Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛЕПТОСПИР

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛЕПТОСПИР"



, МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

Московский технологический институт мясной н молочной . промышленности

V

провал рукописи

ЕЖОВ ГЕОРГИИ ИВА

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛЕПТОСПИР

.. (03.00.07— микробиология)

Автореферат 1 диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1 976

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР

Московский технологический институт мясной и молочной _промышленности__

На правах рукописи ЕЖОВ ГЕОРГИИ ИВАНОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И БИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ ЛЕПТОСПИР -

(03.00,07 — микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

/

Москва — 1075

Работа выполнена в Ордена дружбы народов Университете дружбы народов им. Патриса Лумумбы (ректор— доктор экономических наук, профессор В. Ф, Ста-нис).

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор В. С. Киктенко,

доктор медицинских наук, профессор Т. Т. Березов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Ю. Г. Чернуха,

доктор медицинских наук, профессор А. С. Самедов,

доктор биологических наук, профессор Е. В. Козловский

Ведущее предприятие, давшее отзыв о научно-практической ценности работы — Государственный научно-контрольный институт ветеринарных препаратов МСХ СССР.

Автореферат разослан 975 года.

Защита диссертации состоитсяУй^й? 197^ г. на заседании Объединенного Ученого ^Совета Московского технологического!) нститута мясной и молочной промышленности, С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Отзывы и замечания просим присылать по адресу: Москва, ул. Талалихина, 33. Московский технологический институт мясной и молочной промышленности.

Ученый секретарь Совета

Л. А. Пчслинцева

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Благодаря проведению больших лечебно-профилактических и оздоровительных мероприятий по профилактике н борьбе с лептоспнрозом в нашей стране за последние 10 лет разко снижена заболеваемость сельскохозяйственных животных этой инфекцией. В стране практически ликвидирован лептоспнроз промысловых животных и сведен до минимума лептоспнроз лошадей и мелкого рогатого скота.

В настоящее время достаточно полно изучены морфология лептоспир, клиническое проявление и пути распространения инфекции, выявлены .источники и резервуары лептоспир в природе, разработаны методы н средства специфической профилактики и терапиплептоспнроза у человека* и животных.

Однако в проблеме леитоспироза целый ряд вопросов боль-шоп научной и практической значимости остается недостаточно изученным. К их числу, в частности, относятся: некоторые особенности биологии и физиологии лептоспир, химический состав их клеток и антигенов, энзиматнческая активность, метаболизм, питательные потребности и др. Далека от своего решения проблема классификации и таксономии лептоспир. Существующая классификация основана на одном — единственном свойстве лептоспир-—антигенной структуре. На основании этого признака последний список патогенных лептоспир (Доклад ВОЗ, 1968, 380) включает в себя 124 серотнпа, объединенных по близости серологических свойств в 18 серологических групп.

В последние годы у нас и за рубежом в систематике микроорганизмов все больше используются данные химического состава таких классов соединений, как белки, аминокислоты, лнпнды, жнрные кислоты и, особенно, ДНК. В настоящее время получены данные, неопровержимо доказывающие, что нуклеиновые кислоты являются не только материальной формой хранения наследственной информации, но н теми соединениями, через которые осуществляется реализация наследст-

венностн в процессе развития организма, Поэтому можно считать, что изучение химического состава лептоспир, особенно липидов и нуклеотидного состава их ДНК. будет служить важной предпосылкой для создания научно обоснованной классификации этих микроорганизмов с учетом генетических признаков.

Изучение химического состава лептоспир диктуется не только настоятельной необходимостью разработки и создания более совершенной систематики этих спирохет. Изучение химического состава к свойств отдельных химических компонентов лептоспир предпринимается, кроме того в связи с возрастающими требованиями к средствам диагностики и профилактики лептоспироза. Подобные исследования, таким образом, имеют не только теоретическое, но и большое прикладное значение.

Одним из актуальных вопросов проблемы лептоспироза является выращивание лептоспир в колониях на плотных питательных средах. Это необходимо как для получения чистых культур лептоспир при изучении химического состава, энзима-тической активности и изменчивости этого рода спирохет, так и для диагностических целей — выделения лептоспир из организма животных, больных лептоспирозом. Однако сложность состава предложенных сред и методики культивирования лопестпнр на плотных средах сдерживает до последнего времени использование их в производственных лабораториях. Разработка простых по составу плотных питательных сред для культивирования лептоспир увеличит возможности изучения химии и генетики этого возбудителя, положительно скажется на диагностике заболевания.

Цель работы. Основной целью работы было изучение химического состава и биологических особенностей культур лептоспир, определяющих развитие патологии у животных и человека на территории нашей страны. Разработка этих вопросов позволит выяснить возможность использования данных о химическом составе лептоспир для разработки более совершенной классификации этих спирохет, изучения генетики и подбора диагностических и вакцинных штаммов.

Основные задачи исследования. С учетом вышеизложенного при проведении исследований нами были поставлены следующие основные задачи:

■— определить состав электрофоретическнх фракций белков лептоспир;

— изучить аминокислотный состав белков;

— изучить динамику содержания и нуклеотндный состав

РНК; . .....

— изучить динамику содержания и нуклеотидный состав ДНК;

— определить содержание свободных лнпидов и фосфоли-ппдов, состав фосфолипндов и жирных кислот;

— определить липазную активность;

— установить возможность использования плотных питательных сред в работе с лептосппрами.

Научная новизна. Впервые современными методами биохимического н физиологического анализа изучены химический состав н биологические особенности большого числа штаммов лептоспнр. Представлены основные показатели содержания и состава таких жизненно важных классов соединений, как белки, нуклеиновые кислоты и лппиды. Сделана сравнительная оценка значимости изучаемых химических компонентов для классификации, подбор'а диагностических и вакцинных штаммов лептоспир, Показано, что химический состав лептоспир, в частности состав и количественное содержание аминокислот, жирных кислот и, особенно, нуклеотидный состав ДНК н лнпазная активность лептоспир могут быть использованы в качестве дополнительных критериев для возможно полном и объективной оценки сходства и различий штаммов при разработке более совершенной естественной классификации лептоспир. Впервые показана возможность объединения лептоспир в биологические группы не по антигенной структуре, а по генетическому материалу — содержанию ГЦ в их ДНК.

Установлена возможность н показана целесообразность использования плотных питательных сред для очистки штаммов лептоспир при изучении химического состава, для прямого выделения возбудителя нз мочи зараженных свиней и для изучения изменчивости лептоспир. Впервые выявлена диссоциация лептоспир при культивировании на плотной питательной среде. Изучен химический состав и биологические особенности исходного и диссоциировавшего варианта лептоспир.

Практическая ценность. Представлены материалы для более полной биологической характеристики и объективной оценки сходства и различии штаммов лептоспнр. Эти данные могут быть использованы для разработки научно обоснованной естественной классификации этих микроорганизмов, а также для подбора диагностических и вакцинных штаммов.

Предложена схема объединения лептоспнр в биологические группы но генетическому признаку — по содержанию ГЦ в ДНК. На основе этой группировки выявлены внутри-групповые и межгрупповые отношения между существующими таксономическими единицами (серотнпами) и высказано предположение о причинах гетерологических связей, выявляе-

мых серологическими методами при диагностике лептоспп-роза.

Доказана возможность использования плотных питательных сред как для получения чистых штаммов лептоспир, необходимых при изучении химического состава и энзиматнческой активности, так и для диагностических целей — прямого выделения возбудителя из мочн.

Апробация. По материалам длссерташш сделаны ^сообщения на:

— IX Международном конгрессе Федерации Европейского биохимического общества ( Болгария, 1971);

— Национальном симпозиуме «Лептосппроз, летоспнры и другие спирохеты» (Румыния, 1975);

— V Всесоюзной научной конференции по лептоеппрозам человека и животных (Казаш., 1971);

— VI Всесоюзной конференции но лсптоспирозу (Баку, 1975); '

— I—II и III Межвузовских симпозиумах по лептоеппрозу (Москва, 1968; 1970, 1973).

