Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Этиологическая структура лептоспириозной инфекции в Колумбии

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Альсате Лус Энид, Москва

Министерство общего и профессионального образования Российской Федерации Российский Университет дружбы народов

На правах рукописи

АЛЬСАТЕ ЛУС ЭНИД

ЭТИОЛОГИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ЛЕЛТОСПИРОЗНОЙ ИНФЕКЦИИ В КОЛУМБИИ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность: 03.00.07-микробиология Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Волина Е.Г. Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор Никитченко В.Е.

Москва-1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение......................................................................... 4

Глава 1. Обзор литературы.............................................. 9

1.1. Общая характеристика возбудителей лептоспироза... 9

1.2. Лептоспирозная инфекция у сельскохозяйственных животных....................................................... 12

1.3. Методы выявления лептоспирозной инфекции у животных..................................................... 18

1.4. Распространение лептоспироза в странах Латинской

Америки.......................................................... 23

Заключение...................................................... 46

Глава 2. Материалы и методы исследований.......................... 55

2.1. Характеристика исследуемых образцов крови............ 55

2.2. Характеристика штаммов лептоспир, используемых в серологических реакциях, и их культивирование.......... 56

2.3. Схема проведения реакции микроагглютинации......... 59

2.4. Методика определения классов (IgM и 1§0) противолептоспи-розных антител................................................... 60

2.4.1. Техника обработки образцов сывороток крови животных цистеином..................................................... 61

2.5. Схема проведения реакции иммуноабсорбции............ 62

2.6. Математическая обработка результатов..................... 63

Глава 3. Результаты собственных исследований..................... 64

3.1. Характеристика климато-географический условий в Колумбии.......................................................... 64

3.2. Состояние сельского хозяйства и животноводства в

Колумбии............................................................ 74

3.2.1. Основные направления в развитии сельского

хозяйства.......................................................... 74

3.2.2. Состояние животноводства и характеристика ветеринарной службы в Колумбии ............................................. 75

3.3. Культивирование лентоспир в жидкой питательной среде

с гемолизированными эритроцитами крови кроликов...... 78

3.4. Распространенность и этиологическая структура лептоспироза среди крупного рогатого скота в Колумбии................... 86

3.4.1. Обнаружение противолептоспироных антител у КРС в РМА

в разных районах Колумбии.................................... 88

3.4.2. Определение классов Ig M и Ig G противолептоспирозных антител в сыворотках КРС....................................... 93

3.4.3. Результаты иммуноабсорбционного анализа сывороток КРС, положительных на лептоспироз.................................. 101

3.4.4. Этиологическая структура лептоспирозной инфекции КРС

в разных районах Колумбии..................................... 104

3.5. Распространенность и этиологическая структура лептоспирозной инфекции у свиней в Колумбии.......................... 109

3.5.1. Обнаружение противолептоспирозных антител в сыворотках крови свиней...................................................... 109

3.5.2. Этиологическая структура лептоспирозной инфекции у свиней............................................................... 114

Глава 4. Обсуждение результатов............................................. 120

Выводы................................................................... 131

Практические рекомендации........................................ 133

Список литературы................................................... 134

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Страны Латинской Америки и Карибского бассейна являются основными мировыми поставщиками мяса и племенного скота. В связи с этим первостепенными задачами работников биологической науки и практики этого региона являются изучение инфекционных болезней сельскохозяйственных (с/х) животных, в том числе и лептоспироза, сокращение до минимума потерь от этих болезней и, как следствие, увеличение поголовья животных и улучшение его структуры.

