеточной линии при старении

Задачи ист. мЛошшй: 1. Изучение возрастной днианнхи величин читотического индекса и суточного проднфердтивного пула популяции фолликулярных тироцитов шн-товилиой железы лабораторных белых крыс

2- Исследование частоты патологических митозов железистых клеток в основные возрастные периоды.

3. Анализ динамики содержания клеток с микроядрами в тнреондной паренхиме на протяжении постнагалыюго онтогенеза

4. Морфомстричсскос н цигофотометрическое {содержание ДНК) изучение ядерного аппарата м нкроиуклеиромн им* тироинтов

5. Изучение особенностей возрастной динамики пролиферации железистых клеток в составе основных структурных компонентов тнреондной паре их ими

Научная пышна Вперньк к раммш »клостиого исследования детально исследована возрастная динамика формирования м нкронутспсированных тироцнтои во взаимосвязи с пролнферативиыми процессами в тнреонд-ной паренхиме. Установлен закономерный фазовый характер феномена онтогенетического накоплении тнроцнтов с микроядрамн. ьыяюена прямая корреляция между интенсивностью процессов мтфопуммоин и частотой патологических митозов желез истых клеток 1Ю мере старения организма

При цитофотометрическом и морфомстрическом анализе ядерных структур аберрантных клеток впервые установлено, что возрастное формирован}« тнроцнтов с мнкроядрами связано с активизацией кластогенных механизмов поврежден}« генетического аппарата и не соор<тождде1ся процессами их полнплондизаими

Впервые определи« величина суточного пролнфератнвного пула тироцитов на уровне тнреондной паренхимы в целом и отдельных се компонентов (фолликулы различных размерных классов, интерфолликуляриый ut и гелий) в основные шмрасшые периоды постиатадыюго рюиитня крыс Основные теоретические положения, «ыноеимые на ланиту

1. lía протяжении пoctiштильного онтогенеза крыс в фолликулярном эпителии увеличивается частота патологических митозов и клеток с микроядрамн, наиболее интенсивно эти процессы выражены при старении.

2. Сыпанное с возрастом формирование микронукленроппных тнроии-тов развивается m райках сохранения диплоидного генома.

3, В основе феномена усиленно™ формирования микроиукленрованных лгрощктов при старекин дежаг ((¡«имущественно joacroreMMUt мешинтмы повреждения генома железистых клеток

H ну чип- пгшкт и ч ескаа шачичммь Полученные результаты конкретизируют механизмы и условия формирования клеток фолликулярного эпителия щитовидной железы с ыикроялрамн а постиатадьном онтогеиеэе, как чуастаителыюго морфологического маркера развития позрастной нестабильности их генома. Оценка иитенснмюсти обраюйания гнрошгтов с чигроядрами в условиях естественного уровня клеточного обновления в тнреондной паренхиме и о жег быть использована для раннего выявления ассоциированных с возрастом нарушении пролиферации железистого эпителия в качестве ОДНОГО Hl возможных морфологических критериев оценки риска развития неоплпетических поражений Органа, a также при биомонитормпе влияния антропогенных факторов >а паренхиму щитовидной железы.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Кораблева, Татьяна Владимировна

вы воды Пролнфсративиая активность фол л юсу л я р н ы* тироцнтов максимально у новорожденных крыс и равномерно снижается к концу периода полового созревания, У жнвощых репродуктивного нозркп и при старении суточный пролиферативный пул иселетистых клеток ставил тируется иа уровне 0,9-1.1%.

2. На протяжении поетнатального развития наблюдается шестикратное увеличение частоты форм патологн'меких митозов тироцнтов, связанных как с кластогениым (отставание и фрапленнидня хромосом в метафазе, набухание II слипание хромосом) так н ваеугеииым (рассеивание хромоеом л метафазе, трсхгрупповая метафаза. многополюсный митоз, асимметричный митоз) мехв1ппмлмн повреждена генепгчсского аппарата железистых клеток.