Публикация. По теме диссертации опубликовано 25 печатных работ.

Объем работы. Материалы диссертации изложены па 276 страницах машинописного текста и состит из 8 глав, выводов н рекомендаций. Работа иллюстрирована 41 таблицей, 32 рисунками и фотографиями. Список литературы включает 317 наименовании отечественных и 334 — иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе были использованы биохимические, бактериологические, биологический, серологический к статистический методы исследования.

В процессе работы было использовано около 600 л жидкой культуры лептоспир, которую выращивали в лаборатории партиями по 20—30 литров. Нами получено и исследовано более 100 г необезвоженкон и 1982 мг обезвоженной лнофилизн-ровэнной биомассы лептоспир. В ходе исследований было выполнено около 10000 разнообразных химических анализов, а также большое количество бактериологических, биологических, серологических и других исследовании, связанных с электронномикроскопическим изучением морфологии и ультраструктуры лептоспир, а также особенностями роста колонии на плотных питательных средах. Эксперименты по изучению иммунобиологических свойств и вирулентности лептоспир проведены на лабораторных животных, а но выделению возбуди-

теля на плотной среде из мочи — на свиньях в опытно-экспериментальном хозяйстве ГНКИ «Маннхнно» н в совхозе «Сафоновский» Московской области.

Материалы и методы исследований

При выполнении исследований использованы 20 штаммов лептоспир нз 12 серологических групп. В их числе 18 музей-пых культур, полученных из Справочной лаборатории ВОЗ при Институте эпидемиологии и микробиологии имени Н. Ф, Гамалея АМН СССР к из лаборатории по контролю колн-сальмонеллезных и лептоспнрозпых препаратов Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратор МСХ СССР. Кроме того, использованы два штамма лептоспир «Машшшо Пг» и «Пх» (серогруппа Pomona), выделенных нами из мочи поросенка, зараженного лептоеппро-зом, в опытно-экспериментальном хозяйстве ГНКИ «Маннхнно».

Все исследования проводились на штаммах лептоспир, выделенных нз колоний при культивировании на плотных питательных средах.

Для культивирования лептоспир использовали жидкую среду Ферворт-Вольфа или среду ГНКИ с альбумином и фактором роста. Количество и подвижность белковых фракций в белках лептоспир определяли диск-электрофорезом в полн-акрнламидном геле на стандартном приборе «Модель-Gib производства венгерской фирмы «Реанал», Белковые экстракты нз лептоспир получали по методу О. Б. Кузовлевой (1960), Электрофорез проводили в трис-глицернновом буфере при pH 8,3 в течение 1,5—2 часов, при силе тока 2,0—2,5 мА на трубку. Аминокислотный состав солянокислых гидролизатов белков лептоспир изучали при помощи одномерной нисходящей хроматографии на бумаге по Bode (1955) в модификации Г. Н. Зайцевой и Н. П. Тюленевой (1958), по образованию медных производных с нингидрнном. Определение суммарного количества нуклеиновых кислот проводили в сухой обезжиренной биомассе по методу А. С. Спирина ( 1958). Количество РНК и ДНК во фракциях определяли спектрофотометрически, вводя поправку на поглощение примесями при 283 нм для РНК и 281 нм для ДНК. Количество нуклеиновых кислот расчитывали в % от сухого веса лептоспир. Определение нуклео-тидного состава оснований РНК проводили в сухой обезжиренной биомассе методом нисходящей хроматографии на бумаге по А, С. Спирину (1958). Выделение ДНК и определение ее нуклеотндного состава проводили по G. Schmidt and S. Tannhauser (1945) в модификации А, С. Спирина и

Á. H. Велозерского (1956) с небольшими изменениями, предложенными Б. Ф. Ванюшиным (1964). Гидролиз ДН1\ проводили в запаянных ампулах в присутствии 72% раствора НОЮ«. Разделение азотистых оснований ДНК проводили с помощью одномерной нисходящей хроматографии на хрома-тографической бумаге Whatman DE-81.

Суммарное количество общих липндов определяли по методу J. Foleh et al. (1957); количество фосфолнпидон — но G. R. Bartlett (1959), в модификации D. Л. Usher (1963); разделение фосфолипидов на подклассы проводили с помощью тонкослойной хроматографии на силнкагеле LS 5/40 (ЧССР); состав жирных кислот изучали методом газо-жидкостнои хроматографии на автоматическом анализаторе «Chrom-4» с пламенно-ионизационным детектором (ЧССР); определение лн-пазной активности лептоспир проводили титрометрпческнм методом (N. Tíetz, 1966). В качестве субстрата при определении лнпазной активности использовали омульсню оливкового масла, С целью подтверждения достоверности полученных данных была применена статистическая обработка материала.

Интенсивность роста лептоспир на питательных средах, чистоту культур, а также наличие лептоспир в моче больных лептоспирозом или в суспензии из органов павших животных определяли просмотром препаратов раздавленной капли в темном поле зрения микроскопа. Морфологию и ультраструктуру лептоспир изучали просмотром препаратов в электронном микроскопе УМВ-100, Морфологию колоний, образуемых различными штаммами лептоспир, изучали на плотных питательных средах, приготовленных по прописи, разработанной нами.

Вирулентность лептоспир определяли виутрибрюшинным заражением золотистых хомяков; антигенные свойства изучали постановкой реакции микроскопической агглютинации с иммунными сыворотками, полученными путем гииериммунн-зации кроликов. Выживаемость лептоспир на плотных питательных средах определяли по подвижности лептоспир в раздавленной капле и по появлению роста лептоспир в посевах.

Результаты исследований

Исследованиями установлено, что при электрофорезе в полиакрнламидном геле белки лептоспир четко разделяются на фракции и располагаются на электрофореграмме в виде отдельных дисков в завнснмоснт от размеров молекул белка н скорости пх продвижения в процессе миграции. Количество и степень окраски отдельных белковых фракций у

различных штаммов лептосппр различны. Максимальное количество (18) белковых фракций обнаружено в антигенах из лептосппр штамма Moskva-V (серогруппа Grippotyphosa). У остальных штаммов четко выявляется от 12 до 17 белковых фракции.

На основании полученных данных можно заключить, что лептоспиры обладают сложным белковым спектром, обусловливающим сложность их антигенной структуры.

Выявлены индивидуальные особенности как в подвижности, так и в содержании белковых фракции у отдельных штаммов лептоспир. Так, белки штамма Gamsulin (серогруппа Hebdomadís) отличается от всех других штаммов наличием дополнительной фракции, соответствующей по скорости миграции фракции белка из группы трансфернпа и отсутствием пятой фракции гаптоглобнна. Штамм «Маннхино Пх» (серогруппа Ротона) отличается от своего исходного штамма «Маннхино Пг» наличием дополнительной фракции пре-альбумин-2 и отсутствием фракций глобулин-З и гаптогло-бин-8. Судыш бескрючковый штамм отличается от исходного крючкового потерей фракции гаптогдобин-2.

Различия в белковых фракциях имели место не только между гомологичными, но и гетерологнчнымн штаммами. Так, при одном и том же количестве фракций, содержащихся у лептоспир штаммов Hond Utrecht ÍV {серогруппа Canteóla) и Mus-127 (серогруппа Ballum) они отличаются между собой но содержанию фракции глобулнн-3, глобулин-5, гап-тоглобин 1 и 6, 7 и 8, а от остальных изученных штаммов они отличаются как общим количеством фракций, так и их индивидуальностью. Для штамма Perepeücin (серогруппа Та-rassovi) характерно наименьшее содержание белковых фракций в дпек-электрофореграммах, содержанием только двух (из пяти обнаруженных нами фракций) глобулинов (3 н 4), отсутствием первой и четвертой фракций " гаптоглобинов. Штамм Moskva-V (серогруппа Grippothyphosa), наоборот, отличался наибольшим спектром белковых фракций в составе белковых диализатов. Этот штамм содержал все (кроме трансфернн-2, как и другие штаммы), из числа обнаруженных нами белковых фракций.

