Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспирозов в очагах тропического пояса

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка тест-системы на основе полимеразной цепной реакции для диагностики лептоспирозов в очагах тропического пояса"

На правах рукописи

ЛЮ Чжун-Фу

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗОВ В ОЧАГАХ ТРОПИЧЕСКОГО ПОЯСА

03.00.07 — микробиология

Авторефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва — 1996

- 1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ»

Актуальность тема. Лептоспирозы относятся к группе природ-ноочаговнх зоонозов, имеющих широкое распространение в различных климато-географических и ландиафтннх условиях. С начала 00-х годов и до настоящего времени во многих странах отмечается устойчивая тенденция роста заболеваемости этими инфекциями среди людей, проявляющейся как в виде спорадических случаев, так и крупных эпидемических вспниек ( Ю.М. Федоров S В.В. Горяенко, 1990; Shi H.H.. 1995 и др.). Однако наиболее интенсивные природные очаги этих инфекций, имеющие выраженное эпидемическое проявление. расположены в странах тропического пояса (J.D. Everard Ä C.O.R. Everard, 1993 и др.). С момента введения официальной регистрации лептоспирозов в 1955 году эта проблема остается в числе приоритетных в системе национального здравоохранения Китая. В его южных и юго-восточных провинциях ежегодно регистрирувтся десятки, а в отдельные годы более ста тысяч случаев заболеваний среди людей при показателях летальности, достигающих 102 ( Shi H.H.. 1995). Столь высокий процент неблагоприятных исходов в значительной мере обусловлен несвоевременной диагностикой, которая осложняется следующими моментами:

1) Многообразием спектра клинических проявлений болезни: от гепаторенального синдрома до геморрагических пневмоний.

2) Своеобразием н сложностью этиологической структуры лептоспирозов в Китае, где установлена циркуляция патогенных лептоспир. относящихся к 74-м сероварам 19 серогрупп (Shi H.H.. 1995: Luo Y.B. 1992.)

3) Отсутствием эффективных средств ранней лабораторной

диагностики лептоспирозной инфекций адекватных региональным особенностям этиологической структуры.

Вполне очевидно, что при столь разнообразной серопейзаке возбудителей использование " золотого стандарта " лабораторной диагностики лептоспирозов - реакции микроагглютинации лептоспир (РМА) представляет определенные трудности из - за необходимости использования широких панелей диагностических атаммов всех эпидемически значимых для данной территории серогрупп. Кроме того, специфические агглютинины, как правило, выявляется не ранее конца 1-й, начала 2-й педели заболевания. В этой связи возникает необходимость в разработке новых методов ранней лабораторной диагностики лептоспирозов, которые могут быть использованы в очагах со слояной этиологической структурой, в частности, в очагах тропического пояса Китая.

В этом отношении представляется перспективным использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанного на амплификации специфических последовательностей ДНК и отличающегося высокой чувствительность» и специфичностью.

Ранее разработанные за рубежом высокочувствительные тест-системы на основе ПЦР для индикации лептоспир ( Чап ЕуБ,1989; Сгаиекаир, 1990; Рего1аЬ,1993) обладает родовой, либо серогрупповой специфичностью. Видоспецифичная ПЦР тест-система с использованием С - праймеров С А.П.Самсонова и др., 1эЬ4 г.; такие не отвечает указанным задачам, поскольку не позволяет выявлять ДНК лептоспир ряда серогрупп и преяде 'всего Сг1рро1урЬоза - одной из наиболее распространенных и эпидемически значимых во многих странах мира, включая Китай. Кроме того, до настоящего времени не проводилось исследований по оценке диагностической эффективности ПЦР-анализа в сравнении с тради-

ционннми методами лабораторной диагностики в очагах лептоспирозов с различной этиологической структурой и на разных стадиях заболевания.

Цель исследования. В связи с изложенным целью исследований явилась разработка высокочувствительной и видоспецифичной тест-системы на основе ПЦР для диагностики лептоспирозов в условиях политипичных очагов тропического пояса, а также оценка па диагностической эффективности в сравнении с иммунологическими методами.

Основные задачи исследования.

1) На основании данных литературы провести анализ этиологической структуры лептоспирозов в различных провинциях Китая; определить наиболее значимые в эпидемическом отношении серовары возбудителей.

2) Провести идентификацию «таммов лептоспир. выделенных от больных лептоспирозами в Китае, в реакции микроагглютинации (РМА) с панелями моноклональннх антител.

