Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение и создание реципиентных систем для генетической трансформации кормовых культур

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение и создание реципиентных систем для генетической трансформации кормовых культур"

г-

Московская ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственная академий вмени К.А»Тимпрязева

На правах рукоп«,...

ИВАШУТА СЕРГЕЙ ИВАНОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ И СОЗДАНИЕ РЕЦИПИЕНТНЫХ СИСТЕМ ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КОРМОВЫХ КУЛЬТУР

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

Моек за

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии и клеточное селекции Всероссийского научно-исследовательского института кормов имена В.Р.Внльямса.

доктор биологических наук, профессор Шмыгл» В*А*

кандидат биологических наук Рассадина Г .В»

Ведущее учреждение - Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии.

Зашита состоктса ' -10 ' марта г. ь ' " ч на заседании специализированного сраета Д. 120.85*07 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А»Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, ул, Тимирязева*- 48» сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНВ ТСКА.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Лосева А.С.

Научньм руководитель: доктор биологических наук Мазин В.В* Официальные оппоненты!

Автореферат разослан

/

.Использование методов генетической иизвнерии уяе дает возыовность. получения растений со свойствами, которые невозможно достячь методами традиционной селекции, а также изучения регуляции генной экспрессии и различных физиологических процессоп, происходящих в растениях. Одшш яз основных препятствий для осуществления генетической трансформации зайних сельскохозяйственных растений является отсутствие принципиально новых подходов, позволяющих осуществлять эффективный перенос генов в растительный геном., Несмотря на больное количество работ, посвященных генетической Трансформации, успеиное получение трансгзйных растений, зависящее от взаимодействия аирокого ряда факторов,еде далеко ве всегда мояат быть достигнуто даяе для одного в того яе вида растения в разных лабораториях (ЦпЛвеу,, 1992). Так наиболее пироко используемый в практике агробактериальпой трансформация метод "листовых дисков", являясь довольно удобнкм н эффективным для ряда культур, как например пасленовые, оказывается но всегда подходящим для трансформации важных кормовых культур. В то на врекя разработка новых подходов и наиболее подходящих для конкретных культур реципиентных систем позволяет значительно расширять всзмояюсти генетической трансформации с применением агробактерий.

В последнее время, наряду с введением в растенпя генов, контролирующих иояогетше признаки, наблюдается интерес к интеграции генов, изменявших гормональный баланс растений а продукт трансляции

которых существенно пеняет метаболизм растений а опосредопапло влп-

»

яет на ванные полигенно контролируешь признаки растений.

Пель п задачи рабдти. Целью настоящей работы было пзучение условий взаимодействия систем переноса генетической информации с разнообразны:« реципиептными системами люцерны, клевера а рапса, а такие изучение вочкозяоетн осуществления генетической трансформации

г

этих культур при использования различных генетических конструкций. В соотвестги с этим г задачи работы входило:

1. Отработать систему культивирования и регенерации in vitro ряда генотипов кормовых культур, используемых в селекционной работе.

2. Изучить разнообразные реципиентные системы для проведения генетической трансформации кормовых растений с помощью различных способов переноса генетической информации.

3. Определить оптимальные параметры взаимодействия комплекса: генотип растения - генетическая конструкция - реципиент»ая система.

4. Получить генетически трансформированные растения.

5. Провести первичную оценку экспрессии целевого гена на основе морфо-физиологических и других показателей полученных растений.

Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное изучение и сравнение различных рецппиевтных систем люцерны, клевера н рапса. Определены условия рецнпиентной системы клевера, основанной на использовании клеточной суспензионной культуры. Разработана ре-ципиеьтная система клевера и люцерны, основанная на разобщении доминирующих центров проростка и использовании особенностей синтеза и транспорта эндогенных фитогормоков. По данной рецнпиентной системе оформлено авторское свидетельство, на которое получено положительное решение. Выдвинуто предположение о лимитирующем влиянии физиологического состояния клетки-реципиента на эффективность трансформации. Впервые получены регеиеракты люцерны без применения экзогенных регуляторов роста путем прямого органогенеза и через каллусо-генез после обработки эксплантов штаммами Agrobac terium tumefaci-ens и A.rhizogenes. Впервые осуществлена генетическая трансформация дикого вида люцерны И.всуеП и ряда сортов отечественной селекции.

Научно-практическое значение работы. Эксперименты проводилась ка трех важных кормовых культурах-люцерне, клевэрч и озимом рапсе.

Работа имела иетодическув направленность, однако в процессе работы получены трансгенные .^астения с иорфо-физиологическиаи изменениями, имеющими практическую ценность для кормовых культур.Разработаны эффективные реципиентиыэ системы для различных видов люцерны к клевера. Определены условия эффективной трансформации озимого рапса.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на: Всесоюзной научной конференции молодых ученых и аспирантов "Актуальные проблемы интенсификации кормопроизводства"(г.Москва, 1991); I Всесоюзном симпозиуме "Новые методы биотехнологии растений" (г.Пущине, 1991); Российско-германском рабочей совещания по молекулярной биологии я биотехнологии (г.Москва., 1992); Годичном общем собрании отделения кормопроизводства, РАСХН (г.йосква, 1993); II Росийскоа симпозиуме "Новые иетодц биотехнологии растений" (г.Пущино, 1993); II йеадународной конференции "Биология культивируемых клеток растений н биотехнология" (г.Алнаты, 1993); конференции по генетике соаатнческих клеток в культуре (г.Черноголовка, 1993)

По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура я обьем диссертации. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, пятя глав с излокеипеи результатов, обсун-дения, заключения, выводов, списка литературы, включающего 164 наименования, пз них 118 иностранных. Работа пзлояена на 119 страницам ».¡аншгаписиого текста, содерзпт И таблиц а 51 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И ЙЕТОДН Растительный матера«1»;. Выбор растительного материала осуществлялся по одному из двух критериев:высокая регенерациояная способность в культуре in vitro и использование в селекционной практике. В работе использовали семена я вегетяруюцие растения следующих сортов и перспективных образцов: лвцеряа северная, "edlcago borealis I., няон К 54, получен к.б.н. А.В.Мезенцевым (ВНИИ кормов) и клон

