Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярное клонирование ДНК Leptospira interrogans серовара Pomona для идентификации и дифференциации лептоспир

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярное клонирование ДНК Leptospira interrogans серовара Pomona для идентификации и дифференциации лептоспир"

U 0 fi

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи

ТЮРИНА Ирина Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ ДНК LEPTOSPIRA INTERROGANS СЕРОВАРА POMONA ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЛЕПТОСПИР

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии и биохимии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко и лаборатории иммунологических исследований ВНИнТИБП.

Научные руководители:

Заведующий лабораторией молекулярной биологии и биохимии ВИЭВ, академик РАСХН, профессор Г. Ф. Коромыслов.

Заведующий лабораторией иммунологических исследований ВНИиТИБП, кандидат ветеринарных наук В. И. Белоусов.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук Ю. В. Ананьина (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи)

Кандидат биологических наук Б. А. Фомин (Московская ветеринарная академия им. К. И. Скрябина)

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Защита диссертации состоится « » ¿Ь. 1994 г.

в «-/у» часов на заседании специализированного совета К. 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан » «СсОД/УиСЬ* 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

Актуальность те>а*. Лептоспироз относится к числу наиболее распространенных природноочаговых зооантропонозных, весьма опасных в социальном и экономическом отношениях болезней.

Для предупреждения распространения болезни и выбора средств профилактики и борьбы необходима эффективная диагностика.

При лабораторной диагностике лептоспироза применяют в основном серологический метод ( реакцию микроагглютинации - РМА ). Несмотря на высокую чувствительность и специфичность этот тест нельзя признать оптимальным методом,так как он достаточно трудоемок, сопряжен с необходимостью постоянно поддерживать набор референтных живых культур лептоспир и соблюдать режим работы с ними.

Перспективным направлением исследований является внедрение в ветеринарную лабораторную практику ДНК-зондов, которые с успехом используются для обнаружения многих вирусов,бактерий и паразитов (Prem S. Р. ,1990).

Мэлекулярно-биологические методы играют в настоящее время важную роль для изучения систематики патогенных лептоспир,поиска возможностей их дифференциации и идентификации, на основании сравнения генотипов С Nielsen J.N. ,1989; Ramadass P. ,1990,1992).

За рубежом ведутся интенсивные исследования генома многочисленных сероваров лептоспир с целью практического применения рестриктазного анализа и различных вариантов ДНК-ДНК гибридизации (Le Febure R. В. .Thiermann A.B. ,1987; Mi llar B.D. et al. ,1987; Terpstra W. J., Schoone ü J. ,1987; Zuerner R. L , Bolin С. A. ,1988; Pacciarint M.L et al. ,1992; Marien F. et al. ,1992).

В нашей стране Ежов Г. И. ,1974,1988 и Артюшин С. К. ,1980 изучали нуклеотидный состав и степень подобия нуклеотидных последовательностей у паразитических и сапрофитных штаммов лептоспир.

Однако методы идентификации и дифференциации лептоспир путем молекулярного клонирования ДНК L. interrogans серовара pomona в доступной литературе отсутствуют.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследования являлось молекулярное клонирование ДНК L. interrogans серовара pomona и получение гибридизационного зонда для идентификации и дифференциации лептоспир. В соответствии с поставленной целью выполнялись следующее задачи :

1. Клонировать ДНК L. pomona в плазмидном векторе и создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащих случайные фрагменты генома L. рошэпа.

2. Получить банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир различных серогрупп.

3. Провести серию гибридизаций отдельных клонированных фрагментов ДНК с полученными препаратами нуклеиновых кислот лептоспир и выявить фрагмент ДНК L interrogans серовара pomona , пригодный для использования в качестве видоспецифичного гибридизационного зонда.

4. Исследовать возможности применения некоторых клонированных фрагментов ДНК для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации.

Научная новизна работы. Впервые осуществлено молекулярное клонирование ДНК L. interrogans серовара ропопа штамма ВГККИ-б и получена клонотека рекомбинантных плазмид.

Получен банк препаратов нуклеиновых кислот производственных и референтных штаммов, полевых изолятов лептоспир из коллекций ВГНКИ ветпрепаратов.НИИЭМ им. Е Ф. Гамалеи и университета Друлйы Народов им. IL Лумумбы.

Епервые изучена гибридизационная активность отдельных клонированных Фрагментов L. pomona по отношению к образцам ДНК

референтных штаммов лептоспир,полевым изолятам серогруппы Pomona и другим представителям бактериального мира

В результате проведенных экспериментов выделен Фрагмент ДНК, который может быть использован в качестве гибридизационного зонда :

- для дифференциации патогенных лептоспир от сапрофитных ;

- для выявления Leptospira interrogans как диагностический тест;

- для идентификации штаммов лептоспир , используемых в производстве вакцины против лептоспироза животных.