Лептоспироз относится к наиболее распространенной инфекции из группы природно-очаговых зоонозов. Он зарегистрирован у диких, сельскохозяйственных и домашних животных почти во всех странах мира, в различных климато-географических условиях. Однако наиболее интенсивные природные очаги этой инфекции расположены в странах тропического пояса - на Африканском континенте, в странах Азии, Латинской Америки и Австралии. (Faine S. 1982., Terpstra W. 1992., Everard С. 1992). Он наносит значительный материальный ущерб народному хозяйству и постоянно угрожает здоровью и жизни людей. Активные исследования на лептоспироз животных в странах Латинской Америки начали проводиться с 50-60-х годов и к настоящему времени накоплен обширный материал по изучению восприимчивости диких и сельскохозяйственных животных, течению и диагностике лептоспирозной инфекции, в изучении свойств возбудителей, особенностям эпизоотического процесса, а в ряде стран и этиологической структуры очагов. Среди лептоспир, циркулирующих на территории региона, обнаружено большинство известных сероваров возбудителя (icterohaemorrhagiae, hebdomadis, sejroe, ротона, canicola, grippotyphosa, ballum, tarassovi и др.). За весь период с начала исследований на лептоспироз и до настоящего времени на этой территории из различных источников (больные люди и животные, лептоспироносители) было впервые выделено 54 новых серовара лептоспир. Лептоспирозная

инфекция обнаружена в Аргентине, Бразилии, Перу, Панаме, Никарагуа, на Кубе и др. государствах. Большой вклад в изучение этой проблемы внесли ученые Латинской Америки: Cacchione R., Cordeiro F., Espino R., Everard C., Gale К., Galton M., Guiteras J., Herrer A., Liceras de Hidalgo., Aguirre M., Mazzonelli J., Noguchi H., Ribeyro E., Savino E., Silva I., Spence L., Sulzer C., Zamora J. и др.

В Колумбии, расположенной на северо-западе Южной Америки, климато-географические условия благоприятны для развития животноводства на естественных пастбищах. Здесь преобладают экстенсивные методы ведения скотоводства, что сопровождается низкой продуктивностью поголовья, широким распространением природно-очаговых болезней, высокой инфицирован-ностью скота. На пастбищах обитают дикие травоядные животные многих видов, способные поддерживать активный эпизоотический процесс, обеспечивающий циркуляцию различных возбудителей, в том числе и лептоспир, в природе. Исследования на лептоспироз в Колумбии стали проводиться недавно. Имеются лишь единичные сообщения о выявлении лептоспирозной инфекции у КРС, собак, грызунов. Отмечены случаи заболевания и среди людей (Manza et al. 1978., Manrique G. 1978., Otte E. et al. 1990 и др.).

Множественность природных хозяев лептоспир и полиэтиологичность лептоспирозной инфекции, вариабельность клинических проявлений, сложность диагностики обусловливают трудности в организации мер по оздоровлению животноводческих хозяйств.

В связи с этим актуальным является активизация исследований на лептоспироз с/х животных в Колумбии для установления распространенности этой инфекции, изучения этиологической структуры и выяснения эпизоотической ситуации. Это важно для разработки мероприятий по профилактике лептоспи-роза с учетом форм ведения животноводства и количества животных, способов лечения инфицированных, мер личной профилактики работающего персонала, а также по предотвращению завоза возбудителей в соседние страны.

Целью исследования явилось выявление распространенности лептос-пирозной инфекции и установление этиологической структуры лептоспироза КРС и свиней в разных животноводческих районах Колумбии на основе обнаружения сывороточных вротиволептоспирозных антител.

Основные задачи исследования:

1,Оценить природно-климатические, ландшафтно-географические условия Колумбии с точки зрения возможности развития эпизоотического процесса по лептоспирозу.

2.Оценить состояние сельского хозяйства и животноводства Колумбии с точки зрения существования полеводческих и животноводческих очагов лептоспироза.

3.Провести серологические исследования на лептоспироз сывороток крови КРС и свиней,полученных из разных животноводческих районов Колумбии.

4.Определить распространенность и интенсивность (напряженность) лептоспирозной инфекции у КРС и свиней в Колумбии.

5.Изучить этиологическую структуру лептоспирозной инфекции у КРС и свиней в Колумбии

6.Разработать способ приготовления высокопродуктивной и экономичной жидкой питательной среды для культивирования эталонных штаммов лешгос-пир, используемых для серологических исследований.

Научная новизна. Впервые в Колумбии проведены комплексные исследования на лептоспироз КРС в шести районах наиболее активного скотоводства, на основании которых представлены сравнительные характеристики по распространению инфекции и активности животноводческих очагов. Установлено, что средние показатели инфицированности КРС составляют 62,5%, а свиней - 26,08%.

