Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro

Обозова, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro"

На правах рукописи

Обозова Татьяна Анатольевна

«Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro»

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена во Всероссийском Научном Центре Молекулярной Диагностики и Лечения.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.И. Киселев кандидат биологических наук М.И. Артемьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ю.М. Романова кандидат биологических наук И.В. Манухов

Ведущая организация:

НИИ фтизиопульмонологии ММА им И.М. Сеченова Минздрава России.

Защита диссертации состоится « 20 » января 2006 г. в 11 час. на заседании Диссертационного совета Д001.007.01 в ГУ Научно - исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Автореферат разослан « 19 » декабря 2005г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор

Е.В. Русакова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (В.В. Покровский, 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобакте-риями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.

Несмотря на проводимую в ряде стран массовую иммунизацию против туберкулеза, заболеваемость туберкулезом продолжает расти. Разрастающаяся эпидемия туберкулеза в мире обусловлена несколькими факторами:

- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Calmette Guerin) (В. R. Bloom, 2002);

- демографические сдвиги;

- интенсивная миграция населения;

- распространение штаммов микобактерий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (И. Бастаан и Ф. Порталь, 2003);

- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (В.В Покровский, 2003);

- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (M.l.Voskuil et al., 2003).

Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активное ш. В этом состоянии мико-бактерии не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (В.Н. Герасимов и соавторы, 2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобактерий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобактерий в метаболически неактивном нерепликативном состояниии. (Wayne L.G. et al., 1998).

Для изучения феномена персистенции М tuberculosis были разработаны модели

персистенции in vitro, простые в исполнении и

гплп^ррцнии, а гакже исключающие

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ i БИБЛИОТЕКА J С. Петербург л i

... *э у тк ;

действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма на присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причин создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистенции in vivo.

Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные М. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистенции - гены М tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.

Необходимо отметить, что к началу данной работы о проблеме персистенции М tuberculosis было опубликовано много работ, но основные исследования проводились с использованием микробиологических методов, а генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий в состояние персистенции, были мало исследованы (В.П.Герасимов и соавт., 2003; И Р.Дорожкова и соавт., 1995, С.В.Прозоровский и соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано с изменением уровней экспрессии определенной группы специфических генов (C.Boon et al., 2001; L.G.Wayne et al., 2000).

Задача быстрого определения жизнеспособности популяции М tuberculosis поставлена в мировой науке давно и продолжает оставаться актуальной (Hellyer T.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является основой для создания методов определения лекарственной устойчивости, а также методов, позволяющих в короткие сроки тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов с использованием референс - штаммов М tuberculosis.

Консолидация новейших исследований в области генетики М tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистенция) оьчичается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию ангимикобактериальных препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (А.Г. Хоменко, 1996; I.G.Wayne et

al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериальной популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фенотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра антимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.

Существенным недостатком практического применения данного подхода является низкое содержание специфических мРНК в культуре микобактерий.

В связи с этим цель данной работы состояла в исследовании индуцибельных генов в качестве маркеров жизнеспособности М tuberculosis и подборе такой системы ген - индуктор, использование которой позволит увеличить исходное количество специфической мРНК в клетке и тем самым сделает детекцию лабильной мишени более точной.

Цель исследования:

• Определить генетические маркеры, адекватные для оценки жизнеспособности и персистенции М tuberculosis, на моделях in vitro.

Задачи исследования:

1. Разработать количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для изучения экспрессии генов М tuberculosis, выбранных для исследования в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции in vitro.

2 Исследовать возможность использования генетических маркеров для оценки жизнеспособности М tuberculosis как показателя действия антибактериальных препаратов.

3. Исследовать возможность использования генетических маркеров для характеристики разных стадий персистенции на моделях in vitro.

4 Исследовать дифференциальную экспрессию генов М bovis BCG, ассоциированных с персистенцией, на разных стадиях персистенции на моделях in vitro, оценить их в качестве адекватных генетических маркеров персистенции in vitro

5. Исследовать корреляцию между уровнем экспрессии генетических маркеров персистенции и уровнем толерантности персистентной культуры М bovis BCG к антибактериальным препаратам.

Научная новизна работы

- разработан оригинальный методический подход, основанный на количественном определении уровня специфических мРНК и созданы количественные ПЦР и ОТ-ГЩР для изучения дифференциальной экспрессии генов dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, ¡S6110 M tuberculosis при нахождении мико-бактерий в разных физиологических состояниях in vitro;

- впервые установлено, что уровень мРНК гена dnaK может быть использован для экспресс - определения степени устойчивости штаммов М tuberculosis к рифампици-ну и изониазиду;

- впервые определен профиль специфических мРНК генов sigA, sigB, sigF. dosR, acr, jbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623 на разных стадиях персистенции М bovis BCG на моделях in vitro. Согласно установленным нами критериям, гены Rv2623, sigF, dosR являются наиболее адекватными генетическими маркерами персистенции микобактерий на моделях in vitro-,

- впервые предложен маркер разных стадий персистенции микобактерий на моделях in vitro (уровень 16S рРНК). Использование этого маркера позволяет. 1) определить минимальный уровень метаболической активности популяции микобактерий на моделях in vitro; 2) проводить сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro.

Практическая значимость работы

Выявлены генетические маркеры жизнеспособности и персистенции М tuberculosis на моделях in vitro, которыми являются гены - dnaK и Rv2623, sigF, dosR, соответственно. Уровень мРНК гена dnaK может быть использован как универсальный показатель жизнеспособности, при действии антибиотиков. Белковые продукты генов Rv2623, sigF, dosR, могут могут быть кандидатами для производства специфических реагентов для определения латентных форм туберкулеза.

Внедрение полученных результатов

Получено авторское свидетельство на изобретение № 2003136881 «Способ количественного определения копий ДНК и РНК мишеней методом полимераз-ной цепной реакции с использованием универсально! о внутреннего калибровочно] о стандарта (УВКС)» от 23.12.2003

Апробация работы

Результаты исследований доложены на 4-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), на II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на 14-ом Русском национальном конгрессе по легочным заболеваниям (Москва 2004 г.), на рабочем совещании «New Horizons for Diagnosis and Therapy of Tuberculosis» (Денвер, США, 2004), на межлабораторном семинаре отдела молекулярной биологии ВНЦМДЛ (Москва, 2005).

Апробация диссертации состоялась 18.11.05 г. на научной конференции отдела Генетики и Молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. Получено 1 авторское свидетельство.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает 128 источников, из них 15 отечественных и 113 иностранных.