Сапрофитные штаммы БШ и Patoc-1 (серогруппа Sema-ranga) содержали, соответственно, по 13 и 14 фракций белка. На днек-электрофореграммах белков этих штаммов содержалось меньше фракций гаптоглобинов (отсутствовали фракции 7 п 8, а у Patoc-1 и фракция 6). Кроме того у штамма БШ отсутствовали фракции глобулина 1 и 3. Отсутствие гапто-глобиновых и глобулин 3 фракций сближает эти штаммы со

штаммами «Судьии» крючковьш и бескрючковый, однако у последних имеются глобулин-1 и гаптоглобнн-7.

Таким образом, из числа исследованных штаммов, несмотря на близкое количественное содержание фракций белков и диск-электрофореграммах, не обнаружено ни одного штамма совпадающего с другим по качественному набору белковых фракций. В качественном отношении все штаммы имели свои особенности, отличающие их от других даже гомологичных штаммов. Эти различия носят, очевидно, штам-ыовыи характер.

Аминокислотный состав белков лептоспир нз различных серологических групп почти идентичен и состоит из большого набора аминокислот. Методом нисходящей хроматографии на бумаге нам удалось выявить 14 аминокислот : серин, гли-ция, глутамии + глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота, аланин, метнонин + валин, лейцин + лзолейцнн, гнети дин, аргинин, треонин, лизин.

Анализ показывает, что абсолютное (в мг%) содержание аминокислот (без неидентифнцнрованных) в гидролизатах сапрофитных лептоспир (штаммы Ра1ос-1—52,33 мг%, «БШ»— 61,99 мг%) несколько выше чем у патогенных штаммов (44,1^51,63 мг%). Исключением нз группы патогенных лептоспир оказался штамм Судьин крючковый серогруппа Гс(е-гоЬаетоггЬа^ае), суммарное содержание аминокислот у которого (53,55 мг%) приближается к содержанию их сапрофитными лептоспнрами. Наименьшее суммарное количество аминокислот выявлено у лептоспир серогруппы Ротопа, а среди представи тел ей этой группы — у штаммов «Матшшо Пг» и «Пх» (соответственно 44,17 и 44,0! мг%).

Проведенный нами дисперсионный анализ абсолютного (в мг%) и относительного (в%) содержания аминокислот в гндролизатах белков лептоспир показывает, что но этим показателям исследуемая группа сапрофитных и паразитических лептоспир не однородна (для абсолютного количества = 11,9-и98,8>Ро,9э (19,49) =2,3; для относительного количества Рф=17,7-:-67,0>Ро,95 (19,49) =2,3).

Результаты дисперсионного анализа свидетельствуют о том, что разные штаммы достоверно различаются по содержанию аминокислот, т. е. различия в количестве содержащихся аминокислот носят штаыыовый характер.

При сравнении средних двух групп (паразитических и сапрофитных) лептоспир по аминокислотному составу выявлены существенные различия средних групп по ряду аминокислот. Так, содержание серина, аланина и метиоиина с валинои в

белках паразитических лептоспнр (соответственно X = 4,28; 4,49 и 5,47 мг%) больше, чем у сапрофитных штаммов (соответственно Х=2,61; 3,51 и 5,14 мг%) и различия средних статически достоверно (во всех случаях F,|,>F0,95).

Основными аминокислотами, в количественном отношении, у всех исследованных штаммов были моноамнноднкарбоно-вые аминокислоты, в частности глутаминовая и аспарагино-вая кислоты. Относительное количество (в %) этих кислот у сапрофитных штаммов: глутамата, в среднем 16,78% (при колебаниях от 14,58% до 18,99%, tfctp • Sx=0,718-:0,375) ас-партата — 10,18% (9,45--10,92%, ±tp • Sx = 0,387-:-0,665) несколько больше, чем у патогенных (соответственно, глутама-та, в среднем, 15,44% (13,20-:-19,40%, ±tp -Sx=0,627^ 1,07), аспарата —8,54% (5,99% +10,49%, ±tp • Sx= 1,26^0,129). Наибольшее количество днкарбоновых аминокислот обнаружено у лептоспнр штаммов Pomoria-297 (серогруппа Pomona), Ballico (серогруппа Australis), Veldrat Batavia (серогруппа Javanica) н «ÉLU» (серогруппа Semaramga). У штаммов, входящих в одну серологическую группу, а особенно у родственных вариантов одних н тех же штаммов («Маннхнпо Пг» н «Пх»,— серогруппа Pomona, а также Судьнн крючковын и бескрючковын — серогруппа Icterohaemorrliagîae), количественные показатели днкарбоновых аминокислот очень близки.

Известно, что аслартат и глутамат к их амиды играют важную роль в азотистом обмене у многих видов микроорганизмов. Эти соединения принимают участие не только в синтезе ряда других аминокислот, но играют важнейшую роль в биосинтезе белка, нуклеиновых кислот и некоторых фосфоли-ппдов. Очень важна их роль н в связывании и детоксикаинн продуктов метаболизма, в построения коферментов. Аминогруппа глутамина и асиарагпновой кислоты служит источником азота при биссинтезе пурнновых и ннрнмиднновых нуклео-тндов, а также некоторых аминокислот. Освобождающаяся в процессе метаболизма щавелевоуксусная и фумаровая кислоты включаются в цикл трнкарбоновых кислот, связывая таким образом, аминокислотный и энергетический обмен клетки.

Большой интерес представляют данные по содержанию сернна и глицина. В противоположность содержанию дикар-боновых аминокислот, эти моноамнномонокарбоновые кислоты содержались в большем количестве в составе гидролпзатов патогенных лептоспнр. Наибольшее количество этих аминокислот содержалось у следующих штаммов: Perepelicin (серогруппа Tarassovi) —'сернна 10,5%, глицина 8,4%; Vîtulina и Moskva V (ceporpvnna Grîppoivpliosa), соответственно сернна 10,0 и 9,0%; глицина 8,8 и 9,1%"; Swart van Tienene (серогруп-

па Ва1а\чае) —9,5 и 8,7%; 1?0А (серогруппа Т^егоИаетоггЬа-61ае) — 9,4 и 8,3%.

У сапрофитных штаммов лептоспнр Ра1ос I и БШ (серогруппа Бетаганда) относительное содержание серииа было самое низкое нз всех нследоваипых нами штаммов (соответственно 5,2 и 3,9%), а содержание глнцппа не отличалось от среднего содержания этой аминокислоты в гидролизатах патогенных лептоспнр.

Обнаруженное нами высокое процентное содержание в гидролизатах патогенных штаммов лептоспнр серииа п глицина, возможно связано с их участием и синтезе таких фос-фолипидов, как фосфатидилэтаноламни и фосфатпдилсерии.

Относительно высокое содержание дикарбоновых аминокислот и их амидов, а также серииа и глицина п гидролизатах лептоспнр указывает на то, что все эти аминокислоты являются метаболически наиболее активными, клгочепыми соединениями азотистого обмена у этих микроорганизмов. Их относительное содержание (в % от суммарного количества аминокислот, принятого за 1СЮ%) было несколько выше у паразитических штаммов — 44,1-^-52,3%, против 42,8-:-43,8%, обнаруженных у сапрофитных лептоспнр. По содержанию этих аминокислот близкими к сапрофнтам оказались три патогенных штамма: Моняков, «Манихино Пг» (серогруппа Ротона) и Судьин крючковын (серогруппа 1^его1]аетогг11а51ае).

Нами установлено высокое содержание в гидролизатах лептоспнр разветвленных аминокислот — лспцниа, пзолейцнна и валнна с метионнном.

