Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение клеточной адгезии в модельных системах in vitro

ВАК РФ 03.00.17, Цитология

Автореферат диссертации по теме "Изучение клеточной адгезии в модельных системах in vitro"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНОВ ЛЕНИНА, ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЩИИ И ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

• На правах рукописи

ГОРДЕЕВА Лариса Валентиновна

УДК 576.5

ИЗУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ В МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМАХ IH VITRO '

03.00.17 - цитология

Автореферат дооертации на ооиокание ученой степени кандидата биологических наук

Моиква - 1989

Работа выполнена в Межфа^льтетской проблемной научно-исследовательской лаборатории молекулярной биологии и биоорганической химии им.А.Н.Белозерского МГУ им,М.В.Ломоносова (директор чл.-корр. АН СССР, профессор В.П.Скулачев).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Л.Б.МАРГОЛИС. .Официальные оппоненты¡доктор биологических наук

Ведущее учреждение: Институт цитологии АН СССР (г.Ленинград).

на заседании специализ! . . . 68

в Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова

В.Ю.ПОЛЯКОВ,

доктор медицинских наук

Ю.А.РОВЕНСКИЙ.

Защита состоится

по адресу: Москва, И 9^99, Ленинские горы, Биологический факультет МГУ. Автореферат разослан "

п

Ученый секретарь споан.адпзграгаиного Совета, Сиологиччгких наук

Е. Н. Калпстратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

:...ч:рст1альиостъ проблемы. Адгезия клеток - одна из центральных --^-доуеточной биологии. Адгезия является ключевым процессом эмбриогенезе, при морфогенезе и регенерации тканей и органов, опухолевых клеток адгезия часто нарушена. Полагают, что это . ужит одной из причин инвазивного роста и метастазированин зло-чествешпйс новообразований.

Адгезия представляет собой слояный биологический энергозави-иый процесс, в результате которого клетка прикрепляется и раскатывается на поверхности неклаточного субстрата или другой зтки. Началом этого процесса служит контакт плазматической ■.браны о другой поверхностью, при котором происходит связыва-| клеточных рецепторов с лигандаки. Но не только наличие или утствяе рецепторов влияет на исход контактных взаимодействий, ример, количество рецепторов к локтинам примерно одинаково на эрхности нор:1альних и злокачественно трансфоргляровшпшх клеток, ако, гяюгие тисы трансформированных клеток агглютинируют в зензни при гораздо меньшее концентрациях лектилоз, чем кор-ышэ. Какие свойства поверхности норглалышх и трансфорларозан-клзтох определяет это различие, до сих пор плохо понятно. Вагнув роль в клеточной адгезии играет, по-видимому, липид-'-зтрикс мз;.:брани. Изучение структуры лкпндного матрикса пока, что з ?*з«брппо нхзется лзпздшо докакы различно!» иакроаяз-з: гэдко-яргсгаллпчоссто ("задало") с высокой латеральной таостьэ лэлегул з гэлсобразино ("тЕврдиа"), где дьааоняя ко-I огрзизчзги. !'л:фовязкооть ио.7,вг определять кеи^ороцы» «ЖС талвкул V их подвшглость в плоскосгс г.!е.ибр.?-г;. 1!оэшкн.>, :шэ домен! различней ¡.мкромэксстл '.-огут и непосредственно гютгаать яоатакта о другой иевчрхи-югкк. :ггог г -и^ цок.» н недостаточно.

Итак, процесс клеточной адгезии дат.о на уровне начального контактного взаимодействия зависит от многих характеристик плазматической мембраны. Дале-, контакт клена о другой поверхностью шщуцпрует целый комплекс кортикальных реакций, за которыми следует перестройка структуры цитоскелета: шкрофшюмзнтов', микро- ' трубочек и т.д. По-видимому, в любом из этих звеньев могут произойти изменения, приводящие к нарушению адгезии у опухолевых кло ток. В такой сложной экспериментальной системе исследование значения характеристик плазматической ыемйраш в процессе адгоакг затруднено.

Одним из перспективных подходов для изучении: роли различных мембрашшх компонентов в клеточной адгезии является заилена одной из взаимодействующих клеток на искусственную комбралу, свойства которой задается экспериментатором. В нашей лаборатории разработана полумэдельная система "клетка-искусственная лзшддная ыекбра на", в которой изучается влияние различных характеристик лшшдаО' го катрпкса мембраны на процесс установления гхштактов. В настоя п:эИ работе ¡/я продолжили серию подобных исследований.

Полья работы било:

1) Усовершенствовать метода изучения клеточной адгезии о по г.:паью полумоделышх систем "клетка-плоская липздная пленка"; "¡•-тстгл-липосокы". Разработать новао систош "¡шетгл-липосош.мо д^-пцирокипшо локтином" и "клетка с модкфнцироЕшкой плазматической мембраной - адгезивный субстрат".

2) Использовать указанные модолышо систош для изучогаш ро .та р!Л1.'ач!пге компонентов плазматической мембраны в меточной

Л-'Ч.-од нгис слодутеияо ниШ221:

I. г.тгт;:ие вз'&молиЯстгая элитшздадьних клеток с

х ••„•".•»<.: плггг/а-.! {шюго фа а ого го' состсяпкя.

2. Исследовать с помощью трансмиссионной электронной микро-зкошш зош контакта эпителиальных клеток с липосомаш. Сравнить ;о структурой зон формирования межклеточных контактов.

3. Разработать методы использования липосош, модифициро-5ЕНН0Й. локишом, в качестве модели комплекса клетка-лектин с ;ельы изучения механизмов лектин - опосредованной агглютинации гормалышх и злокачественно трансформированных фибробластов.

4. Изучить адгезии двух типов клеток, неспособных распластаться на субстрато (асцитной карциномы Эрлиха и шелош линии ;-бЗ), после модификации их поверхности адгезивными к субстрату

ЮЛОКуЛаМП .