3) Подобрать праймеры и оптимальные условия постановки ПЦР, обеспечиващие таксономическую специфичность тест-системы.

4) Определить чувствительность разработанной ПЦР-тест-системн на препаратах очинённой ДНК и лизатах клеток чистых культур L. interrogans, а также на модельных образцах клинического материала.

5)Дать оценку диагностической эффективности разработанной ПЦР тест-системы на различных стадиях заболевания лептоспирозом в сравнении с традиционными иммунологическими методами (PMfl и слайд-агглютинации (БАСА)).

Научная новизна. На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработаны две высокочувствительные тест-системы (G- и

В-) для индикации патогенных лептоспир (Leptospira interrogans), в том числе возбудителей, имещих наибольшее эпидемическое проявление в политипичных очагах лептоспирозов тропической зона Китая. При постановке ПЦР со смесью праймеров отмечено явление их интерференции. С помощью панелей моноклинальных антител среди штаммов серовара grippotyphosa, выделенных от больных в провинции Сычуань, идентифицировано два новых субсе-ровара, которые такае различались между собой по температурному спектру реакции в £~ и (С+В)-тест-системах ПЦР. Впервые проведены испытания диагностической эффективности ПЦР-анализа в очагах лептоспирозов с различной этиологической структурой в зависимости от стадии заболевания.

Практическая значимость работы. Показана возможность использования разработанных G- и B-тест-систем ПЦР в целях ранней диагностики лептоспирозов (начиная с 1-го дня заболевания) в политипичных очагах лептоспирозов. Получены данные, свидетельствующие о перспективности использования ПЦР-анализа для контроля течения инфекции и прогноза возможных осложнении лептоспирозов. Результаты работы используются при чтении лекции для врачей бактериологов и эпидемиологов в Информационном Центре Госсанэгшдназора РФ и Российской Медицинской Академии последипломного обучения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научно-практической конференции " Биомедицинские технологии" РАМН, Московской медицинской академии и РУДН (февраль, 1996 г.) и на совместной конференции отдела инфекций с природной очаговостью и лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов НИИЭМ им.11.Ф.Гамалеи РАМН (апрель 1996 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 тези-

сы. 2 статьи сданы в печать.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения , 6 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 150 работ ( из них на русском языке - 32. на иностранных языках - 118). Работа изложена на 105 страницах машинописи, иллюстрирована 20 таблицами и 11 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДН.

В работе использовали втаммы лептоспир из Международной коллекции лаборатории лептоспирозов НИИЭМ им.Н.Ф. Гамалеи РАМН, а также 7 изолятов серовара grippotyphosa, выделенных в Китае в провинции Сычуанъ из крови больных лептоспирозом в 1994 г. В П1|Р всего исследовано 34 штамма.

Для проверки таксономической специфичности тест-системы НИР использовали ДНК и лизаты микроорганизмов различных родов и видов, а также эукариотические ДНК (тимуса быка и человека), любезно предоставленные сотрудниками различных лабораторий НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Культуры лептоспир выращивали в жидкой среде Фервоорта-Вольфа с 107. крольичьей сыворотки при 28°С в течение 7-10 суток. Концентрацию лептоспир в культурах определяли подсчетом в камере Петрова - Хауссера.

Исследовано 173 сыворотки крови: 127 - от больных леп-тоспирозами или подозреваемыми на это заболевание, 28 - от больных заболеваниями нелептоспирозной этиологии (серозные менингиты, вирусные гепатиты, грипп) и 18 - от здоровых доноров.

Сыворотки больных собраны во время вспышек лептоспирозов: R7 - на территории Курганской области России в июле 1994г., 60 - на территории провинции Хунань Китая в ииле 1994 г..

До исследования в ПИР все образцы хранились при -20°С.

Модельные образцы для определения чувствительности ПЦР при индикации лептоспир в клиническом материале готовили путем добавления известного количества клеток культуры штамма Moskva U к образцам сыворотки крови.

РМА проводили обцепринятым методом согласно рекомендациям ВОЗ (WHO. Guidelines,1982.) с живыми культурами 13-и референтных штаммов лептоспир.

Идентификации 7 штаммов лептоспир серовара grippotyphosa, выделенных от больных лептоспирозами, проводили стандартной реакцией микроагглютинации лептоспир с панелью мАТ Fl (H.Terpstra, 1990). Реакцию слайд-агглютинации с антигеном Байрам-Али (БАСА) ставили по методу, описанному Е.М.Петровым (1993).