Д12, получен С.И.Иваиутой (ВНИИ кормов); люцерна посевная, Н.sativa L., клон i24, получен H.А.Голышкиной (ВНИИ корнов); люцерна посевная, Й.sativa L., сорт Надежда и сорт Кокве; люцерна изменчивая, И. varia I,., клок 868, получен А.В.Мезенцевым (ВНИИ кормов); M.lupu-lina к M borealis, клен 45, соматический гибрид, получен к.б.н.H.H.' Агафодоровой (ВНИИ кормов); люцерна хмелевндн'ая, И.lupulina, днп-локд, дикий вид и его тетраплоидная форма, полученная к.б.н.H.H. Агафодоровой (ВНИИ кормов);люцерна мейера, H.ieyeri,дикий вид; клевер луговой, TrifolíUB pratense, сорт ВИК-7; клевер луговой, Trifolium pratense, клок РУ-2, получен к.б н.Л.А.Солодкой (ВНИИ кормов); клевер луговой. Trifoliim pratense, клон РФ, получен к.б.н. И.Г. Кирьяк (ВНИИ kgdmob): рапс озкмый, Brassica napas L., сорта Тясме-нецкий, Страдненский, Тандем, BHW-1, Lirogolíl, Проминь.

Бактериальный материал, В работе использовала следующие штаммы AgrobacteriuBi tuicefaciens н A.rhizogcnes:

A281/pGV941tt -гипервирулентный втамк A.tunefaciens А 283 с "нераз-оруяеиной" Ti-плазиидой рТ1Во542 и бинарным вектором pGV941tt, несущем гены KPT II и знтоногоксича(tox).Втакм получен из инсг-та С/х биотехнологий (Зап.лаб.д.б.п.К.Ф.Шемякин).

LGV 3B50/pGl.Tr4- штамм А.tumefaciens С58 с "разоруженной" Ti-плаз-мидой pGV3B50 п бинарным вектором pGLTr4, несущем гены HPT II и синтеза цитокииина (ipt). Штамм получен из инс-та Молекулярной генетики РАК (Зав.отделок д.б.н.Э.С.Пирузян).

LGV 3850::рЕК19~ штамм А.tumefaciens С5С с "разоруженной" 71-плаз-мидой pGV3350 н коинтеграгивным вектором рЕК19, несущем гены IIPTII и ген глюкозоиземеразы íxyi). Ит&ми получен из инс-та Молекулярной генетики РАН (Зав.отделом д.б.н.Э.С.Пирузян).

GV3101 IpGV 2200)-мутантный штамм А.tumefaciens (shooty) с делети-рованными генами синтеза ауксина и интактным геном синтеза цитоки-

айна.Штамм получен от к.С.н.В.А.Аветисова (икс-i С/хбиотехнологии). LGV 3850/pGV941tt-DTa.HM A.tuaefaciens С58 с'раэоруяенной" Т1-плаз-кндой pGV3850 и бинарным вектором pGV941tt, несущем гены NPTII и знтомотоксина (tox). Штамм получен из инст-та С/х биотехнология (Зай.лаб.д.б.н. Н.$.Шемякин).

А4 |pRiA4)—дикий нтамм A.rhizogenes. Втамм получен из инс-та йоле-кулярной генетики РАН (Зав.отделом Э.С.Пирузян).

Итамкы агробактерий культивировали на средах с антибиотиками. fle-уоды работы с растительным материалом. Растительный материал культивировали на питательных средах Гамборга (В5) (Gaaborg,1968) и Иураииге-Скуга (HS) (Hyrashige, Skoog,1962). Для индукции каллусо-генеза люцерны и клевера в среду В5 добавляли 250 иг/л нитрата аммония, 30 г/л сахарозы, 2 иг/л 2,4-Д а 0,2 иг/л кинетика. Индукинв морфогенеза из каллусов осуществляли, вводя в среду В5 бепзиламино-пурин (от 0,02 до 0,5 иг/л). Клеточные суспензионные культуры клевера и люцерна получали из каллусов на среде В5 с 0,5 мг/л 2,4-^ 0,5 иг/л кинетина а 2 нг/л 2,4-Д+0,2 иг/л кянетина, соответственно. Индукцию соматического эмбриогенеза в клеточных культурах клевера осуществляли на среде с 0,5 мг/л кинетина. Рапс регенерировали из семядолей на среде MS с 4 иг/л БАП ила 3 мг/л БАП+- 0,5 мг/л НУК.

йетодика провздения генетической трансформации. . Для изучения возможности агробактериальной трансформации кормовых культур были использованы четыре реципиентные системы (рис.1.).

В рецяпиеитной сиситеме >i 1 использовали изолированные части растений (малые гетерогенные экспланты), которые «окультивировали с агробактерней и затем помещали на селективную питательную среду. Из устойчивых к канаиицину каллусов получаля регеперанты. Данная система трансформации язляется наиболее распространенной и основана на методе "листовых дискоз".

5.

к.

АМ ¡и ■ „_

Рис.!

При использовании реципиентной систеюыг (суспензионная клеточная культура) кокультивирование с агробактериай проводили в видной среде. Инокуляцию осуществляли добавлением 5 ыкл разбавленой в 1000 раз ночной культуры агробакгерии к 20 мл клеточкой суспензии. Использовали три типа клеточных культур: а) пролиферпрусвдгв суспен-' зип в фазе экспоненциального- роста, б) суспензию б начале инрукции соматического эмбриогенеза, в) суспензию с образовавшимися эмбраои-дами и началом индукции вторичных экбриоидог. После 2-3-х суток ко-кульгнвирсвания суспензию отмывали от бактерий я ресуспендирсеалн в среде, содержащей канамицнн (Кб) и цефотаксци. Селекцию на устойчивость к Кш проводили в жидкой или в агврязованной средах,

Система^ 3 - разобщенных доминирующих центров, основана на использовании в качестве реципиентов клеток, лежащих на поверхности среза 7-9-ти дневных проростков. Инокуляция проводили. путей нанесения на срез разбавленной ночной культуры агробактерии и последующего кокультивирования с ней верхней и нижней частей проростка срезами вверх на агаризованной среде без регуляторов роста. После кокультивирования часть гипокотяля с инокулированныи срезом помещали на селектизные среды или ¡га среды без Кга и без регуляторов роста. Полученные каллусы использое&лк для регенерации растений.