Научная новизна работы. В настоящей работе установлена воз-гозность образования стабильного контакта между эпителиальными ' летками и плоскими лшшдными пленками в "твердом" Сно не "гидом") фазовой состоянии. В местах контакта эпителиальных клеток "твердшш" липосомами под плазматической мембраной обнаружены локтрокноплотныв структуры, характерные для зон формируюсдася 'глклеточных контактов. Эти результаты указывает на возможность частпя ."твердых" липлдных доменов и липид-связываыцих центров лазматпческой мембраны в межклеточной адгезии. В работе впершэ бнарузоно, что липосош, модифицированные лектином, в отличие от зободнкх локтгоюв л немоди&щиро ванных липосом, способ!Ш пренму-оствешю связываться о трансформированными фибробластами. Разра-отшш методы иммобилизации остатков биотипа на молекулах клеточ-эй поверхности, несущих свободные ашногртнш. Впервые показано, го "модификация плазматической мембраны ¡теток асцитной кг.эционо- ' л Зрлиха молекулами биотипа придает клеткам способность расчдяс-хватьоя па покрытом апиданом субстрате.

' Научно-практическое значение работы. Т'аь.аботанная методика эдификации клеточных мем.ран позволяет тугль шшишрмы иапуцр-

ния адгезивных свойств клеток при различных проявлениях злокачественной трансформации. В полумодельной системе "протеолипосо-ма-клетка" могут быть воспроизведены и исследованы важные свойства опосредуемого белком межклеточного узнавания, основанного на взаимодействии лиганд--рецептор. Результаты по дифференцированному связыванию модифицированных лектином липосом с нормальными и трансформированными фибробласташ указывают на существование принципиально нового подхода для разработки методов направленного транспорта липосом к клеткам: использовать в качестве векторов специфические молекулярные комплексы клеточной поверхности. Выявленные характеристики взаимодействия клеток с модельными липидны-ми мембранами служат основой для формирования новых представлений о механизмах образования межклеточных контактов.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на

Ш и У Всесоюзных симпозиумах по биохимии липидов СПущано, 1984;

*

Алма-Ата, 1987); Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (Тбилиси, 1937) и I Республиканской конференции "Изучение и применение лектинов"- (Тарту - Таллин , 1988). Диссертаций апробирована на заседании кафедры цитологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Структура и объем тботн. Диссертация изложена, на. 176 страницах машинописного текста, включает 26 рисунков, 5 таблиц и состоит из введения, четырех глав и выводов. Список использованной литературы оодеркшт 257 ссылок.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе попользованы: шишше эмбрионалыше фпбробласгы [М39), клсткн липли X. (трансформированные г.кзшне фибробласты), .гэтпшальяо транс-^ор^розшпшо фибробласты линии ЗТЗ, фибробласты гпнзги ЗУБТЗ (получекц трансформацией клеток линии ЗТЗ вирусом , V-10 ), опнтолиолкшо плетки лшпй ЕВТ (трахея быка) и ШТР получены трансформацией первичной ¡сультурц почт идлн вирусом

'.0 ), клетки ?:иелс:л1 линии Х-53, а тагсно глетга асцятаой кар-зном1 Зрлиха, наращиваемые в'гутрп бркиноЯ полости мтсей.

Для получения плосгпх лияидни? пленок каллга лишяного раство-а в оргапчосхо.м растворителе наносили на поверхность покровного гекла я упаривали. Диаметр липидиых плонок. составлял 60-3000 гам, Ьерднэ" адегаг получала 'из дапаль?.01топл4юс^агадалхол>ша (.ЩПХ), глдкне" - из яичного фоо^атясглхолнна.

!-ал:."Э !«онол.г"злллртше ллпосо?д{ ползал:! Еозде2отшзи ультра-

туга т дисперсно смаси ллпздов з бу-^рлсч пас Для т.'.спг—

»

глэитсз с эпителиальными клетками исзояьэозялз липоесл! из ПП5Х тнорлиэ" при 37°С; :»ицьлтрац2я лягала«»» 5 яг/:а). Сауороссептао чзиыг .'ппосе":: садучаян, добавляя к ДП5а флуоресцентный зо!С.

(1-2 об.£)„

лгап^ся лект:п::::г; нспо.-'-гсъалп гсг>-

'.тглга ¡.''»лтг.з с лгттап.г.'п.'. гонглнзалтт:»->.

с лппссгг-: прогогата с ломс.ге» хтгтг;^-^"'л'гузплглэт;ч '.--¿■г-т гг-'лм :;-г.иуоленсупглл^ги.цлл-З--;;;-пнр:!лг,.■• ' .'"О?^, '-нгссл го^еглалл ДЛ1У н ■""'-'•пголлн]:-.''' г."

ссг '.^'-"'гпчзля—ц^-гуф \у:лл:л\ v.--.

(мэтм-ое отно.летге 9:'}. нонЛ

н'/..! липпсо'.: п -^ч-;-ч.-^иа. '.Ъс:-• • ' ' • " "Н'.ГЮ" ГЗ ■пго-:;:.;:;:! С/Г;П;

ОЛЛЧ " ! гт-УУЛ, • ! ■ < - ! г,-; ■ _

фо с фатидплэ г ак оламин о м, входящим в состав липосом (10 мольных %) совместно с ДШ'Х (90 мольных %). Флуоресцентно почете яипосош содержали леркленоилфосфатадилхолпн (0,5 мольных Кокъгг&ты лекгинов с липосомами очищали с помощью гель-фильтрации на сефа-розе сь-6Б.0дна конА - липосома несла в среднем 2 молекулы лек-тина; одна АЗЛ - липосома - I молекулу.

Клетки на покровных стеклах шпсубировали в капле суспензии липосом при 37°С во влажной камера 15-20 мин.

Лля ш,мобилизации анилина 'покровные стерта предварительно обрабатывали карбонидлишшдазолом (100 мг/мл в диметилфор^игладе; I ч в атмосфере аргона при 25°С). Активированные стекла лнкубнро-г,оли в раствора авкдпна (2 нг/кл в буфере 50 и'.! иа^в^о^, рн 8,0) г, точение ночи при. постоянном встряхивания при 25°С. Оаштие от песвязаваэгося акадпна стекла использовали в экспериментах с /.нелогично связывали со стеклами (Зычий сывороточный

¿льбуташ.