По результатам РМА, определения классов противолептоспирозных антител и иммуноабсорбционного анализа, выявлено что этиологическая

структура лептоспироза КРС представлена лептоспирами 14 серологических групп с преобладанием Sejroe (57.5%), Hebdomadis (20.0%) и Grippotyphosa (7.9%). В этиологической структуре лептоспирозной инфекции свиней имеют значение 9 серогрупп лептоспир. Основными этиологически значимыми являются лептоспиры серогрупп Pomona, (22.3%), Ballum (16.65%), Austraiis, Panama, Shermani и Sejroe (11.1% каждая). В ед иничных случаях выявлены антитела против серогрупп Canicola, Cynopteri, Ranarum (по 5.55% против каждой). Установлено, что этиологическая структура лептоспирозной инфекции неоднородна в разных районах страны, что, вероятно отражает разнообразие природ-но- климатических, гидро-географических условий, состояние и особенности ведения животноводства и неоднородный состав представителей дикой фауны, поддерживающей циркуляцию возбудителей в природных очагах.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

1. Разработан новый способ приготовления жидкой питательной среды

с гемолизированной кровью кроликов для культивирования лептоспир. Среда проста и экономична в изготовлении, пригодна для длительного пассирования культур лептоспир.

2. Получены новые данные об экологии лептоспир на территории Южной Америки.

3. Результаты наших исследований будут переданы МСХ и животновод ства Колумбии с целью создания единой национальной программы по изучению возбудителей, диагностики лептоспироза и разработки мер по оздоровлению животноводческих хозяйств в Колумбии.

На защиту выносятся:

1. Новые данные о распространении лептоспирозной инфекции среди КРС и свиней в разных районах Колумбии.

2. Данные об этиологической структуре лептоспирозной инфекции КРС и свиней в Колумбии, полученные на основе анализа обнаружения

противолептоспирозных антител.

Апробация диссертационной работы:

Результаты исследования представлялись для обсуждения на II Международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" 2-4 сентября 1998 года в г. Санкт-Петербурге, на семинарах кафедры микробиология ж отдела микробиологических исследований НИИ общей патологии РУДН (1998г.).

Диссертант стала победителем грантов РУДН 1998 года среди аспирантов сельскохозяйственного факультета РУДН.

Публикации: по теме диссертации опубликовано 4 статьи. Объем и структу ра работы Диссертация изложена на 154 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (4 разделов), главы собственных исследований, описания материалов и методов исследова-ния, результатов исследований, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 217 источников (63 из них на русском языке). Работа иллюстрирована 7 рисунками и 22 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЛЕПТОСПИРОЗА.

Лептоепиры, получившие свое название (leptos-тонкий, spira-сшфаль) из-за морфофизиологических особенностей (166), были обнаружены в крови больных людей и животных (134, 202), а так же выделены из воды открытых водоемов (207).

В 1983г. Международный подкомитет по таксономии лептоспир выделил эти спирохеты в самостоятельное семейство Leptospiraceae в подотряд Spiro-chaetalis, В него включен род Leptospira, объединяющий 2 вида: L. mterrogans-naToreHHbie лептоепиры и L. ЫЛеха-сапрофитные.

Вид патогенных лептоспир в настоящее время включает 202 серовара, которые по степени антигенного родства объединены в 23 серологические группы (141). Вид сапрофитных лептоспир состоит из 63 сероваров и 23 серо» логических групп. Штаммы L. ЬШеха свободноживущие и мотуг быть обнаружены в почве, особенно влажной, поверхностных слоях открытых водоемов, водопроводной воде. Их часто называют водными легггоспирами. Они не вызывают заболевании человека и животных, авирулентны для лабораторных моделей животных.

Дифференциация видов лептоспир основывается на различиях в структуре, биологических и серологических характеристиках.

Морфологически виды лептоспир не отличаются друг от друга. При темнояольной микроскопии они имеют вид тонких светлых нитей с загнушш концами в виде крючков, которые придают им форму буквы « С » или «S ». Известны одно- и бескрючковые формы. Они находятся в постоянном движении.