ДНК в препаративных количествах из штаммов L.interrogans R£A и Moskva U, получали модифицированным методом Marnur (19Ü1).

Лизаты чистых культур лептоспир для использования в ПЦР готовили кипячением на водяной бане в течение 10 - 15 минут.

Обработку модельных и клинических образцов сывороток крови проводили по методике,включающей в себя лизис с помоцыо доде-цилсульфата натрия, экстракции смесью хлороформ-изоамиловый "спирт" и осаждение этанолом.

Олигонуклеотидные последовательности праймеров заимствованы из работ Gravekamp с соавторами ( 1990, ). Они представляют собой участки случайно клонированного фрагмента генома из библиотеки генов штамма RGA ( серовар icterohaeiorrhagiae Leptospira interrogans и штамма 1051 (серовар bin).

ПЦР проводили по одной из стандартных программ, разработанных в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов

НШШ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН для амплификатора марки Techne РИС.

Регистрации результатов ПЦР осуществляли путем исследования продуктов реакции методом электрофереза в агарозном геле и последующей окраской бромистым зтидием.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка тест-систем на основе полимсрдзной цепной реакции для индикации Leptospira interrogans.

Задачей первого этапа работы являлся подбор таких условий проведения ПЦР, которые обеспечивают видоспецифическую индикации патогенных лептоспир всех наиболее распространенных и эпидемически значимых серогрупп. включая Grippotyphosa. В качестве основы использовали описанную Gravekanp с соавт (1393) систему с В-праймерами (в дальнейием именуемую " В-система") в сочетании с ранее разработанной в напей лаборатории системой с G-праймерами (в дальнейием именуемой " G - система") (Самсо-нова А.П. и др. 1994.).

Как было показано ранее, температуры отжига G - праймеров лежат в интервалах (в зависимости от применяемой формулы): для Gl - 47°С — 62°С, для G2 - 49°С — 64°С. В наиих исследованиях при расчете температур отжига В-прайнеров получены еле-

О °

дуюцие величины: для B64-I - 47 С — 59,9 С, для B64-II -48°С — 62,5°С. На основании полученных результатов определен

о о

интервал температур (49 С—6.0 С), в котором происходит отжиг всех 4-х праймеров. Поэтому в дальнейием температуру отжига праймеров изменяли в указанных пределах, а все остальные условия проведения ПЦР сохраняли постоянными.

Согласно результатам, полученным при изучении особен-

ностей работы систем прайыеров G, В и смеси G+B в разных точках расчетного интервала температур, при тестировании ДНК штамма RGA (ceporpynna Icterohaeaorrhagiae) специфические фрагменты амплифицирувтся только в системах с участием праймеров G ( G и G+B), но отсутствует амплификация фрагмента специфичного для В-системы праймеров. При этом на величину массы ампликона продукта, полученного в ПЦР, не влиявт чистота ДНК в образце,марки используемых при постановке ПЦР реактивов и оборудования.

Тестирование аналогичным образом ДНК лептоспир мтамма Moskva U (ceporpynna Grippotyphosa) показало, что при темпера-

о о

туре 50 - 55 С одинаково хорожо работавт как G, так и. В-прайме-ры. При увеличении температуры отжига праймеров до 57° - 60° С амплификация в G-системе не наблюдается, в В-системе moiho четко видеть продукт ПЦР, а при использовании G+B-системе реакция идет нестабильно: результат то отрицательный, то слабоположительный, на него оказывает влияние чистота исследуемого образца ( очищенная ДНК или лизат), а также марки используемых при постановке ПЦР реактивов и оборудования ( амплификаторов).

В тех ie опытах было отмечено, что при температуре отжига праймеров количество синтезируемого ампликона примерно одинаково Ссуда по результатам электрофореза в агарозном геле) при постановке реакций со всеми системами праймеров (G, В, G+B). В

о

то же время при увеличении температуры отжига праймеров до 55 С наблвдали уменьшение масс синтезированных продуктов ПЦР в G+B-системе по сравненив с массами наработанных амшшконов в G и В-системах по отдельности.

Поскольку во всех опытах в реакционнув смесь ПЦР вносили строго одинаковые количества ДНК или клеток лептоспир, то на конечный выход продуктов ПЦР при использовании разных систем

(Б-, В- или 5+В-системы) и разных температур отжига праймеров, начальная концентрация ДНК не влияла. На этом основании, можно

<3 о

сделать вывод, что в диапазоне температур отжига 57 С - 60 С при постановке ПЦР в С+В-системе имеет место интерференция между двумя парами праймеров.