Мслгк^икшрш поверхности клеток остатками баотлна проводив

о

цу юс:.-.! обризои: суспензию клеток (0,5 мл? 1x10 кяэтое/ш)

с родшм объемов раствора п -гадроколсулхфзсуйзшш'ш-{5-.«:тотхшмакэдэ)-гексаиолта (I мг/ик) п хпкууикомиш щп нс' 20 мл; при 4°С. Поело многократной (5-5 раз) оттва „V не.-::. ..:-;и'согося бпопша суспензии клэток в доядотрацви

щу.'ок/кс шшосхяп в кашю на оубстг~' ка 1-3 ч при .'.,••'€. Ь >¿,0 ь ипУЪ'Сзярогтуа емзеъ до6&1>ъи\-'л ццтохал&гш .'

•ДО ».с.."'/'.-'-/; АиС-о натрил (20 кУ).

г^рэрзспродасош:« роцонторог г. }»цА платка {.-лн/йч Г-Г;?) лчкуЗ^рльглта поедшеозатгльво в растх-ораг ковА (100 у.-:;-/'!^-:), 1;ролг.ч:..сго ^гги-гл^-гш&гглобулаиа, $о,хплкнз (10";О " .-члзюго ^аггЕгяавулШй, ксньюшровакаого с

(.••сси.окигыи^осйц'-лт'»»! (-:5ГГн). со. 15 мги пра 3?°С.

Клетка исследовали методаъи прижизненной фазо-контрастной и флуоресцентной микроскопия на микроскопе 0р1;оп р1ю1,от1сгозсор iii (ОРТ). Ыикрофлуориметрические измерения проводили с помощью микрс-флуориметра 4МЕЯ-2 (ШЮ, СССР). Флуоресценцию измеряли в относительных единицах. Ноль прибора устанавливали по собственной флуоресценции клеток, отмытых от среды раствором Хенкса. Для каздого препарата выполняли 15-20 измерений на произвольно выбранных участках поверхности разных клеток.

Тонкуз структуру поверхности клеток исследовали методом сканирующей электронной микроскопии. Для этого клетки фиксировали 2% глутарошм альдегидом, обезвоживали в растворах ацетона возрастаний концентрации и высушивали в критической точкэ каления 002« Препараты напыляли слоем платины и исследовали на микроскопе РЬШ1ря РЗЕМ- 500 .

Подготовку препаратов к трансмиссионной электронной микроскопии вела согласно методикам Н.В.Еелицер [ ЗеНЛаег ^ п1., 1936). Для фиксации применяли 2,5% раствор глутаральдегцда с 0,1" таннинозой кислотой на ОДМ какодилатном буф-эре; постфиксациз проводили в 1% растворе четырехогсгси осмия с 0,8£ феррицазнида калия;-затем препараты контрастировали в 2% растЕсре танииновой кислоты. Далее использовали стандартную процедуру подготовки образцов для электронной микроскопии (по Узил, 1875). Ультратошше серийные срезы, ориентированные перпендикулярно плоскости субстрата, исследовали на микроскопе. ¡1-600 ( апасм, Япония).

Статистически обработанные результат!' представлены в ваде

»» + '

ь.- и, где М - срэднае арифметическое, а - стандартное от: лопегач' среднего арифметического. Доверительные интервалы определял:' согласно - - распозделетгз Стьадента с доверлташшм уровнем.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДЕНИЕ.

I. Контактные взаимодействия эпителиальных клеток с "кадкам.." и "твордыми" плоскими

липядннми пленками._

В первой части работы ш исследовали возможность'участия "жидких" и "твердых" липидных доменов плазматический мембраны в' установлении, стабильных межклеточных контактов.

Изучали области контакта эпителиальных клеток линии ШТР о модельными мембранам! - плоскими ляпвднымп пленками, адсорбированными на поверхности покровного стекла. Иссольновалп лпппдша пленки, которые при 37°С находились е "гадком", либо в "твердом" фазовом состоянии. Ли шэд ш с мембраны разного фазового состоязел получали из разных молекулярных видов фосфатндилхолипов,- отдача* • кихся насыщенностью жирнокислотных остатков. Исследовали мэрфоло таю меток эпителиального пласта, контактируем с лпшдными пленками "край в край", а также перераспределение связанных с клеточной поверхностью поливалентных лигавдов .- конкававалипа L и "твердых" (гелеобразных) липосом. Для контроля таким со образов исследовали клетки эпитачиалыюго пласта, но контактирующие о дг-шилпдз! пленками.

Контрольные клетки образовывали па субстрате островки эпи- ' теляондноК морфологии. Клетки в островках не были .поляризованы; ciRi плотно прилегали друг к другу в были раздолйш достаточно чотюши . По мора роста культуры 'остроы-л сливалась в

едашгЯ ааятаагвлышй пласт.

У Kpaöi<yx клеток rw&cxft на свободней 6окобой поверхности u-s-Tnai. voiieaz рас/1лл'станлач часть цитоплазма, лишенная крутжзс opuvioAX к »клечанлй, - Tairназываемая лпделла- о уэдуздруисзА м'ллрзлой, В iicViucTft [¿сг.клпточных контактов ль-меллы отсутствовал

В тетях пппгаггсясдоша клеток о ллпададш плен»:»»« разлх-

:али два типа Контактов: а) клетка касаетоя края липидкой пленки амеллой; б) на участке тент акт а ламеллы нет (клетка примыкает к .рас липздной пленки-своей зндоплазматичесглй частью).

К краю "жидкой" липпднбй пленки метки в типичном случае приткали лаивллами. В местах контакта с "твердой" пленкой ламеллы в ольшинстве случаев отсутствовали.Иногда ламеллы в области контак-а с липиднымя пленками били очень узюши.Поэтому для надежной центифлкацяи ламелл ш использовали кх характерное свойство "чьс-етЬОЯ*1 ОТ К01ШЛ0КС0В ЛОКТИН-рецепТОр С VasilieT et al.f 1976].