Содержание работы Материалы и методы исследования

1. Штаммы микобактерий и условия их культивирования.

В данной работе использовали следующие штаммы микобактерий:

• М tuberculosis штамм H37Ra - чувствительный к рифампицину и изониазиду, полученный из коллекции Государственного Научного Пентра Прикладной Микробиологии (Московская область).

• Референс - штаммы М tuberculosis, полученные из коллекции Национального Еврейского Центра, Денвер, Колорадо, США (Таблица 1):

Таблица 1. Характеристики используемых штаммов М. tuberculosis.

-г. ' Минимальные и»гибиру«пцвеконаеятрявди жгибтпша ftlMKJ, мкг/мл

рифампицин j изониазид

H37Rv 0,06-0,12 0,025 - 0, 05

АТСС 35838 >8,0 0,05

RU 122 -96 ! 0,12 1,2

• Вакцинный шгамм Mycobacterium bovis BCG, полученный из ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН.

На основании сравнительною изучения организации геномов М bovis BCG и М tuberculosis было сделано заключение о высокой степени гомологии геномов этих микроорганизмов (S.Cole et al, 1998). С учетом морфологических, гистопатологиче-ских особенностей, особенностей клинического течения заболевания. М bovis (BCG) отнесена к комплексу М. tuberculosis. Эти факты позволили исследователям использовать М bovis BCG в качестве безопасной лабораторной модели. В частности, некоторые авторы использовали М bovis BCG для изучения экспрессии генов и продукции белков, ассоциированных с персистенцисй микобактерий на моделях in vitro (C.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999). Анализ работ и выводы авторов позволяют сделать заключение о том, что некоторые вопросы, касающиеся генетических механизмов длительного выживания микобакгерий в модельных условиях in vitro могут быть изучены с использованием штамма М bovis BCG в качестве модельного, с последующей экстраполяцией результатов для М tuberculosis Это особенно актуально в том случае, если постановка эксперимента включает необходимость получения больших объемов культуры М tuberculosis (более 5 - 10 мл.), но при этом должна соответствовать нормам безопасности, соблюдение которых является обязательным при работе с патогенными микроорганизмами. Выбор М bovis BCG в качестве модельно-ю штамма был обусловлен необходимостью работать с большими объемами культуры микобактерий (200 мл.) при изучении динамики экспрессии генов микобактерий на поздних стадиях персистенции в моделях in vitro, где низкий уровень метаболической активности популяции микобактерий не позволяет получить достаточное количество мишени для проведения количественной ОТ-ПЦР с использованием малого количества клеточного материала.

Очевидно, что при изучении некоторых иммунологических, эпидемиологических и биохимических аспектов жизнедеятельности М. tuberculosis, нельзя использовать М bovis BCG в качестве модельного штамма. Причина этого заключается в существовании ряда генетических различий между этими микроорганизмами, определяющих разницу в антигенных свойствах и некоторых стадиях биохимических процессов.

В этой связи, в своей работе мы использовали только те гены, идентичность которых доказана как для М tuberculosis, так и М bovis BCG (C.Boon et al.„ 2001; Lim A.etal., 1999).

Выращивание культур М tuberculosis и М bovis BCG проводили в жидкой питательной среде Middlebrook 7НВ Broth («Difco». №0713-17) в различных модельных условиях. определенных целями данной работы:

• Аэробные условия роста М tuberculosis и М. bovis BCG

Выращивание культур М tuberculosis и М bovis BCG проводили в колбах объемом 200 мл с объемом среды 100 мл. Культуру микобактерий выращивали до логарифмической фазы роста (OD5g0 = 0.5) и разводили до OD58o = 0,005 в конечном объеме свежей ростовой среды.

• Модель Wayne «без перемешивания» («Wayne dormancy model without stirring»).

Культуру M bovis BCG выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом пластиковом матраце (объемом 25 мл фирмы "Linbro") при 37°С без перемешивания. Получаемая таким образом анаэробная культура соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model without string» (Wayne L.G. et al, 2001):

• Модель «поздней стационарной фазы» («Wayne old stationary phase model»)

Культуру M bovis BCG выращивали в 100 мл среды в колбе объемом 200мл. при

37°С без перемешивания в течение 240 дней.

• Модель Wayne «с перемешиванием» («Wayne dormancy model with stirring»)

Культуру M tuberculosis выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом матраце

(объемом 25 мл) с медленным перемешиванием (40 об./мин.). Получаемая таким образом анаэробная культура микобактерий соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model with string») (Wayne LG. et al., 2001).

(Выращивание культуры M tuberculosis в условиях модели «Wayne dormancy model with stirring» проводилось в National Jewish Center, Денвер, Колорадо, CIIIA).

Выращенную микобактериальную культуру разливали по 1 мл в пробирки (1,5 мл типа Эппендорф), центрифугировали при 5000 об./мин в течение 5 минут при комнатной температуре, супернатант удаляли.

Осадок микобактерий хранили при - 70°С до момента использования.

2. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) тотальных РНК.

Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК) и тотальных РНК проводили стандартными методами (J.A.Mangan et al., 1997).

3. Конструирование внутренних калибровочных стандартов (ВКС).

Принцип конструирования ВКС (ДНК-ВКС и РНК-ВКС) заключается в получении вектора со встроенной генетической последовательностью специфического гена, содержащего неспецифическую вставку размером 80 - 120 н.п. (Рисунок 1)

ДНК-ВКС

РНК- транскрипт

- специфическая последовательность для посадки пары праймеров

- неспецифическая нуклеотидная последовательность

- промотеры фагов вР6 и Т7.

Рис.1 Принцип конструирования внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС и РНК-ВКС).

! И

4. Условия проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) и поли-меразной цепной реакции (ПЦР).

Состав буферных растворов, временных и температурных режимов, количество циклов амплификации, температуру отжига устанавливали в зависимости от используемых праймеров и в соответствии с экспериментальными задачами.

Анализ продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 0,8 и 1,5% агарозном геле по стандартной методике.

5. Програмное обеспечение.

Подбор олигонуклеотидных праймеров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем проводили с помощью программы Oligo 6,31.

Анализ и визуализацию продуктов амплификации проводили с помощью программы Labwork 4,0.

Результаты и обсуждение

1. Подбор генов М. tuberculosis для исследования в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции на моделях in vitro.

Путем анализа данных литературы мы выбрали гены М tuberculosis для их исследования в качестве потенциальных маркеров жизнеспособности и персистенции (Таблица 2).

