Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического полиморфизма и экспрессия в Escherichia coli гена стерол-14 α-деметилазы Mycobacterium tuberculosis

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шавкунов, Александр Сергеевич

Список сокращений.

Введение.б

Глава I. Обзор литературы.

1.1. Цитохромы Р4 50.

1.1.1. Общая характеристика цитохромов Р450 (CYP).

1.1.2. Физические свойства.

1.1.3. Характерные особенности пространственного строения Р450.

1.1.4. Механизм реакций, катализируемых Р450.

1.2. Характеристика семейства стерол-14а-деметилаз (CYP51).

1.2.1. Биологическое значение.

1.2.2. Эволюция семейства CYP51.

1.2.3. Особенности субстратной специфичности CYP из разных организмов.

1.2.4. Механизм функционирования CYP51.

1.2.5. Стерол-14а-деметилаза М. tuberculosis.

1.2.5.1. Общая характеристика.

1.2.5.2. Субстратная специфичность.

1.2.5.3. Пространственное строение молекулы МТ CYP51.

1.2.6. Азоловые ингибиторы CYP51.

Глава II. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.1.1. Бактериальные штаммы и клинические изоляты.

2.1.2. Плазмидные векторы.

2.1.3. Ферменты и другие реактивы.

2.2. Методы.

2.2.1. Выделение геномной ДНК М. tuberculosis.

2.2.2. Получение радиоактивно меченных олигодезоксинуклеотидов.

2.2.3. Полимеразная цепная реакция.

2.2.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.2.5. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP).

2.2.6. Выделение целевых фрагментов ДНК из агарозного геля.

2.2.7. Гидролиз ДНК специфическими рестрикционными эндодезоксирибонуклеазами (рестрикция).

2.2.8. Лигирование фрагментов ДНК.

2.2.9. Трансформация клеток E.coli.

2.2.10. Выделение небольших количеств плазмидной ДНК.

2.2.11. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.2.12. Определение нуклеотидной последовательности ДНК.

2.2.13. Экспрессия белка МТ CYP51 в клетках E.coli.

2.2.14. Денатурирующий электофорез белков в полиакриламидном геле.

2.2.15. Масс-спектрометрический анализ рекомбинантного белка МТ CYP51.

2.2.16. Выделение рекомбинантного МТ CYP из клеток Е. coli.

2.2.17. Определение содержания СО-восстановленной формы CYP51MT методом сканирующей спектрофотометрии.

2.2.18. Определение константы связывания МТ СУР51 с лигандами методом сканирующей спектрофотометрии.

Глава III. Результаты исследования и их обсуждение.

3.1. Изучение генетического полиморфизма CYP51 в клинических изолятах М. tuberculosis.

3.2. Клонирование и экспрессия МТ CYP51 в E.coli.

3.3. Взаимодействие МТ CYP51 с азолами.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетического полиморфизма и экспрессия в Escherichia coli гена стерол-14 α-деметилазы Mycobacterium tuberculosis"

Актуальность проблемы;

К началу 60-х годов сложилось представление о туберкулезе как об исчезающем заболевании. Однако, этот прогноз не оправдался. По данным ВОЗ, в настоящее время туберкулез лидирует в качестве фактора смертности от инфекционных заболеваний среди взрослого населения в мировом масштабе. По наиболее благоприятным прогнозам, в ближайшее десятилетие ожидается по меньшей мере 80 миллионов новых случаев заболевания туберкулезом, из них около 20 миллионов - со смертельным исходом. При этом значительная доля заболевших оказывается инфицированной антибиотикорезистентными штаммами Mycobacterium tuberculosis, обладающими устойчивостью по отношению к традиционно используемым препаратам.

Современная химиотерапия туберкулеза, как правило, преполагает использование комбинаций из нескольких препаратов основной группы, в число которых входят изониазид и рифампицин; однако, даже комбинации традиционных препаратов не могут гарантировать успешность лечения, поскольку все чаще встречаются инфекции, вызванные мультирезистентными штаммами М. tuberculosis, обладающими устойчивостью к нескольким, а иногда и сразу ко всем препаратам основной группы. Альтернативные курсы химиотерапии могут включать фторхинолоны (ципрофлоксацин, офлоксацин), аминогликозиды, олигопептиды (капреомицин), циклосерин, тиоацетазон, парааминосалициловую кислоту; их использование по большей части дорого, кроме того, многие из них обладают выраженными побочными эффектами.