Клетки обрабатывали лектином кснканавалином А (конА). Далее ^ распределением связанного с кчеточной поверхностью конА слезла с помощью метода непрямой шлмунофлуоросцепции. Исходно конА ?язывался со всей поверхностью эпителиального пласта.Затем с оаевых лвмелл оц перемещался по мембране по направлению к цонт-ш>нш областям клеток. Происходила так называемая "чиспл" . ¡результате цвднофлуоресцентнсго окрашивания на конА "иочлщвн-ге" участки выявлялись в виде черных полосок при флуоресцентной гкроскопии. В области иезклеточных контактов, а также на участ-IX свободного края, где ламелл не было, не было и черных зон нстки", Тагапд образом,. наличие черных зон свидетельствовало о >м, что клеточный край активен.

Ш подсчитали процент клеток, у которых "чистка" захватнва-, веоь свободный .край, либо .весь контактирующий о лишдной пдон-й участок. Результаты представлены на риск I. В области коцтэд-.. с "твердой" пленкой таких клеток было в <" раза меньше, чем на ободном краю пласта. В случае ö "кидкой" планкой разница cjo-вляла 1,2 раза. В области межклеточных контактов "чистка" щ гк-чески всегда отсутствовала.

— —

Рлс. I. Доля "почистившихся" • от конЛ меток на свободном краю эпителиального пласта (а, контроль), контактирующих с ■ "-.сидкой" (б) и "твердой" Св) лппвдными пйонкаш.

•V •

По вор!икали - доля клеток, %. "Почистившееся" считали клетку, у которой либо весь свободный край (а), лноо контактц-■ 7гецтй с -ланкой участок (б, в) имел "чистку", ЗЗовдикалышмя :'гг;:хи."л лзоОракош станддртные отклонения сродного арифметического ( 1.: ) . • . - .

входные результаты были получены,- когда использовали ■ "твор-

.'ллосоад в качество лигавда. Ранее показ что "твордно"

.'.г.п^ос.и; кротао связываются с глоточной поверхностью, Свчзавиие-

;\1 с ¡ю2ор;сностьа распластанных фибробластов ллпосом! ведут собя

г.атавслеитнио лиганди - "чистятся" с .поверхности ламелл.Апа-

..о ггроцчсо К1 чпопадат на ошгтигальннх ияопеах: сзлзав-

^Л'огл Г. ШСИКП1.Н02 гоьоухиостыо пласта ^туоросцшгггао лвпооош

о лглшд свободного края. В области молклбточшх кои-

мктоо "т.мткч" па ттрои'.'ходиг. Она тагас отсутствует у больЕинст-

? ".'.огт.чх гочт.'лг.тг с. "тгордаи" литд1г.;;.с: ялояюм?..Оглло

"гзгдглч" пмно?. •■зспа" пэдавляптся в изиьиоЗ отслоил.

- ir -

Таким образом, при контакто эпителиально:» клетки о "твердой" липидной пленкой клеточный край в большинстве случаев становится зтабильным, т.е. исчезает ламеллы и'прекращается движение связав-шхся с клетнюй поливалентных лигандов (конканавалина А и "твердых" липосом). В этом смысле контакт с "твердой" липидной пленкой »ходен с межклеточным контахстом." Контакт с "явдкой" плешссй но гриводит к подобным изменениям.

Почему клетки столь' различно реагируют на контакт с "твердой" "леидкей" липидной пленкой? Это мояет быть связано с установлен-ой ранее большей адгезивностью липидных пленок в гелеобразном эстошпш. Вероятно, при контакте с адгезивной "твердой" пленкой неточный край иммобилизуется на ней. При этом образуется стабиль-$ контакт. На неадгезивной "жидкой" пленке иммобилизации клеточ-)го края по происходит.

ПолучешшД нами результат свидетельствует в пользу вцдаину-й ранее гипотезы о тем, чт.о "твердые" (но но ".тлдкие") лнппднне мены плазматической мембраны могут принимать участие в сшзьгаа-н клеток друг о другом.

2. Ультраструктура зон контакта эпителпалыеше

меток о "TBñpmwni" (гвлеобтазннми) липосомами.

. ЗЬшпдкые домшш шхас5г.атачоо1сой мембраны в процессе установлю-

t гааишточних контактов, взаимодействуют, вероятно, со спзцн-

•нша дтгд-авлзшиткетмн центраг.п а мембране соседней клетки.

центра, m-шщшоцу, ккезг бодкозую природу и могут уоиавать

mío лшпдгшо структур-i, в тег; числз "твердые" п "хщрше" дипо-

ы, a тмсге "твердые" лтшидаю кленки. lía участие липид-олчзн-

центров в ¡жгклоточной адгозгш косвенно углэтаан? данк .о

подавлению агрегации фибробластов в сусиен:;нл поело предвари-

ьной обраб/тки их "твердыми" липосоиак», а такие нреш.г/цаотвеп-

'сцчзыванио "твердых" лшюсом ишшю с томи участками этттели-

о

• ального пласта, которые способны устанавливать межклеточные контакты - СО свободным краем пласта С Margedla, líeyfakh, 198 Ja,V/) .

Мы предприняли поиыт"у оценить роль лшщд-овяаывазздпе центров в процессе установления межклеточных контактов методом трансмиссионной электронной микроскопии. Использовали культуру эпителиальных меток линии ЕВТ и липосомы малого размера ("твердые" при 37°С). Участки контакта мембраны клетки о липосомаыз сравни-.. вала с зонами формирования межклеточных контактов.

Характерной особенностью формирующихся межклеточных контактов является наличие подмембраннцх уплотнений но х;райней мера у. одной lid контактирующих клеток. Именно в этих участках выявляются сужения межклеточного пространства. Если в остальных областях,гдо клетки примыкает друг к другу, характерное.расстояние моаду момй-•раначл 20-30 шл, то в зонах с нодмомбранныыи уплотнениями ширина г.эла составляет 10-12 шл и ыевыае (вплоть до 2-3 км). •

Еодаюгёранше уплотнения могут образовать^ л результате »•¡¡¡тает-, с другой клеткой или с субстратом, lío и , случаев 'ш сбааруаилл под,мембранные уплотнения и вно цеккдеточиых контактов. Еозуигло, что контакты возникают ллаь там, гдз у;;;е существуют дм о того споцпсдышо CTpyiCTypU.