Практическая значимость работа. Полученный банк рекомби-нантных плазмид, содержащих фрагменты ДНК лептоспир, служит ис-точни.сом специфичных гибридизационных зондов, предназначенных для изучения генома лептоспир.

Разработан метод выделения вьюокоочищенных препаратов ДНК из биомассы лептоспир.

Предложено использовать регсомбинантную плазмиду pLp 41 в реакции ДНК-ДНК гибридизации для дифференциации вида L. interrogans от L. biflexa и других родов бактерий, а также для дифференциации производственных штаммов лептоспир.

Материалы диссертационной работы использованы при составлении " Методических рекомендаций по идентификации производственных штаммов лептоспир и дифференциации вида Leptospira interrogans от Leptospira biflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации", Мэто-дические рекомендации предназначены для использования в научно-исследовательской работе и практике при паспортизации производственных штаммов лептоспир и изучении культур лептоспир, выделенных от сельскохозяйственнных и диких животных.

Дпробацкя результатов иссдвдюваииа . Основные положения диссертации доложены и одобрены иа научной

конференции" Научные основы технологии промышленного производства ветеринарнных биологических препаратов" ( Москва , 1991 г.);

на Международной научной конференции .посвященной проблемам леп-тоепироза ( Мэсква, 1Q91 г.); на научно-практической конференции " Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных" ( Москва, 1993 г.).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в четырех научных работах.

Объем работы. Материалы диссертации изложены на 130 страницах машинописного текста и состоят из следующих разделов : введения,обзора литературы»результатов собственных исследований,. обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложения. Список цитируемой литературы содержит 150 отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 12 рисунками . ■

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Хатериалы и методы.

Исследования были выполнены в 1991 - 1992 гг. в лаборатории молекулярной биологии и биохимии БИЭВ. Музейные культуры референтных штаммов лептоспир любезно предоставил;! Ю. В. Ананьина (лаборатория лептоспироза НИИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи) и Г. И. Ежов (кафедра микробиологии университета Дружбы Народов им. П. Лумумбы). Производственные штаммы лептоспир, используемые при изготовлении вакцины против лептоспироза животных, получали из ВГНКИ ветери- ;• нарных препаратов от профессора Малахова Ю. А.

Культивирование лептоспир проводили на твин(полисорбат)-альбуминовой среде (F. Rüssel , С.Rüssel, 1986).

Хромосомную ДНК из биомассы лептоспир выделяли по методу Мармура (1961) с модификациями.

Молекулярное клонирование ДНК L. pomona осуществляли в плаз-

мидном векторе pUC 19 ( С. Yanish-Perron et al. ,1985 ).

Банк фрагментов ДНК L. pomona создавали,используя стандартные методики молекулярного клонирования (Маниатис Т. и др. ,1984).

В качестве клетки-хозяина для рекомбинантных плазмид применяли бактериальный штамм JM 109 Е.coli.При выращивании бактериальных культур использовали среду LB.

Идентификацию рекомбинантных клонов осуществляли на чашках с агаризованной LB, содержащей по 1 мМ селективного гистохимического красителя X-gal ( б-бромо-4-хлоро-З-индолил-.р-галактозид) и индуктора 1ас-промотора IPTG ^-изопропшМ-тио-^-Д-галактозид), а такие 75 мкг ампициллина.

Для выделения плаэмидноЯ ДНК использовали метод кипячения (Holmes,Quigjey,1981) и метод щелочного лизиса ( Blrnboim Н.С. и Doly J. А. , 1979).

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот проводили в 0,8 % агарозном геле ( Л. А. Остерман, 1981 ).

Рестрикционный анализ бактериальной и плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями Маниатис и др. ,1984 , с использованием эндонуклеаз рестрикции, полученных из НПО "Ферме нт"( Литва).

Включение радиоактивной метки в ДНК-зонды осуществляли методами ник-трансляции (Rigby P.V.J, et al. ,1977) и рассеянной затравки (Feinberg и Vogelstein,1984). Удельная радиоактивность ДНК-зондов составляла не менее 10~7 имп. мин. / мкг.

Перенос ДНК на нейлоновую мембрану Hybond-N ("Amersham") осуществляли по методике, предложенной Е. Southern, 1975, с использованием для переноса 10 X SSC буфера.

В одних случаях предгибридизацию и гибридизацию ДНК осуществляли при 47°С в растворе,содержащем 30 % формамид, 2 X S3C, 5 X раствор Денхардта, 0,1 7. 3D3 и 100 мкг/мл денатурированной

- о -

ДНК спермы лосося.