До последнего времени поиск антимикобактериальных препаратов велся главным образом эмпирически. Однако расшифровка генома ряда штаммов Mycobacterium tuberculosis (H37Rv, CDC1551) открывает принципиально новые возможности рациональной разработки новых веществ с противотуберкулезной активностью на основании информации о первичной структуре генов предполагаемых мишеней для лекарственной терапии. Как правило, поиск и отбор таких генов ведется по наличию гомологии с уже изученными генами других организмов, связанными с выполнением жизненно необходимых функций. В частности, в качестве потенциальной мишени для противотуберкулезных препаратов нового поколения рассматривается белок, кодируемый геном Rv0764 М. tuberculosis, стерол-14а-деметилаза (CYP51) из надсемейства цитохромов Р450. Ген стерол-14а-деметилазы был обнаружен в 1997 году при анализе генома штамма H37Rv. У эукариот стерол-14а-деметилаза выполняет жизненно важные функции, принимая участие в биосинтезе холестерина клеточной мембраны, а также некоторых регуляторных стероидов. Ингибиторы стерол-14а-деметилазы из группы азолов широко используются в клинической практике для лечения грибковых инфекций; при этом было показано, что некоторые мутации в гене CYP51 обеспечивают резистентность патогенных грибков к азолам.

Показано, что белковый продукт гена Rv0764 М. tuberculosis обладает спектром поглощения, характерным для цитохромов Р4 50, способен осуществлять деметилирование субстратов СУР51-деметилаз эукариот в положении 14а и ингибируется при связывании азолов; таким образом, продукт гена Rv07 64 действительно является стерол-14а-деметилазой CYP51 (МТ CYP51). Кроме того, продемонстрировано наличие антимикобактериальной бактериостатической и бактерицидной) активности ряда азолов in vitro. Таким образом, стерол-14а-деметилазу М. tuberculosis можно рассматривать как перспективную мишень для новых противотуберкулезных препаратов.

Целью настоящей работы было исследование полиморфизма гена стерол-14а-деметилазы (CYP51) в клинических изолятах Mycobacterium tuberculosis, получение функционально активного белкового продукта и изучение его физико-химических свойств.

Для достижения поставленной цели предполагалось решение следующих задач:

1) Изучить наличие аллельных вариантов гена CYP51 в клинических изолятах М. tuberculosus.

2) Выявить точечные нуклеотидные замены в гене CYP51. М. tuberculosis путем клонирования и секвенирования его аллельных вариантов, полученных из разных клинических изолятов.

3) Клонировать кодирующую последовательность МТ CYP51 в экспрессирующий плазмидный вектор.

4) Экспрессировать ген CYP51 М. tuberculosis в Escherichia coli и выделить функционально активный белок.

5) Изучить взаимодействие стерол-14а-деметилазы CYP51 М. tuberculosis со специфическими ингибиторами из группы азолов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шавкунов, Александр Сергеевич

выводы

1. Изучен полиморфизм гена МТ CYP51 у 64 клинических изолятов М. tuberculosus, устойчивых к действию противотуберкулезных препаратов. В кодирующей последовательности гена не обнаружено значащих нуклеотидных замен. У 10 изолятов обнаружена незначащая нуклеотидная замена 114 GCT-»GCC.

2. Клонирована полноразмерная кодирующая последовательность гена МТ CYP51. Получен рекомбинантный плазмидный вектор рЕТ15/сур51 для гетерологичной экспрессии гена МТ CYP51 в Е. coli.

3. Подобраны и оптимизированы условия получения рекомбинантного белка МТ CYP51 в Е. coli, процедура его выделения и очистки. Выход нативного рекомбинантного МТ CYP51 составил 1-1,5 мкмоль на 1 л культуры Е. coli.