В качестве альтернативной реципиентной системы (//4)(генеративные клетки) изучали.: возможность использования' для генетической трансформация процесса опыления-оплодотворения растений. Супеизив агробактерий или плазмндную ДНК наносили на рыльце пестика или на срез пестика, сделанный через некоторое время после опыления. Полученные сеиоиа проращивали на селективной среде.

Кроме переноса генетической информации с помощью агробактерий Использовали такне высокоскоростную трансфекцию (на базе инс-та Молекулярной биологии РАН, к.б.и. В.А.Колесников). В качестве реципиентов использовали листочки, каллусные и суспензионные культуры.

' Аналп? растительного материала. Для подтверждения трансгенной Природы растительных тканей проводила определение активности кео-кпципфосфотрапсферазы II (НРТ) (Снотт и др.1991) у клеточных линий я.рвгенераитов я осуществляли анализ растений е помощью полимераз-ной цепной реакцин(РСЮ (Саики и др.,1990). У полученных растений изучали спектры зстераз в полиакрнламидном Геле (Сафонов и др., 1971) и иорфо-физяологическяе язмеяепия.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. ВзпУНодейстзпе ренляпеятроГг ткани с агробактзрией при пс-пользонавии малых гетерогенных эксплаитов. Преимуществом этой системы является простота, а различные кодификации и призмы повыиення эффективности сделали возгюаныи ее принененпе для трансформации ряда растений. К основным приемам, повыаащии эффективность системы,

относятся: подбор пары хозяин- патоген, подбор состава питательной . ■ • * ' - ' среда п условий культивировался-, подбор оптимального типа экспланта

для конкретного растения, определенен параметров кокультивирования

реципиента с бактерией, усиление вирулентности агробактерий.

Наша работа, по изучению, взаимодействия агробактерий с различными ргцигшектныки системами люцернн, клевера и рапса была начата

.■■i-пну с изучения возможностей данной системы.

Льцерна. Основным способом регенерации люцерны in vitro явля-

. гея регенерация через стадию каллусогснеза. Предварительная оценка

эффективности каллусогеназа различных эксплантов была проведена с

целью выбора оптимального для трансформации типа экспланта(Табл.1).

4 Таблица 1.Эффективность каллусогенеза эксплантов клона 868 (в % от общего числа эксплантов в варианте)

тип \ баллы

экспланта \ . 12345678

черешки 50.0 50.0

листья 33.3 33.3' 13.4 10.0 10.0

гипскотилк 13.3 70.0 16.7

сеиядо.чи 10.0 " '23.3 66.7

Баллы {1-С)-кратность увеличения массы каллуса по отноаению к массе инициального экспланта за 24 суток культивирования.

Как видно из табл.1, для клока 86В лучшими типами эксплантов оказались молодые листья взрослых растений и семядоли. Каллусы всех типов были в дальнейшем способны к регенерации. В процессе наблюдения за развитием каллуса выяснилось, что количество образующегося каллуса не может служить достаточно надежным показателей пригодности экспланта для экспериментов по генетической трансформации. Сложность состояла в том, что далеко не все экспланты продуцировали каллус непосредственно из места среза, г.е. места наиболее вероятной трансформации при контакте с агробактерией. У большинства эксплантов наблюдался первичный некроз срезов, заключающийся в гибели верхних слоев клеток, и лишь затеи каллус развивался из клеток, лежащих Солее глубоко. Изменения в составе регуляторов роста в среде существенно не влияли на развитие некроза, но ухудшали регенерацию. Таким образом, лишь часть эксплантов. не проявляющих интенсивного некроза срезов, могут быть использованы как реципиенты.

На кизнеслособность реципиентной ткани также влияют особенности кокультивирования экспланта с агробактерией. В нашей работе были

изучены три способа кокультивирования: 1) в видной среде с добавлением суспензии агробактерии, 2) при погружении экспланта в суспензию агробактерни с последующим культивированием на агаризованной среде, 3) при погружении экспланта в суспензию агроЗактерии с последующим культивированием на бумажном фильтре, лежащем на слое клеток из суспензионной культуры люцерны. Большинство из используемых эксплантов люцерны оказались чувствительными к воздействию агробак-терйй, в результате чего ниэнеспособность реципиентних клеток значительно снижалась.Наиболее "щадящим" оказался способ культивирования на бумажных фильтрах, который позволял проводить длительное ко-культивирование (5 суток) без снижения жизнеспособности экспланта.

Опираясь на приведенные выше результаты, был проведен ряд экспериментов для изучения взаимодействия эксплантов с агробактерией и установления возможности трансформации в конкретных парах генотип растения-атамм агробактерии при определенных условиях (Табл.2).

Результаты приведенного ряда экспериментов показывают, что

Табл.2 Эффективность трансформации при инокуляции агробактерией малых гетерогенных эксплантов люцерны.

Генотип Штамм агро- Тип экс- Состав ¡Концен. Допол. Эффект-сть

растения бактерии планта среды |Ки мг/л услов. трансфорн.%

кл. 124 pGV941tt пшокот. Кс 75 - 1.18

кл. 124 р&У941П семядол. Кс 75 пр. к. 1.72

Кокае А281П гипокот. Кс 50 - 2.28

кл.868 А281и семядол. Кс 50 пр. к. 1.61

кл.868 А281и семядол. БАПо,2 50 пр.к. 2.63

кл.868 А281« семядол. 6/Г - - 3.23

кл.868 ША4 черешки б/г - - 2.22

Р-45 рЕК19 сег.стебл. Кс 60 - 1.24

Д-12 К1А4 черешки б/г - - 2.38

Хкел.(д.) рСУ2206 гипвкот. б/г - - 6.38

ХмелЛд.) А28НЬ семядол. Кс 50 - 41.3

Хмел.(т.) А281ЪЪ семядол. Кс 50 - 44.2

Примечание:Кс-среда для каллусогенеза; БАПо,2-среда с 0.2 нг/л БАП; б/г-сгеда без регуляторов роста; Пр.к.- предварительное культиьиро-вание экспланта на среде Кс до инокуляции агробактерией; результат приведен в % эксплантов, дающих положительную морфогенетичеекую ре акцию,к общему числу эксплантов в эксперименте; штаммы агробактерий названы в соответствии с векторными нлазмидами,кроме штамма А281гЪ.