Для выбора потенциальных генетических маркеров жизнеспособности М tuberculosis были определены следующие критерии, гены должны обладать высоким уровнем конститутивного синтеза или являться стресс - индуцибельными.

Этим критериям в частности соответствовал высоко экспрессивный ген ßpB, кодирующий 85В белок (а-антиген) - один из наиболее экспрессивных белков (Heller et. al.. 1998) Использование в наших экспериментах гена fbpB позволило иметь надежный контроль и провести сравнительное исследование новых генетических маркеров жизнеспособности относительно хорошо исследованного гена М tuberculosis.

Для выбора потенциальных генетических маркеров персистенции М tuberculosis были определены следующие критерии.

- отсутствие или сравнительно низкий уровень экспрессии в активно-растущей культуре микобактерий;

- высокий уровень экспрессии при переходе микобактерий из стадии активного роста в стадию персистенции in vitro, позволяющий достоверно детектировать специфические мРНК (Таблица 2).

Таблица 2. Гены М. tuberculosis - потенциальные маркеры жизнеспособности и перси-

ш t, Г",................. ' ........ ' ............. .............. БвДкй н функции

1 Rv0350 drwK* Ответ на тепловой шок

2 Rv3223 sigH* Сигма фактор РНК-полимеразы

3 Rv2737 recA * Репарация повреждений ДНК

4 Rv2703 sigA * Сигма фактор РНК-полимеразы

5 Rv2710 sigB * Сигма фактор РНК-полимеразы

6 | Rv3286 sigF** Сш ма фактор РНК-полимеразы

7 ¡ Rv3133 dosR ** Регуляция "dormancy" оперона

g \ Rv2031 acr ** шаперон

9 Rvl886 fbpB* а-антшен

10 Rv2626 нет ** 16КДа гипотетический белок

11 Rv2623 нет ** 32КДа гипотетический белок

12 | Rv ! 16S 16SpPHK

13 | Rv | IS6110 Инсерционный элемент

Гены М. tuberculosis, использованные для исследования в качестве маркеров: * -жизнеспособности; ** - персистенции на моделях in vitro.

2. Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis.

Методическим принципом нашей работы было исследование дифференциальной экспрессии генов М tuberculosis путем сравнительного измерения количества специфических мРНК.

Исследуемые в работе образцы мРНК были пересчитаны на количество геном -эквивалентов.

Для количественной оценки экспрессии генов М tuberculosis были разработаны количественные ПЦР и ОТ-ГЩР системы на каждый исследуемый ген

Принцип определения количества исследуемой генетической мишени в реакции ПЦР и ОТ-ПЦР состоял в титровании исследуемой мишени относительно известного количества внутреннего калибровочного стандарта (ВКС).

. ■ ■ -.' «1

ВКС (360 Н.П.)

мишень - ген dnaK (247 н.п.)

Рисунок 2. Двукратное титрование мишени - гена ЛпаК относительно ВКС. Количество ВКС - 80 копий в каждой ПЦР реакции; количество мишени: 1 - 40; 2 - 80; 3 - 160; 4 -320 копий; 5 - маркер молекулярных масс.

Точно определить число копий мишени возможно в том случае, если полосы свечения продуктов амплификации мишени и ВКС совпадают по интенсивности на электрофореграммах Такой подход позволил детектировать двукрашое изменение количества исследуемой мишени (Рисунок 2).

Количество ВКС, не влияющее на чувствительность количественных ГТЦР и ОТ-ПЦР систем принимали за оптимальное. Оптимальное количество ВКС соответствовало 80 - 160 копиям ДНК мишени для количественных ПЦР и 800 -1600 копиям мРНК мишени для количественных ОТ-ПЦР систем.

Чувствительность ПЦР и ОТ-ПЦР систем определяли путем прямого титрования стандартных препаратов ДНК и мРНК. Для ПЦР систем чувствительность составила 40 ± 4 копии ДИК мишени, для ОТ-ПЦР систем - 400 ± 40 копии мРНК мишени

Эффективность реакции обратной транскрипции определяли путем относительного титрования известного количества стандартных препаратов ДНК и мРНК. Эффективность реакции обратной транскрипции составила 14 - 4%

Исследование молекулярно - генетических маркеров жизнеспособности М. tuberculosis

3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М. tuberculosis относительно контрольного значения в исследуемом образце в пересчете на количество геном - эквивалентов.

Принцип определения жизнеспособности М tuberculosis состоял в сравнительном измерении количества лабильной мРНК М tuberculosis до и после действия фактора, подавляющего жизнеспособность микобактерий (антибиотика).

С целью определения генов М tuberculosis, оптимальных для дальнейших исследований в качестве маркеров жизнеспособности, мы исследовали изменения уровней специфических мРНК (количество мРНК на 1 клетку) до и после индукции с последующим выявлением наиболее экспрессивного гена.

В качестве индукторов использовали нагревание (Т =~ 42°С) и 1% этанол. При исследовании экспрессии генов М tuberculosis в условиях тепловой индукции температурную обработку проводили в течение 30, 60, 90 и 120 минут.

Нами установлено 5 - 10 - кратное (в зависимости от гена М tuberculosis и условий индукции) увеличение уровней экспрессии исследованных генов М tuberculosis Уровень экспрессии гена fbpB оставался постоянным при любых условиях индукции (Таблица 5).

Установлено, что наиболее индуцибельным является ген dnaK. Количество мРНК гена dnaK увеличивается в 50 - 70 раз относительно контрольного значения в условиях тепловой индукции: Т = 42 °С, время индукции - 120 минут (Рисунок 3).

ВКС (360 II п ) dnaK (247 и,п ) „ , Ш)и.п.

Рисунок. 3. Изменение уровня мРНК гена dnaK в условиях тепловой индукции. Представлено титрование образцов мРНК гена dnaK после тепловой индукции (Т = 42°С) в течение 30, 60, 90 и 120 минут. Каждая проба содержала равное количество клеток М. tuberculosis (нормировано по количеству геном - эквивалентов) в логарифмической фазе роста. Количество ВКС - 80 копий в каждой ПЦР реакции; Разведения препаратов:

(1 -4) - без индукции: J - 10-крагнос; 2 -102кратное; 3 -103 кратное; 4 -104кратное; (5 - 7) - температурная индукция в течение 30 минут: 5 -102 кратное; 6 -103 кратное; 7 -104 кратное;

(8 -10) - температурная индукция в течение 60 минут: 8 -102 кратное; 9 -103 кра гное; 10 -10" кратное;

(11 -13) - температурная индукция в течение 90 минут: 11 -102 кратное; 12 -103 кратное; 13 -104 кратное;

(14 -16) - температурная индукция в течение 120 минут: 14 -102 кратное; 15 - 10J кратное; 16 - 104 кратное;

(17 -19) - продукты амплификации размером 160 н.п., 360 и 247 н.п. Приведены результаты одно! о из трех однотипных экспериментов.