4. Изучено сродство МТ CYP51 к 4 селективным ингибиторам из группы азолов, для трех из них впервые определена константа диссоциации. Константа диссоциации комплекса МТ CYP51 с кетоконазолом составила 7,7 мкМ, с итраконазолом -12 нМ, с доконазолом - 160 нМ, м парконазолом - 18 нМ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование белка CYP51 М. tuberculosis и кодирующего его гена Rv0764c имеет важное практическое значение. Интерес к МТ CYP51 прежде всего связан с разработкой новых противотуберкулезных препаратов, подавляющих его функцию. До настоящего времени оставался неизученным вопрос о степени генетической изменчивости CYP51 у клинических штаммов М. tuberculosis, напрямую связанный с оценкой вероятности развития резистентности к разрабатываемым препаратом. Нами было впервые показано, что последовательность гена CYP51 у клинических штаммов является высококонсервативной. Это служит серьезным аргументом для использования CYP51 как молекулярной мишени в противотуберкулезной терапии. Обнаруженный нами полиморфизм в кодирующей последовательности гена может найти применение в качестве маркера в популяционно-генетических и эпидемиологических исследованиях возбудителя туберкулеза. Созданная нами эффективная система гетерологичной экспрессии CYP51 МТ позволяет получать значительные количества высокоочищенного рекомбинантного белка, который может использоваться для быстрого и дешевого первичного скрининга антимикобактериальных препаратов на основе азолов и других специфических ингибиторов CYP51, что было показано нами на примере кетоконазола. Мы полагаем, что необходимо дальнейшее изучение структурно-функциональной организации МТ CYP51, в особенности в сравнении с его человеческим гомологом, с целью обеспечения необходимой селективности новых противотуберкулезных препаратов и сведения к минимуму возможных побочных эффектов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шавкунов, Александр Сергеевич, Москва

1. Арчаков А.И., Карузина И. И. Цитохром Р-4 50 // Белки и пептиды. Под ред. Иванова В. Т., Липкина В.М. В 2 т. -М.:Наука, 1995. Т.1.- Стр. 95-102.

2. Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. Холестериноз. М.: Медицина, 1983. - 352 с.

3. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., "Мир", 1984.

4. Финкельштейн А.В., Птицын О. Б. Физика белка. М. : Книжный дом «Университет», 2002. - 376 с.

5. Aoyama Y, Yoshida Y. The 14a-demethylation of lanosterol by a reconstituted cytochrome P-450 system from yeast microsomes // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1978, vol.85 (1), pp. 28-34.

6. Aoyama Y, Okikawa T, Yoshida Y. Evidence for the presence of cytochrome P-450 functional in lanosterol 14a-demethylation in microsomes of aerobically grown respiring yeast // Biochim. Biophys. Acta, 1981, vol. 665 (3), pp. 596-601.

7. Aoyama Y., Yoshida Y., Sato R. Yeast Cytochrome P-450 Catalyzing Lanosterol 14a-Demethylation. II. Lanosterol metabolism by purified P-450i4DM and by intact microsomes // J. Biol. Chem., 1984, vol. 259 (3), pp. 1661-1666.

8. Aoyama Y., Yoshida Y., Sonoda Y., Sato Y. Role of the 8-double bond of lanosterol in the enzyme-substrate interaction of cytochrome P-450(14DM) (lanosterol 14a-demethylase) // Biochim. Biophys. Acta, 1989a, vol. 1001 (2), pp. 196-200.

9. Aoyama Y, Yoshida Y, Sonoda Y, Sato Y. The 3-hydroxy group of lanosterol is essential for orienting the substrate site of cytochrome P-450(14DM) (lanosterol 14a-demethylase) // Biochim. Biophy.s Acta, 1989c, vol. 1006 (2), pp.209-213.

10. Aoyama Y, Yoshida Y, Sonoda Y, Sato Y. Structural analysis of the interaction between the side-chain of substrates and the active site of lanosterol 14a-demethylase (P-450(14)DM) of yeast // Biochim. Biophys. Acta, 1992b, Vol. 1122 (3), pp. 251-255.

11. Aoyama Y., Funae Y., Noshiro M. , Horiuchi T., Yoshida Y. Occurrence of a P450 showing high homology to yeast lanosterol 14-demethylase (P450 14DM) in the rat liver // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, vol. 201 (3), pp.1320-1326.

12. Aoyama Y, Noshiro M, Gotoh 0, Imaoka S, Funae Y, Kurosawa N, Horiuchi T, Yoshida Y. Sterol 14-demethylase P450 (P45014DM*) is one of the most ancient and conserved P450 species // J. Biochem. (Tokyo), 1996, vol. 119 (5), pp. 926-933.

13. Aoyama Y., Horiuchi T., Gotoh 0., Noshiro M., Yoshida Y. CYP51-Like Gene of Mycobacterium tuberculosis Actually Encodes a P450 Similar to Eukaryotic CYP51 // J. Biochem. (Tokyo), 1998, vol. 124, pp. 694-696.

14. Aoyama Y., Kudo M., Asai K., Okonogi K. , Horiuchi T. , Gotoh 0., Yoshida Y. Emergence of Fluconazole-Resistant

15. Sterol 14-Demethylase P450 (CYP51) in Candida albicans Is a Model Demonstrating the Diversification Mechanism of P4 50 // Archives of Biochemistry and Biophysics,. 2000, vol. 379 (1), pp. 170-171.