10

^____

для каждой пары генотип растеннй-нтамм агробактерий, помимо того, что га-гамм должен быть вирулентен для хозяина, необходим подбор конкретных условий трансформации,порою сильно отличающихся оТ условий, необходимых для другой пары. Наиболее эффективно трансформировалась (41-44%) люцерны хмелевидная. Эффективность трансформации других культур (клоны Р-45 и 124) была значительно ниже и некоторые генотипы не трансформировались совсем. Частота трансформации генотипов люцерны зависела от используемого итамма, типа экспланта, состава питательной среды и времени кокультяварован^я. Штамм А281Н был наиболее эффективен для трансформации используемых генотипов люцерны. Отмечено; что жизнеспособность экспланта имеет определяющее значение для успешной трансформации.' Семядоли и гипокотяли оказались в целом наиболее удобными эксплантами. Предварительное культивирование экспланта (1-2 суток) на среде Кс до инокуляцип агро-бактерией увеличивало частоту трансформации. Состав фитогормонов в-среде также влиял на эффективность трансформации, особенно при использовании втаммов агробактерии, меняющих гормональную регуляцию растительной клетки Так, в эксперименте с парой клоп 868 - втамм А28иь уменьшение содераанпя фятогорионов в среде Кс увеличивало эффективность трансформации с 1.61Х до 2.63Х. При использовании ке штаммов ША4 и рСУ'2206 успешная трансформация была получена лишь на среде без регуляторов роста. В целом ее использование метода ко-нультивирования с малыми гетерогенными эксплантами, несмотря на попытки оптимизировать основные факторы,влияющие на трансформацию, не дает возможности значительно повысить эффективность трансформации и улучшить воспроизводимость экспериментов. Очевидно, что для люцерны необходим поиск более эффективной реципиен'лной системы.

Клеаер. Регенерация клевера лугового возможна через стадию каллусогенеза кз яхсплантсв различного типа. Метод кокультивирова-

пия экспланта с агробактерией, был аналогичен методу.применяемому для люцерны, я заклинался в кокультивировании на бумажном фильтре. Серия экспериментов была проведена для изучения влияния условий трансформации в паре генотип растения-итамм агробактерии (Табл.3).

Габл.З Эффективность трансформации при инокуляции агробактерией малых гетерогенных эксплантов клевера.

Генотип Штамм агро- Тип экс- Время Состав Конц. 1 Зффект-ть

растения бактерии планта кок-я среды Кш.ыг/и|трансформ.

ВИК-7 рвУ941и гипокот. 3 Кс 50 2.63

ВИК-7 раУ941П черенок 3 Кс 50 2.94

ВИК-7 А281и черепок 3 Кс 50 3.33

РУ-2 рЕК19 семядоли 3 Кс . 50 4.35

РУ-2 рЕК19 черешки 3 Кс 50 15.38

РУ-2 А281и почки 4 Кс 50 2.17

РУ-2 А281П черешки 3 Кс 50 27.65

РУ-2 Я1А4 черешки 3 б/г — 2.17

. Обозначения см. в примечании к Таблице 2.

Опыты показали, что клевер с несколько большей частотой, по сравнению с культурным» видами люцерны, способен к трансформации используемыми нами штаммами агробактерай. Трансформация была получена на всех используемых типах эксплантов, однако черешки давали лучояе результаты, как,например,в паре РУ-2-рЕК19. В варианте с парой ВИК-7-А281Н и РУ-2-А281Н формирвалнсь наиболее актишю растущие клеточные линии без ингибкрования роста даае при концентрации Ка до 200 мг/л. Воспроизводимость результатов при трансформации клевера была несколько выае, чем у люцерны, однако недостатки метода, характерные для люцерны, имели такие место для клевера. Серьезным дополнительным недостатком можно назвать значительную трудность регенерации растений из устойчивых к Ки клеточных линий, даае при использовании генотипов, обладающих исходно хорошей регенерацией.

Рапс.В отличие от клевера и люцерны рапс способен регенерировать растения,как через стадию каллусогенеза, так и минуя ее, путем прямого органогейеза. Проведенные нами эксперименты с использованием регенерации через стадии каллусогенеза для трансформации рапса

не дали положительных результатов, поэтому решено было использовать методику регенерации путем прямого органогенеза. Было установлено, что наиболее удобным эксплантом являются семядоли. Из пяти испытуемых вариантов сред выбрали две, процент регенерации на которых был наиболее высоким (Рис.2). Тип регенерации, наблюдаемый на этих двух средах (среда 1 и 5, рис.2), различался. Так, при культивирован»' зксплантов на среде 1 наблюдали образование на срезе черенка многочисленных неристематических зон наряду с развитием плотного каллуса. Впоследствии из меристенатическнх зон развивались многочисленные побеги с одновременным образованием корней. На среде 5 наблюдали образовакие побегов и эмбриоидов без каллусировакия эксплан-та. Сравнение регенерационной способности эксплантов пяти сортов озимого рапса на этих средах, показало, что эффективность регенерации у всех изучаемых сортов был вьше на среде 1 (Рис.3), но так как от типа регенерации может зависеть эффективность трансформации испыпгвалнсь оба варианта сред. Для отбора трансформантов использовали 15 мг/л Кт, что обеспечивало надежный отсев не трансгенных побегов, вызывая разрушение хлорофилла и остановку роста.