Таким образом, в ходе опытов были проверены и уточнены оптимальные температуря отжига праймеров различных систем по сравнении с расчетными для разных жтаммов лептоспир. Оказалось, что тестирование проб исследуемого материала со смесь» праймеров С+В можно эффективно проводить лижь при температурах отжига

о °

праймеров 50 С - 55 С. Если возникает необходимость проведения ПЦР в интервале отжига праймеров 57°С -В0вС, то с цель» получения однозначно регистрируемых и воспроизводимых результатов, можно рекомендовать использовать раздельно С- и В-системы, а не смешанную С+В. как рекомендует бгауекажр (1993).

При проведении ПЦР с В-праймерами амплификации ДНК микроорганизмов других таксономических групп не наблюдали.

В экспериментах с ДНК зукариотических организмов (тимуса быка и человека ), было отмечено, что при температурах отжига

а о

праймеров 50 С - 55 С происходит неспецифический отжиг их и амплификация соответствуижих фрагментов ДНК. Слабые положительные результаты в В-системе дают также Ь. ЫПеха (Ра1ос I) и 1Л111п1 (3055) (таблица 1). При увеличении температуры отжига праймеров до 57°С - 60°С происходила амплификация ДНК только штамма Иобкуа и, но не лептоспир-сапрофитов и зука-риот. Диалогичные данные были ранее получены в отношении Б-системы ( Й.П.Самсонова, 1994).

Таким образом, исходя из полученных нами результатов, для

Таблица 1. РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР С ДНК И ЛИЗАТАМИ ПЕПТОСПИР, ДНК ЭУ-КАРИОТ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ ОТЖИГА ПРАИМЕРОВ.

Температура отжига

О о о О О

Итака 50 С 32С 55С 5 7 С 6 О С

g в ( g + b) g в <G+B> g в (g+b) g в ( g+b) g в ( g+b:

1. м-20 + - + - + - + - + _ + _ + - 4- - + _ + -

2. pga + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

3« Lai + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

4» Nanxi + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

5" Poi + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

6• Dehong + - + . - + - + - + - + - + - + - + - + -

7• Каширский + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

8- Castellon-3 + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

9« Guangdong + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

10- Salinem + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

11. Menglian 5626+ - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

12-Vleermuis 3868* + + + + + + +

13- Akiyami A + - + - + - + - - - - - - - - - - - - -

14- Еж Ml ♦ - + - + - + - - - - - - - - - - - - -

15- Rushan 507 + - ♦ - + - + - - - - - - - - - - - - -

16- Pomona + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

17- Moskva V + + + + + + + + + + + + - + - +* - + - +

18-Lianggtiangl880+ + + + + + + + + + ♦ + - +

19. 3705 + - + - + - + - ♦ - + - + - + - + -

20-Manzhuang A23 + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

21• Longnan LS13 + - + - + - ♦ - + - + - + - + - + - + -

22- HS-26 + + + + + ♦ + +

23- Перепелицын + - + - + - + - ♦ - + - + - + - + - + -

24- Yunnan A10 + - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

25- Hekau H27 + - + - + - + - + - + - + - + - + + -

26-Pt ngchang80412+ - + - + - + - + - + - - - " - - - - -

27- Lichuan L30 + - + - + - + - + - j* - + - + - + - + -

28- Patoc I + + + + + + + + + + + +

29- Байрам Али + - + - + - + - + - + - - - - " - - - -

30. 3055 + + + + + + + + + + +

31 • Phoney parva + - + - + - + - + - + - - - - - - - - -

32-AHK тип- быка + + + + + + + + + + + +

33- ДНК человека + + + + + ♦ + + + + +■

* + - ! реакция идет нестабильно-

обеспечения относительной видоспецифичности £ и В-тест-систем ПЦР, оптимальная температура отжига праймеров лежит в диапазоне

о о

57 С -- 60 С. Поэтому мы рекомендуем проводить все последующие эксперименты по исследовании клинического и патологического материала и объектов окружающей среды (вода,почва) раздельно в G- и В-тест-системах ПЦР при температуре отжига праймеров

о о

58 С — 59 С, так как эта температура лежит в центре упомянутого выже интервала.