Таким образом, в результате экспериментальной работы нами было установлено, что оптимальной системой ген - индуктор, позволяющей существенно увеличить количество специфической мРНК в кле!ке и соответственно сделать более точной детекцию мишени, является система: ген dnaK - тепловая индукция (Т = 42°С, время индукции - 120 минут).

4. Исследование генов dnaK, sigH и fbpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis.

Проведено исследование уровня мРНК, имеющих короткий период полураспада в активно растущих клетках, генов dnaK, sigH и fbpB в качестве маркеров жизнеспособности при относительно коротких сроках обработки кулыуры микобактерий ри-фампицином.

Для этого мы определяли уровень специфических мРНК до и после действия на антибиозико - чувствительный штамм М tuberculosis H37Ra рифампицином (10 мкг/мл) в течение 24 и 72 часов.

Параллельно определяли жизнеспособность М tuberculosis H37Ra с помощью стандартного бактериологического метода, путем измерения КОЕ

Рисунок 4. Изменение уровня мРНК гена dnaK до и после действия на М. tuberculosis штамм H37Ra рифампидином (10 мкг/мл).

Представлены электрофорграммы титровании образцов «РНК гена dnaK в разных экспериментальных условиях. Каждая проба содержала равное количество клеток М. tuberculosis (нормировано по количеству i еном - эквивалентов) в логарифмической фазе роста. Количество ВКС - 80 копий в каждой ПДР реакции. Верхняя стрелка указывает на ампликов от ВКС, нижняя - ампликон от мРНК гена dnaK.

А - Титрование мРНК гена dnaK относительно ВКС в контрольном образце. Разведения препаратов: 1-10 Kpa i нос; 2 -10: кратное; 3 -103 кратное; 4 -104 кратное;

5 -105 кратное;

6 - маркер молекулярных масс.

Б - Титрование мРНК гена dnaK относительно ВКС после обработки М. tuberculosis штамма H37Ra рифампицином в течение 72часов.

Разведения препаратов: 1-10 кратное; 2 -102 кратное; 3 -101 кратное; 4 - 104 кратное; 5 - маркер молекулярных масс.

В - Титрование мРНК гена dnaK относительно ВКС после проведения тепловой индукции.

Разведения препаратов: 1 - 102 кратное; 2 -103 кратное; 3 -104 кратное; 4 -105 кратное; 5 -106 кратное;

7 - маркер молекулярных масс.

Г - Титрование мРНК гена dnaK относительно ВКС после проведения тепловой индукции и обработки М. tuberculosis Н37Ка рифампицином в течение 12 часов. Разведения препаратов: 1 -10 кратное; 2 -10" кратное; 3 - 103 кратное; 4 -104 кратное. 5 - маркер молекулярных масс.

В качестве примера, на Рисунке 4 представлены электрофореграммы титрования образцов мРНК гена dnaK, полученные в разных экспериментальных условиях.

В результате, нам удалось установить изменение уровня мРНК для всех трех генетических маркеров {dnaK, sigH, fbpB) уже после 24 часов инкубации микобактсрий с рифампицином. Уровень 16S рРНК оставался стабильным (не изменялся относительно контрольного значения).

Установлено, что уменьшение уровней мРНК всех трех маркеров коррелирует со снижением выживаемое!и М tuberculosis H37Ra

Использование теплового шока позволило нам существенно увеличить уровень

специфических vPHK генов dnaK и sigH в клетках живых микобактерий

Таким образом, использование метода количественной ОТ-ПЦР и термо - инду-цибельных генетических мишеней позволило нам определить жизнеспособность (как показатель действия рифампицина) микобактерий в течение трех дней. Для сравнения, определение жизнеспособности с использованием бактериологического метода заняло три недели.

5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности при действии рифампицином и изониазидом на референс - штаммы М. tuberculosis.

Термо - индуцибельный ген dnaK в качестве маркера для определения степени жизнеспособности был исследован на трех референс - штаммах при действии разными концентрациями рифампицина и изониазида Концентрации антибиотиков были равны или превышали минимальные ингибирующие концентрации (МИК) для каждого штамма. МИК - это концентрация антибиотиков, при действии которой гибнет 99 % микобактерий (L. Heifets et al., 2003). Для рифампицина использовали концентрации - 0,2; 1: 5 мкг/мл. для изониазида - 0,2; 0,5; 1 мкг/мл.

На Рисунке 5 представлены уровни мРНК гена dnaK, значения КОЕ и количества геном - эквивалентов до и после действия разными концентрациями рифампицина и изониазида на исследуемые штаммы М tuberculosis

Установлено, что уменьшение уровня мРНК гена dnaK коррелирует с уменьшением выживаемости (КОЕ) всех исследуемых референс - штаммов.

При 48 часовой инкубации референс - штаммов М tuberculosis с разными концентрациями рифампицина и изониазида показано снижение уровня мРНК гена dnaK, если концентрация антибиотика соответствует или превышает значение МИК. Уровень специфической мРНК оставался постоянным (не изменялся относительно контрольного), если используемая концентрация антибиотика была ниже, чем значение МИК (за единственным исключением для штамма М. tuberculosis АТСС 35838).

<з

£ a x a

Ось абсцисс - концентрация рифамиицина (миг/мл)

Ось абсцисс - концентрация изоншиида (мкг /мл)

0,2 0,5

Рисунок 5. Уровни мРНК гена dnaK, значения КОЕ и количества геном - эквивалента до и после действия разными концентрациями рифампицина и изониазида на референс - штаммы М. tuberculosis.

Представлены нормированные на 1 мл клеточной культуры микобактерий значения log м КОЕ ( ■ ) , log м числа копий геном эквивалента гена sigA ( О ) и log ю числа копий мРНК гена dnaK( Е23 ) стандартных штаммов М. tuberculosis с разными уровнями устойчивости к рифампицину и изониазиду ( Таблица 1) : А - H37Rv; Б - RU 122-96; В - АТСС 35838.