Табл.4 Эффективность трансформации при инокуляции агробакте-

рией малых гетерогенных эксплантов рапса..в

Генотип растения

Штамм агро-бактйрии

Разбавление

Время кок-я

Состав среды

Селек.|Допол. конц. |уелов.

Эффек-сгь трансфор. %

ЫгойоН рЕК19

Тисменец. рЕК19

Тисменец. р01Тг4

Тисменец. рСЬТг4

Тисменец. рОЬТг4

Тисменец. рбУ2206

1 50 3 1 15 пр. к 5.56

1 53 3 1 15 пр. к 2.78

1 50 3 1 15 пр. к 11.11

1 200 в 1 15 син.к 5.45

1 200 5 1 15 - 2.81

1 50 3 б/г - пр. к. 4.41

Обозначение см. в примечании к таблице 2: среда 1 см. рис.2

Результаты экспериментов показывают, что данный метод монет быть успешно Кспользован для трансформации сортов Ыгс^оЫ и Тисме-нецкий. Однако другие используемые в работе сорта не были способны формировать устойчивые к канамяцину побеги. Предварительное культй-

1 2345' 1 2345

0-побеги, ЕЗ-каллус.ЕЭ-корни О-ЗБАП+0,5НУК;Щ-4БАП (мг/л) 1- ЗБАП+0,5НУК; 2- 2БАП+1НУК; 3- 1-Проиинь, 2-ВНН-1, 3-0траднен-26АП; 4- 1БАП+ЗНУК; 5- 4БАП(мг/л) ский, 4-Тискенецкий, 5-Тэндеи

Рис.2 Влияние гормональных до- Рис.3 Эффективность регенерации бавок к среде на морфогенети- различных сортов рапса на средах ческую реакции эксплачтов рапса с разными фитсгормонами

зирование эксплантов в течение суток до инокуляции агробактерией является в больаннстве вариантов определявшим фактором для получения положительного результата. В то же время снижение первоначальной плотности ииокулима в 4 раза при увеличении времени кокультивн-ровании с 3-х до 5-ти суток, дает эффект, сходный с предварительным культивированием. Лучшие результаты были получены на среде 1. Введение в среду синапиновой кислоты увеличивало эффективность трансформации на среде 1 (Тнсменецкий-рСЬТг4).

Результаты экспериментов позволяют заключить, что данный метод отличается малой трудоемкостью я хорошей воспроизводимостью и может быть с успехом использован для генетической трансформации рапса.

2. Взаимодействие суспензионных клеточных культур с агробактерией. Суспензионная клеточная культура широко используется а раО< ■гах по селекции, ко крайне редко в работах по генетической гране формации. Нами предпринята попытка изучить возможности суспензион-

них клеточных культур люцерны и клевера в качестве реципнентных систем для генетической трансформации.

Клевер. При определении селективной концентрации Ко мы исходили из того, что чувствительность клеток суспензии к Ка на разных этапах ее развития различается н соответственно определяли несколько концентраций. Для пролиферирующей клеточной суспензии клевера была выбрана концентрация Ка 60 мп/л. При платировании клеток суспензионной культуры концентрацию снижали до 50 иг/л. Индукция соматического эмбриогенеза ингибнровась при концентрации Кп 30-40 мг/л.

Таблица 5.Эффективность трансформации при кокультивировэнии суспензионной клеточной культуры клевера (линия РФ) с агробактерией.

Тнп суспензион- Штамм Время ко- Концент. Дополн. Эффективность пой культуры культнв. Ки мг/л условия трансформации

Пролиферир. А281и 2 50 плэйт.Кс . 13 Пролиферир. рвЬТг4 2 50 плэйт.Кс 9 Индукц.эмбриогенеза рСЬТг4 2 40 'жид.сред. 2 поб. Эмбриоиды рйУ94т . 3 50 высев БАП 1 поб.

Примечание: среда Кс или БАП- плэйтинг нли высев суспензии на среду для кадлусогенеза или на среду для развития эмбркоидов; «ид. сред.-отбор устойчивых к Кв клеточных линий в жидкой среде; результаты приведены в количестве клеточных линий или побегов Споб.) на одну Чайку Петри (среднее из пяти повторностей).

Результаты экспериментов показывает,- чт пролифернрувщая клеточная суспензия может быть успешно использована для генетической трансформации. В то Ее время при использовании экбриоидов не удалось добиться образования устойчивого к Ка каллуса, даже при длительном культивировании (до 8 суток) змбриоидов с гипервирулентныа штаммом Д281ЬЬ, несмотря на то, что нам удалось сохранить хоровую аизнеспособность реципнентных тканей. После кокультивирования с агробактерией в суспензионной культуре эмбриоиды иногда способны образовывать устойчивые к Кш побеги. Однако, очевидно, что химер-ность таких побегов будет достаточно высокой, и мы считаем, что более предпочтительным является отбор на клеточном уровне при ис-поль'зосашп; пролифериругаей суспензии. *

Люцерна. Кокультнвнрованне пролнферирукщей клеточной суспензии люцерны (клон 868 и Р-45) с агробактерней (А281ЬЬ н рбЬТгД) не дало полояительньс: результатов. По-видикому, необходимы специальные исследования по подбору результативных пар и условий трансформации.

3. Взаимодействие частей проростков с агробактерией. Идея использования в качестве реципиентов частей проростков с сохраненными зонами синтеза эндогенных фитогормонов родилась на основании опытов, сделанных во время работы с. малыми гетерогенными эксплан-тамя. Использование малых гетерогенных эксплангов,таких как сегменты стеблей, гипокотилей, черешков, листочков ряда генотипов люцены Я клевера не удобно из-за низчой жизнеспособности ренипиентного слоя клеток в месте поранения. Подбор оптимального соотношения регуляторов роста в среде несколько повыпал акзнеспособность реци-пиентных клеток, однако, кардинально не изменял ситуацию и требовал больних объемов работ. В то не время было отмечено, что проростки клевера или лвцерпы, разрезанные в средней части гипокотиля и помеченные на среду без регулятороз роста, сохраняли живые клетки срезов нижней и верхней части проростков в течение десяти и более дней независимо от генотипа. Иы полагали, что высокая жизнеспособность ^яеток среза проростка, в отличие от срезов малкх гетерогенных экс-.(лантов, объясняется сохранением зон биосинтеза эндогенных фитогормонов проростка н особенностями их транспорта в частях проростка.