Г. области контакта -"твердых" .плюсом с плотной пой глчзютл-одсгоИ момлрдлой также наСладажсь хараю-оршто ушготиенкй. .tmo-cc:.jj часто обнаруживалась на кчеточной поверхности nCmss мест • 5«>5Па;:та глоток друг о другом, а такг.0 в связи с вершшгамл кафо-pope:,-ííc-.v, mtüj<o«:í i-югш часто }¡ouroih'upyx№ друг с другое. Так»? ••»орлуои, лиаосош явхяюол триерам* участков плазматической ¿;ем5 p."jí¡;, спосоСию. к усгановлонпе маталаточных контактов^

¿¿косом была илЯдени ко только на плоских 5чаоа-ках кдаточ-» ¡-..".'í' >¿jx:^p!ii:,i & r.ü !с«:рсüojtciíHiías. но г. в .owtfucoinqtx углублениях Г SClilu'Tí-b'.'.iCí fitftZt^'.iax. СсчТгГ.'СЯ iiOñ'.'Hiü.i, рЛГ'.Г.П-.^'ГОа »Тл ПО СПО.-

цифкчяости молекулярные компоненты плазматической мембраны, опосредующие сндоцитоз ллпосом и участвующие в их стабильной адсорбции на хлэточкой поверхности. .

Итак, в результате сравнения ультраструктрры зон формирования метслоточкых контактов и участков контакта клетки о "твердыми" гапосомамя полно предположить,- чтс участки плазматической мембраны, адсорбирующие .ttito'jo'E! и характерпзугжшэся специфический . ' злэитронпоплотге»!!! структурами на цвтоплазкатичоской стороне, вовлечены п устойовдопм гсгитактов молду ктеткаг.п!. Это сг;о слно 'одтверздгпто участил .,пппд-овязнвш"рс центров плазматической гамбранц з моаялотэчгс'1 -"/лэапл.

3.' Взгпмодойс?"-;-, ;íг,г талышх и т^нсформирояаннк;: {'"■ б^фгооточ о.. .~тгата,г.'ог ■'.ттдгорпгт.н^г

Исгусотзопаая ллгпдт?'?"! мембрана -- крайне угроиекнья ;ю?олъ лзткя; Сдп дсет изучать "-.-.рактерпстпкя лишь едкого

:гибрашюто шлюпсчга - -^гадного ¡:¿crпта. at'raysroi! :ra' п изу-

.маглглоточчс"'! /\nros;r: с шмсцыэ гстусотвепысс гтскбрап соото-т-, очевидно, в модайплаи^п ляяэдпой v-кбраш опеврфгезс^а бзл-ar.fi-, глйг-сбашая л гдяглстшдала. Т:".сй подпид бшг использовал . ссг.оль:стт1 груплз"! псогодсжатблой; Тз», в качестве »«сдает клэт-п црашвга 'дшосогги, "олйгщроватшо о гликопроткшата ¿'-ели -. IT^-Civi" tlMelnna 131. ai • .1937». Огик-з-;, .Sdelmaa, 198В] лппосома, aco moho- л олслойн."'? дна ¡дныо влбйкч. гюдифаирозаягасо ¡гатите- . r^Ti СКсСом-:!! o't -м ■, Ш кс:. ользовалв исзусстшшо •

poTfjo^nirv'ivío uwCpzru " - ¿одедпро?' :■■::'('тыклтопкшг вшило--

аЗстгяй, нгг.:сао;г;1Г,!.::: .......тосса о-сгог-.^овакнсй Лпктлпг.мя гггта-*

iiksesi вгосся.

Дргг'ТЯ'ч покигтп:: сп: "Люстп к лпияшксяа у ;m!«¿ icr¡-.To:t'оиссг:с"л"тсг, по* Е2дпмо.'.:у, но хз^иигром саягивсшг ís ¡/¿чсзул док-шиа с злодугаоЯ »азвраа'*.?.^, а лрояуятохи?.

на-стадии связывания комплекса клетка-глектин с другой клеткой или комплексов между'собой, № разработали модельную систем, в которой заменили комплекс клетйа-лзктин на липоооау, шдафицпрованну» лекяшом. Конканававин А (конА) к -агглютинин из зародышей пшеницы (АЗЛ) ковалентно связывали - с поверхностью 'малых монолакеллярных липосом. Оба лектина при етом сохраняли способность узнавать, специфические моносахариды: Ы -метил- в-мшшогшранозлд и И-ацетил-глюкозамин, соответственно.

Изучали "связывание лектиновых липосом (конА-линойом и АЗП-липосом) с двумя парами линий нормальных и трансформированных мышиных фибробластов: ЬШ- ЗТЗ- зузтЗ. Для наблвдошш за липосо-мами на клеточной поверхности в их мембрану вводили флуоресцентный маркер перцленоилфосфатидалхолин. Для контроля изучали овязы-вание с этими линиями клеток свободных-л еютшов, меченых ОИТЦ.

Инкубация лектиношх липосом с клетками с последующей отмывкой раствором Хенкса приводила к появлению на клетках диффузной флуорооценции. Набладения при различном положении фокусной плоскости микроскопа показали, что флуоресценция сосредоточена преимущественно на клеточной поверхности.

Связывание'конА-лкносом с клеточной поверхностью происходила преимущественно через молекулы лектина: оно не уменьшалось, пооло инкубацни клеток с липосомаш бег лек-тина, а тадсх- поело предварительно!! обработки шаток трипсином (в отличие от. контрольных оштов с липосомами без конА). С другой отороны, предварительная обработка клеток свободным к/жА в 3 раза сшшала связыв&шю о щ конА-липосом, И к такоцу ке результату приводило-добавление в' инкубационную среду с( -метил- В-маннопиранозида, кош';урлрунцего о меточными рецепторами за связывание с конА..

В случае АЗН-липосом связывание с клотка'ы уменьшалось' в' 4 раза в присутствии специфического конкурентного ингибитора. -и -ацетилглюкозш.шна.