Эти аминокислоты играют большую роль в метаболизме лептоспнр. Метнонии, с его подвижной метнльной группой, используется по-видимому, в качестве источника СНз при синтезе жирных кислот, а также для синтеза белка п других клеточных структур, а разветвленные аминокислоты обеспечивают очевидно связывание и детокенкашно липидов своими неполярными боковыми цепями.

По нуклеотидно.му составу РНК исследуемые штаммы лептоспнр относится к слабовыражеппому ГЦ-типу. Показатель Г + Ц у патогенных штаммов колеблется и пределах 53,1 -:-55,4 (± tp -~Sx = 0,176 3,24), а у сапрофитных — 53,3-:- 54,6

(± tp • Sx = 0,391 -:-0,903).

Состав оснований РНК v исследованных штаммов лептоспнр довольно одонороднын и не зависит от принадлежности микроорганизмов к паразитическим или сапрофитным штаммам.

Показатель специфичности состава РНК — ГЦ/АУ был в пределах 1,13-т-I,22_(±tp • Sx = 0,018~:-0,089), у патогенных н 1,14—1,20 (±tp - Sx = 0,258) у сапрофитных штаммов. Этот показатель у исследованных штаммов лептоспир оказался очень близким, маловарнабельным н не позволял их дифференцировать не только по принадлежности к каим-лнбо серологическим группам, но н даже к паразитическим и сапрофитным штаммам.

ДНК исследуемых штаммов лептоспир относилось к АТ-тппу разной степени выраженности (ГЦХ=35,9-н41,7 моль%).

Коэффициент специфичности (ГЦ/AT) у большинства паразитических штаммов лептоспир (0,56-нб,64) ниже, чем у сапрофитных (0,65^-0,71). В дальнейшем при проверке значимости различии по критерию Фишера установлено, что существует статистически достоверное различие между средними групп патогенных и сапрофитных штаммов (Рф=202,4> >Ffc*(l;59)-4,0).

Только два штамма из 18 паразитических лептоспир по коэффициенту специфичности приближались к сапрофонтным. Так, штамм Perepelicin (серогрунпа Taras^ovi) имел коэффициент ГЦ/АТ 0.67(±tp -Sx^0,021), а штамм Veldrat Balavia 46 (серогрунпа Javanica) — 0,65 (iip • Sx = 0,018),

Проведенный налги дисперсионный анализ комплекса азотистых основании, входящих в состав ДНК паразитических и сапрофитных штаммов лептоспир, не подтверждает гипотезу однородности этих штаммов но содержанию нуклеотидов в их ДНК (F,|,= 13,13—93,5>F0,95 (19,41) = 1,8) и ставит под сомнение моноспецпфпчность рода Leptospira, которым он считается до сих пор некоторыми авторамп.

Результаты дисперсионного анализа свидетельствуют о неслучайном различии лептоспир по всем азотистым основаниям ДНК. Наибольшие различия между штаммами выявляются при сопоставлении содержания в ДНК ГЦ-пар (F,i,— = 9315>F0,«(19,41) =1,8) и цнтознна (F(|,=61,82>Fo,sr,(19,41) = = 1,8).

В качестве наиболее чувствительного параметра при разделении лептоспир на группы паразитических и сапрофитных штаммов выступает комплекс Г + Ц, Содержание ГЦ-иар основании н ДНК. патогенных лептоспир (Xi=37,53 моль%) меньше, чем у сапрофитных (Х2 = 40,33 ,моль%) и различие средних статистически достоверно (F,к=607,3>Fo,m(1,59) = = 4,0).

Анализ состава основании представителей паразитических лептоспир по количеству ГЦ позволяет считать и эту групупу

г/

V

Таблица I

ДЕЛЕНИЕ ЛЕПТОСПНР НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ГРУППЫ ПО СОДЕРЖАНИЮ ГЦ-ПАР В ДНК

ШТАММ

ГЦ_(моль_«б> xilp'S.t «=0,0г

Je ШТЛММ013, аналогичных по количеству ГЦ

1 2

5 6 7 8 9 10 11 12 13 н| 15 1б| 17 18¡ 19 i

Akijami А R.G.A.

Судыш крючк.

Судьин бсскрючк.

ViíuJina

Makarov

Van Tienen

Gamsulin

Monjakov

Pomona-297

«Манихино Ilr»

«Манихпно Пх»

Hond Utrecht IV

Ballico

Perepelícin

Moskva-V

Mus-127

Ve Id. Batavia 46

БШ

Patoc-I

35,724 35,154 36,154 36,454 36,854 36,504 36,2936,254 36,304 38,074 36,914 37,324 36,314 37,45-39,06-:■ 38,804 38,544 38,514 38,394 40,664

36.08 37,45 36,65 36,95 37,35 37,11 37,31 36,75 36,60 38,93 38,15 37,62

38.09 37,95 41,54 39,41 40,26 40,49 39,81 42,74

4 9

♦

©

e 9

9 9 9

99

9 9 4 9 9 ♦ 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9

O 9 O 9 4 9 9 4 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 ♦ 99 9 4 9 9 9 4

9 9 9

9 9 9 9

9

9 9 9

0 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 >

Биологическая группа

♦ 9999 9 4-999 9 9 4 9 9 9 9 9 4 9 9 9 9 9 4

9 9 9 9

4 9

9 4

9 9 9 9 9 9 4 9 9 9 4 9

И

111

IV

сапрофиты

довольно неоднородной. Содержание ГЦ в ДНК разных штаммов этой группы различается на 3,6 моль% (Х. = 35,9-:— 39,5 моль%), а коэффициент специфичности — на 0,08 (X =0,56-:-0,64). Это дает основание предположить, что существует генетическая отдаленность между паразитическими лептосппрамн, относящимися к различным серологическим группам.

Используя в качестве критерия количественные показатели (моль%) состава азотистых оснований лситоспир нами было выявлено четкое разделение их по генетическим компонентам на три биологические группы.

Анализ данных табл. 1 показывает, что по содержанию ГЦ в ДНК в сформированных нами группах существует доверительная связь, характеризующаяся плотностью распределения точек количеств ГЦ между штаммами. Каждый штамм внутри группы по крайним значениям разброса средних величин ГЦ обязательно совпадает почти со всеми штаммами, входящими в эту биологическую группу. Такая доверительная связь но количеству содержащихся ГЦ-иар в ДНК позволяет предполагать близость генетических отношении штаммов, входящих в состав каждой группы.

Важным обстоятельством, с нашей точки зрения, является определение диапазона взаимосвязей штаммов по генетическому материалу. Так, штаммы, стоящие вначале каждой биологической группы, судя по характеру наложения точек по количеству ГЦ (перекрещивание крайних значений средних), обладают более широким диапазоном дисперсии средних и, по-видимому, большим количеством комплементарных ГЦ-пар азотистых оснований, входящих в состав генетического аппарата клеток. Однако данные таблицы свидетельствуют п о том, что по количеству пар ГЦ взаимодействие (доверительная с вязь) распределяется не только внутри одной биологической группы, по и за ее пределами.

Так, по количеству содержащихся ГЦ-пар, штамм КйА (I группа) аналогичен дополнительно четырем, а штамм'VI-1п]ша (этой же группы), трем штаммам второй биологической группы. Штамм Ротопа-297 из второй группы проявляет оп-ределниую аналогию с четырьмя штаммами третьей группы. По количеству ГЦ-пар содержащихся в ДНК, сапрофитный штамм БШ (IV группа) перекрещивается с ДНК патогенных штаммов III биологической группы. Эти необычно широкие диапазоны разброса средних по содержанию ГЦ между леп-тоспирамн, гетерологнчпыми по биологической группировке, позволяет предполагать родственность наследственного аппарата у многих штаммов. Можно предположить, что м нож ест-

венная комплементарность средних количеств ГЦ-пар в ДНК этих штаммов обеспечивает очень большую мозанчпость их антигенной структуры п обусловливает множественность гете-рологичиых (мёжгрупповых) серологических связей, выявляемых при серологической диагностике лсптоспнроза.