Определение чувствительности тест-системы с В-праймерами проводили в опытах с использованием очищенной ДНК определенной концентрации и лизата, содержащего известное число клеток чистой культуры лептоспир втамма Moskva U. Показано, что в описанных выие условиях ПЦР позволяет выявлять от 100 фемтог-раммов до 1 пикограмма ДНК или 100 — 1000 клеток в пробе, что в пересчете на 1 мл соответствует 4000 — 40000 клеткам, так как объем реакционной смеси при постановке ПЦР в наших исследованиях - 25 мкл.

При изучении внутривидовой таксономической специфичности тест-систем ПЦР исследовали 31 музейный итамм патогенных лептоспир L.Interrogans ( в том числе 13, выделенных на территории Китая), в G-, В- и GtB-тест-системах при температурах отжига праймеров, лежащих в интервале 50°С — 80°С.

При исследовании внутривидовой таксономической специфичности G-тест-системы при температурах отжига праймеров в диапа-

з о

зоне 50 С - 52 С наблюдалась амплификация ДНК патогенных леп-

i> о

тоспир всех исследованных референс-жтаммов. При 53 С - 55 С не происходила амплификация ДНК жтаммов Ulee^uis 3888 (серовар cynopteri), Akijam! й (autuanalls) и EI Hoi (bratislava), a

о о

при 5? С - 60 С - также штаммов Moskva U (grippotyphosa) и

HS-26 (d]atzi) (таблица 1). Результаты тестирования всех штаммов этих серогрупп, выделенных на территории Китая, совпадают с таковыми для соответствующих референс-штаммов. При изучении ранее не исследованных штаммов серогрупп Hebdoiadis, Mini и Hanhao положительные результаты ПЦР получены при температуре отжига праймеров в диапазоне 50°С — 60° С. Только у представителей серогруппн йапагиж положительная ПЦР отмечалась

о t

при температуре отжига праймеров в диапазоне 50 С — 55 С, подобно лептоспирам вида Leptospira biflexa.

В наших исследованиях при тестировании лептоспир разных сероваров в пределах одной серогруппн в G-сиетеме (IcterohaeMorrhagiae - Copenhagen!. IcterohaeMorrhagiae, lai, nanxi; Javanlca - poi, dehong: Ва11иш - castellonis. guangdong: Pyrogenes - pyrogenes. Menglian; Australis - bratislava, rushan; Hebdoiadis - lanzhuang, longnan) не наблюдается различий в результатах ПЦР между представителями разных сероваров.

При изучении внутривидовой таксономической специфичности В-тест-системы при температурах отжига праймеров в диапазоне 50° С - 52° С положительные результаты ПЦР отмечались с ДНК референс-штаммов Moskva У (серовар grippctyphosa), Uleenuis 3868 Ccynopteri), HS-26 (djatzi), Lianguang 1880 одноименного серовара, относящихся по классификации Vasuda (1987) к геновиду L.kirschneri. При 53 " С - 55°С не происходила амплификация ДНК штаммов UleerBuis 3868 и HS-26.

При тестировании ДНК лептоспир серовара grippotyphosa в G+B-тест-системе в диапазоне 57°С - 60°С отмечались нечеткие и нестабильные результаты.

Таким образом, в наших исследованиях показано, что при описанных условиях проведения ПЦР, обеспечивающих видоспецифич-

ность, с помочью В-системн можно надежно выявлять только представителей серогруппы Grippotyphosa.

Ранее при использовании РМА с панелями моноклональных антител была установлена антигенная гетерогенность лептоспир серовара grippqtyphosa (Ананьина В.В.,1993). Как уже указывалось, в этиологической структуре лептоспирозов в Китае этот возбудитель занимает важное место. Принимая во внимание вероятность получения различных результатов ПЦР с представителями различных субсероваров, мы исследовали 9 полевых изолятов, выделенных от больных людей в провинции Сычуань Китая, методами РМА с моноклональными антителами и ПЦР.

Полученные результаты представлены в таблице 2.

На основании полученных данных оказалось возможным выделить по крайней мере 2 субсеровара в пределах этой группы «таймов, которые отличались как между собой, так и от референтного ■тамма Moskva U ( не реагирует с мАТ F71 - С19):

1. жтаммы N2 и 4 — не реагируют с мАТ F71 - Сi6 и С19;

2. «таммы N9, 223, 234, 246, 725 — реагирует со всеми мАТ F71, причем практически во всех случаях сохраняется одинаковая пропорциональность между титрами с разными моноклонами.