16. Barnes H.J., Arlotto M.P., Waterman M.R. Expression and enzymatic activity of recombinant cytochrome P450 17a-hydroxylase in Escherichia coli // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, vol. 88, pp. 5597-5601.

17. Barnes H.J. Maximizing Expression of Eucaryotic Cytochrome P450s in Escherichia coli // Methods in Enzimology, vol.272. N.Y., Academic Press, 1996. - pp. 314.

18. Barry C.E. Ill, Slayden R.A., Sampson A.E., Lee R.E. Use of Genomics and Combinatorial Chemistry in the Development of New Antimycobacterial Drugs// Biochem Pharmacol., 2000, vol. 59, pp. 221-231.

19. Bellamine A., Mangla A.T., Nes W.D., Waterman M.R. Characterization and catalytic properties of the sterol 14a-demethylase from Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, vol. 96, pp. 8937-8942.

20. Black S.D., Martin S.T. Evidence for conformational dynamics and molecular aggregation in cytochrome P450 102 (BM-3) // Biochemistry, 1994, vol. 33, pp. 12056-12062.

21. Bok, R. A., Small, E. J. The treatment of advanced prostate cancer with ketoconazole: safety issues // Drug Saf., 1999, vol. 20, pp. 451-458.

22. Byskov A.G., Andersen C.Y., Nordholm L., Thogersen H., Xia G., Wassmann 0., Andersen J.V., Guddal E., Roed T. Chemical structure of sterols that activate oocyte meiosis // Nature, 1995, vol. 374, pp. 559-562.

23. Byskov A.G., Baltsen M., Andersen C.Y. Meiosis-activating sterols: background, discovery, and possible use // J. Mol. Med., 1998, vol. 76, pp. 818-823.

24. Byskov AG, Andersen CY, Leonardsen L. Role of meiosis activating sterols, MAS, in induced oocyte maturation // Mol. Cell. Endocrinol., 2002, vol. 187, pp. 189-196.

25. Chappie C. Molecular-genetic analysis of plant cytochrome P4 50-dependent monooxygenases // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 1998, vol. 49, pp. 311343.

26. Chen C.D., Kemper B. Different Structural Requirements at Specific Proline Residue Positions in the Conserved Proline-rich Region of Cytochrome P450 2C2 // J. Biol. Chem., 1996, vol. 271 (45), pp. 28607-28611.

27. Coon M.J. Enzyme ingenuity in biological oxidations: a trail leading to cytochrome P450 // J. Biol. Chem., 2002, vol. 277 (32), pp. 28351-28363.

28. Davydov D.R., Petushkova N.A. , Archakov A.I., Hui Bon Hoa G. Stabilization of P450 2B4 by Its Association with P450 1A2 Revealed by High-Pressure Spectroscopy // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, vol. 276, pp. 1005-1012.

29. Degtyarenko K.N. Structural domains of P450-containing monooxygenase systems // Protein Eng., 1995, Vol. 8 (8), pp. 737-747.

30. Degtyarenko K.N., Kulikova T.A. Evolution of bioinorganic motifs in P450—containing systems // Biochem Soc Trans., 2001, vol. 29 (p. 2), pp. 139-147.

31. Dismukes W.E. Introduction to Antifungal Drugs // Clin. Infect. Dis., 2000, vol. 30, pp. 653-657.

32. Draper P. The outer parts of the mycobacterial envelope as permeability barriers // Front. Biosci., 1998, vol. 3, dl253-1261.

33. Forgue-Lafitte M.E., Coudray A.M., Fagot D., Mester J. Effects of ketoconazole on the proliferation and cell cycle of human cancer cell lines // Cancer Res., 1992, vol. 52 (24), pp. 6827-6831.

34. Geber A., Hitchcock C.A., Swartz J.E., Pullen F.S., Marsden K.E., Kwon-Chung K.J., Bennett J.E. Deletion of the Candida glabrata ERG3 and ERG11 Genes: Effect on Cell

35. Viability, Cell Growth, Sterol Composition, and Antifungal Susceptibility // Antimicrob,, Agents Chemother., 1995, vol. 39(12), p. 2708-2717„

36. Georgopapadakou N. H., Dix B. A., Smith S. A., Freudenberger J., Funke P. T. Effect of antifungal agents on lipid biosynthesis and membrane integrity in Candida albicans // Antimicrob. Agents Chemother., 1987, vol. 31, pp. 46-51.

37. Georgopapadakou N.H., Walsh T.J. Antifungal Agents: Chemotherapeutic Targets and Immunologic Strategies / / Antimicrob. Agents Chemother., 1996, vol. 40 (2), pp. 279291.