Ш изучили связывание лектиновых липосом с поверхностью нормальных п трансфор?Л1рова1шых 'клеток метолом кикрофлуориметряи.Как следуот из результатов,приведенных' на рис.2, специфическое (т.о. подавляемое cL -метил- D-машопнраяозидом) связывание конА-липосом клетка:,я лилии Ь' в 2,5 раза вниз, чем мьояитми эмбриональны?.® фи-бробласта!.п. Данное различие сохраняется в йяроком диапазоне кон-цонтрацкп :;онА-липоссм (p-tc.3). Клетки лшеш sv3t3 специфичсскл* звяонвали з 3 раза больше конА-лппосо;л,чем клетки ЗТЗ (рис.2).

Сходндй кТфзкт б:хл по.оучен при использовании АЗИ-липосом 'табл.1):, спецп^тссксл.&т/оресцекция на поверхности Ь -тслотсч бита Ь 2 раза 'Ш1тенс1гга.оо,-то,{ на-яоверетостн норшьиа Лзброблайтов.

'Таблица I. Сгязеея":о ASli-JBffiocctf^ кшгягаш г'».;бсг:0313лг-!гьс.51 фгброблЛсташ п ■ .хяекккз ;лння Ь.

Ктет:си

"33 L

гллтликозамш (50 r.i!)

Интенсивность ащр~ ресцекцпз, отн. ёд.°'

20,7 ± 0,9 1 г X — 012 44,6 ± 0,2 8,7. ± 0,3

а) Ксгщенгргщая лиллда 1,7 mt/i.v.;

■б) Результаты' пссдставленн в видо и i'a . ~ в

В -отличие от ксиА-одшосом связывание свободного конЛ было эсколько Е'яэ в случае мгяшшос эмЗряояалышх фяо'робластов по рззкештэ с глстка\пь(рис.4а). Прзкэрко такая -не завяса-зсть получ-г-на я д.™т АСЛ £слс-.4б). Б сбоах случаях связывание по-хвлялосб п''прзсутлгг:п коасуренттл: хлшгбитороз лектшгов, т.з 1ло спсцт:л:чш1г.?. Зги результат соглгоуютоя с ягавротгуртая дая-пя1. <5вяг:хакпо лшосом без листана кормалькдала а ?рзнефор.\з1ро-шпшла клетка.« еуг,естзон:-:о но различалось.

+

- ¿с -

го 16. <2 в

иф,оти.е0.

МЭФ и ЗТЗ $\/5Т5

Ьто. 2. Ыикрсфлуориметрия клеток, инкубированных с ковА-отпосЬ-шш \1 мт'лшща/мл). □ - тотальное связывание;

В » с&чьыватао в присутствия ¿-мети--1>~мшсюгаранозвда. Иф - ыленсивность флуоресценции.

Еёртикашшш штрихами изображены стандартные' отклонений среднего аргф.ютичеркого (т). Яри р <. 0,05 рсзлпчил статистически достоверны.

20

.<6 &

4

И^.оти.ей.

о о,гь 0,60 . 0,75 н,оо .

ЛИПИД,иг/ил

"но. 3, Зависимость .связывания цонА-дашооом клетками лиши Ь (&) и МЭФ. ( ® ) от концонтрццал лнпоаом. йф - икгрнсчвксо^ь флуоресде'щии. йэртихгоьешк штртсаьы обозначены интервалы

ередеих-значгжй. ' '■• ..

4

о

ÍO

Ит^сти.сч!.

Ж

Jr

i

С11ГЦ-кгн Л,

И К Г/M*

О '.J 1 СО

ГЗ И?,етч.гЭ.

'.3

ВО

я

'¿Q0

фитц-лзп,

и rr¡"h

rao

ÍÍÜ

"CÍO

Fzó. -i. зл1?лс1нгасгь сглгизгпля чигт-копл Oí) п vivtu-afll íó)

luroTi^-a лика ¡Л л ) rr МЗ? ( о ) о? -снцептрпгхлл Iíj - пктоясгая:ос*ь Лт/ороогдасрм. " ■ Зорк!гл.ти«г,г. .rvpracs CÍOSKÜ^HH ,tcBop.c?'Vj«îo "KTcparvrü cparnu'.x скездппй»

• Известно, что обработка нормальных клеток низкими концентрациями протеаз увеличивает их способность агглютинировать под действием лектинов. 3 наших экспериментах кратковременная обработка трипсином ь-клеток не приводила к увеличению связывания конА-ли-посом (табл.2). В то же время специфическое связывание с поверхностью МЗЪ увеличивалось в 1,6 раза поело такой обработки.

Таблица 2. Влияние трилсиннзации шинных эмбриональных фибробластов и клеток линии ь на их способность связывать кочА - липосото .

Клетки -метил- 0 -маннопиранозид (20 мМ) Трипсин (100 мкг/мл) 30 сок Интенсивность флуоресценции, отн.ед.

ь - • - 16,'2 ±0,5

+ - 4,8 ± 0,2

- + 15,8 ± 0,9

+ + 3,2 ± 0,3

ЫЗФ - - ■ 6,5 ± 0,2

+ - 2,1 ± 0,4

- + 9,7 ± 0,6

и + + 2,8 ± 0,2

а) Концентрация липида I мг/ш.

б) (+) - клетки последовательно иш-;убировс!ЛП в растворах трипсина, ингибитора трипсина (I ыг/мл) к конА-лнпссом; (-) - контроль: клетки инкубировали в растворе, ссдер^-¡дем трипсин и его ингибитор, а затем обрабатывал:! • кона-липосомйш.

в) Розультаты представлены в виде к!».

Таким образом, разработанная нами система "Клетка-липосоьг;, модифицированные лектиноы" полностью воспроизводит основные характеристики системы связывания клеток .друг с другом через Ч;зле-кулн лектина.

Из этих опытов можно заключить, что:

1) Иммобилизация белковых молекул на поверхности малых мо-поламэллярных дшгасом изменяет свойства самих липосом: они приобретает способность более эффективно связываться некоторыми тзтпа-мз трансформированных клеток по сравнению с нормзлънж.гя.