Во второй группе несколько отличается от других мтамм N9: титр реакции с С2 выже, чем у других втаммов более чем на порядок.

По температурному спектру реакций в В-системе эти итаммы практически не различаются между собой. В то же время втамм N4 отличается от других в реакции в G- и Ё+В-системе:

о

нестабильность реакции с Q-праймерами проявляется уже при 55 С. Что касается жтамма N9. то приходилось вносить в реакционную смесь ПЦР в 2 раза больше клеток культуры по сравнении с куль-

тирами драгих итаммов, чтобы получить такую »е массу продуктоп амплификации. Естественно, из-за отсутствия количественного варианта ПЦР более точные исследования провести не удалось.

Таким образом, различия в антигенной структуре субсерова-ров в пределах серовара дг1рро1ур1юза, проявляющиеся на феноти-пическом уровне и выявляемые в РХА с моноклональными антителами, повидимому, имеют в своей основе различия на уровне генотипов.

Табл. 2. ПРОФИЛЬ МИКРОАГГЛЮТИНАЦИИ ВТАМКОВ ЛЕПТОСПИР СЕРОВАРА бШРРОТУРША, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ БОЛЬНЫХ ЛЕПТОСПИРОЗОМ В КИТАЕ.

Н 0 Н 0 К Л 0 Н А Л Ь 1 Н 8 Е АНТИТЕЛА ? 71

И Т А М И

С2 СЗ С9 С13 С16 С17 ГЛ!

Мозкча и 5120* 640 10240 10240 160 20480

N2 2560 640 10240 81920 — 40960 —

N4 320 640 5120 81920 — 40960 —

Н9 5120 640 10240 81920 640 81920 16

N223 320 160 20480 81920 5120 81920 16

N234 320 1280 5120 81920 1280 40960 16

N246 320 160 5120 81920 2560 40960 16

Н725 320' 320 20480 81920 2560 81920 1С

* — величина, обратная агглютинационному титру.

Оценка диагностической эффективности G- и В-тест-систем ПЦР п очагах лептоспирозов.

Ранее в нашей лаборатории (Самсонова А.П. 1994.) была показана принципиальная возможность применения G-тест-системы ПЦР для экспресс-диагностики лептоспирозов людей как на ранних, так и поздних стадиях заболевания, включая серонегативние сличай. В этой связи на следующем этапе работы мы провели аналогичное изучение В-тест-системы.

Контрольные образцы сывороток крови, не содержащие леп-тоспир, дали в ПЦР В-тест-системе отрицательные результаты. При исследовании модельных образцов, содержачих известное количество клеток культуры лептоспир (итамм Koskva (J амплифициро-ванный фрагмент по размеру соответствовал фрагменту очищенной ДНК штамма Hoskva U.

Согласно результатам, полученным на модельных образцах си-вороток крови с известным числом клеток лептоспир, показатели чувствительности составляли 100 - 1000 клеток в пробе, что соответствует таковой при использовании лизатов чистой культуры. В пересчете на 1 мл ( объем реакционной смеси ПЦР 25 мкл) это

3 *

соответствует 4 X 10 - 4 X 10 клеток, то есть порядку средней концентрации лептоспир в крови больных в период лептоспиремии.

Таким образом, чувствительность разработанной нами В-тест-системы ПЦР теоретически достаточна для проведения индикации лептоспир в. клинических образцах.

Исследования клинических образцов сывороток крови лшдей проводили слепым методом: образцы сывороток крови обозначали определенными номерами без указания сведений о больных (диагноза, даты заболевания и взятия крови ). Сравнение результатов РИА и

ЛЦР осуществляли только после полного окончания исследований (таблица 3).

В I группу были вклвчены сыворотки крови больных с серологически подтвержденным диагнозом "лептоспироз серогруппы Grippotyphosa".

Во II группу вопли сыворотки больных с серологически подтвержденным диагнозом " лептоспироз серогруппы Icterohaeaorrhaglae".

III группу составляли сыворотки, взятые от больных заболеваниями нелептоспирозной этиологии; IU - от здоровых доноров.

Таблица 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ПЦР-АНАЛИЗЙ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ СЫВОРОТОК КРОВИ.