38. Ghannoum M.A., Rice L.B. Antifungal Agents: Mode of Action, Mechanisms of Resistance, and Correlation of These Mechanisms with Bacterial Resistance // Clin. Microbiol. Rev., 1999, Vol. 12 (4), pp. 501-517.

39. Goad L.J., Berens R.L., Marr J.J., Beach D.H., Holz G.G. Jr. The activity of ketoconazole and other azoles against Trypanosoma cruzi: biochemistry and chemotherapeutic action in vitro // Mol. Biochem. Parasitol., 1989, vol. 32 (2-3), pp. 179-189.

40. Gotoh 0. Substrate Recognition Sites in Cytochrome P450 Family 2 (CYPB) Proteins Inferred from Comparative Analyses of Amino Acid and Coding Nucleotide Sequences // J. Biol. Chem., 1992, vol. 267 (1), pp. 83-90.

41. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids // Journ. Mol. Biol., 1983, v. 166, pp. -557-580.

42. Hasegawa M, Hashimoto T, Adachi J, Iwabe N, Miyata T. Early branchings in the evolution of eukaryotes: ancient divergence of entamoeba that lacks mitochondria revealed by protein sequence data // J. Mol. Evol., 1993, vol. 36(4), pp. 380-388.

43. Hitchcock C.A., Dickinson K. , Brown S.B., Evans E.G., Adams D.J. Interaction of azole antifungal antibiotics with cytochrome P-450-dependent 14 alpha-sterol demethylase purified from Candida albicans // Biochem. J., 1990, vol. 266(2), pp.475-480.

44. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal. Biochem., 1981, vol. 114, p. 193.

45. Itoh A., Vick B.A. The purification and characterization of fatty acid hydroperoxide lyase in sunflower // Biochim. Biophys. Acta, 1999, vol. 1436 (3), pp. 531-540.

46. Jackson C.J., Lamb D.C., Kelly D.E., Kelly S.L. Bactericidal and inhibitory effects of azole antifungal compounds on Mycobacterium smegmatis // FEMS Microbiol. Lett., 2000, 192, pp. 159-162.

47. Jackson C.J., Lamb D.C., Marczylo T.H., Parker J.E., Manning N.L., Kelly D.E., Kelly S.L. Conservation and cloning of CYP51: a sterol 14a-demethylase from Mycobacterium smegmatis // Biochem. Biophys. Res. Commun.,2003, vol. 301, pp. 558-563.

48. Jarlier V., Nikaido H. Mycobacterial cell walls: structure and role in natural resistance to antibiotics // FEMS Microbiol. Lett., 1994, vol. 123, pp. 11-18.

49. Jefcoate CR, Gaylor JL, Calabrese RL. Ligand interactions with cytochrome P-450. I. Binding of primary amines // Biochemistry, 1969, vol. 8 (8), pp. 3455-3463.

50. Jeng M. R., Feusner J. Itraconazole-enhanced vincristine neurotoxicity in a child with acute lymphoblastic leukemia // Pediatr. Hematol. Oncol., 2001, vol. 18, 137-142.

51. Ji H., Zhang W., Zhou Y., Zhang M. , Zhu J., Song Y., Lu J., Zhu J. A Three-Dimensional Model of Lanosterol 14a-Demethylase of Candida albicans and Its Interaction with Azole Antifungals // J. Med. Chem. , 2000, vol. 43, pp. 2493-2505.

52. Joseph-Horne T., Manning N.J., Hollomon D., Kelly S.L. Defective sterol A5(6)-desaturase as a cause of azole resistance in Ustilago maydis // FEMS Microbiol. Lett., 1995, vol. 127 (1-2), pp. 29-34.

53. Joubert B.M., Nguyen L.N., Matsuda S.P., Buckner F.S. Cloning and functional characterization of a Trypanosoma brucei lanosterol 14a-demethylase gene // Mol. Biochem. Parasitol., 2001, vol. 117 (1), pp. 115-117.

54. Kauffman C. A., Hedderwick S. A. Treatment of systemic fungal infections in older patients: achieving optimal outcomes // Drugs Aging 2001, vol. 18, pp. 313-323.

55. Kelly S.L., Lamb D.C., Baldwin B.C., Kelly D.E. Benzo(a)pyrene Hydroxylase activity in yeast is mediated by P450 other than sterol 14a-demethylase // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, vol. 197 (2), pp. 428-432.