3- Возрастная динамика содержания мнкронукленрованиых клеток в тиреоидноП паренхиме имеет фмо«ый характер: двукратный подъем в течение первого месяца, стабилизация показателя на уровне 0,3-0.4% в ювеиильнм и репродуктивном возрасте, выраженный рост до 1,1-13% у старых животных.

4. Популяция фолликулярных троинтов на протяжешм жизни имеет преимущественно диплоидный характер, количество полиплоидных (2с х 2) клеток увеличивается с 0,12% у новорожденных до 2.2% у старых крыс Формирование мнкронукленрованиых тироиитов не с о« гро м ждается их поли плоили за циеН

5. В щитовидной железе гсмитнрондэктомироваиных половозрелых животных при моделировании кдостогенного воздействия (гамма-облучение) формируются тнроцнты только с мелкими, а анеутенного повреждения (введение колхицина) - с более крупными ыикроядрами, еостаадиющими соответственно 7.6%(!-19%}н 32%(19-43%) от суммарного объема ядерного аппарата оберршгтной клетки.

6. Средний объем мнкроялер в тирошгтах при старении уменьшаете* ни 20% по сравнению е новорожденными та счет прогрессирующего hçMTUOU частоты рммеришх классов мелких мнхроядер. Это с в ндегельсгв) ег, что и основе феномена усиленного формирования аберрантных тирощгтов у сирых животных лежит активизация шнюпшк механизмов повреждения генома железистых клеток

7. На протяжении поста зталыгого развития крыс пролиферативные процессы в тирсоидной паренхиме в большей мере обеспечиваются делением клеток в составе мелких фолликулов и, в меньшей степени, - в составе фолликул» среднею размера; патологические митозы тирощгтов наиболее часто обнаруживаются в мелких фолликулах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Разработанная модель постановки микроядерного теста с использованием в качестве клеточной системы популяции фолликулярных тнроютов без доекммн тельной стимуляции гтроднферагивной активности тиреоидной паренхимы может был. рекомендована для углубленного морфологического анализа развития возрастной нестабильности генома тнрошгтои. раннего выявления ассоциированных с возрастом нарушений пролиферации эпителия, а также биомониторннга влияния антропогенных факторов на паренхиму щитовидной железы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кораблева, Татьяна Владимировна, Москва

1.Алешин БВ О некоторых спорных вопросах современной цитофизиологни щитовидной железы .■'.•' Успехи совр. биологии - 1982. - Т. 93. -Л 1, -С. 121-138

2. Алов НА, Цптофи-шатогия н патология митоза. М-: Медицина, 1972.-263 с.

3. Алов И-А , Казатгъев В В О судьбе отставших хромосом и микроидер И Доклады АН СССР. 1969. - Т. 187. - № I. - С. 191-192.

4. Лрхипснхо В.И. Фсдчеико Н-П, Некоторые особешюетм структурной организации щитовидной железы // Лрх.аиат. 1983- - Т, 85, -Ж 12.-С. 27-34.

5. Бродский В, Я., Урыиаева ИВ Клеточная полиплоидия Пролиферация и лнфференцнровка М. : Наука» 1981. -259 с.

6. Бродский В.Я. Полиплоидия в миокарде. Компенсаторный резерв сердил" Бгалл экстр, биод.- (995.-Т. 119.-JftS.-C-454-459.

7. Быков В.Л Гнстофи за юло г и я щитовидной железы в посткаталыюм онтогенезе // Ар*, анвт. -1979, Т. 76- - № X - С. 80-94,

8. БыковВ Л Стереологичсскяй ана/пгз щитовидной жеясш (обзор методов) Н Арх. анат. 1979а, - Т-77. - №7 -С, 124-132,

9. Быков В Л. Гетерогенность пуповидной железы млекопитающих и возрастные изменения органа // Арх. анат 1979Ь. - Т. 77. - 10. - С-61-71.

10. Гансбургский А Н,, Павлов А.В. Митоптческое происхождение двуядерных клеток в регенерирующем эндотелии Н Онтогенез, 1993. - Т. 24, - ^ 6. - С-79-82.