В других случаях предгибридиэацию и гибридизацию проводили при +65"С в растворе .содержащем 5 X раствор Денхардта.2 X SSC, 0,2 % SDS, 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося.

После 18 часов инкубации мембрану отмывали от несвязавшейся меченной ДНК последовательно в 2 X SSC, 0,2 7. SDS три раза по 10 мин. ; в 0,1 X SSC, 0,2 % SDS два раза по 15 мин. при +60°С и один раз в растворе 0.1 X SSC 10 мин.

Детекцию результатов гибридизации проводили радиоавтографией с использованием рентгеновской пленки PB-M и усиливающего экрана .

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Выделение и характеристика ДНК лептоспир.

Препараты нуклеиновых кислот референтных штаммов сероваров pomona.tarassovi, polonica, djatzi, szwajizak.ballum, whitcombi, shermani, pyrogenes, canicola, louisiana, panama, grippotyphosa, kabura.bratislava.copenhagôni.patoc.andamna, seraranga, sejroe, celledoni.castellonls, hebdomadis,poi,ranarum,dJasiman, lichuan, sarmin.autumnalis, a также производственных штаммов лептоспир и полевых изолятов серогруппы Pomona бшш получены для анализа специфичности рекомбинантных плазмид.

Используя фенол - додецилсульфатный метод, было выделено и очищено 65 препаратов ДНК штаммов лептоспир.

На каждое выделение брали 5-7 мл культуры лептоспир. При этом среднее количество ДНК, полученное из биомассы лептоспир составляло 1,5 мг.

Оптические характеристики ДНК .рассчитанные как соотношение поглощений при заданных длинах волн ультрафиолетового спектра, в сродном составляли А 260/230-1,8 (контаминация полисахаридами) и

- 9 -

для А 260 / 280 - 1,9 (контаминация белками).

Усредненная величина гиперхромного эффекта для препаратов ДНК достигла 28 X .

Полученные данные по спектральным характеристикам свидетельствуют о том , что изученные образцы содержали нативну» ДНК , не контаминированную примесями белков и полисахаридов. Препараты ДНК отвечает требованиям и могут быть использованы для проведения гешюсистематических исследований.

2.2.2. Создание клонотеки ДНК L. interrogans серовара ропюпа.

Источником хромосомной ДНК служил штамм ВГНКИ-б серогрутшы Pcrrona , который выделен от свиньи в 1966 г. в Московской области. Выбор штамма этой серогруппы обусловлен тем, что на территории кашей страны Pomona является одной из наиболее распространенных серогрупп, поражающих как сельскохозяйственных животных ( особенно свиней ), так и человека.

Хромосомную ДНК штамма ВГНКИ-б расщепляли на отдельные фрагменты эндонуклеазой рестрикции EcoR I в условиях неполного гидролиза. Были подобраны такие условия рестрикции, при которых максимальное количество продуктов реакции составляли фрагменты ДНК размера 1-4 тысяч пар нуклеотидов (т. п. н.). Эта фракция ДНК выделялась препаративным электрофорезом из агарозного геля.

Выделенные фрагменты ДНК лигировали с плазмидой pUC 19, предварительно расщепленной рестриктазой EcoR I.

Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е. coli штамма JM 109 и высевали на чашки с агаризованной средой LB,содержащей ампициллин, индикатор ^-галактозидааной активности Х-gal и индикатор галактозидааы IPTG.

Рекомбинантные клоны были отобраны по отсутствию JJ-галакто-эидаэной активности, поскольку у них нарушена способность к син-

тезу фермента вследствие сдвига рамки его считывания при встраивании в векторную плазмиду фрагмента чужеродной ДНК,т. е. клоны рекомбинантного фенотипа на селективной среде формировали бесцветные колонии в отличие от обычных колоний синего цвета.

В результате молекулярного клонирования было, отобрано 44 колонии рекомбинантного фенотипа

2.2.3. Анализ полученной клонотеки.

2.2.3.1. Рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид.

Из биомассы случайно отобранных 44 клонов были выделены препараты плазмидной ДНК. Размеры клонированной ДНК ротопа в составе рекомбинантных плазмид определяли с помощью рестрикции ЕсоН I и электрофореза в агарозном геле. Как следует из представленных данных таблицы 1, 42 рекомбинантные плазмзды содержали по 1-3 фрагмента чужеродной ДНК, размеры которых варьировали от 0,4 до 3,6 тысяч пар нуклеотидов. Сумма клонированнных Фрагментов ДНК лептоспир достигла 88,9 т. п. н. .что составляет 4 X бактериального генома