Исследованиями установлено, что лептоспнры относятся к микроорганизмам с высоким содержанием свободных лнпндов, По отношению к сухому весу биомассы лептоеппр нами обнаружено от 13.72 до 20,42% свободных лнпндов. Наиболее высокое содержание лнпндов (20,42%) установлено у штамма .Мо?1ч\'а-У (серогруппа Опрро1ур^а), а самое низкое (13,72%) у штамма РОЛ (серогруппа 1с1его11аешоггИад1пе). У сапрофитного штамма Ра1ос-1 (серогруппа Эетагапда) содержите» 19,1% лпгтндов. По содержанию свободных лшшдов этот штамм не отличается от паразитических штаммов. В пределах одного серотнна (штаммы «Манпхпно Пг, Пх», Мо-ияков) вариации в содержании липпдов достигают 3,12%. Установленные различии в содержании липпдов лептоспира-ми, относящимися к различным серогруппам н входящими в состав одной ссрогрупны, свидетельствует о существовании индивидуальных особенностей метаболизма лнпндов у каждого штамма леитоспир.

Наиболее резкие количественные сдвиги, носящие по-видимому, индивидуальный, штаммовын характер выявляются при анализе содержания фосфолппндов. На долю это» сложной фракции лшшдов у некоторых штаммов приходится почти половина общего количества лшшдов. Более высоким содержанием фосфолннндон отличаются штаммы: Ак^агп! А, (серогруппа ЛиЫтпаП*)—48,49%, Гамзулин (серогруппа НеМо-тасП?) ■— 47,38% и РегереПст (серогруппа Tarassovi) — 42,48%. Содержание общих фосфолнпндов" у остальных паразитических штаммов варьировало в узких пределах (38,15— 39,60%), Только дна штамма из числа паразитических (Мо^к-\'а-У и ЕЮ А) характеризуются более низким содержанием фосфолнппдов (соответственно 31,14 и 31,44%). В пределах одной серогруппы (штаммы «Манпхипо Пг», «Пх» п Моняков) вариации в содержании фосфолшшдов были пезиачнтельны-мп. У сапрофитного штамма Ра1ос-1 обнаружено 45,8% фос-фолиппдов.

Используя метод тонкослойной хроматографии, фосфоли-пнды леитоспир удалось разделить и соответствии с коэффициентом распределения свидетелей па шесть подклассов: лн-зофосфатпднлхолин с 'фосфатнднлеерппом, сфипгомпелин, фосфатидплинозитол, фосфатидилхолин, фосфатидплэтанол-

амин и кардполттпнн. Кроме того, па линии старта были обнаружены заметные количества неидентифнцнроваиных фосфолипидов.

Полученные пз большинства паразитических и сапрофитных штаммов лептоспир фосфолнппды по своему качественному составу были идентичными.

Преобладающим подклассом у лептоспир является фос-фатидилэтаноламнн. Наибольшее количество фосфатнднлэта-иоламииа в составе фосфолипидов содержится у сапрофитного штамма Patoc-I (35,23%). Из паразитических лептоспир наибольшим количеством этого компонента "обладают штаммы «Маннхтго Пг» (29,67%) и «Маннхпно Пх» (30,58%). Наименьшее количество фосфатидилэтаноламииа обнаружено п составе фосфолипидов штаммов Hond Utreclit-IV (21,24%) и Moskva-V (21,33%). Несмотря на высокое содержание фосфа-тиднлэтаноламнна в составе фосфолипидов у паразитических штаммов лептоспир, его содержится у этих штаммов на 5— 14% ниже, чем у сапрофитного штамма.

В составе фосфолипидов лептоспир обнаружены и фосфо-лшшд не на глицериновой основе, в частности: сфнигомиелнн и фосфатнднлннозитол. Эти компоненты находятся в лепто-спирах примерно н равных соотно!пеннях н по своему количественному выражению занимают четвертое-пятое место в составе фосфолипидов.

Метолом газо-жидкостной хроматографии метиловых эфн-ров жирных кислот выявлено на хроматограммах от 12 до 21 пика, соответствующих различным жирным кислотам.

В составе жирных кислот свободных липндов лептоспир обнаружены насыщенные (34,0-f-46,34%) и ненасыщенные (53,06 — 60,0% ) жирные кислоты, содержащие от 12 до 22 атомов углерода в цепн. Имеются в их составе жирные кислоты V. четным и нечетным числом, с прямой и разветвленной цепыо углеродных атомов.

Основными;- по количественному составу, насыщенными кислотами паразитических штаммов лептоспир были пальмн-шновая (19,35-27,64%) и стеариновая (3,89-:-11,96%)■ Из насыщенных жирных кислот с числом углеродных атомов .менее 14 в составе свободных лигшдов этих штаммов лептоспир встречалась в небольшом количестве только лаурнновая (С)2: 0) кислота. В составе свободных лшшдо» некоторых штаммов лептоспир помимо жирных кислот с прямой цепью, содержались разветвленные жирные кислоты (ог 0,20 до !,65%). Так, штаммы Moskva-V (серогрунна Grippotyphosa) и Hond Utreclit-lV (серогруппа Canicolai содержали но две жирных кислоты с разветвленной пенью (Ci^n и Quo), л штамм Моняков (серогруппа Pomona) содержал только одну

разветвленную кислоту (Сл:о). Циклопропановых и других необычных жирных кислот, а также низших жирных кислот в свободных лнпнда паразитических лептоспнр не обнаружено.

У сапрофитного штамма Ра1ос-1 содержалась 21 жирная кислота. Количество насыщенных жирных кислот у этого штамма превышает 56% от общего количества жирных кислот незначительно выше их содержания у патогенных штаммов. Основными но количественному составу жирными кислотами от общего их количества были" пальмитиновая (34,43%) и стеариновая (15,26%). В сумме эти кислоты составляли 87,93% от общего количества насыщенных жирных кислот лептоспнр данного штамма. У паразитических же штаммов сумма этих кислот составляла в среднем 76,45% (67,72-:--^83,66%). В несколько большем количестве, чем у паразитических штаммов, содержалось у штамма Ра1ос-1 разветвленной ЖНрИОН КИСЛОТЫ (С,5:о).

Характерным для лептоспнр является высокое содержание ненасыщенных жирных кислот, а в их составе наличие полиненасыщенных жирных кислот (лпнолевой, лпноленовоп и арахидоновой), Выявляются четкие-различия между паразитическими и сапрофитными штаммами и содержании мнрп-стнновоп кислоты (Сно)- У сапрофитного штамма се почти в два раза больше (1,34%), чем \' паразитических штаммов (0,76%).

Кроме того у Ра1ос-1 обнаружены жирные кислоты с низким числом углеродных атомов (капрпловая и каприновая), в то время как ни одни из паразитических штаммов не содержал этих кислот. Напротив, паразитические лептоспиры содержали в большем количестве жирные кислоты с длинной цепью (Сго, Сл, Огг).

Исследования показали, что при наличии определенных закономерностей в содержании общих лнпндов, фосфолппп-дов и жирных кислот, почти каждый из исследованных штаммов лептоспнр обладает выраженной индивидуальностью качественного состава и количественного содержания фосфолп-пндов и жирных кпслот. Этп различия носят штаммовып характер и могут быть использованы в качестве самостоятельного критерия биологической характеристики при разработке классификации лептоспнр.

Высоое содержание свободных лнпндов, а в их составе фосфолипидов, а также богатый качественный состав жирных кпслот говорят в пользу гипотезы и, ,]о1ш!>оп е1 а). (1963), Е. Коп с! о е! а1, (1972), Эйппек е1'а1, (1973) о том, что лнпи-ды и жирные кислоты, кроме пластической роли, которую они выполняют входя в состав клеточных бномембран у многих

бактерий, у лептоспир играют существенную роль в метабо лизме, являясь основным источником энергнн и углерода.