11. Гансбургский А-Н., Миро ТЛ„ Аиашкииа Е Н. Гансбургский М-А. Кинетика клеточной пролиферации в регакрирующей щитовидной железе И Морфология 2000, - Т. 117. - № 3. - С. 35.

12. Гаисбургский М.А, Анализ клеток с микроядрами в опенкепролиферации зютедн* щитовидной железы : авгореф. днсе. . канл. мед наук. / РГМУ. M , 2005. - 20 с,

13. Гнбадулнн P.A., Романов Ю.А. Щитовидная железа / Клеточное обновление / доя ред. Л.Д Лиознсра. Л. : Медицина, 1966- С 207-219.

14. Дурнев А.Д., Середении С-Б. Мута«»гы; скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. М. : Медицина, 1998. -328 с,

15. Епифанова О.И., Тереких В В., Захаров А Ф. Радиоавтография. M, Высшая школа. 1977, - 246 с,

16. Западнюк ИЛ., Западнюк В.И., Захария Е.А. Лабораторные животные, Разведение содержание использование и эксперименте. -Киев. : Внша школа, 1974,

17. Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Образование ядерной оболочки вокруг метафазных хромосом иод действием гипотонии // Цитология. 1982. - Т. 24.- Л I.-C.S-10.

18. Захндов С,Т., Гордеем О.Ф,. Маршак ТЛ. Б|юлогнчсская модель ускоренного старения I. Динамика спонта)шых мутаций в сперматогенезе мыикй лшши SAM (ускоренно стареющих мышей) И Известия РАН : Биолога». 2001. - № I. - С. 23-30,

19. Ильнжкнх H.H., Идьниских И.Н. Бочаров Е.Ф. Цитогеиетнчсский гомеостпз и иммунитет. Новосибирск I (лука, 1986- -24« с.

20. Кирсеа ИМ., Зацепина О.В., Поляков 8.Ю., Чсндов Ю,С Ультра структура митотнческнх хромосом клеток СПЭВ при их обратимой искусственной «ЮЩМацш in vivo// Цитология. 19&8, - Т. 30.-»8.-С. 926-932.

21. Кропачова К , Мншурова Е. Продолжительность скрытого повреждения печени после окончания хронического у-облучения И Радиобиологи*, 1988. - Т.28, - AI, - С. 44-47.

22. Кропачова К , Мишурова Е. Индукция лате|гпюго повреждения печени цнклофосф амидом И Бюлп. зкегтер, биол 1989. -Т. 107. 6. С. 756-758.

23. Ликин Г.Ф. Биометрия. М. Высшая школа,! 980. -292 с.

24. Михайлова КЖ, Зацепина О-В. Структурные и имчуноиитохнмнчсс кие характеристики ядрышек, образованных в условиях трехмерно!) сепарации ядрышхового организатора хромосом И Цитология. -l993.-T.35.-te5.-C.3-9

25. Павлов A.B., Аихмшюна Е-М- Пролиферативиля активность типичных тироцитов и С- клеток в нормальной и регенерирующей щитовидной железе // Арх. анат. 1988. - Т.94. - Jftl. - С JM-99.

26. Павлов A.B. Пролиферагивная и функциональная активность парзтирощгтоя и иярофолликулярных (С-) клеток в регенерирующих околошнтовидных и щитовидной железах : лис доктора мед. наук. -Ярославль, 1990.

27. Федченхо Н П Некоторые проблемы структурной организации шитоаиляюй железы И Арх, аият, 1986 - Т,90, - Л 6, - С, Й2-89.

28. Хмельницкий О,К, Цитологическая и гистологическая диагностика заболеваний щитовидной железы. Руководство. Санкт-Петербург: СОТИС, 2002- 288 с,44. 1Цнтовидная железа: Фундаментальные аспекты > Рел А Н Кубарко и С-Яыаснта-- Минск-Нагасаки, 1998- -398 с,

29. Alben МП, Bücher N L R Laien! injury and repair in rat Нч-сг induced 10 regenerate at intervals after y-irnndiation U Cancer Res, 1960, - Vol-20.-P. 1514.