Поскольку для клонирования из агарозного геля после рестрикции ДНК штамма ВГНКИ-б препаративно выделяли фрагменты, находящиеся в пределах полосы 1-4 т.п.н.,то видно,что выделенные из рекомбинантных плазмид вставки соответствуют по размерам диапазону клонированных фрагментов. '" ' ■•

При рестрикционном анализе рекомбинантных клонов было также установлено,что из. некоторых плазмид выделялось 2 или 3 фрагмента чужеродной ДНК. Это обьясняется тем, что клонированный фрагмент чужеродной ДНК содержит внутри себя сайты рестриктазы Есой I и в результате полного гидролиза препаратов ДНК, в местах узнавания данной рестриктазы происходит полное расцепление ДНК по этому сайту. Возможно, однако .что наличие этих сайтов

обусловлено одновременным дотированием в одном векторе двух и более мелких фрагментов ДНК лептоспир.

Таблица 1

Результаты рестриктазного анализа рекомбинантных плазмид.

N плазмиды количество размеры вставок

вставок (тысяч пар нуклеотидов)

рЬр 01 2 1,28 0,96

рЬр 02 г\ 2,03 0,69

р1.р 03 1 1,82

рЬр 04 1 1,66

рЬр 05 3 1,12 0,60

рЬр 06 2 2,44 1,22

pLp 07 2 1,91 0,66

рЬр 08 2 1,89 0,58

рЬр 10 3 1,53 0,70

рЬр 11 2 2,46 1,17

рЬр 12 2 2,39 0,69

рЬр 14 2 0,99 0,70

р!-р 15 1 1,78

рЬр 16 1 1,79

рЬр 17 1 3,22

pLp 18 1 1,72

pLp 19 3 1,42 0,91

рЬр 20 2 1,90 0,68

р1р 21 2 1,68 0,41

рЬр 22 1 1,98

pLp 23 3 0,75 0,67

рЬр 24 1 1,50

Продолжение таблицы 1 Результаты рестриктазного анализа рекомбинантных плазмид.

N плазмиды количество размеры вставок

вставок (тысяч пар нуклеотидов)

рьр 25 1 0,56

р[..р 26 дуплет 2,79

рЬр 27 2 1,91 1,64

рЬр 28 1 0,63

рЬр 29 1 1,49

рЬр 30 1,06 0.78

рЬр 31 1 1,80

рьр 32 1 1,88

рЬр 33 1 2,33

Р'-Р 34 1,86 0,73

рЬр 35 1 1,09

рЬр 36 1 0,80

рЬр 37 2,32 1,56

рЬр 38 1 1,18

рЬр 39 1 1,41

рЬр 40 1 0,76

рЬр 41 1 1,20

рЬр 42 3,62

р!-р 43 2 2,30 2,00

р!.р 44 1 0,89

2,2. 3.2. Анализ рекомбинантных плазмкд в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

Принадлежность клонированных фрагментов к ДНК лептоспир была подтверждена в реакции дот - гибридизации с радиоактивно меченными ДНК-зондами , в качестве которых использовали тотальные ДНК штаммов : ВГНКИ-6 серогруппы Pomona, RP-29 серогруппы Tarassovi, Pinos серогруппы Canteóla

Результаты дот-гибридизационного анализа свидетельствовали, что клонированные в плазмидном векторе pUC 19 фрагменты ДНК действительно лептоспирозной природы-все 42 рекомбинантные плаз-миды обнаруживали интенсивные положительные сигналы на радиоавтографе после гибридизации с меченной радиоактивным фосфором ДНК штамма ВГНКИ-6. Десять рекомбинантных плазмид имели комплементарные последовательности в геноме штамма Pinos серогруппы Canicola и лишь одна единственная рекомбинантная плазмида (pLp 41) гибри-дизовалась с тотальной ДНК штамма RP-29 серогруппы Tarassovi. Эти данные не противоречат результатам экспериментов Р. Yasucia et al. (1987), Р. Ramdass et al. (1992), определившим, что по степени гомологии ДНК представители серогрупппы Tarassovi генетически отдалены от представителей серогрупп Роггопа и Canicola.

Из созданной клонотеки рекомбинантных плазмид для дальнейших исследований отобрали pLp 23,pLp 37 и pLp 41.

— ntirtriTiitioiinm «ллчилп «лмл »ипл ллг^ли. j Jiii i a i dxvj i пу^иДиоаДни /tionuDwcnu, iíu j^cn-wm

бинантная плазмида pLp 23 гибридизовалась с ДНК штаммов ВГНКИ-6 и Pinos, pLp 37 показала положительный сигнал на радиоавтографе только с хромосомной ДНК ВГНКИ-6, a pLp 41-е ВГККИ-б и RP -29.