2) Вагсые свойства опосредуемого белксм мегглеточного узнавания, ССНО221Л10Г0 нн взаимодействия лигапд-рецоптор, могут сить' воспроизведены и исследованы з более простой системе "протеолп-посома - клетка".

3) ЛрП!ЦПЕПаЛЬЕО HOBj'l ПОДХОД "0~гт быть псшльзовзн для разрпботхя «этодов випраЕлгнного трэтгорта ¿ппсаса к глстхт:' встраивать з лппсссмы :то т^кторныо молзкулы, сбладаггхе повютн-пгя сродством к молокулгл ггеотшой поверхности, а саха молекулы клеточной поверхности и их лпгапды, пштрз.сер, лзктып!. II получать татгм odpisc:.! лгпоссги, потлрувдче глотку в процесса »!вз-"лоточхюго узкавалпл.

4. Лдгезпя глсгок, ."сдр'рщарсвашпас лскусстзегп-зм Е55ёШВ31,к стбстгзту с пгаздсч.

В слодулдсЛ часга работы m цродтрзниаа ьляатзу fjosjr&asqp- ■ ■%ать 72С нз "оделыгуп, а' собственно гаготочнув гккбргку. В гл^ост-. пз объекта иегфретной ¿пгскеряз нзбраля тслеткт: гсцитной яарцивса Эртзса. юготкя лредст-аяя»? собой хгра&кй случай опухолезсЛ прогргссгз: о;ш rory? с размножаться в суспзнзгя. Способность г. у тих ласузста. 1 nmsx зксггтргмептг:: тельг.о едкзгай«!

wíctjir кз "rr?TTíO;S zorrj.-ur.n прсидрэзжггсг, я стеклу, если на жм-балп адй'^Г'ровсша сагэгл^^чгав Сане; ^ла в среде прлпутс?2э».гга г.чзоро?гк. Годные балл потутсш paireo CEmEa.Fossrc-

:ст"1У30!. "а "чисто»'!" л-лтета прякрапяйлось' в 5-10 раз болхсо г'ле1с-к.0™"'"-"о,о!1л :-.-з ъпсхтстнвалесь, а оставалась с§ор-<г-гэсчг.а,

удерживаясь на подложке при uo;.ios3i коротких отростков.

' Ш ввела в клазштачаскую иамбрану асхщтиой клетка пскусст-. венные рецептора к ^¿обшщзовалпому на подлоге лэтавду. К коле-ь:о;.;5рапи, щквды свободниэ шдшогруппц, привязывала остатки биотина. Лодяогку докрцваяи белком аЕадипои, к которое бдотан Елюзт йасокоо сродство. Клотхш в Taicofi слот-з.'.гз приобретала способность расшамтцваться.

Расшхастшшае клзтвд имела здатедаопдаую иорфолопш: уплощенную центральную часть и довольно узкую Кольцову!) дама гну по кран. Грушш распластшпшх клеток naaoiaaana островка эпителиального плаз та: клетки плотно пралогела друг к другу, балл роздалока

с

чэткащ гранацады и ко поляризовала.

Следующие контрольные гкспералинти вокзала, что расклаошва-lao происходит именно благодаря споди4лчосту ьзаалодействая аш-дкиа с биотипом: а) Саошншшровашше 1;лсткн но расплаотцвадась па ЕС1»да$ад»Р°иа!ц:оа оубстрате; б) они на ра-'^аасачшаяись на стеклах о ил-¿¡к^-сиашши Оачьша сшгороточаам адьбушиом; ь)мет-га токле оатагались cf.ipaiscisnc:, седа пэкрлтцЛ акадшом. субстрат дрс;г<кус.арозал.: сс с^ойодаам блотапел.

Isi проварил:., но яьдястел ли боло/. ar-W-u дослед^чьгязд

аизалаз^а-анна за счаг'сьоогр аодсаг-

тсльасгс ..ат~а;а. (-лазллсл:,, '¡¡г нот. Еса.-иаролаядао к nc;ui;rc;., с;.с расплаа:;__;л..:;,. Сложна. раиулглал

бил калу •»•;.:: л,.a нгпглис^.лл-л су ос .-р.'Л'а, г;;•. .-„ч

с;-ocvpa?« сий, i ...¿.a,. : ,л.чаза:;11. a

из i.;oaai;a4a;iw3 *• раатсаихи-.¿„..¿оалаэ;-; WTU. nr. »-ада

иаа-р/.и, a 1;аала алзаад тьл.:^,;^,! o^a;;...«; аагаалллг. pa а ¡-.лаг* !а;ь. Kpu.-ij тою, ¡¡о act. т.н.. ..^ч.а ar.„оl-лг а слзто.л^ "клогал а ¡.вда^цлроаэлиил адази»!лс лс..;. иимар.. a.. . - слг-.-заацЛ cjCcTf«*'/

морфологию, которую мы паблвдаля у асцятннх клоток. Tait, на уда-лооь вызвать распластывание клеток миелош линии Х-63 (нормальными предшественникам? этих клеток являются В-лимфоциты, которые неспособны распластываться). Еиотиньлировшшые кяетки миеломц.как у немодафицировшшые, оставались сферическими на покрытом авидином субстрата.

Ведущую роль в процессе распластыванич биотинилировшнпЕс . ' клеток играет актиновий ксртекс: воздействие на расшгастакгиеся клетки шсокпмз дозшл ццтохалазина В, селективно разрупмсцзго ликрофяламэнты, приводило к ретракции ламелл и появлению херок-repmoc арборяэованнш: фпбрялд,-Похохло §а<5радта (уэкю, дяиладв яростна), ко но плоскпо лакэллы клоткз обраговывачп, есля цято-: ал аз пн В добавляли з глоточную оуспсшзпю пород нанесенном на ¡убстрат. Аналогичные процессы описаш дая итогах культур нор-аяьных оштелзолыпде.д <7~бро<5ласто:етг!ос клоток.