Группа Число исследованных Число и (У.) положительных

результатов ПЦР

больных больных -

&-система В-система

I 26 0 (0,00) 16 (61,54)

II 21 15 (71,43) 0 (0,00)

III 28 0 (0,00) 1 (3,57)

IÜ 18 0 (0,00) 0 (0,00)

- 17 -

Статистическая обработка результатов по методу Х^показала, что между этими группами имеются статистически значимые различия ( Р<0,001): в I группе частота положительных результатов в В-систеые, а во II - в ^-системе ПЦР достоверно выие, чем в остальных группах ( таблица 3).

Таким образом, показана принципиальная возыояность использования Б- и В-тест-систем ПЦР для экспресс-диагностики лептоспирозов. Относительно низкая чувствительность В-систеыы ПЦР объясняется тем, что в данном разделе расчеты производились на основе суммарных данных без учета стадии заболевания.

В июне -июле 1994 г. в Курганской области С Западная Сибирь, Россия) была зарегистрирована вспывка лептоспироза среди людей.

Было госпитализировано 47 больных с клиническим диагнозом "лептоспироз". С 1-го по 19-й день болезни от этих больных получено 67 однократных или 2-3 -кратных проб сывороток крови. Все сыворотки были исследованы в стандартной РМА с панель» ре-ференс-итаммов лептоспир, Байрам-Али-слайд-агглютинационноы тесте (БЙСА) и ПЦР с двумя парами праймеров С и В.

При исследовании 26 сывороток, взятых от 21 больного, во всех 3-х тестах получены отрицательные результаты. Таким образом, клинический диагноз " лептоспироз" в РМА подтвержден только у 28 из 47 (5Ь,32%) исследованных больных,

Я всех 26 больных положительные результаты РМА отмечены с лептоспирами серогруппн Сг1рро1урЬоза в титрах 1:200 - 1:12800. Во всех случаях положительные результаты ПЦР получены только в В-системе, а в Ё-системе отрицательные. Сравнительная эффективность различных методов лабораторной диагностики на разных стадиях заболевания представлена в таблице 4.

- 18 -

Как следует из приведенных данных, в ранние сроки заболевания ( I неделя) показатель чувствительности ПЦР (70,62) значительно превыиаает таковые РМА (35,3%) и БАСА (5,9%). К 3-й неделе по мере образования специфических антител эти различия сглаживаются (соответственно 66,6%, 1002 и 66,6%).

Относительно высокий процент положительных реакций ПЦР на 3-й неделе заболевания можно объяснить тем обстоятельством, что в этот период у части больных этой группы отнималась рецидивная волна, которая, как известно, сопровождается вторичной лептоспереиией.

Табл.4. РЕЗЭЛЬТАТН ИССЛЕДОВАНИЙ СЫВОРОТОК КРОВИ БОЛЫШХ ЛЕПТ0ШР030М 6г!рро1ур1юза НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЙ.

Сроки с Число и (X) исследо- Число и (%) положительных момента ванных сывороток результатов в тестах

заболевания - -

от больных с под-общее твержденным диаг. РИА БАСА ПЦР

I неделя 27 17 (63,0) 6 (35.3) 1 (5,9) 12,(70,6) И неделя 32 18 (56,3) 18 (100,0) 8 (44,4) 5 (27,8) III неделя 8 6 (75.0) 6 (100,0) 4 (66,6) 4 (66,6)

Принципиально важным представляется тот факт, что методом ПЦР можно обнаружить ДНК лептоспир уже на 1 - 3-е сутки заболевания. Следовательно, он может быть использован в целях ранней

диагностики лептоспирозов.

Летом 1994 г. во время вспыжки лептоспироза в провинции Хунань (Китай) было госпитализировано 30 больных с клиническим диагнозом "лептоспироз". От каждого больного получены парные сыворотки крови, взятые в разные периоды заболевания. Все сыворотки исследованы в стандартной РИА с панельв референс-штаммов лептоспир и ПЦР с двумя парами праймеров.

При исследовании 12 сывороток от 6 больных в обоих тестах получены отрицательные результаты. Таким образом, клинический диагноз "лептоспироз" лабораторными методами подтвержден у 24 (802) исследованных больных.

Положительные результаты ПЦР во всех случаях получены только в G-системе, а В-системе - отрицательные. У 3 больных положительные результаты ПЦР были получены при отрицательных результатах РИА. Во всех остальных случаях на поздних стадиях заболевания положительные результаты РЫА были отмечены только с лептоспирами серогруппы Icterohaeaarrohagiae в титрах 1:400 -1:800 (только в 1 случае 1:20++).