Однако выбор наиболее перспективной рекомбинантной плазмиды из числа предварительно отобранных структур может быть сделан на основе дальнейших исследований с использованием в гибридиза-ционных экспериментах более широкого круга представителей бактериального мира.

2.2.4. Плазмиды pLp 23, pLp 37 и pLp_41 как гибридизационные зонды для идентификации референтных штаммов лептсспир.

Согласно цели исследования осуществили препаративное выделение фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pLp 41. Рекомбинантные плазмиды pLp 23, pLp 37, pLp 41 по результатам рестриктазного анализа содержали 3,2,1 фрагментов ДНК L.pomona соответственно (таблица 1). Выделенные из рекомби-нантных плазмид шесть фрагментов-вставок ДНК L. pomona метили радиоактивным фосфором и использовали в качестве зондов в реакции слот-блот гибридизации. В эксперименте использовали препараты ДНК, выделенные из музейных культур референтных штаммов лептос-пир. Всего с использованием данной методики было исследовано 42 препарата суммарных нуклеиновых кислот лептоспир.

Сравнение результатов слот - блот гибридизации тотальных ДНК различных штаммов лептоспир с ДНК-зондами из рекомбинантных плазмид pLp 23,pLp 37 и pLp 41 показало, что штаммы патогенных лептоспир отличаются друг от друга по интенсивности сигналов радиоавтографии. Возможно , что различия в степени гибридизации с молекулярными зондами в штаммах патогенных лептоспир могут быть связаны с разной степенью гомологии этих зондов комплементарным им нуклеотидным последовательностям в ДНК штаммов L. interrogans. Однако различия могут быть обусловлены и разным числом копий последовательности исследованных ДНК-зондов внутри генома лептоспир того или иного штамма.

Одновременно, было показано , что ни один из исследуемых ДНК-зондов не гибридизовался с ДНК сапрофитных штаммов лептоспир. Полученные данные позволяют утверждать, что ДНК-ДНК гибридизация с ДНК-аондом, приготовленным из рекомбинантной плазмиды pLp 23, pLp 37 или pLp 41 , позволит дифференцировать вид L. interrogans от вида L. biflexa.

При определении специфичности полученных рекомбинантньгх плазмид в реакции слот-блот гибридизации с референтными штаммами патогенных лептоспир было обнаружено, что одни фрагменты-вставки гибрндизовались с более узкой,а другие - с более широкой группой бактериальных штаммов . Так , например, фрагмент - вставка ДНК L. pomona размером 1,50 т. п. н. из рекомбинантной плазмиды pLp 37 активно гибридизовался со штаммами лептоспир следующих сероваров: pomona,panarra, canicola.polonica.grippotyphosa,kabura,szwajizak, • pyroxenes,louisiana,autumnal is, djasiman, copenhageni.whitcombi, poi; исключение составили ballum, ranarum.sejroe, lichuan.sarmin, caste11on i s,tarassov í,Shermanl,ce11edon i.

Однако фрагменты-вставки рекомбинантной плазмиды pLp 23 обнаруживав при радиоавтографии интенсивные положительные сигналы с препаратами ДНК немногих сероваров ( для фрагмента размером 0,67 т. п. н. это серовары : polonica , kabura, sarmin, cynopteri, pyrogenes ;для фрагмента 0,40 т. п. н. - polonica,cynopteri, kabura; а для фрагмента размером 0,75 т. п. н. это серовары: erippotyphosa, cynopteri,panama,celledoni,1lchuan, sarmin,hebdomad i s ).

Для фрагментов-вставок из рекомбинантньгх плазмид pLp 23 и pLp 37 слот - блот гибридизацией отмечено одно общее свойотео -отсутствие положительных гибридизационных сигналов с образцами ДНК лептоспир патогенного серовара tarassovi. Таким образом , можно полагать , что хромосомные ДНК штамма Perepeíicyn (из музейных коллекций кафедры микробиологии университета Дружбы Народов им. П. Лумумбн и лаборатории лептоспироза НИИЭМ им. Н. Ф. Гама-' леи ) не несли комплементарных pLp 23 и pLp 37 последовательностей нуклеотидов.

Одновременно результаты исследований показали,что в хромосомных ДНК сероваров tarassovi , pomona , sejroe , kabura, grippotyphosa,panana,sarmin, szwajizak, bratlslava,casto1lonls.

louisiana, xhitcoirbi , djatzi, cynopteri присутствует области, гомологичные ДНК-зонду pLp 41.

Описанные выше результаты слот - блот гибридизаций не противоречат сообщениям литературы ( Terpstra W. J., Schoone G. J. . et al. ,1986,1987; Zaal J. et al. ,1988 ). Проведенные опыты по идентификации патогенных лептоспир при использовании в качестве зондов геномной или клонированной ДНК лептоспир показали перекрестную гибридизацию между сероварами даже в строгих ( жестких ) условиях дот - блот анализа .