56. Kojima M., Morozumi T., Onishi A., Mitsuhashi T. Structure of the Pig Sterol 14a-Demethylase (CYP51) Gene and Its Expression in the Testis and Other Tissues // J. Biochem., 2000, vol. 127, pp. 805-811.

57. Kusano K., Kagawa N., Sakaguchi M., Omura T., Waterman M.R. Importance of a Proline-Rich Sequence in the Amino-Terminal Region for Correct Folding of Mitochondrial and Soluble Microbial P450s // J. Biochem., 2001, vol. 129, pp. 271-277.

58. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature, 1970, vol. 227, pp. 680-685.

59. Lai MH, Kirsch DR. Nucleotide sequence of cytochrome P450 LIAI (lanosterol 14a-demethylase) from Candida albicans // Nucleic Acids Res., 1989, vol. 17 (2), p. 804.

60. Lamb D.C., Kelly D.E., Baldwin B.C., Gozzo F., Boscott P., Richards W.G., Kelly S.L. Differential inhibition of Candida albicans CYP51 with azole antifungal stereoizomers // FEMS Microbiol. Lett., 1997a, vol. 149, pp. 25-30.

61. Lamb D.C., Kelly D.E., Kelly S.L. Molecular diversity of sterol 14a-demethylase substrates in plants, fungi and humans // FEBS Lett., 1998a, vol. 425, pp. 263-265.

62. Lamb D.C., Kelly D.E., Manning N.J., Kelly S.L. A sterol biosynthetic pathway in Mycobacterium // FEBS Lett., 1998b, vol. 437, pp. 142-144.

63. Lamb D.C., Cannieux M. , Warrilow A.G.S., Bäk S., Kahn R.A., Manning N.J., Kelly D.E., Kelly S.L. Plant sterol 14a-demethylase affinity for azole fungicides // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2001, vol. 284, pp. 845-849.

64. Lamb D.C., Kaderbhai N.N., Venkateswarlu K., Kelly D.E., Kelly S.L., Kaderbhai M. A. Human sterol 14ademethylase activity is enhanced by the membrane-bound state of cytochrome b5 // Arch. Biochem. Biophys., 2001, vol. 395 (1), pp. 78-84.

65. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant dna joining reactions. // J. Mol. Biol., 1985, vol. 181, pp. 297-312.

66. Lu Z., Xia G., Byskov A.G., Andersen C.Y. Effects of amphotericin B and ketoconazole on mouse oocyte maturation: implications on the role of meiosis-activating sterol // Mol. Cell. Endocrinol., 2000, vol. 164 (1-2), pp. 191-196.

67. Macchiarulo A., Costantino G. , Fringuelli D., Vecchiarelli A., Schiaffella F., Fringuelli R. 1,4-Benzothiazine and 1,4-Benzoxazine Imidazole Derivatives with Antifungal Activity: A Docking Study // Bioorg. Med. Chem., 2002, vol. 10, pp. 3415-3423.

68. Manavathu E.K., Cutright J.L., Chandrasekar P.H. Organism-Dependent Fungicidal Activities of Azoles // Antimicrob. Agents Chemother., 1998, Vol. 42 (11), pp. 3018-3021.

69. Martinez-Botas J., Suarez Y., Ferruelo A.J., Gomez-Coronado D., Lasuncion M.A. Cholesterol starvation decreases P34cdc2 kinase activity and arrests the cell cycle at G2 // FASEB J., 1999, vol. 13, pp. 1359-1370.

70. Myasoedova K. N. Cytochrome P450 1A2 : Oligomers in Proteoliposomes // Biochemistry (Moscow), 2000, vol. 65 (2), pp. 186-225.

71. Nair D. R., Morris H. H. Potential fluconazole-induced carbamazepine toxicity // Ann. Pharmacother. 1999, vol. 33, 790-792.

72. Neely M.N., Ghannoum M.A. The Exciting Future of Antifungal Therapy // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 2000, vol. 19, pp. 897-914.

73. Nelson D.R. Cytochrome P450 and the individuality of species // Arch. Biochem. Biophys., 1999, vol. 369 (1), pp. 1-10.

74. Nés D.W., Janssen G.G., Crumley F.G., Kalinowska M., Akihisa T. The structural requirements of sterols for membrane function in Saccharomyces cerevisiae // Arch. Biochem. Biophys., 1993, Vol. 300 (2), pp. 724-733.

75. Nitahara Y., Aoyama Y., Horiuchi T., Noshiro M., Yoshida Y. Purification and Characterization of Rat Sterol 14-Demethylase P450 (CYP51) Expressed in Escherichia coli // J. Biochem., 1999, vol. 126, pp. 927-933.