Куль гуру клеток М. tuberculosis, находящуюся в логарифмической фазе роста обрабатывали разными концентрациями рифампицнна (концентрации антибиотиков представлены па рисунках по оси абсцисс) в течение 48 часов. На следующем этапе эксперимента проводили тепловую индукцию: Т = 42°С, время индукции - 2 часа. Количество мРНК гена dnaK и количество геном - эквивалент по гену sigA определяли с помощью количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем. Приведены средние результаты трех независимых измерений и стандартные отклонения.

Исследование молекулярно - генетических маркеров персистенции М. tuberculosis на моделях in vitro

Цель исследования состояла в изучении дифференциальной экспрессии генов М tuberculosis в условиях нормированной клеточной популяции микобактерий на разных стадиях персистенции на моделях in vitro.

Под стадиями персистенции мы понимаем последовательные этапы перехода М tuberculosis из стадии активного роста в состояние «глубокой» персистенции.

Состояние «глубокой» персистенции микобактерий, по нашим представлениям, характеризуется минимальным уровнем метаболической активности, позволяющей микобактериям поддерживать жизнеспособность и способность к реактивации в течение длительного времени.

6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистенции in vitro.

Динамика изменения количества 16S рРНК в пересчете на количество геном -эквивалентов при переходе микобактерий в разные физиологические состояния была изучена на двух моделях персистенции in vitro: модель Wayne «без перемешивания», модель Wayne «стационарная фаза роста» На Рисунке бив Таблице 3 представлена динамика изменения количества 16S рРНК при инкубации М bovis BCG в условиях модели Wayne «без перемешивания».

Г"— 23S рРНК , 16S рРНК

Рисунок 6. Электрофореграмма изменения количеств 16S рРНК M.bovis BCG при инкубации в условиях модели Wayne «без перемешивания».

1-10 дней инкубации M.bovis BCG-,

2-40 дней инкубации M.bovis BCG;

3-110 дней инкубации M.bovis BCG.

Таблица 3. Динамика изменения количества 16S рРНК при инкубации М. bovis BCG в условиях модели Wayne «без перемешивания».

L^feL W^WMtö . ■ '.* V-".- -,'I 1 ■■■ J ¿'&T1'"—■ " Ii1—---'-^ " —ГТ7--. ^ v-'1.^ ■

Ея»мицы ии пику* ¡¡нши Mi Wfewee .(ДНИ)"

намерения Маркер 1« 4® 110 210 .. -m'

бактериологический количество колоний/мл КОЕ 107 5х107 106 0 0

электрофорез нг/мл ДНК 100 500 300 -40 -40

электрофорез нг/мл 16S рРНК 130 -40 <40 <40 <40

количеств ОТ-ПЦР число копий / мл 16SpPHK 10" Ю10 109 103 103

Приведепы средние результаты трех независимых измерений.

7. Исследование экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях пер-систенции in vitro.

Определен профиль специфических мРНК генов sigH, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, 16S pPHK, Rv31$3c, Rv2623 на разных стадиях персистенции микобакгерий, определенных с помошыо 16S рРНК на моделях in vitro

На Рисунке 7 представлена динамика изменения уровня мРНК исследованных генов и 16S рРНК М. bovis BCG, нормированные по количеству геном - эквивалентов на разных стадиях инкубации в условиях модели Wayne «без перемешивания».

Рисунок 7. Дипамикя изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях инкубации в условиях модели Wayne «без перемешивания». Приведены средние результаты трех независимых измерений.

Аналогичные исследования проведены на модели Wayne «стационарная фаза роста». Анализ полученных данных позволил нам определить три гена, наиболее пер-

спекгивные для использования в качестве маркеров персистенции sigF, dosR, Rv2623 согласно следующим критериям:

- отсутствие или сравнительно низкий уровень экспрессии в активно растущей культуре микобактерий;

-высокий уровень экспрессии при переходе микобактерий в условия персистенции in vitro, позволяющий достоверно детектировать специфические мРНК;

- наличие детектируемого уровня экспрессии генов микобактерий на поздней стадиии персистенции in vitro.

8. Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, Rv2623, acr и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к рифампицину и метронидазолу.

Проведено сравнительное исследование уровней специфических мРНК и бактериологическое определение количес1ва жизнеспособных клеток после действия ри-фамшншном (10 мкг/мл) и метронидазолом (12 мкг/мл) в интервале с 0 по 21 день инкубации микобактерий в условиях модели Wayne«6e3 перемешивания» (Таблица 4, Рисунок 8).

iur

- -i "

10 дня 15

sigF

Т-1-г-

5 10 дни 15

- -9

20 25

• i - - - - - - -i

20 25

dosR

10 дни 20

Rv2623

hi— ■i - ■

10 дни 15

Рисунок 8. Динамика изменения экспрессии генов acr, sigF, dosR, Rv2623 на 0;2;4;7;14 и 21 день инкубации культуры M.bovis BCG: - • - в условиях аэробного роста;

■ в условиях модели Wayne «без перемешивания». Приведены средние результаты трех независимых измерений и стандартное отклонение.

Установлена корреляция между увеличением экспрессии генов sigF, dosR, Rv2623 acr M bovis BCG и уровнем чувствительности (устойчивости) микобактерий к антибактериальным препаратам.

Таблица 4, Процент выживаемости М. bovis BCG после обработки культуры клеток рифампицином (10 мкг/мл) и метронидазолом (12 мкг/мл).

.: г " '¿г,: - ™ ^ - —■ *■ " • у«

рифампипин ¡ метронидазол (10 мкг/мл) ¡ (12 мкг/мл)

рифампицин метронидазол (10 мкг/мл) (12 мкг/мл).

100

1,2 Т

100

Приведены средние результаты трех независимых измерении.

В данном случае мы наблюдали феномен фенотипической устойчивости, причиной которой являются не генетические мутации, а изменение метаболического статуса микроорганизма.

Выводы

1. Разработаны оригинальные количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для исследования экспрессии генов М tuberculosis: dnoK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, IS61I0 с целью определения возможности использования этих генов в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции микобактерий на моделях in vitro.

2. Среди исследованных генов выбран термо - индуцибельный ген dnaK в качестве маркера, оптимального для оценки степени жизнеспособности культуры М tuberculosis как показателя действия рифампицина и изониазида.

3. Впервые определена возможность применения генов sigH, dnaK,fbpB для экспресс - определения жизнеспособности М tuberculosis при действии рифампицином в течение 24 часов.