ким образом, мы получили систему, названную нами системой разобщенных доминирующих центров, и которая может быть использована в качестве реципиентной системы для трансформации многих генотипов дацерны я клевера. К началу нашей работы по данной системе (начало 1992 г.) мы не встречали б литературе аналогичного использования частей лроростксв для осуществления генетической трансформации. Кроме того, предлагаемая система является удобной моделью для изучения влияния синтеза эндогенных фитогормонов (иитокиников в корне

нижней частя и ауксинов в апикальной зоне верхней части проростка)

на результативность генетической траи< формации.

Люцерна. Схема экспериментов и основные результаты использова

ния описанной реципиентной системы приведены в таблице 6.

Таблица 6. Эффективность трансформации при инокуляции срезов верхней ш нижней частей проростков люцерны.

Растит. Штамм Время Питатель. Условия Эффек-сть трансф.

материал агробак. кокульт. среда отбора верхи.ч . ниан.ч

Хмелев.(д) рСУ2206 3 БАПо,2 морф. 2.56 : В

Хмелев.(д) А281П 3 БАПо,2 Кш 79.48 г

Хмелев.(д) А28т 3 Кс Кш 80.26 0

Хмелев.(т) А281« 3 БАПо,2 Кв 77.21 -

Хмелев.(т) А281и 3 Кс Кш 78.67 -

Хмелев.(д) рвИгЛ 4 б/г иорф. 30.22 -

кл.868 К1А4 6 б/г морф. 72.73 0

кл.868 рА1.Тг4 6 б/г морф. 57.14 5.55

кл.868 р6[,Тг4 6 Кс Ко 89.64 74.32

М.веуег! рСПг4 10 б/г морф. 66.67 . -

Примечание: примечание см.табл.2; морф.- отбор по специфичным мор-фогентическим признакам; Ка- отбор по признаку устойчивости к Кв; *-"- нет данных; время кокульт.- в сутках.'

Кокультивирование диплоидной люцерны хмелевидной со втаммон р6У2206 приводило к образованию, у 2,56Х эксплантов многочисленных побегов, тогда как в контроле морфогенез отсутствовал. Такой тяп регенерации наблюдали только на срезе верхнгй части проростков при культизировании на среде, содержащей БАП. Получить нормальные растения из таких побегов нам не удалось. Кокультивирование эксплантов люцерны хмелевидной с штаммом А281^ приводило к эффективной трансформации, проявляющейся в интенсивном каллусообразовании на обработанных срезах верхней части проростка в присутствии Кв, как для диплоидной, так и для тетраплоидной форм. Кокультивирование эксплантов верхней части проростка люцерны хмелевидной со штаммом pGl.Tr 4 вызывало на инокулированном срезе образовние почек у 30.22Х эксплантов. Обычно закладывалось от 2-х до 6-ти почек, из которых затей развивались жизнеспособные побеги. После инокуляции эксплантов клона 866 штаммом рйЬТгД на срезах верхней части проростка, куль-

тивируемой на безгормональной среде, наблюдалось интенсивное образование тератом темно-зеленого цвета с антоциановой окраской. Впоследствии из тератомных структур на среде, содержащей ВЛП, были получены растения-регекеранты. На срезах нижней части проростка образования тератомных структур отмечено не было. При оцзнке эффективности трансформации по признаку устойчивости к Ка в паре клон 868-итанм pGLTr4 наблюдала .образование устойчивых к Ки каллусов почти у 90Х эксплантов верхней и у 74* эксплантов нижней части проростка.

Инокуляция эксплантов М.веуегг штаммом pGLTr4,вызывала образование почек яа срезах верхней н никней части проростка. На среде без регуляторов роста эти почки образовывали многочисленные побеги, которые давали дополнительные придаточные побеги и росли в форме куста без признаков апикального доминирования. Некоторые из таких побегов удалось укоренять н получить низнеспособные растения.В контроле образования придаточных побегов не наблюдалось и сохранялось апикальное доминирование на средах без регуляторов роста.

КокультивироЕание эксплантов клона 563 с диким итамком A.rhí-zogenes А4 приводило к образованию корней из ерэзов у 62* эксплантов верхней части проростка, по сравнении с 2% в контроле. На едном из наиболее интенсивно растущих корнепых клонов через месяц культи-пированиЯ на среде без регуляторов роста появлялись зеленые нерис-тейатгспеские зоны, из которых затем развивались почки.Короткая экспозиция отрезков корня с почками на среде, содержащей ВАП и НУК, с последующим культивированием на среде без регуляторов роста, нриво-дйла к образованию многочисленных побегов,которые легко укоренялись прй Отделении от основного экспланта. Фрагмент корня на безгормо-калытой среде в течение четырех месяцев был способен обильно про -дуЦи^овать побеги. В жидкой питательной, средэ, содержащей вместо сихароэи глюкозу и не содержвцей регуляторов роста, через дзе неде-

ли культивирования на срезе эксплантов этого ве корневого клона образовывался плотный зеленый каллус. При пассирования вновь на ага-ризованную среду без регуляторов роста наблюдалось образование на интактных тканях корня неристематических центров, из которых зятем без дополнительной индукции развивался внсокоиорфогеиный каллус. Многочисленные побеги, полученные из такого каллуса, хорошо укоренялись на безгормональной среде> Кроме того, корневой клон при культивировании на среде без регуляторов роста с невысокой частотой был способен формировать полноценные регенерааты с развитой корневой системой. Таким образом, без применения регуляторов роста из корней люцерны, индуцированных A.rhizogenes, были получены рзге-неранти как через каллусогенез, так и путем прямого органогенеза.