76. Omura T., Sato R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature // J. Biol. Chem., 1964, vol. 239, pp.2370-2378.

77. Omura T. Forty Years of Cytochrome P450 // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1999, vol. 266, pp. 690-698.

78. Orita M., Suzuki Y., Sekiya T., Hayashi K. Rapid and Sensitive Detection of Point Mutations and DNA

79. Polymorphisms Using the Polymerase Chain Reaction / / Genomics, 1989, vol. 5, pp. 874-879.

80. Pikuleva I.A., Bjorkhem I., Waterman M.R. Expression, Purification, and Enzymatic Properties of Recombinant Human Cytochrome P450c27 (CYP27) // Arch. Biochem. Biophys., 1997, vol. 343 (1), pp. 123-130.

81. Podust L.M., Poulos T.L., Waterman M.R. Crystal structure of cytochrome P450 14a-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with azole inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2001, vol. 98 (6), pp. 3068-3073.

82. Pont A., Graybill J.R., Craven P.C., Galgiani J.N., Dismukes W.E., Reitz R.E. High dose ketokonazole therapy and adrenal and testicular function in humans // Arch. Int. Med., 1984, vol. 144, pp. 2150-2153.

83. Poulos T.L., Finzel B.C., Gunsalusll I.C., Wagner G.C., Kraut J. The 2.6-A Crystal Structure of Pseudomonas putida Cytochrome P-450 // J. Biol. Chem., 1985, vol. 260 (30), pp. 16122-16130.

84. Rex, J. H., Pfaller M. A., Galgiani J. N., Bartlett M. S., Espinel-Ingroff A., Ghannoum M. A., Lancaster M., Odds

85. Rozman D., Waterman M.R. Lanosterol 14a-demethylase (CYP51) and spermatogenesis // Drug Metab. Dis., vol. 2 6 (12), pp. 1199-1201.

86. Rushe J., Howard-Flanders P. Hexamine cobalt chloride promotes intermolecular ligation of blunt end dna fragments by T4 DNA ligase. // Nucl. Acids Res., 1985, vol. 13, pp. 1997-2008.

87. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, vol.74, pp. 5463-5467.

88. Sanglard D. Clinical relevance of mechanisms of antifungal drug resistance in yeasts // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin., 2002, vol. 20 (9), pp. 462-470.

89. Saribas A.S., Gruenke L. , Waskell L. Overexpression and Purification of the Membrane-Bound Cytochrome P450 2B4 // Protein Expr. Purif., 2001, vol. 21, pp. 303-309.

90. Sheehan D.J., Hitchcock C.A., Sibley C.M. Current and Emerging Azole Antifungal Agents // Clin. Microbiol. Rev., 1999, vol. 12 (1), p. 40-79.

91. Stromstedt M., Rozman D., Waterman M.R. The Ubiquitously Expressed Human CYP51 Encodes Lanosterol 14a-Demethylase, a Cytochrome P450 Whose Expression Is Regulated by Oxysterols // Arch. Biochem. Biophys., 1996, vol. 329 (1), pp. 73-81.

92. Sud, I. J., and D. S. Feingold. Action of antifungal imidazoles in Staphylococcus aureus // Antimicrob. Agents Chemother., 1982, vol. 22, pp.470-474.

93. Tafi A., Anastassopoulou J., Theophanides T., Botta M. , Corelli F., Massa S., Artico M., Costi R., Di Santo R., Ragno R. Molecular Modeling of Azole Antifungal Agents Active against Candida albicans. 1. A Comparative Molecular

94. Field Analysis Study // J. Med. Chem., 1996, vol. 39, pp. 1227-1235.

95. Taton M, Rahier A. Properties and structural requirements for substrate specificity of cytochrome P-450-dependent obtusifoliol 14a-demethylase from maize (Zea mays) seedlings // Biochem. J., 1991, vol. 277 (p. 2), pp. 483-492.

96. Trzaskos J., Kawata S., Gaylor J.L. Microsomal Enzymes of Cholesterol Biosynthesis. Purification of lanosterol 14a-methyl demethylase cytochrome p-450 from hepatic microsomes // J. Biol. Chem., 1986, vol. 261 (31), pp. 14651-14657.

97. Trzaskos J.M., Henry M.J. Comparative effects of the azole-based fungicide flusilazole on yeast and mammalian lanosterol 14 alpha-methyl demethylase // Antimicrob. Agents Chemother., 1989, vol. 33(8), pp. 1228-1231.