30. Allen J.W., Collins B.W„ Setzer R.W. Spermatid nticiwoclcus analysis of aging effects in hamsters 0 Mutet. Res, 1996. - Vol, 316 - N 5-6. -P. 261-266.

31. Arnes B.N. Shigenaga M.K. Oxidants are a major contributor to aging- HAaa- N Y. Acad. Sei. 1992- - Vol-663. - P. 85-96.

32. Auer G.U., liackdahl M„ Forsshmd GM, Askensten U.G. Plotdy levels in nonneoplastic and neoplastic thyroid cells И Anal Quant Cylol Hisiol -1985. Vol. 7. - N 2. - P. 97-106.

33. Bohr V.A. DNA repair fine structure and its relations to genomic Instability // Carcinogenesis. 1995. - Vol. 16. - P. 2885-2892.

34. Bolognesi C„ Abfoondwdolo A„ Swale R, |rt at,. Age-related increase of baseline frequencies of sister chromatid exchanges, chromosome aberrations, and MN in human lymphocytes // Cancer Epidemiol, Biomarkers, Prev. 1997. - Vo1.6. - P. 249-256.

35. Bolognesi C-, Lando C, Forni A. ct at.. Chromosomal damage and ageing: effect on tmcfomiclei frequency in peripheral blood lymphocytes // Age Ageing 1999 - Vol, 28. - N 4. - P 393-397

36. Brands R,F.,Sullivan L.M., O'Neil J.P. el al.| Measuremen to iHPRT mutant frequencies in T-lymphocytcs from healthy human population II MuiSL Re» 1993. - Vol. 285. - P. 267-279.

37. Bradsky V.Ya-, Uryvaeva 1,V. Genome Multiplication in Growths and Development- Biology of Polyploid and Polytene Cells, ■ Cambridge Cambridge University Press. I9S5. - 305 p.

38. Brooks A.L., Mead D.K., Peters R.T. Effect of aging on tlw frequency of metaphase chromosome aberrations in liver of the Chinese hamster //J. Gerontol. 1973 - Vol, 28 - P, 452-454.

39. Camargo R.S., Maeda M.Y, di Loreto C, (el al). Is agNOR and DNA ploidy analysis useful for evaluating thyroid neoplasms? ti Anal Quant Cytol Hisiol. 2005. - Vol. 27, - N 3, - P, 157-61

40. Castedo M-. Perfettini J.L, Roumier T fd al |. Cell death by mitotic catastrophe, a molecular defmiCiOtW Oncogene 2004, - VolJL3. -N 16.-P. 2825-2837.

41. Catalan J., Surrallesi J. Falck G.C.M ct al.. Segregation of sex chromosomes in human lymphocytesII Mutagenesis 2000. - Vol. 15. - P. 251255.

42. ChriHov К, lîollmm R-. ТЬоовд С. Thyroid follicular coll proliferation as function of age// Beilr. Pathol 1973. - Vol. 14«. - P. 152-154.

43. Conde E-, Martin-LaCBVe Ц Utrilla J.C. fct at. J. Mitotic activity of the endocrine ceiís m rat thyroid glands tfonrig postnitfal life // Endocrinology. -1992.-Vol.131. NI - P. 436-440.

44. Crowley C-, Curtis HJ The development of lomaik mutation in mice with age I/ Proc. Nat , Acad, Sel- USA, 1963. - Vol. 49 - P- 626*28.

45. Curtis H.J, Biological mechanisms underlying the aging processes ¡i Science, 1963. - Vol. 163. - P, 686-694.

46. Das N.K. Synthetic capacities of chromosome fragments correlated with their ability to maintain nucleolar material !/ J. Cell. Biol. 1962. - Vol. 15. -NI, -P. 121-130,

47. Dass S.B„ Ali S.F. Höflich RH-, Casciano DA, Frequency of iponlaneous and induced micronuclei in the peripheral blood of aging mice, // Mutai Res. 1997.-Vol. 381.-N l.-P, 105-110,

48. Faggiano A-. Coulot J., Bellon N, (d al . Age-dependent variation of follicular îi/.e and expression of iodine transporters in human thyroid tissue U J Nucl. Med 2004 - Vol. 45--N2.-P- 232-237.