Клевер, Способ трансформации при использовании частей проростков был также применен для клевера. Растительным материалом слукил клон РУ-2 клевера лугового. Результаты экспериментов (Табл.7) показали, что способ, разработанный нами для люцерны, монет быть с успехом использован для клевера. Кокультивнрование клевера с втаимоа А281и приводит к образованию устойчивых и Кп каллусов из срезов ВВХ верхней и 27Я шшней частей проростков", культивируемых па среде Кс. Отбор по морфогеиет^ческим признакам дал близкие результаты й на среде без регуляторов частота трансформации у срезов верхней в

Таблица 7. Эффективность трансформации при инокуляции срезов частей проростков клевера.

Растит.

Штамм агробак. Время кокульт. Питатель среда Условия отбора Эффект-сть трансф. верхн.ч. нивн.ч.

А281« 6 Кс Ка 88.23 26.92 .

А281« 6 б/г морф. 85.1а 23.07

рСЬТг4 6 Кс Кп 54.53 0

рИ,Тг4 6 б/г морф. 34.61 0

рЕК19 6 Кс морф. 80,95 -

рЕК19 - • 6 ..... б/г морф. 19.05" -

5 б/г' морф. 6.33 0

РУ-2 РУ-2 РУ-2 РУ-2 РУ-2 РУ-2 РУ-2 -

Примечание: обозначения см.табл.2; морф.- отбор по спец'»»фач!ща кор-фогекегичаским признакам в срагзкчшн с контролем; Кп- отбор по признаку устойчивости к Ь'и; "-"- нет данных

нижней частей проростка составляла соответственно 85.18Х и 23.07%. Обработка срезов штаммом pGLTr4 вызывала образование плотных зеленых новообразований на среде без регуляторов роста и без Ки, а на среде Кс формировался каллус.

Таким образом, использование системы разобщенных доминирующих центров проростка в качестве рециппентной для генетической трансформации различными атаммэия агробактерий имеет хорошие перспективы как для . люцерны, так и для клевера. Срезы верхней часта проростка клевера и люцерны характеризуются более высокой эффективностью трансформации по сравнению со срезами nnsueft части.

4. Использование процесса опылепия-оплодотпорения растения для генетической трансформации. Были определены оптимальные сроки срезания пестиков л»церны после опыления, существенно ке влияющие на завязываемость семян. Из семян, полученных из .обработанных доиорным материалом соцветий, не удалось отобрать устойчивые к Кя растения.

Не удалось тэкжо осуществить трансформацию люцерны при использовании метода высокоскоростной трансфекцна.

ft.Анализ- подученного растительного материала. У ряда клеточных линий и регенераитов был получек половятллышй результат при тестировании активности NPT и определении по методу PCR присутствия гена ИРТ II в растительном геноме (Рис.4,5).

K-^ite -if AbiiisK

\ 1 s

Рис.4 Определение НРТ-активности: Рис.5 Результаты PCR анализа:

1-"+" контроль, 2-С-образцы. ^"-"контроль, 2-8-обрззцн.

Метод определения актиэности NPT и метод PCR дают информации лишь о маркерном гене и не дают никакой информации об экспрессии целевого гена и возникающих вследствие этого изменениях в растениях, что является практической целью трансформации. В связи с этан нами была проведена первичная оценка изменений в полученных реге-нерантах по сравнению с контрольными образцами. Оценка норфо-фазио-логических и биохимических изменений в трансгенных растениях в качестве подтверждения экспрессии чужеродных генов связана с .природой интегрированных а растения целевых генов, изменяющих гормональный баланс растений, что при экспрессии гена должно приводить к измене нию морфо-физнологических к биохимических характеристик растении Нами был выявлен целый ряд морфо-физнологических изменений в net внчных регенератах (рис.7), отличающих их от контрольных растений а также изменений в спектрах неспсцифических эстераз.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итоги результатам исследований, прежде необходимо с> метить, что создание реципиентиых систем для генетической яраясфсц мации является наименее изученным звеном в технологии получении трансгешшх растений. В навей работе была наследована возможность генетической трансформации кормовых культур с помощью A.tuuefaciens и А.rhizoger.es, системы опыления-оплодотворения растений и высокоскоростной трансфекции. Показано преимущество агробактериальной трансформации кормойых растений и изучены перспективы использования четырех реципиенгных систем. Генетическая трансформация при использовании малых гетерогенных эксплантов показала, что эффективность этой системы не велика для большинства генотипов клевера и люцерны, а перспективы повышения результативности ограничены. В то ке время такой подход обеспечивает достаточно хорошие и стабильные результаты для рапса. При использовании клеток суспензионной культуры была

достигнута хоровая эффективность трансформации для клевера, однако трансформации люцерны в таких условиях достичь не удалось. Наиболее удачной и эффективной из всех изучаемых нами реципиентных систем оказалась система разобщенных доминирующих центров, основанная на использования частей проростков с сохраненными зонами синтеза эндогенных фитогормонов. Использование этой системы позволяет получать стабильные и высокие результаты по трансформации люцерны н клевера, на порядок превылаюцие результаты, получаемые при использования ма-лнх гетерогенных эксплантов. Перспективность использования изученных нами реципиентных систем для генетической трансформации конкретных кормовых культур отображена на Рис.6.

Срезы про- Малые гетероген- Суспензионная Геиератив. ростков ными экспланты клеточ.культ, клетки

люцерна + + +

клевер + + + ■ *■ + 0

рапс 0 + + 0 0

"++" -высокие, "+" -средние, -низкие, "0" -нет данных

Рис. 6

В качестве целевого гена, вводимого в кориовые растения, перспективным является использования генов,изменяющих гормональный статус растения. Такой выбор основывался на предположения о перспективности использования таких генов для улучшения кормовых растений, что и получило первичное подтверждение в наших результатах Основные группы изменений, наблюдаемые нами в первичных регенерантах, полученных после трансформации штаммами агробактерий, несущими в Т-ДНК гены синтзза фитогормонов, представлены на Рас.7 .