4. Впервые установлена возможность использования уровня 16S рРНК в качестве маркера разных стадий персистенции микобактерий на моделях in vitro, что позволяет:

- проводшъ сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro;

- определить стадию «глубокой» персистенции популяции микобактерий на моделях in vitro, которая характеризуется стбильным минимальным уровнем метаболической активности и является наиболее адекватной для исследования процессов, обеспечивающих выживание микобактерий в течение длительного времени.

5. Установлено, что гены sigF, dosR и Rv2623 могут быть использованы в качестве маркеров персистенции микобактерий на моделях in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Обозова Т.А., Зуева E.H. Стресс - гены как маркеры лекарственной устойчивости M tuberculosis H37Ra II Генодиагностика инфекционных заболеваний. Сб. тез. докл. 4-й Всероссийской на}чно -практической конференции, г. Москва,- 2002.- стр. 397 - 398.

2.0бозова Т.А., Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Киселев В.И. Уровень экспрессии sigF, lóKDa, D -23, D-32, а-кристаллин мРНК как молекулярного маркера состояния нерепликативной персистенции М. tuberculosis /'/ II Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Сб. тез. докл. Москва.- 2003,- стр. 106

3. Демихова О.В., Артемьев M И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Обозова Т.А., Киселев В.И. Стресс - гены как маркеры лекарственной устойчивости M tuberculosis H37Ra II II - ой Московский Международный KoHipecc «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Сб. тез. докл. Москва.- 2003.- стр. 294.

4. Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Обозова Т.А. Исследование эффективности воздействия рифампицина на M tuberculosis H37Ra с использованием RT-PCR // II - ой Московский Международный Конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Сб. тез. докл. Москва,- 2003,- стр. 63.

5.Артемьев М.И., Сметанина С.Е., Барановский П.М., Обозова Т.А., Киселев В.И., Зуева E.H., Белушкина H.H., Северин Е.С., Киселев В.И., Пальцев М.А. «Способ количественного определения копий ДНК и РНК мишеней методом полимеразной цепной реакции с использованием универсального внутреннего калибровочного стандарта (УВКС)» от 23.12.2003.

6. Артемьев М.И., Сметанина С.Е., Барановский П.М., Зуева E.H., Обозова Т.А , Киселев В.И. Исследование эффективности воздействия рифампина на штамм M tuberculosis H37Ra с использованием ОТ-ПЦР II Молекулярная медицина,- 2005.- №].. стр.53 - 60.

7.0бозова Т.А., Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е, Киселев В.И. Исследование корреляции между уровнем 16S рРНК и жизнеспособностью M bovis BCG в ггерсистентном состоянии //14 - ый Русский национальный конгресс по легочным заболеваниям. Сб.тез.докл. Москва,- 2004,- стр. 408.

8. Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Обозова ТА., Киселев В.И., Демихова О.В., Голышевская В.И., Хейфец Л.Б. Экспресс методы оценки множественной лекарственной устойчивости М. tuberculosis использующие мРНК, в качестве маркеров жизнеспособности // 14 - ый Русский национальный конгресс по

легочным заболеваниям. Сб. тез. докл Москва.-2004.- стр. 382.

9. Обозова Т. A. Molecular markers of dormancy in tubercle bacilli // Workshop «New Horizons for Diagnosis and Therapy of Tuberculosis». USA, Denver.- August 23 - 26, 2004.

10 Обозова T.A., Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е.. Киселев В.И. Исследование корреляции между уровнем экспрессии Rv3286c, Rv2626c, Rv2031c, Rv3133c и уровнем толерантности Mycobacterium bovis BCG к антибиотикам в различных физиологических состояниях // Проблемы туберкулеза.- 2005,- № 2,- стр. 34-37.

11. Обозова Т.А., Артемьев М.И., Барановский П.М., Сметанина С.Е., Киселев В.И. Использование 16S рРНК в качестве нормировочного маркера для моделей пер-систенции микобакхерий // Молекулярная медицина,- 2005.- № З.-стр. 61 - 65.

Подписано в печать / <6. /с? 200.3?'. Формат 60x84/16.

Тираж экч Заказ № /Усл. печ. л. ^

ООО «Техполиграфценгр» ПЛД № 53-477 Тел./факс: (095) 151-26-70

SD - > 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Обозова, Татьяна Анатольевна

I. Список сокращений

II. Введение

III. Обзор литературы

1. Механизмы длительного выживания микобактерий

М. tuberculosis

2. Модели персистенции М. tuberculosis in vitro

2.1. Модель - «без перемешивания»

2.2. Модель - «с перемешиванием»

2.3. Модель - «стационарная фаза роста»

3. Пути получения энергии М. tuberculosis при персистенции in vitro

4. Экспрессия генов «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro

5. Экспрессия генов, не входящих в состав «dormancy» - регулона М. tuberculosis при персистенции in vitro

6. Экспрессия генов, кодирующих сигма - факторы М. tuberculosis при персистенции in vitro

7. Определение жизнеспособности М. tuberculosis

8. Особенности фенотипических методов определения жизнеспособности М. tuberculosis

8.1. Определение жизнеспособности М. tuberculosis с использованием репортерных микобактериофагов, несущих ген люциферазы

8.2. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня рРНК

8.3. Определение жизнеспособности М. tuberculosis посредством мониторинга уровня мРНК

IV. Материалы и методы 32 1. Штаммы микобактерий и условия их культивирования (модели персистенции in vitro)

2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий

3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК)

4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК)

5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразпой цепной реакции

6. Применение внутреннего калибровочного стандарта для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях

7. Подбор праймеров для количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

8. Условия проведения реакции обратной транскрипции

9. Условия проведения ПЦР реакции

10. Характеристика количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

11. Детекция продуктов амплификации

12. Програмное обеспечение экспериментальной работы

V. Результаты и обсуждение

1. Исследование генов М. tuberculosis в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции

2. Разработка количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем для изучения экспрессии генов М. tuberculosis

2.1 Тестирование специфичности ПЦР и ОТ-ПЦР систем

2.2 Внутренние калибровочные стандарты (ВКС)

2.3 Определение чувствительности количественных ПЦР и ОТ-ПЦР систем

2.3.1. Определение чувствительности количественных ПЦР систем

2.3.2. Определение чувствительности количественных ОТ-ПЦР систем

2.4 Многопраймерная реакция обратной транскрипции 4g

2.5. Использование ВКС для количественного определения исследуемой мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР системах

2.5.1. Определение оптимального количества внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС) для количественных ПЦР систем ^ ^

2.5.2. Определение оптимального количества внутреннего калибровоч- ^ ного стандарта (РНК-ВКС) для количественных ОТ-ПЦР систем