49. Fenech M. Motley A- The efTect of donor age on spontaneous and induced micronuclei /I Mutat. Res. 1985.-Vol. 148. - P. 99-105.

50. Fenech M The cytokinesis-block micronuclcus technique: a detailed descripiion of the method and its application to gcnotoxicity studies in human populations // Mutat Res, 1993, - Vol, 2*5, - N I. - P. 35-44.

51. Fenech M. The in vitro micronucleus technique I/ Mutat. Res. 2000. - VoL 455. - N 1-2.-P-81-95.

52. Ganguly В В Cell division, chromosomal damage and mieronueleus formation in peripheral lymphocyte» of healthy donors: related to donor's age I/ Миш. Res. 1993. - Vol. 295. - P, 135-148.

53. Genskr H.L. Bcmsiain II. DMA damage as the primary cause of aging If Quart Rev Biot. -1984. VoL 56. - N 3. - P. 279-303.

54. Gilbert P. Pfitzer P. Facultative polyploidy in endocrine tissues ii Virehows Arch B Cell Pathol 1977. - Vol 25.- N3. - P. 233-242

55. Goldberg M,T Chidioe P. .An in vivo assay for small intestine genotoxicity H Mutat. Res. 1986. - Vol. 164.-N 4. - P. 209-215.

56. Goodman J.M. Ward R.A., Squire M.B. et al.. Neoplastic and nonneoplastic lesion» in aging Osbom-Mcndel nils U Toxicol Appt, Pharmacol- -1980.-Vol. 55. P 433-447.

57. Grawe J., Zcttcrbcrg G., Amneus H. DNA content determination of mieronucleated polychromatic erythrocyte» induced by claatogens and sptndle poison* in mouse bone marrow and peripheral Wood U Mutagenesis. 1993. -Vol. 8,-N3.-P. 249-255.

58. Gudi R., Sandhu S.S., Athwal R.S. Kinetochore identification in miefonuctei in mouse bone-marrow erythrocytes an assay for the detection of ancuploidy-inducing agents /' Mutot, Res. 1990, Vol. 234, - N 5. - 1'. 263 -268.

59. Guttcnbach M, Sehakowski R. Sclutiid M. Ancuplotdy and ageing: sex chromosome exclusion into micromnciei // Hum. Genet. 1994. - Vol. 94. -P. 295-298,

60. Hondo J , Nath J.,Tucker J. Sex chromosomes, microfiuchH and aging in women H Chromosonm. 1994 - Vol. 103. - P. 186-192.

61. Hamada S-, Naluyima K-, Serikawa Т., Hayashi M. The effect of aging on the results of the rat micronucleus assay II Mutagenesis. 2003, - Vol, 18.-N3.-P. 273-275.

62. Heddle J A., Cimino M.C, Hayashi M. ei al.. Mieronuelei as an index of cytogenetic damage: past, present, and future II Environ Mol. Mutagen. -1991, -Vol 18.- P 277-291.

63. Hogstedt B„ Kartsson A. The size of mieronuelei in human lymphocytes varies according to inducing agent used It Mutat, Res. 1985. -Vol 156. - N 3. - P. 229-232.

64. Jacobs P.A-r Court Brown W.M., Doll R- Distribution of human chromosome counts in retulion to age // Nature, 1961, - Vol. 193. - P, 11781180.

65. Kammori M, Nakamura K., Kasvohara M. et al., Telomere shortening with aging in human thyroid and parathyroid ti.«ue II Exp Gerontol -2002. Vol, 37. - N 4. - p- 513-521.

66. Kaneko T , Tahora S, Malsuo M. Non-linear accumulation of 8-hydroxy-2-deoxyguanosine. a marker of oxidized DNA damage, during aging // Mutat. Res, 1996. - Vol. 316. - P. 277-285.