98. Tuck S.F., Aoyama Y., Yoshida Y., Ortiz de Montellano P.R. Active Site Topology of Saccharomyces cereuisiae Lanosterol 14a-demethylase (CYP51) and Its G310D Mutant (Cytochrome P-450SGi) // J- Biol. Chem., 1992, vol. 267 (19), pp. 13175-13179.

99. Urbina J. A. Chemotherapy of Chagas' disease: the how and the why // J. Mol. Med., 1999, vol. 77, pp. 332-338.

100. Urbina J.A. Parasitological Cure of Chagas Disease: Is it Possible? Is it Relevant? // Mem. Inst. Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro), vol. 94 (suppl. I), pp. 349-355, 1999.

101. Vanden Bossche H., Marichal P., Gorrens J., Coene M.C., Willemsens G., Bellens D., Roels I., Moereels H., Janssen P.A. Biochemical approaches to selective antifungal activity. Focus on azole antifungals // Mycoses, 198 9, vol. 32(Suppl. 1), pp. 35-52.

102. Venkatakrishnan K., von Moltke L.L., Greenblatt D.J. Effects of the antifungal agents on oxidative drug metabolism: clinical relevance // Clin. Pharmacokinet., 2000, vol. 38(2), pp. 111-180.

103. Venkateswarlu K., Kelly D.E., Manning N.J., Kelly S.L. NADPH Cytochrome P-450 Oxidoreductase and Susceptibility to Ketoconazole // Antimicrob. Agents Chemother., 1998, Vol. 42 (7), p. 1756-1761.

104. Watson P.F., Rose M.E., Ellis S.W, England H., Kelly S.L. Defective sterol C5-6 desaturation and azoleresistance: a new hypothesis for the mode of action of azole antifungals // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1989, vol. 164 (3), pp. 1170-1175.

105. Werck-Reichhart D., Feyereisen R. Cytochromes P450: a success story // Genome Biology, 2000, vol. 1(6), pp. 3003.1-3003.9.

106. White T.C., Marr K.A. , Bowden R.A. Clinical, Cellular, and Molecular Factors That Contribute to Antifungal Drug Resistance // Clin. Microbiol. Rev., 1998, Vol. 11 (2), pp. 382-402.

107. Wiggins T., Baldwin B.C. Binding of azole fungicides related to diclobutrazol to cytochrome P450 // Pestiscide Sci., 1984, vol. 15, 206-209.

108. Williams P.A., Cosme J., Sridhar V., Johnson E., McRee D.E. Mammalian microsomal cytochrome P450 monooxygenase: structural adaptations for membrane binding and functional diversity // Mol. Cell, 2000, vol. 5, pp. 121-131.

109. Wolf R., Wolf D., Kuperman S. Focal nodular hyperplasia of the liver after intraconazole treatment // J. Clin. Gastroenterol., 2001, vol. 33, pp. 418-420.

110. Yoshida Y., Aoyama Y. Yeast Cytochrome P-450 Catalyzing Lanosterol 14a-Demethylation. I. Purification and spectral properties // J. Biol. Chem., 1984, vol. 259 (3), pp. 1655-1660.

111. Yoshida Y., Yamashita C., Noshiro M., Fukuda M., Aoyama Y. Sterol 14-Demethylase P450 Activity Expressed in Rat Gonads: Contribution to the Formation of Mammalian Meiosis-Activating Sterol // Biochem. Biophys. Res. Commun., 1996, vol. 223, 534-538.

112. Yoshida Y., Aoyama Y., Noshiro M., Gotoh 0. Sterol 14-Demethylase P450 (CYP51) Provides a Breakthrough for the Discussion on the Evolution of Cytochrome P450 Gene Superfamily // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000, vol. 273, pp. 799-804.

113. Zarn J.A., Bruschweiler B.J., Schlatter J.R. Azole fungicides affect Mammalian steroidogenesis by inhibiting sterol 14a-demethylase and aromatase // Environ. Health Perspect., 2003, vol. 111(3), pp. 255-262.1. Благодарности.

114. Выражаю искреннюю благодарность:

115. Говоруну Вадиму Марковичу и Лазареву Василию Николаевичу за научное руководство и школу,

116. Черноусовой Ларисе Васильевне и Кузьмину Алексею Владимировичу за предоставленный материал для исследования и ценные замечания по оформлению данных,

117. Карузиной Ирине Ивановне, Петушковой Наталье Анатольевне и Лисице Андрею Валерьевичу за помощь в постановке экспериментов с использованием сканирующей спектрофотометрии,