2 б Определение исходного количества числа копий ДНК (мРНК) мишени в препарате

2.7. Тестирование образцов на отсутствие деградации РНК

2.8. Выбор нормировочного маркера для сравнительного исследования количества специфических мРНК

Исследование генетических маркеров жизнеспособности М. tuberculosis на моделях in vitro

3. Подбор системы ген - индуктор, позволяющей увеличить количество специфических мРНК М tuberculosis в исследуемом образце в пересчете па количество геном - эквивалента

4. Исследование генов dnaK, sigH и flpB в качестве маркеров жизнеспособности М. tuberculosis

5. Исследование гена dnaK в качестве маркера жизнеспособности как показателя действия рифампицина и изониазида на референс -штаммы М. tuberculosis 66 Исследование генетических маркеров персистеигция М. tuberculosis на моделях in vitro

6. Использование молекулярно - генетических маркеров для нормирования состояния клеточной популяции М. bovis BCG в условиях моделей персистеиции in vitro

7. Исследование динамики изменения экспрессии генов М. bovis BCG на разных стадиях персистенции на моделях in vitro

8. Исследование корреляции между уровнем экспрессии генов sigF, dosR, acr, Rv2623 и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к рифампицину и метронидазолу

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro"

По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) ежегодно в мире туберкулезом заболевают более 10 млн. человек и умирают около 3 млн. человек, при этом ежегодно в России от туберкулеза умирают 30 тысяч человек (Покровский В.В., 2003). По разным оценкам треть населения нашей планеты инфицирована микобактериями туберкулеза и подвержена опасности развития острой формы этого заболевания (Wayne LG. et al, 2001). В этой связи актуальность изучения всех аспектов этой опасной инфекции очевидна.

- ненадежность протекции, обеспечиваемой вакцинацией BCG (bacillus Cal-mette Guerin) (Bloom В. R., 2002);

- демографические сдвиги;

- интенсивная миграция населения;

- распространение штаммов микобактерий с лекарственной устойчивостью и множественной лекарственной устойчивостью (Бастиан И. и Порталь Ф., 2003);

- нарушение функций иммунной системы у людей, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (Покровский В.В., 2003);

- переход латентных форм туберкулеза в клинически манифестное заболевание (Voskuil M.I. et al., 2003).

Обращаясь к проблеме латентного туберкулеза, важно отметить, что латентное состояние туберкулезной инфекции обусловлено существованием М. tuberculosis в персистентном состоянии в организме человека или животного. Термином персистенция в литературе обозначают состояние М. tuberculosis in vivo, характеризующееся образованием морфологически и функционально измененных форм микобактерий, практически не чувствительных к противотуберкулезным препаратам и обладающих низким уровнем метаболической активности. В этом состоянии микобактерии не дают роста на твердых питательных средах. Показано, что при поглощении макрофагами, клетки микобактерий трансформируются в зернистые и L - формы, спороподобные (вегетативные) формы (Герасимов В.Н. и соавторы,

2003). В зарубежной литературе для обозначения видоизмененных форм микобак-терий используют термин «dormant» (спящий), означающий нахождение микобак-терий в метаболически неактивном нерепликативном состоянии (Wayne L.G. et al., 1998).

Для изучения феномена персистепции М. tuberculosis были разработаны модели персистепции in vitro, простые в исполнении и использовании, а также исключающие действие стресс - факторов, характерных для имунного ответа организма па присутствие микобактерий (Wayne L.G. et al., 2001). Одной из основных причии создания таких моделей in vitro являлось отсутствие методов, позволяющих исследовать генетические аспекты проблемы персистенции in vivo.

Персистенция микобактерий представляет собой серьезную проблему, так как персистентные М. tuberculosis способны к реактивации в активную форму, что может обеспечивать рецидивы инфекции. В связи с этим, существует необходимость в создании быстрых и надежных методов выявления латентных форм туберкулеза. Процесс создания диагностических реагентов для определения латентных форм туберкулеза долгий и многостадийный. В результате должен быть определен белковый продукт, обладающий высоким уровнем специфичности (в отношении персистентных форм микобактерий) и иммуногенности. Для этого в первую очередь необходимо определить адекватные генетические маркеры персистенции - гены М. tuberculosis. Представленные в данной работе исследования, проведенные на моделях in vitro являются первым шагом на пути к решению этой задачи.

Необходимо отметить, что к началу данной работы о проблеме персистенции М. tuberculosis было опубликовано много работ, но основные исследования проводились с использованием микробиологических методов, а генетические механизмы, детерминирующие основные процессы перехода популяции микобактерий в состояние персистенции, были мало исследованы (Герасимов В.Н. и соавт., 2003; Дорожкова И.Р. и соавт., 1995; Прозоровский C.B. и соавт., 1985). Существовали лишь отрывочные данные, позволяющие предполагать, что изменение физиологического состояния микобактерий связано с изменением уровней экспрессии определенной группы специфических генов (Boon C.et al., 2001; Wayne L.G. et al., 2000).

Задача быстрого определения жизнеспособности популяции М. tuberculosis поставлена в мировой науке давно и продолжает оставаться актуальной (Hellyer Т.J., 1999). Определение жизнеспособности популяции микобактерий является основой для создания методов определения лекарственной устойчивости, а также методов, позволяющих в короткие сроки тестировать эффективность действия новых лекарственных препаратов с использованием референс - штаммов М. tuberculosis.

Консолидация новейших исследований в области генетики М. tuberculosis и многолетних наработок в области микробиологии возбудителя туберкулеза позволила составить представление о вариабельности функциональных состояний, характерных для клеточной популяции микобактерий. На сегодняшний день известно, что популяция микобактерий, находясь в физиологически и морфологически измененном состоянии (персистеиция) отличается устойчивостью к разного рода стрессовым воздействиям, в том числе к действию антимикобактериальных препаратов. В данном случае устойчивость не обусловлена мутациями (Хоменко А.Г., 1996; Wayne L.G. et al., 2001). Для изучения этого феномена важно использовать лабораторные методы, позволяющие в короткие сроки определять жизнеспособность микобактериальной популяции in vitro, работающие независимо от механизма, детерминирующего устойчивость к лекарственному препарату. По критерию универсальности перспективными являются фепотипические методы, основанные на определении изменений метаболического статуса популяции микобактерий, где определение жизнеспособности М. tuberculosis, как показателя действия лекарственных препаратов можно проводить для всего спектра антимикобактериальных препаратов и независимо от физиологического состояния, в котором находится популяция микобактерий. Одним из быстрых способов определения роста микобактерий в присутствие антибиотика является определение содержания рибонуклеиновых кислот в исследуемой культуре микобактерий (Jou N.T., 1997). Необходимо отметить, что данная методика требует наличия адекватного генетического маркера (гена) и быстрого способа регистрации количества данной мишени.