67. KaihulgO M.S, A model for ageing // J. Theor. Biol. 1975. - VoL53. -P. 253-261.

68. Kalo It-. Sandberg A. Chromosome pulverization in human cells with micronuclri l/I. Nat, Cancer In«.-196«. Vol. 40.-N I.- P. 165-179.

69. Krohn K„ Fuhrer D„ Bayer Y el al-J- Molecular pathogenesis of euthyroid and toxic multinodular goiter H Endocr. Rev 20Q5. Vol. 26. - N 4.- P. 504-524.

70. Komae N. Nanta H-, Hibino Y-. Sugano N. Morphology and origin of nucnwtuelei induced by mitotic inhibitors // Yukugako Zasshi. 1997. - Vol 117. —N I,-P. 49-58.

71. Konopacka M. Effect of smoking and aging on micronudeus frequencies in human exfoliated buccal cells // Ncoplastna. 2003. - Vol. 50, — N 5.-P-380-382

72. Labidi B. Cregoire M-. Hernandez,-Verdun D. Bouteille M Procedure for isolating micronuclet from nit kangaroo cultured cells containing individualized chromosomes U Eur. J. Cell. Biol- 1985. - Vol. 38. - N t. - P. 165-170.

73. I.each T„ Jackson-Cook C. The application of spectral karyotyping {SKY) and fluorescent in situ hybridization (FISH) technology to determine the chromosomal contends) of miertxuicfei U Mutat. Res. 2001. - Vol. 49J. -P.l 1-19.

74. Lcaroyd DJ-„ Messina M, Zedenius J-, Robinson B.Cj. Molecular genetics of thyroid tumors and surgical decision-making H World, J, Surg. -2000. Vol. 24. - N 8. - P. 923- 933.

75. LebUrnd C-P. Classification of cell populations on d>c basis of their proliferative behavior// Not- Cancer Inst, Moflogr. 1964. - VoLM - p U9-150.

76. Lowe X„ Collins B., Allen J, et »!.. Aneuploidics and nucroiutcld tn the germ cells of mate mke of advanced age // Mutat. Res. 1995. - Vol, 338. -N 1-6. -P. 59-76.

77. Mariotli S., Fronccschi C. Cossorizza A. Pinchera A. The Aging Thyroid t' Endocrine Review. 1995, - Vol.16. - N 6. - P. 686-715.

78. Martin G.M. Genetic and environmental modulations of chromosomal stability: their roles in aging and oncogenesis // Ann. N.Y.: Acad. Seu-1991.-Vol.621.-P. 401-417.

79. Mazzucchelh L., Bwekhardt E. Hirsiger H. e4 at,., Interphase cytogenetics in oncocytic adenomas and carcinomas of the thyroid gland Hum Pathol. 2000. - Vol. 31. - N 7. - P. 854-859,

80. Medvcdcv Z.A. DNA-infarmalion and aging- The balance between alteration and repair t! Gerontology / Ed. D. Plan Berlin -Heidelberg: Springer Verlog - 1989, - P. 3-29.

81. Medvcdcv ZA, An attempt at a rational classification oF theories of ageing /' Biol. Rev. 1990. - Vol. 65 - P. 375-398

82. Messier В. Leblond C.P. Cell proliferation and migration as revealed by radioautography after injection of thymidine-1!! into male cat and mice // Amcr. An«. I960, - Vol-106. - P. 247-285,

83. Miller B.M. Adlcr I D. Application of anttkinetochore antibody staining (CREST staining) to micranuelci in erythrocytes induced in vivo H Mutagenesis, 1990. - Vol, 5. - N 4. - P 4 H -415.

84. Mullaari E, Lohman P.H.M., Berends F,, Vijg J. DNA damage metabolism and aging // Mutat Res. 1990. - Vol.237, - N 5-6, - P, 189-210.

85. I. Nilo S.t Ariyuki F., Ofcantwa A. Spontaneous expulsion of mieronuetei by enucleation in the micronucleus assay II MutaL Res, 1988, — Vol. 207. - N 3*4. - P. 185-192.