2.2.5. Плазмиды pLp 23,37,41 как ДНК-зонды для идентификации полевых изолятов и производственных штаммов лептоспир.

Выполнены эксперименты по гибридизации шести фрагментов ДНК L. pomona из рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37, pLp 41 с препаратами ДНК штаммов лептоспир серогруппы Pomona, которые были изолированы' от сельскохозяйственных животных и человека на территории России. Одновременно изучалась гибридизационная активность клонированных Фрагментов по отношению к ДНК производственных штаммов лептоспир (Таблица 2).

Как следует из полученных данных,наименьшая гибридизационная активность с препаратами ДНК, характерна для фрагментов ДНК L. pomona размером 0,75 т. п. н., 0,67 т. п. н. и 0,40 т. п. н. из ре- • комбинантноа плазмиды pLp 23. Эти фрагменты ДНК рекомбинантной плазмиды pLp 23 в низкой степени гибридизовались с образцами ДНК изолятов лептоспир сероваров rronjakov, pomona и производственных штаммов ВГНКИ-2, ВГНКИ-5, ВГНКИ- 4. Однако высокое сродство к штам- ' мам - изолятам лептоспир, серологически идентифицированным к се-ровару tmzdok, обнаруживали все три фрагменты-вставки L. pomona рекомбинантной плаамиды pLp23.

Таблица 2

Характеристика штаммов лептсспир,используемых в опыте.

N штамм серовар характеристика :

вид животного,год и место

выделения

1 Сарпинский рошопа бычок,1951,Сталинградская обл.

2 Гиацинт pornona бычок, 1946, Московская обл.

3 Иванченко mozdok человек,1961, СОАССР

4 Т-8021 mozdok бычок,1961 СОАССР

5 Моняков monjakov человек,1937, Приморский край

6 Танк monjakov лошадь,1354,Татарская АССР

7 Свинья 185 monjakov свинья,1959,Калининградская обл.

8 ВГНКИ-1 grippotyphosa овца, 1969

9 ВГНКИ-2 ícterohaemorrhagíae свинья,1972,Московская обл.

10 ВГНКИ-3 camcola свинья,1973,Московская обл.

11 ВГНКИ-4 tarassov í свинья, 1573, Московская обл.

12 ВГНКИ-5 balcanica бычок, 1974, Оренбургская обл.

13 ВГНКИ-6 poirona( monjakov) свинья, 1666, Московская сбл.

Исследования показали, что с ДНК - зондами р!.р 37 и р!_р 41 положительный эффект в реакции гибридизации проявляли в равной мере все исследуемые штаммы - изоляты сероваров рошопа, топ}акоу и тогс!ок. Однако только ДНК-зонд,приготовленный на основе реком- ■ бинантной плазмиды рЬр 41, обнаруживал высокую гибридизационную способность со всеми используемыми в этом эксперименте производственными штаммами лептоспир. Рекомбинантные плазмиды рЬр 23 и рЬр 37 в высокой степени гибридизовались с образцами ДНК производственных штаммов ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГ1ПСИ-3, ЕГНХИ-5,БГНКИ-С, за исключением ВГНКИ-4.

- 18 -

2. 2.6. Проверка специфичности рекомбинантных плазмид на коллекции ДТ!К штаммов различных видов микроорганизмов.

Препараты ДНК различных культур микроорганизмов Е. col 1. Leptospira interrogans, Yersinia pseudotuberculosis, Bordetella bronchioseptica.Corynebacterium pyogenes,Corynebacterium rinale, Pasterella multocida, Brucella abortus. Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma luteus ) гибридизовали по стандартной методике с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 41.

Результаты эксперимента показали, что нуклеотидные последовательности ДНК L. pomona рекомбинантных плазмид pLp 23 и pLp 41, не обнаруживают перекрестную гибридизацию с образцами ДНК чужеродных источников. В местах нанесения препаратов ДНК сероваров патогенных лептоспир отмечали положительные сигналы гибридизации.

2.2.7. Реакция блот-гибридизации для дифференциации

. производственных штаммов лептоспир. В настоящее время разрабатываются ряд молекулярно-генети-ческих методов , позволяющих осуществить дифференциацию возбудителей при анализе структуры ДНК

Препараты суммарной ДНК лептоспир в количестве 0,8 мкг расщепляли рестриктазой Hind III , рестриктные фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 0,8 % агарозном геле й переносили на нитроцеллюлозную мембрану, используя блоттинг по Саузерну.

В качестве маркера молекулярной массы использовали фрагменты ДНК фага лямбда, полученные при расщеплении Pst I. Фильтры с иммобилизованными фрагментами ДНК лептоспир гибридизовали с фрагментами рекомбинантных плазмид pLp 23, pLp 37 и pl.p 41.