]корнеотгрысковосгы

[сроки цветения! кустаЦ-(СУТ+А1'Х I

содержание! / С¥Т фертильностьЬ X. У__:__

хлорофилла)" ((рСЬТгД)! ----X Ч ^¡фоома соцветий)

¡спзктры эстераз^'УНРЬ+АТО

¡устойчивость ____-Г1 (рКзА4)1 'развитие кор-

[кучнистой росе| ^морфология листьедА / |Невой системы

Гиг.7.

Кроне того показано, что предложенная нами реципнентная система разобщенных доминирующих центров проро тка, удачно сочетается с использованием в качестве целевых генов - генов,изменяющих гормональный баланс растений. В ряде случаев эти гены могут играть роль маркеров ,проявляющих себя через специфичные морфогенетические реакции.

ВЫВОДЫ

1. Предложены эффективные методы регенерации люцерны и рапса, заключающиеся в изменении протоколов культивирования и повышающий выход регенератов у генотипов, используемых в практической селекции.

2. Сравнительное изучение различных методов переноса генетической ииформации в геном кормовых растений выявило преимущество использования в качестве вектора Ti и Ri- плазиид Agrobacterium tumoía-ciens и A.rhizogenes.

3. Анализ результатов генетической трансформации люцерны и клевера лугового при использовании ыалых гетерогенных эксплантов показал, что эффективность этого метода низка, а Ьозкоэпостк существенного ее повышения ограничены.

4. В качестве реципиевтпой системы для опосредованной агробактери-ек генетической трансформации клевера 1юиет0слуаигь пролиферирующая суспензионная клеточная культура.

5. Разработана реципнентная система, основанная па разобщении доминирующих центров проростков клевера и люцерны.Установлено, что данная система обеспечивает высокую эффективность трансформации и мало зависит от генотипа люцерны и клевера.

6. Получены генетически трансформированные клеточные линии и растеши люцерны äedicago borealis, И.sativa, lî.varia, M.lupullna, клевера JiyroBoroíTrifoliuE pratense) и озиаого рапса (Brassica париз). Впервые проведена генетическая трансформация дикого вида K.neyeri.

7. Трансгенная природа ряда клеточках линий н регенерантов люцеркы,

клевера я рапса подтверядена результатами PCR-анзлиза и определе нием ИРГ-активности.

8. Разработан метод изменения гормонального статуса кормовых растений с помощью включения в их геном генов прокариот, обеспечивающих синтез фитогормонов. Экспрессия чужеродных генов оценивалась по изменению иорфо-физиологических и биохимических показателей.

9. Выявлена возможность полезных изменений у первичных регенерантов кормовых растений, трансформированных штаммами агробактерий, содержащими в Т-ДКК гены, изменяющие фитогормональный статус растений.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1.йвашута С.И. Трансформация клевера к люцерны с помощью агробак-терии// Тез.копф. молодых ученых и аспирантов "Актуальные проблемы интенсификации норшшроизводства"(Москва,1991).- М. 1991.-С.70-71

2. Ивапута С.И., Кирьян И.Г.,Мазин В.В. Использование суспензионной культуры клевера лугового для проведения генетической трансформации с помощью Agrobacteriua tuoefaciens/VI Всесоюзный симпозиум "Новые методы биотехнологии растений"(г.Пущино,1991).-Пущино,- 1991.-С.18

3. Иванута С.И.,Назин В.В..Солодкая Л.А.Генетическая трансформация культры почек клевера лугового//1 Всесоюзный симпозиум'Новые методы биотехнологии растений" (г.(Тупим, 1991). - Пуцпно,- 1991.-С.19

4. Hazin V.V., Ivaschuta S.I., Agafodorova H.H., Kirjan X.G., So-lodkaya LA,, Ermaicova E.G., Sologentsev P.D. Biotechnological and genetic transforation investigations of fodder cultures// Workshop on plant Bolecular biology and biotechnology, Gernan-Russian-Cis Research Cooperation, -Moscow. -19925

5. Мазпн В.Б., Иваяута С.И. Целенаправленное изменение генотипов кормовых растений методами генной я клеточной иниенерии// II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений" (г.Яущнно, 1993) .-11ущино.-1993 .-С. 104

6 Агафодпрова М.Н., Квашута СИ , Назин В В., Андрианов В.М., Пи-

рузян Э.С. Пряной органогенез трансформированных эксплантов läedica-¿0 Beyeri//II Российский симпозиум "Но»ые методы биотехнологии растений' (г.Пущино, 1993).-Пущино.-1993.-С.106

I. Ивашута С.И. .Агафодорова U.H.,Назин В.В. Генетическая трансформация люцерны с помощью "неразорувенного" втамма Agrobacteriiua tu-nefaslens// II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений" (г.Пущино, 1993).-Пуциног.-1993.-С.142

8. Ивашута С.И., Агафодорова H.H., Мазни В.В. Изменение морфогене-тнческой реакции люцерны, трансформированной с помощь» Agrobacteri-uta rhlzogenes// II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений"(г.Пущино, 1993).-Пущино.-1993.-С.143

9. Солодкая i.A., Иваиута С.И., Еуикова Т.к., Назин В.В. Иснользо-вание генетической трансформации для полученкя иорфогещшх каллус-пых культур клевера лугового// II Российский симпозиум "Новые методы биотехнологии растений" (г.Пущипо, 1993). -Пуцино.~1993.-С.169 104 Агафодорова Н.К.,Ивавута С.И.,Казни 8-.В. Различные пут регенерации растений люцерны из корней, индуцированных Agrobacteriua rhi-zogenes//II Международная конференция "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (г.Алиати, 1993; .-Ал;:агы.-1993.-С.81

II. Агафодорова H.H., Иваиута С.Н., Власов Н.Ф., Парикова Л.А., Назин В.В. Изменения физиолого-биохимических характеристик растений регенерантов лззцерпы, полученных после кокультвпровання с Agrobac- • teriua tunsfaciens// Конференция по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка, 1993) -Черноголовка.-1993.-С.69

12. Солодкая H.A., Иваиута С.И., Назин В.В. Трансформация растений клевера лугового с помощью Agrobacteriua rhizogenes// Конференция по генетике соматических клеток и культуре (Черноголовка, 1993) -Черноголовка.-1993.-С.72