86. N'orppa H , Luomahaara S. Heikanen H. et al . Mtcronucleus assay in lymphocytes as a tool to biomomtor human exposure to anevploidogens and clastogens II Environ, Heallh Perspect 1993, - Vol, 101, - Suppl, 3 P 139143.

87. Panoo J.W., Ganriott M.L., Beyers J.E, Expulsion of demecolclno-induced micronuclei from mouse bone morrow polychromatic erythrocytes it Environ.Mol.Mutagen.- 1991.-Vol. 17.-N2.-P. 79-83,

88. Physiological basis of aging and geriatrics / ed P.S, Timiras. CRC Press Inc. - Roca Baton-Ann Arbor-London-Tokyo, 1994. - 326 p.

89. Pieroui M.A. Chromosomal rearrangements in thyroid carcinomas; a recombination or death dilemma H Cancer Lett, 2001 Vol. 166. — N L-P. 1-7,

90. Ramire/. A , Saldanha P I. Micronucleus investigation of alcoholic patients with oral carcinoma // Gencücs und Mol- Res. 2002- - Vol. I. - N 3- -P, 246-260.

91. Ramsey MJ. Moore 11 D.H., Brined. et id.. The effects of age and life style factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting H Mutât. Res. 1995 . - Vol- 338. - p. 95-106.

92. Rao-Rupanagudi R., Hcywood R. Gopinath С Age-related changes in thyroid structure and function in Spragwe-Dawley rats Ц Vet. Pathol, 1992. -Vol. 29.-P. 55-63.

93. Redmond O. Tuffeiy A.R. Mitotic rate of thyroid follicular celts in untreated and goitrogcn-trcated rats: variation with time of day II J.Anat. 1979. - Vol. 133. - P- 37-47.

94. Saad л <3-, Kumar S. Ron E, et a.]. Proliferative activity ofhünan thyroid cells in various age groups and its correlation with the risk of thyroid cancer afler radiation exposure H У Oin. Endocrinol. Metab. 2006. - Vol, 9]. — N7.-P. 2672-2677.

95. Sandberg A.A The Chromosomes in Human Cancer and Leukemia, 21*1 edition. New York : Elsevier, 1990.

96. Sanum A-, Bounaccr A-, Lepage F {et at.. Mechanisms of mutagenesis in mammalian cdis. Application to human thyroid tumours H С, R.

97. Acad, Sei. III- 1999. - Vol. 322. -N 2-3. - P. 145-149.

98. Shcline G-E. Thyroid proliferative potential as a function of age If Cell risa. К inet. 1969. - Vol. 2. - P. 123-132

99. Shimizu N , Itoh N„ Utiyarna H., Wnhl G.M, Selective Entrapment of Extrachromosotnally Amplified DNA by Nuclear Budding and MicronuCtelion during S Phase // J. Cell Biol. 1998.-Vol. 140.-N6. - P. 1307-1320.

100. Shirokawa J.M., Elisci R., Kuauf J.A. et al.| Conditional Apoptosis Indueed by Oncogenic Ras in Thyroid Celb // Mol. Endocrinol- 2000. - Vol. I4.-NII.-P. 1725-1738,

101. Schmid W. The mkronuclei lest // Mutm. Res 1975. - Vol, 31, - P, 9 -15.

102. Schneidcr B.M. Wurgfer F-E.4 Romagna F. Distinct area distribution differences of micronuclci induced by elastogcntc and «neuploidogenic chemicals in the bone marrow of the CD-1 mouse fi Mutm. Res. 1995. - Vol. 334. - N L -P. 81-89.

103. Singh N.P., Danncr D.B., Ticc RR. et al.. DNA damage and repair with age in individual human lymphocytes H MutaL Res. 1990. - Vol. 237, - P. 123-130.

104. Singh S.M , Tote J.F-, Resume J, Genotype- and age-associnled in vivo cytogenetic alterations following mutagenic exposures in mice // Can J Genet Cytol. -1986. Vol. 28. - N 2. - P. 286-293.