Результаты блот-гибридизации Hind II! фрагментов тотальной ДНК штаммов лептоспир с ДНК - зондами pLp 23, pLp 37, pLp 41 предстньл1'ны в таблице 3.

Таблица 3.

Результаты блот-анализа.

N штаммы Размеры гибридизующихся Hind III - фрагментов геномной ДНК лептоспир с ДНК - зондом : (тысяч пар нуклеотидов)

pLp 23 pLp 37 pLp 41

1 ВГНКИ-1 4,9; 4,8; 4,7 5,0 5,1; 4,7; 4,5; 2,8; 1, 4

2 ВГНКИ-2 3,6 4.7 4,0;2,9 . 4,5;3,5'

3 ВГНКИ-3 4,8;3,6 4,6 4,0; 2,9 5,0; 4,5

4 ВГНКИ-4 4,8;3,6 4,8 4,5;4,0 5,1-2,9;2,4;2,0; 1, 7

5 ВГНКИ-5 4,8; 3,6 4,7 4,0; 2,0 4,8; 4,5; 3,5

6 ВГНКИ-6 4,8 4,8 4,7;2,9 4,8;3,5;2,6

7 MoskvaV 4,9; 4,6; 3.6 5,0 4.0 5,1; 4,7;4,5;2,8; 1, 4

8 Каширский 4,8; 3,6 4,8 4,6; 4,0; 2,9 5,0;4,5

9 Perepelicyn 4,8; 3,6 4,8 4,0 5,l-4,5-2,9;2,4;2, 0; 1,7

10 493 Poland 4,8;4,7;4,6 4,8 5,l;4,7;4,5;3j5;2, 9

11 Pomona 4,8;3,6 4,8; 4,6;4,0;2 9 5,0;4,5;3,5

С ДНК-зондом рЬр 23 идентичные профили гибридизации характерны для штаммов ВГНКИ-3,ВГНКИ-4 и ЕГНКИ-5, хотя все производственные и референтные штаммы давали чрезвычайно низкий гибриди-зационный сигнал .

При гибридизации с ДНК-зондом р1р 37 не отмечено сущзстаен-ных различий у штаммов ВГНКИ-3, ВГНКИ-2 , а для штамма ВГНКИ-1 интенсивная гибридизационная полоса была локализована в верхней части трека, при этом не наблюдалось никаких дискретных полос.

Отсюда можно полагать,что существуют отдельные места в геноме ВШШ-1, где комплементарные ДНК-зонду pLp 37 нуклеотидные последовательности концентрируются в значительной степени.

Из представленных данных следует, что pLp 23 и pLp 37 не пригодны для дифференциации производственных штаммов лептоспир методом Слот-гибридизации по Саузерну.

Различие гибриднзационных профилей ДНК лептоспир, рестрик-цированных зндонуклеазой Hind III, оказались наиболее демонстративными, когда в качестве ДНК - зонда .использовали фрагмент -вставку размером 1,20 т.п.н. .которая вьпцепляется из рекомбинант-кой плазмиды;рЬр 41. Производственные штаммы лептоспир отличались друг от друга числом и размером гибридизующихся фрагментов, а также интенсивностью сигнала радиоавтографии. Характерно наличие пяти дшсретных полос для штамма ВГНКй-1 и интенсивного гибриди-зационного пятна по всему треку для штамма ВГНКИ-4. что, вероятно, указывает на хороший разброс по геному данной клонированной последовательности. Результаты блот-гибридизации позволяют предполагать, что фрагмент - вставка рекомбинантной плазмиды pLp 41 представлен в геноме ВГНКИ-4 как большое количество копий , повторяющихся друг за другом.

Таким образом,каждый производственный штамм характеризовался наличием как общих .так и индивидуальных различающихся по молекулярной массе и специфичности отдельных фрагментов- ДНК.

Елот-гибридизация Hind III фрагментов ДНК штаммов лептоспир с ДНК-зондом pLp 41 показала идентичные профили гибридизации для производственного штамма ВГНКИ-1 и референтного штамма Moskva V, а в случае гибридизации с ДНК-зондами pLp 23 и pLp 37 профили этих штаммов были отчетливо различимы. Также нами установлено, что нельзя точно отличить блот - гибридизацией с ДНК-зондом pip 41 производственный пггамм ВГНКИ-3 и рефс-ронтный штамм

Каширский. Однако Слот-гибридизация с ДНК-зондом pLp41 различала производственные ' штаммы ВГНКИ-4, ВГНКИ-5 и ВГККИ-б серогрупп Tarascovi, Sejroe и Pomona соответственно от их референтных штаммов Perepelicyn, 493 Poland и Pomona

ВЫВОДЫ .