Большинство исследованных штаммов паразитических лентосннр обладали лнполптпческой йе^тнвностью в отношении оливкового масла. Липолитическая активность штаммов лептоспир зависит от возраста культуры. Оптимальным периодом для определения липолитической активности лептоспир является стационарная фаза роста (II сутки). В этот период большинство штаммов проявляли максимальную способность расщеплять триглицериды оливкового масла. Активность липазы у некоторых штаммов (Судьин крючковый и Van Tiene-пе) возрастала до конца второй недели. У большинства штаммов лннолитическая активность к этому времени несколько снижалась, однако она сохранялась в течение длительного времени (до 46—48 суток — срок наблюдения).

Наибольшей лнполнтическон активностью обладали штаммы Gamsulin (серогруппа Hebdomadis). Swart van Tíenene (серогруппа Batavia) ,* Hond Utrecht-IV (серогруппа Canteóla) и RGA (серогруппа Icterohaemorrhagiae).

Штамм Судьин крючковый и Судьин бескрючковый (серогруппа Icterohaemorrhagiae) по своей лнполитической активности в отношении трнбутпрпна оливкового масла приближались к активности штамма RGA этой се серогрунпы.

Выраженная липолитическая активность выявлена у штаммов Vitulina н Moskva-V (серогруппа Grippotyphosa)* Макаров (серогруппа Canicola).

Низкая липолитическая активность в отношении растительного жира установлена у штаммов Perepelícin (серогруппа Tarassovt, Akijami А (серогруппа Automnalis), Mus-127 (серогруппа Ballum), Báltico (серогруппа Australis).

С очень низкой лнполптической активностью (практически липазонегатпвными) оказались штаммы лептоспир серогрунпы Рошопа (Monjakov, Pomona-297, «Манихино Пг» и «Манн-хино Пх») и штамм Veldrat Batavia-46 (серогруппа Javaníca),

Сапрофитные штаммы БШ и Patoc-1 (серогруппа Sema-ranga) были липазонегатпвными в отношении трибутирина оливкового масла.

Штаммы, входянще по своей серологической типизации в одну серогруппу, обладали близкими показателями липолитн-ческоп активности. Так, все четыре штамма серогруппы Рошопа обладали наименьшей (практически отрицательной) лн-пазной активностью, а два штамма серогруппы Canicola и три штамма серогруппы Icterohaemorrhagiae имели высокие (и близкие между собой) показатели активности липазы.

В числе исследованных паразитических лентосиир были два штамма авнрулентных: Судьин бескрючковый (серогруп-иа 1с(егоЬаетоггЬа§1эе) и «Маннхнно Пх# (серогруппа Ротона). По своей липолитической активности они оказались идентичными своим исходным линиям.

Таким образом, наши данные не являются подтверждением данных некоторых исследователей об очевидной связи между активностью липазы и вирулентностью штамма лепто-спнр. Среди патогенных лептоспнр из определенных серологических групп нами были обнаружены как обладающие лппо-лнтической активностью, так и лппазонегатнвиыс штаммы. Следует однако отметить довольно выраженную связь между лпполнтнческой активностью лептоспнр и их серогрупповин принадлежностью, Леитоспиры, относящиеся к определенным серогруппам, обладали, как правило, различной липолптнче-екон активностью, а штаммы, входящие в одну серологическую группу, проявляли близкую по своим показателям активность липазы.

Отсутствие плотных питательных сред для культивирования лептоспнр отрицательно сказалось па изучении всей проблемы лептоспнроза. Однако наибольшие затруднения нспы-тываютсл при изучении химического состава и энзимов лептоспнр, их метаболизма и изменчивости. Это обусловлено тем, . что для подобных исследований необходимы чистые, однородные, а подчас клонированные культуры лептоспнр, получить которые возможно только из отдельных колоний, выращенных на плотных питательных средах.

В своей работе мы использовали две плотные питательные среды: с сывороткой крови кроликов (в дальнейшем именуемая «сывороточная») н более простую и легко изготовляемую «альбуминовую» среду. В качестве основы этой среды использовали жидкую альбуминовую среду ГНКИ с фактором роста. к которой добавляли 0,1 мл/л твнн — 80 и 1% агара Днф-ко. Исследования показали, что как сывороточная среда, так и альбуминовая среда вполне пригодны для очистки музейных штаммов лептоспнр от посторонней микрофлоры и для' прямого выделения лептоспнр из мочи животных — лептоспиропо-сителей.

Установлено, что при наличии в посевном материале жизнеспособных лептоспнр они начинают размножаться и образуют на плотной среде характерные колонии. Колонии сапрофитных лептоспнр появляются на сывороточной среде на 4—5, а на альбуминовой — на 3—4 сутки с момента посева. Колонии паразитических лептоспнр обнаруживались, соответетвен-

но средам, на 7—8 и 5—6 сутки. В момент появления колонии представляют собой мелкие, едва заметные в проходящем свете матовые точки, расположенные у поверхности агара. Какого либо различия в морфологии колоний лентосннр различных штампов в этот период роста не установлено. С возрастом колонии увеличиваются в диаметре и углубляются в питательную среду. На 10—12 сутки с момента появления наступала стабилизация формы колони» и они приобретали зрелый морфологический тип. Нам удалось выявить только три типа зрелых колонии лептоспир: I тип — п виде гомогенного диска с ровным краем; 11 тип — в виде гомогенного диска с уплотнением в центре; III тин — в виде гомогенного диска (иногда с плотным центром) и ободком. В дальнейшем колонии прорастают на всю глубину агара. Вокруг основного диска колонии при росте некоторых штаммов появляется полоска новой зоны роста. Такие колонии имеют двухдисковую структуру.

При многократных пересевах лептоспир с плотной среды на плотную каждый штамм сохраняет морфологически определенный тип колоний. Так, для штаммов серогрулп Pomona п Grippotyphosa характерен 1 тип колоний — гомогенные, круглые, различной плотности колонии с четко отграниченным или исчезающим краем. Для лептоспир штаммов RGA, Hond Utreclit-lV, Veldrat Batavia-46 и Perenelicin характерен II тип колоний-—гомогенные с плотным центром. Сапрофитные штаммы лептоспир образуют колонии Ш типа — гомогенные двухдисковые колонии. Однако строгой зависимости между типом колоний и принадлежностью штамма лептоспир к тому или. иному серологическому типу или группе нами не обнаружено. Не обнаружено разницы и в морфологии колоний лептоспир, принадлежащих к сапрофнтнческпм и паразитическим вариантам. Единственным, наиболее достоверным отличием у лептоспир—сапрофитов является более раннее появление колонии на питательной среде п более быстрое формирование зрелых типов колоний с образованием дополнительной зоны роста (кольца) вокруг основного диска. Различия в тинах колоний, по нашему мнению, обусловлены скоростью нх роста и формирования и не зависят ог серотина лептоспир. В одной и той же чашке, при посеве одного и того же штамма лептоспир можно наблюдать колонии различных типов. С течением времени наблюдается переход одного типа колонии в другой, вплоть до образования двух- и трехднско-пых колоний и изменениями в центре. Не одновременное появление и созревание колоний часто приводит к образованию на чашках разных типов колоний.

Бескрючковые лептосппры (штамм Судьнн) при росте на

плотной среде образовывали очень мелкие плотные узелковые колонии с множеством боковых нитевидных ответвлений, создающих вокруг колонии — узелка вид вуали. Такой тип колоний не образовывал ни одни из исследуемых нами штаммов и обусловлен, по-видимому, меньшей подвижностью бескрючковых лептоспнр.

При длительном хранении без пересева жизнеспособность лептоспнр сохраняется на плотных средах до б—9 месяцев.