На более ранних стадиях заболевания в ряде случаев у больных были также обнаружены антитела к лептоспирам других серогрупп, но в более низких титрах, чем к Icterohaeiaorrohaciae, Canicola - 3 случая, Autumnalis - 1, Sejroe - 1, Manhao - 2, Pyrogenes - 1. У одного больного на II неделе с момента заболевания были обнаружены антитела к лептоспирам серогруппы Ballua в титре 1:20+, а на IU неделе - к лептоспирам серогруппи Icterohaemorrhagiae в титре 1:20++. У одного больного на П неделе с момента заболевания в низких титрах (1:20и ) были обнаружены антитела к лептоспирам серогрупп Javanica, Canicola, liai lui, Australis, Grippotyphosa, a на U неделе результаты РМП

били отрицательны.

Эффективность обоих методов лабораторной диагностики на разных стадиях заболевания представлена в таблице 5.

Таким образом, наибольшая эффективность ПЦР как метода диагностики лептоспироза в очаге 1сЬего1тепоггЬад1ае, как и при лоптоспирозе Сг1рро1урЬойа, отмечается именно на I неделе заАолсвания, в фазе лептоспирении. Вместе с тем, положительные результаты ПЦР (15,47.) получали и при исследовании сывороток больных, взятых в периоде ранней реконвалесценции.

Табл. 5. РЕЗЗЛЬТАТН ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ СЫВОРОТОК

КРОВИ БОЛЬНЫХ ЛЕПТОСПИРОЗОМ 1с1егоЬаевоггЬад1ае НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ.

Сроки с Число и (X) исследо-момента ванных проб заболевания -

Число и (X) положительных

результатов в тестах:

от больных с под-общее твержденным диаг. РКП

ПЦР

I неделя 11 8 (72,7)

II неделя 14 И (78,6)

III неделя 5 5 (100.0)

IV неделя 17 13 (72,2)

и неделя 13 11 (91,7)

0 ( 0.0) 7 (87.5)

9 (Б1.8) 8 (72.7)

5 (100,0) 3 (60,0)

13 (100,0) 2 (15,4)

5 (45.5) 0 ( 0.0)

Полученные данные свидельствует о перспективности использования ПЦР-анализа не только в целях ранней экспресс-диагностики

лептоспирозов, но и для возможных осложнений.

контроля течения инфекции и прогноза

В Н В О Л У

1. На основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) разработаны две высокочувствительные тест-системы (С и В) для индикации патогенных лептоспир (Leptospira interrogans), в том числе серова-ров, имеющих эпидемическое проявление в политипичных очагах лептоспирозов тропической зоны Китая.

2. При постановке ПЦР в интервале температур отжига прай-меров, обеспечивающих видоспецифичность тест-систем ( 57° С —

О

60 С), отмечено явление интерференции G и В-праймеров при их использовании в одной реакционной смеси. На этом основании рекомендовано проводить исследование проб на наличие лептоспир раздельно в G и В-тест-системах.

3. Изучение атаммов лептоспир серовара grippotyphosa, выделенных от больных в провинции Сычуань Китая, в РИА с панелями моноклональных антител, позволило идентифицировать 2 новых субсеровара, которые также различались между собой по температурному спектру реакций в G и (С+В)-тест-системах ПЦР.

4. При испытании разработанных Б и B-тест-систем ПЦР в очагах лептоспирозов с различной этиологической структурой (Grippotyphosa и IcterohaeMorrhagiae) показана более высокая диагностическая эффективность ПЦР-анализа по сравнению с референтным серологическим методом (РИА), особенно на ранних стадиях заболевания. На 1-й неделе показатели чувствительности ПЦР составляли соответственно 70.и 87,5Z, РИА - 35,5% и 0%.

5. Возможность выявления ДНК лептоспир методом ПЦР в крови больных лептоспирозами, начиная с 1-го дня заболевания, а также

в периоды рецидивов и ранней реконвалесценции свидетельствует о перспективности его использования не только в целях ранней зкспресс-диагностики, но и для контроля течения инфекции и прогноза возможных осложнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПЭБШОШШ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ.

1. А.П.Самсонова, Лю Чжун Фу, А.Л.Гинцбург, Ю.В.Ананьина Использование полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике лептоспирозов // Международный симпозиум , посвященный году Пастера, " Идеи Пастера в борьбе с инфекциями ".6-10 июня 19Я5 г., - институт им. Пастера, - Санкт-Петербург. Россия, -с.138.