1. Клонирование ДНК штамма ВГНКИ-6 еерогруппы Pomona позволило создать клонотеку рекомбинантных плазмид, содержащую 67 фрагментов бактериального генома лептоспир.

2. Шлучен банк препаратов нуклеиновых кислот лептоспир, содержащий 42 препарата ДНК референтных штаммов,6 -'производственных , а также семь образцов ДНК штаммов еерогруппы'Pomona,изолированных от больных сельскохозяйственных животных и человека в различных регионах страны.

Разработан метод выделения высокоочищэнных препаратов ДНК из биомасы лептоспир.

3. В результате реакций ДНК-ДНК гибридизации полученной кло-нотеки с нуклеиновыми кислотами лептоспир была выделена рекомби-нантная плазмида pLp 41 размером 3 880 пар нуклеотидов,содержащая фрагмент ДНК L. interrogans серовара pomona,нуклеотидная последовательность которого пригодна для использования в качестве видоспецифического гибридизационного зонда.'

Установлено,что плазмидный зонд гибридизувггея только с ДНК лептоспир вида L. interrogans , и не гибридизуюгея с препартами суммарных нуклеиновых кислот сапрофитных лептоспир, иерсиний,кишечной палочки,бруцелл,микоплазм и других бактерий.

В хромосомных ДНК серовароз tarassovl , sojroe, pomona, kabura .polonica, whitcombi , grippotyphosa, panama,castellonis, sarmin , szwajisak , bratislava , djatzl, Iouisiana , cyncpteri присутствуют области, гомологичные фрагменту ДНК L. pomona в сос-

теше рекомбинантной плазмиды pLp 41. Показано,что ДНК-зонд pLp 41 позволяет выявлять образцы ДНК штаммов лептоспир, представляющих основные серогруппи Pomona, Tarassovi, Sejroe, Grippotyphosa, которые вызывают заболевание у свиней и крупного рогатого скота на территории России и других стран СНГ.

4. Показана возможность использования фрагмента ДНК L. рошопа .• из рекомбинантной плазмиды pLp 41 в качестве ДНК-зонда для дифференциации производственных штаммов лептоспир в реакции блот-гибридизации. Установлено, что в хромосоме производственных штаммов лептоспир присутствуют различные по молекулярной массе области, кеоуиио участки ДНК , гомологичные фрагменту ДНК L. pomona, входящего в состав плазмиды pLp 41.

5. Определены молекулярно-генетические характеристики указанного фрагмента, обеспечивавшие его идентификацию. При этом установлено, что клонированный фрагмент ДНК имеет размер 1 200 пар нуклеотидов,ограниченный сайтами рестриктазы EcoR 1,а также не содержит сайты следующих рестриктаз : Pst I , Sma I ,Xba I и EcoR V. Плазмида содержит ген Ыа .детерминирующий синтез ^-лак-томазы, что обеспечивает устойчивость к ампициллину штамма Е. col 1, несущего данную плазмиду. Плазмида мультикопийна и не-конъюгативна.

Практические предложения.

1. Получена рекомбинантная плазмида pLp 41, используемая в качестве источника молекулярного зонда, разработанного для идентификации патогеннвых лептоспир.

2. Разработаны " Методические рекомендации по идентификации производственных штаммов и дифференциации Leptospira interrogans от Leptospira btflexa в реакции ДНК-ДНК гибридизации",утвержденные научно-методической комиссией ВНИиТИБП от 17.09.93,протокол N2.

Список работ , опубликованных по теме диссертации .

1. Тюрина И. tt , Артюшин С. К. .Белоусов В. И. .Быкова Е Е ДНК - зонд для идентификации и дифференциации лептоспир// Ветеринария. -1993. -N 8.-с. 53

2. Тюрина И. а , Артюшин С. К., Белоусов R К , Быкова Е Е Идентификация и дифференциация производственных штаммов лептоспир методом ДНК-ДНК гибридизации // Профилактика и меры борьбы с инфекционными болезнями молодняка животных : - Тез. докл. научно-практич. конф. 21-22 апреля 1993г.-It ,1993..

3. Аг tush in S. .Belousov V. .Bikova M. .Turina I. Development of DNK- hybridization probe for identification of Leptospira interrogans serovar pomona // VII European and IX USSR leptospirosls research conference Moskov, February 20-22 - M. , 1991.- P. 53

4. Артюшин С. к. .Белоусов В. И. .Быкова H. Н.,Тюрина Я Е Иэлекуляр-ное клонирование ДНК Leptospira pomona // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов : Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. 23-25 апреля 1991 г. - М., 1991.- С. 106