Лептоепиры- грамотрицательные спирохеты, длиной 7-14 мкм, толщиной

0,1- 0,15мкм, не образуют спор и капсул, плохо окрашиваются анилиновыми красителями.

При электронной микроскопии выделяют 3 основных структурных элемента: осевую нить (аксистидь), цитоплазматический цилиндр и наружную мембрану.

Осевая нить шириной 0,02 мкм имеет двунитчатое строение (28). € цитоллазматическим цилиндром она связана дисковидными структурами, напоминающими блефаропласт (1).

Каждая клетка имеет 2 осевые ниш, фиксированные на противоположных концах клетки, в средней части цилиндра осевая нить не выявляется. На поперечных срезах видно, что она состоит из 12-14 микрофибрилл. (26). Осевая нить, вероятно, выполняет локомоторную функцию.

Вокруг нее винтообразно закручен цитоплазматический цилиндр, образующий 12-18 мелких первичных завитков. Он имеет трехслойную мембрану и покрыт микрофибриллами.

Цитоплазматический цилиндр (Ц П Ц) имеет мелкогранулярное внутреннее содержимое, в котором находятся ядерный аппарат, рибосомы, мезосомы, включения полисахаридной и полифосфатной природы. На поверхности этого цилиндра выявлены кольцевидные образования шириной 150-200 А (26,28). Внутри и вне цитоплазматического цилиндра описаны особые гранулярные образования (шары, вздутия, гранулы, споры, цистоподобные образования и др.), функция и причины их образования не выяснены.

Наружная мембрана (покров) окружает осевую нить и ЦПЦ, является структурой липопротеидной природы.

Лептоспиры относятся к микроорганизмам с замедленным временем генерации. Латентная фаза размножения составляет 3-5 дней, средняя продолжительность генерации 8-Юч (27). Размножение лептоспир происходит в 16 и более раз медленнее, чем бактерий (11).

Потребности в питательных веществах у лептоспир являются уникальными. Для их нормального развития и размножения необходимы белки, липиды, минеральные соли, незначительное количество углеводов и специальные стимуляторы («факторы роста»). Основными источниками энергии и углерода для них являются липиды и жирные кислоты с длиной цепи в 14-18 углеродных атомов(20, 39, 105). «Факторами роста» являются витамины группы В, биотип, фолиевая кислота, водные вытяжки из пекарских дрожжей, NaPHK и др. (31,189).

Данные о метаболизме лептоспир используются при конструировании питательных сред. Культивируют их в основном в жидких питательных ередах-сывороточных, (51, 77), альбуминовых, содержащих различные фракции альбуминов сыворотки крови (20, 48) и бессывороточных (95,206). Используют также полужидкие (106) и плотные питательные среды (17,24,49,75).

Главным критерием для разграничения патогенных и сапрофитных видов лептоспир является признак патогенности. Основными показателями патогенности у лептоспир являются: вирулентность, способность выживать в организме инфицированных животных и оказывать цитопатический эффект на культуры клеток (5, 29, 40, 44, 129). К факторам патогенности относят эндотоксины (37, 132), гемолизин (4, 94), фибринолизин и гогазмокоагулазу (23), липиды и ферменты липидного обмена, (9,16, 48), DHK-азу и РНК-азу (46), резистентность к действию системы комплемента (7).

Лептоспиры обладают сложной и многообразной антигенной структурой, что выражается в наличии у них большого количества сероваров.

Наиболее глубоко изучены агглютиногены лептоспир, сложность и богатство детерминантных групп которых явилось основой для разработки серологической классификации лептоспир.

Первоначально для этих целей использовали реакцию микроагглюти-

нации (PMA) (154) и иммуноабсорбциоиаый анализ (60). Первая серологическая классификация патогенных лептоспир, основанная на их антигенных различиях, была предложена в 1951г. Wolff, S и Broom J. (1953). Было введено понятие серотип (сейчас серовар), как наиболее межой таксономической единицы в классификации лептоспир. (79). Два или более сероваров, имеющих значительное родство в РМА, объединены в серологическую грушу. Общее количество серогрупп и сероваров лептоспир непрерывно увеличивается.