Установлено, что при культивировании лептоспнр на плотных питательных средах морфология клетки и сложное строение их клетки не меняется. С помощью электронной микроскопии выявлено, что все присущие лептоспирам ультраструктурные образования (наружный покров, цптоплазматн-ческий цилиндр, осевая нить и кольцевидные образования) при культивировании на плотных средах сохраняются.

Нами изучены кул ыур ал ьно-морфологические, некоторые биологические свойства"и химическая структура лептоспнр штамма «Манпхнно» (серотип Моп]ако\'}, спонтанно разделившегося по морфологии колоний на два типа. Этот штамм был выделен нами из мочи поросенка, зараженного лептоспп-розом. При пересевах из первично образовавшейся гомогенной гладкой круглой колонии на питательной среде был выявлен новый тип колонии, отличающейся от исходной своей морфологией. Колонии нового типа имели уплотненный центр, зернистую периферию с расплывчатыми изрезанными краями. По периферии колоний, особенно по краям, образуются множественные дочерние узелки в виде уплотненных матовых участков. Зрелые колонии этого типа напоминали хлопья ваты п, в отличие от исходных, гомогенных («Пг»—типа) были условно названы нами хлопьевидными («Пх»-тнп). При последующих многократных пассажах лептоспнр на плотной питательной среде из гладких гомогенных («Пг»-тип) п хлопьевидных («Пх»-тип) колоний образовывались колонии того же («Пг» или «Пх») типа. Однако в посевах лептоспнр из колоний «Г1х»-тппа иногда наблюдалось появление колоний первичного типа «Пг» (реверсия).

Выявленные культурально-морфологнческпе особенности колоний лептоспнр «Пг» и «Пх» типов, полученных первоначально из одной гомогенной колонии, выросшей в посевах >мочи больной свнныт, позволяют утверждать, что наблюдаемые случаи реверсии колоний обусловлены диссоциацией лептоспнр."

При химическом анализе лептоспнр, выделенных из колоний «Пг» и «Пх» типов установлены различия в количестве

содержащихся аминокислот и жирных кислот. У лептоспир, выделенных из колоний «Пх>>-типа содержались в большем количестве серии, глицин и глутампновая кислота, а также ненасыщенные жирные кислоты (олеиновая и пальмнтоолеи-повая). Кроме того, у лептоспир этого варианта были обнаружены дополнительно лауриновая, ммрнстнновая н энкоза-дненовая жирные кислоты, не содержащиеся в исходном штамме. По нуклеотидноиу составу РНК и ДНК изученные варианты лептоспир не отличались между собой.

Опытами на животных установлена утрата вирулентности лентосинрами, выделенными из колоний «Пх» типа. Серологические исследования показали идентичность лептоспир из колонии «Пг» и «Пх» типов по нммуиогенным свойствам и антигенной структуре.

Таким образом, диссоциация лептоспир штамма *Манихи-ио» (серогруппа Pomona), выделенного от больной свиньи, проявившаяся в изменении морфологии колоний, повлекла за собой изменения в аминокислотном и липидном обмене, а также утрату вирулентности, однако не отразилась на нуклео-тидном составе лептоспир, на их иммупогенпостн и агглютн-пабелыюстп.

В ы В о д ы

1. Методом диск-электрофореза в иолиакриламидиом геле установлена большая гетерогенность белков изучаемых штаммов лептоспир. Каждый штамм характеризуется определенным составом белковых фракции, многие из которых являются специфическими и, очевидно, функциональными для штамма. Наличие общих фракций отражает родоспецифнческне связи, а большое разнообразие функциональных белков обусловливает штаммовые или, возможно, видовые различия.

2. В гидролнзатах лептоспир при помощи хроматографии па бумаге выявлено M аминокислот. Качественный состав аминокислот изучаемых штаммоп лепоенпр идентичен. Выявлены статистически значимые различия в количественном содержании ряда амшюпкелот в составе белкового компонента лептоспир различных серогрупп и серотипоп.

3. Для лептоспир характерно высокое процентное содержание нуклеиновых кислот: 5,8 — 6,9% РНК и 2,8-:-3,4% ДНК.

4. По нуклеотндному составу РНК лептоспир относится к слабо выраженному ГЦ-тниу. Состав оснований и п-.жазатель специфичности РНК у лептоспир довольно однородны и не зависят от принадлежности1 их к сапрофитным или паразитическим вариантам. Нуклетидный состав РНК не может быть

использован как таксономический признак при классификации лептоспнр.

5. По н\-клеотндном\- составу ДНК лептоспнр относится к AT -типу разной степени выраженности. Коэффициент специфичности (ГЦ/AT) у большинства паразитических штаммов (0,56-^-0.64) ниже, чем у сапрофитных (0,65^0,71), что является характерным таксономическим признаком.

6. Существует статистически достоверное различие в содержании ГЦ-пар между средними групп паразитических (37,53 моль%) и сапрофитных (40.33 моль%) штаммов (Рф=202,4> Fo,^ (1,59) = 4,0).

7. Выявлена статистически неоднородность паразитических штаммов лептоспир по содержанию ГЦ-пар в их ДНК-По генетическим компонентам, в частности, по содержанию ГЦ-нар в ДНК изучаемые штаммы паразитических лептоспнр разделяются на три биологические группы:

I группа: общая средняя ГЦ моль% =35,56 (с разбросом 35,62-^37,50): Судьин крючковый, Судьнн беек рюч копий. Макаров, Akijaml А., I?GA, Vitulina, Swart van Tienen, Gam-sultn, Momjakov,

II группа: обшая средняя ГЦ-моль% =37,67 (с разбросом 36,61-i-38,73): «Маннхпно Пг», «Маннхпно Пх», Ротопа-297, Hond Ulreclü-lV, Ballico.

III группа: обшая средняя ГЦ моль% =39,56 (с разбросом 38,28-М0.84): Perepelicin, Moskva-V, Мпз-127, Veldrat Batavia 46.

Сапрофитные штаммы представляют собой самостоятельную биологическую группу с высоким содержанием ГЦ. Для этой группы общая средняя ГЦ моль% =40.33 (с разбросом 37,61 -=-43,05), Штаммы внутри биологических групп обладают высокой степенью однородности по количеству пар ГЦ, но не всегда являются родственными по антигенной структуре. Содержание моль% ГЦ в ДНК следует использовать как одни из наиболее важных биохимических признаков при разработке естественной классификации рода Leptospira.

8. У лептоспнр обнаружено высокое содержание свободных липндок (13,72%-=-20,42%), значительную часть которых составляют фосфолппиды (31,14% -^48,49%).

9. Фосфолппиды лептоспнр содержат в своем составе шесть подклассов: лпзофосфатпднлхолин4-фосфатнднлсернн, сфин-гомнелнн, фосфатидилинознтол, фосфатндилхолин, фосфати-днлзтаноламнн, карднолпнни. Основными, в количественном отношении, подклассами являются фосфатпднлэтаноламнн и фосфатндилхолин.

10. Жнрнокпслотный состав свободных лнпидов паразитических н сапрофитных лентосиир представлен кислотами на-

сыщенного и ненасыщенного ряда, с нормальной н разветвленной цепью, с четным н нечетным числом углеродных ата-мов. Осовнымп насыщенными кислотами у лептоспир являются пальмитиновая и стеариновая, а ненасыщенными — олеиновая н лннолевая. Особенностью жнрнокислотного состава паразитических лептоспир является более высокое (53,69% ^-60,90% ) содержание ненасыщенных кислот, по сравнению с содержанием их сапрофитным штаммом Patoc-1 (43,60%). Характерным для сапрофитного штамма было содержание жирных кислот с низким числом углеродных атомов (Q, С,о), а для паразитических — с длинной цепью (Cao, C2j, С2з).