105. Slagbroom P-E. Vigg J. Genetic instability and aging: theories, facts and future perspectives U Genome. 1989, - Vol, 31. - P. 373-85.

106. Soares S,R„ Bucno-Guimnraes RM., Fcrreira C.M. ct al.- Urban air pollution induces micronuclci in peripheral erythrocytes of mice in vivo H Environ. Res--2003, Vol. 92, - N 3. -P. 191-1%,

107. Suaiez H.G. Molecular basis of epithelial thyroid tumors // C.R. : Acad Sci, 111 - 2000. - Vol. 323. - N 6. - P. 519-528.

108. Suzuki T.( Fujii M. Ayusawu D. Dcmcthvlation of classical satellite 2 and 3 DNA with chromosomal instability in senescent human fibroblasts // Exp-GcroiMol. -2002 Vol. 37. - N 8-9. - P 1005-1014

109. Takaoka M., Teranishi M r Furukawa T. et al,. Age-related changes in thyroid lesions and function in F344/DuCrj rats H Exp.Antm, 1995- - Vol. 44.-N I. - P. 57-62.

110. TaJlini 0. Molecular palhobiology of thyroid neoplasms // Endocrinol. Pathol. 2002. - Vol. 13, - N 4, - P. 271-38«.

111. Tanaka T. Shtmtiu N. Induced detachment of acentric chromatin from mitotic chromosomes leads to their cytoplasmic localization at Gland the micronucleaiion by lamin reorganisation at S phase // J. Celt Sei. 2000. - Vol. 113. - N 6- - P- 697-707

112. Tasevsfct V., Bom D-, Peters G, et al.. The Fischer rat thyroid cell line FRTL-5 exhibits a nondipkiid kaiyoiype //Thyroid, 1998, - Vol, 8- - N 7. -P.623-626.

113. Tates A D ,Van Dam F J., Van Mossel H. et al.}. Use of the clonal assay for the measurement of frequencies of HPR T mutants in T-lymphocytes from five oontrof populations// Mutai, Res 1991, - Vol. 253, - P. 199-213.

114. Tinwell H., Ashby J. Mi его nucleus morphology as a means to distinguish aneugens and clastogens in the mouse bone marrow micronucleus assay // Mutagenesis. 1991. - Vol. 6, - N 3. - P.193-198

115. Tucker J.D., Moore D.H. The importance of age and smoking in evaluating adverse cytogenetic effects of exposure to environmental agents // Environ Health Perspect- 1996. - Vol. 104. - P. 489-192.

116. Vandcrkcrken Vanparys P., Verschacvc L-, Kirsch-Volders M. The mouse bone marrow micronucleus assay can be used to distinguish aneugens from clastogens Я Mutagenesis 1989, - Vol. 4.-N I.-P. 6-11.

117. Von Hoff D. D. McGtll 3. R Forseth В. J. et al.. Elimination of cxtrachromosomally amplified MYC genes from human tumor cells reduces their tumorigetticrty H Píoc. Natl. Acad. Sei. USA. 1992. - Vol. 80. - P. 8165-8169.

118. Xing M. BRAF mutation in thyroid cancer H Endocnne-Related Cancer -2005.-Vol. 12. P. 245-262,

119. Xu X. Quiros R.M , Gattuso P et al.f, High prevalence of BRAF gene mutation m papillary thyroid carcinomas and thyroid tumor cell lines II Cancer Res. 2003, - Vol, 63. - N 13. - P. 4561-4367,

120. Weirich-Schwaiger R, Gniber В., Schweiger M. Htrsch-Kauffmann M Correlation between senescence and DNA repair in cells from young and old individúala and in premature aging syndromes. H Mulat. Res. 1994. - Vol. 316. - P. 37-48.

121. Wojda A, Witt M. Manifestations of ageing at the cytogenetic level. tl J. Appl. Genet 2003. - Vol. 44. - N 3. - P. 383-399.