В используемой- нагя системе "клеткя о годафлцировлшей плаз-атнческой мембраной - адгезивный субстрат" асцкт:гао -детка постановили ряд свойств, характерных для нормальных згателкальшк лоток: они стает сходны с ниш ло морфологии г ■ интзрференционно-гратагельпая шкроскспия показала, 'что вдоль края распластанной зцнтной клетка имеются фокальные контакта (такое расположите жгактов типично для нормального эпителия). Наконец, у гаоглх гспластаншп клоток по периметру цитоплазмы был обнаружен коль-, звой пучок октановых киврофаламэнтов;

Таим образом, "модификация плазматической мэмбрши аендткых гаток искусственными рецепторами позволяет vss осуществлять пор-итапое флзиолоютоокое распластывание на соотвзтствукюм суб-рате.

Экстраполируя получшшый результат па систему in rlro , ра-кно предполояить, что в процессе опухолевой прогрессия асщг-ныо

клетки утратили рецепторы, необходимые для распластывания на субстрате. При этом весь внутриклеточный аппарат распластывания сохранился и способен функционировать.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые модельные системы для изучения клеточной адгезии:

а) "клетка-лппосоми, шдифицированше лектином";

б) "клетка с модифицированной плазматической мембраной -

адгезивный субстрат". Усовершенствованы методы изучения клеточной адгезии в полумо-делышх оистемах "клотка - плоокая липидная пленка"; "клетка - липосомы".

2. Плазматическая мембрана эпителиальных клеток при взаимодействии о краем плоской лишдной пленки в гелбобразном фазовом оостояши может устанавливать стабильный контакт. Такой, контакт приводит к подавлению способности клеточного и>ая "чио-титься" от поливалентных лигандов и исчезновению на нем ламелл. В том случае, когда липидная пленка находится в гшдко-криотал-личоском фазовом состошши, стабилышй контакт но возникает.

3. В местах контакта эпителиальных клеток с "твсрдыщ"лщюсом&\21 под плазматической мембршюй имзютоя элоктрониоплотныо структуры, характорше для зои формирования махклеточных контактов.

4. Таким образом, .гелеобразше липиднно домош и липад-овязившэ-

■ щио центры плазматической мембраны могут участвовать в образовании отабильного контакта ыавду. клеткаш.

5. В оиотемэ "хиштка-липооомы, модифицированные лектином" воопро-• изводятся основные характеристики лектнн-ошеродовшшой агглютинации клеток. Конъюгаты "локтин-липосома", в отличие от сво-' бодных локтинов и ны инфицированных липоелл, более эффективно

связываются трансформировавши! <Тнбробластами по сравнению с нормальнш.м.

Таким образом, спстома "протеолиносома-клетка" может быть попользована для исследования важных свойств кодгслеточного узнавшей, основанного на взаимодействии лиганд-роцоптор.

6, ¿Ьднфхкшцтя плазматической мембраны асцитшх клеток молекулами биотипа придает клеткам способность распласттаться на по'-крытс.м адзидином субстрате.

РазрЕботапп:!! метод мембранной шгхнерии позволлот изучать мо-ханизи! изменения адгезивных свойств клеток при различие: проявлениях пеошластпгоской трансформации,

РАБОТЫ, СЛ7.ПЛИКаВЛННЫЕ 7Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гордеега Л.В., .'"арголпе Я.Б. Взаимодействие знптелиальппс глоток с краями "лядюп" ч "твердых" ллпщршх плети:. - Цитологии. IS86, т.23, c.6S9-70:?,

2. Богданов A.A.,мл., Гс:~,еева Л.В., арголло Л.Б. ,'Горчплии В.П. Конканавалин Л, з^ммобгаизованшй на поверхности липооом. Раздавая :о .связнввпая норгдлыщш и" тптнаТормзровашпп.я шзянюяг фябрсйлгсхшт. - Енол.шмбразш, 1Г?6, т.З, с.67'1-684. • •

3. Гордеи^п Л.В., Богданов A.A.,мл. .Тостшш гак сродство направленно:! рзгуляцхш взаимодействия лшгосом с нормалг-пкшг л транс-форярсвапнш® клеткам.-Тезисы У всесоюзного сп:*позпума по бяохто'л дзпвдов (г./ц-.-д-Ата), К37, с.08.

'Гордос.ьд Л.В., Богдане» А.Л.,мл. Гспользовашго липосом с шго-бплизивашзш локтнном .-ля моделирования конклбточной адгезии.-Тозис^ ?сесок5ио" ; v.r '¡:творситетс'i'ii копфегзенцпп "Гполсгпя клетгч' (г.Тбилпсл), 1П7, о.868-:>70.

5. Атпяу" ':.Г., "r-.;.nrw 1:.3., Гордсо-а Л.В., ¡.'арголиг! Л.К.

Адгег. ■ • ю ум- '' '."точной t!e.v/.'\-!ias :icc:;c,noi::M;iro контактов

•клеток культуры эпителия ,цгуг о другом и "тэердами" липосома-ш. - Еиол.момбраиы,-1938, т.5, с,292-301.

6. Uargolifl L,B., Bogdanor A.A.,Jr., Gordeeva L.V.,Torohilin V.P. Interaction of Oori A-liponomea with cells » binding to normal and transformed mouse fibroblaets.- In t Liposomes as drug carriers, Edited by Q.Gref.oriadie, J.Wiley and Sons Ltd., 19UU, p.727-735.

7, Gordeera L.V., Bogdanor A.a.,Jr., BoibakoT B.A,.Torchilin V.P., l-'argolia L.B. Adhesion defect of aaciteo cells oorrected nith Eesbrane-bou.'id nttachaent molecules.- F3B5 Lett., 19SB, r.241, p.185-187.

8, Iic^danOT A.A. ,Jr., Gordouta L.V., Torohilin V .P. .Uargolis L.B. Ljltin-bearlr.f, lipoaoaeDi differential binding to normal and' to transformed mouse fibroblasts.- iisp. Cell ilea., 1989, т.181, p. 352-374.

9. Богданов А.А.,гл., Гордеев Л.В., Байбаков Б.А..Торчилии В.П., Нарго-кс U.S. Распластш^ие бнотшшлированшх клеток асцит-

lapc^KCMj ка ^лобллпзованно!.; авидино. - Еиол.иамб- •