11. Лептоспиры обладают различной липолнтической активностью в отношении трибутирина оливкового масла. Сапрофитные штаммы БШ и Patoc-I были липазонегатпвны-ми. Среди паразитических штаммов наибольшей липолитпче-ской активностью обладали лептоспнры из серогрупп Hebdo-madis, Batavia, Canicola n Icterohaemorrhagiae, a наименьшей— Pomona и Javanica. Установлена обратная корреляция между активностью липазы и содержанием ГЦ моль% в ДНК лептоспир.

12. Паразитические и сапрофитные лептоспиры размножаются и дают хороший рост колоний на нашей модификации сывороточной и альбуминовой плотной питательной среде. Не выявлено какой-либо зависимости между типом коло-нини серотиповой принадлежностью лептоспир. Морфологические типы колоний связаны со штаммом лептоспир и обусловлены скоростью роста колоний и составом питательной среды. Культивирование лептоспир на плотных питательных средах не влияет на морфологию и ультраструктуру клетки.

13. Плотная питательная среда может.быть рекомендована в. практику для очистки производственных. штаммов лептоспир от посторонней микрофлоры, получения чистых культур лептоспир, необходимых для изучения изменчивости, химического состава и энзимов, а также для диагностических целей — выделения культур лептоспир из мочи больных животных. ,

■ 14. При культивировании лептоспир на плотной питательной среде выявлена их диссоциация, проявившаяся в образовании атипичных хлопьевидных колоний («Пх»-тип). Лептоспиры, выделенные из колонии «Пх»-тнпа, отличались от исходного варианта («Пг»-тнп) утратой вирулентности, а также количеством содержащихся аминокислот и жирных кислот. Однако диссоциация не отразилась на нуклеотидном составе

ДНК лептосипр, на их иммуногенноети и агглютинабельиос-ти.

15, Изучение химического состава таких важных в жизненных процессах классов соединений, как белки, линиды и нуклеиновые кислоты позволяет получать новые количественные характеристики биологических особенностей лептоспир, дополняющие и расширяющие возможности разработки более совершенной естественной классификации этих микроорганизмов, а также отбирать наиболее полноценные диагностические и вакцнониые штаммы.

РЕКОМЕНДАЦИИ

1, Для полной биологической характеристики лептоспир рекомендуем применять не только существующие тесты дифференциации (изучение антигенной структуры, рост в присутствии аналогов пуринов и при пониженной температуре, определение оксидазной активности и др.), но и сравнительное изучение химического состава таких важнейших классов соединений, как белки, лпппды и нукденнопые кислоты,

2, При исследованиях в области таксономии и генетики лептоспир, а также для разработки классификации и подбора диагностических и вакцинных штаммов необходимо учитывать нуклеотпдныи состав ДНК. В качестве наиболее чувствительного параметра при определении родства лептоспир следует использовать содержание моль% ГЦ. По этому признаку предлагаем объединять лептоспир в биологические группы. ■

3, Плотные питательные среды следует шире применять в практике для диагностики лептосинроза, очистки производственных штаммов от посторонней микрофлоры, для изучения химического состава биохимии н изменчивости лептоспир.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Аминокислотный состав белков штаммов лептоспир БШ к Pomona-297. Тезисы докладов науч. конф. по лептоспнрозу. УДН. М., 1968, с. 13.

2. Amina acîd composition at tlie proteins of starins BSh and Pomona-297. Fitth information excliange in Leptospirosis, 1968, p. 8.

3. Сравнительная Оценка фиксаторов, применяемых для электронно-макроскопического исследования лептоспир. Ма-мерналы II науч. конф. мед. факультета. УДН, M., 1969, 32— 33 (соавт. К. А. Трошин, Л. Ф. Левина).

4. Культивирован не лептосгшр на бессывороточной плотной питательной среде. Материалы юбилейной науч. конф. мед. факультета. УДН, М., 1970, 48—51.

5. Аминокислотный состав белков лептоспир. Материалы юбилейной науч. конф. мед. факультета. УДН, М., 1970, 101 — 103.

6. О распространении лептоспироза в странах с жарким климатом. Рефераты докладов ill науч. конф. мед. факультета. УДН, М„ 1971, 106—109 (соавт. А. Л. Ширковская, В. С. Киктенко, С. А. Дратвнн).

7. Содержание ДНК и РНК у некоторых штаммов лептоспир. Там же, с. 6—7 (соавт. Т. Т. Березов).

8. DNA and RNA Content in Some of Leptospira. 7-th Meeting FEBS, Varna, 20—25 sept., 1971 (Bulgaria), (et al. T. T. Berezov).

9. Применение плотных бессывороточных питательных сред для выделения и культивирования патогенных лептоспир. В кн.: Лептоспиры. Труды V Всесоюзной науч. конф. по леп-тоспирозам человека и животных. Казакь, 1971, с. 368— 369 (соавт. В, С. Киктенко, Н. А. Бакулина, Л. Ф. Левина).

10. Влияние РНК-азы и ДНК-азы на ультраструктуру лептоспир. Материалы симпозиума по лептоспирирозу. УДН, М., 1972, с. 15—17 (соавт. К. А. Трошин).

11. Выживаемость лептоспир на плотных питательных средах. Там же, с. 35—36 (соавт. В. С. Киктенко).

12. Мировое распространение лептоснироза сельскохозяйственных животных. Там же, с. 97—100 (соавт, М. Г. Тар-шис).

13. Содержание нуклеиновых кислот и нуклеотндный состав РНК у некоторых штаммов лептоспир. ЖМЭИ, 1974, 9, с. 70—73 (соавт. Т. Т. Березов, В. С. Киктенко).

14. К вопросу о диссоциации лептоспир. ЖМЭИ, 1974, 11, с. 142 (соавт. В. С. Киктенко, Т. Березов).

15. Морфологические признаки новых штаммов Bdello-vibrio bacteriovorus и их литическое влияние на некоторые бактерии и лептоспиры. Гигиена воды и санитарная охрана водоемов. Сборник научных работ. М„ 1973, с. 119—123 (соавт. Ш. И, Сатдыков),

16. Перспективы использования плотной питательной среды в работе с лептоспирами .Труды Гос. науч. контрольного инст, вет. препаратов МСХ СССР. 1974, т .XX, с. 232—234 (соавт. Ю. А. Малахов, А. Н. Шуплико, В. В. Шорохов).

17. Содержание нуклеиновых кислот и нуклеотндный состав ДНК у лептоспир. Журнал Гигиены, эпидемиологии, микробиологии и иммунологии, Прага, 1975, 19, 2, 233—240 (соавт. В. С. Киктенко, Т. Т, Березов).

18, Некоторые данные по изменчивости лептоспнр. Материалы симпозиума по лептоспирозу. УДН, М., 1975, 19—21.

19, Липолитическая активность лептоспнр. Там же, с. 21— 22 (соавт. В. С. Кнктенко, Т. Т. Березов).

20. Анализ белковых компонентов в экстрантах из лептоспнр методом электрофореза в полиакриламидном геле. Там же, с, 22—24 (соавт. В. С. Кнктенко. Т. Т, Березов).

21. Липиды и жирные кислоты лептоспнр. National Symposium on "Leptospirosis, Leptospira and other Spirochaeta", Abstract, Bucharest, 1975, p. 8 (соавт. B.C. Кнктенко, Т. Т. Березов).

22. Спирохеты. Ветеринарная энциклопедия, М., 1975, т. 5.

23, Аминокислотный состав гндролизатов лептоспнр различных серологических типов. В кн.: Актуальные вопросы тропической медицины). Труды УДН. сер. «Медицина», 1975, т. 75, В. 11 (соавт. В. С. Кнктенко, Т, Т. Березов).

S9. XII. 75 г. Объем 1,75 п. л. Тираж 250 экз. Заказ 1643

Типография Университета дружбы народов имени П at риса ЛумумОи Мисквэ, ул, Орджоникидзе, :>