Цель исследования:

• Определить генетические маркеры, адекватные для оценки жизнеспособности и персистенции М. tuberculosis, на моделях in vitro.

Задачи исследования:

1. Разработать количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для изучения экспрессии генов М. tuberculosis, выбранных для исследования в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции in vitro.

2. Исследовать возможность использования генетических маркеров для оценки жизнеспособности М. tuberculosis как показателя действия антибактериальных препаратов.

4. Исследовать дифференциальную экспрессию генов М. bovis BCG, ассоциированных с персистенцией, на разных стадиях персистенции на моделях in vitro, оценить их в качестве адекватных генетических маркеров персистенции in vitro.

5. Исследовать корреляцию между уровнем экспрессии генетических маркеров персистенции и уровнем толерантности персистентной культуры М. bovis BCG к антибактериальным препаратам.

Научная новизна работы

- разработан оригинальный методический подход, основанный на количественном определении уровня специфических мРНК и созданы количественные ПЦР и ОТ-ПЦР для изучения дифференциальной экспрессии генов dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr.flpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, IS6110 M. tuberculosis при нахождении микобактерий в разных физиологических состояниях in vitro',

- впервые установлено, что уровень мРНК гена dnaK может быть использован для экспресс - определения степени устойчивости штаммов М. tuberculosis к ри-фампицину и изониазиду;

- впервые определен профиль специфических мРНК генов sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623 на разных стадиях персистенции М. bovis BCG на моделях in vitro. Согласно установленным нами критериям, гены Rv2623, sigF, dosR являются наиболее адекватными генетическими маркерами персистенции микобак-терий на моделях in vitro;

- впервые предложен маркер разных стадий персистенции микобактерий на моделях in vitro (уровень 16S рРНК). Использование этого маркера позволяет: 1) определить минимальный уровень метаболической активности популяции микобактерий на моделях in vitro; 2) проводить сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro.

Практическая значимость работы

Выявлены генетические маркеры жизнеспособности и персистенции М. tuberculosis на моделях in vitro, которыми являются гены - dnaK и Rv2623, sigF, dosR, соответственно. Уровень мРНК гена dnaK может быть использован как универсальный показатель жизнеспособности, при действии антибиотиков. Белковые продукты генов Rv2623, sigF, dosR, могут быть кандидатами для производства специфических реагентов для определения латентных форм туберкулеза.

III. Обзор литературы

Известно, что популяция возбудителя туберкулеза неоднородна по составу и ряду биологических свойств: микроорганизмы различаются по морфологии, скорости роста и размножения, особенностям обменных процессов, жизнеспособностью (Дорожкова И.Р. и соавторы, 1990). Эти обстоятельства обуславливают различную чувствительность микобактерий к антибиотикам и способствуют развитию приспособительных реакций, позволяющих избежать бактерицидного действия лекарственных препаратов (Wayne L.G. et al., 2001).

Известно, что 75% населения России инфицировано М. tuberculosis, при этом туберкулезная инфекция находится в латентном состоянии и представляет собой резервуар опасного заболевания (Голубчикова В.Т. и соавторы, 1997; Козлова М.К. и соавторы, 1997; www.tuberculosis.ru). Считается, что большинство новых случаев заболевания туберкулезом возникает в результате реактивации латентной инфекции - инфицированные М. tuberculosis лица имеют риск эндогенной реактивации туберкулеза (Voscuil M.I.et al., 2004).

Персистенция микобактерий возможна в результате трансформации в L -формы, ультрамелкие и фильтрующиеся формы (часто называемые зернистыми) (Мишин В.Ю., 2003). Их особенность состоит в том, что даже под действием антибиотиков они способны длительное время сохранять жизнеспособность и при соответствующих условиях вновь «оживать» и размножаться (Хоменко А.Г., 1999).

Под действием ряда факторов, неблагоприятно действующих на бактериальную клетку (антибиотики, ферменты, антитела и др.), происходит L- трансформация бактерий, приводящая к постоянной или временной утрате клеточной стенки. В результате изменения антигенных свойств, снижения вирулентности и ряда других факторов L - формы приобретают способность длительно находиться (персистиро-вать) в организме хозяина. Утрата клеточной стенки делает L - формы нечувствительными к антибиотикам, антителам и различным химиопрепаратам, мишеныо которых является клеточная стенка микобактерий. Нестабильные L - формы способны реверсировать в исходные формы бактерий, имеющие клеточную стенку. Имеются также стабильиые L - формы бактерий, отсутствие клеточной стенки и неспособность реверсировать которых в классические формы бактерий закреплены генетически (Прозоровский C.B., 1981).

Внимание исследователей привлекает вопрос о возможном участии L-форм в хроническом процессе туберкулезной инфекции. При исследовании частоты и динамики выделения L-форм микобактерий туберкулеза у больных с рецидивами туберкулеза легких обнаружено, что L-формы микобактерий туберкулеза выявляются у 40,6 % исследованных больных. В 73,1 % случаев L - формы микобактерий были нестабильными и реверсировали после 1-3 пассажей in vitro в типичную бактериальную форму возбудителя (Чернушепко Е.Ф., 2000). Несмотря на достаточно длительный период в изучении способности микобактерий к длительному выживанию в организме человека до сих пор в литературе встречается некоторая путаница в терминологии.

Морфология измененных форм микобактерий характеризуется высокой степенью полиморфизма (Герасимов В.Н. и соавт., 2003). Зернистые формы микобактерий имеют округлую форму различных размеров: от мелкозернистых форм (0,1 -0,2 микрона в диаметре) до крупных круглых образований (0,6 - 0,8 микрон в диаметре). Часть популяции зернистых форм микобактерий находится в спороподоб-ном (вегетативном) состоянии (Герасимов В.Н. и соавт., 2003). Возможно, что нахождение части популяции микобактерий в спороподобном состоянии обуславливает латентное состояние микобактериальной инфекции (Voskuil M.I. et al., 2003). Эта форма морфологически отличается от L - форм более мелкими размерами и наличием плотной (многослойной) клеточной стенки (Voskuil МЛ. et al., 2004).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Обозова, Татьяна Анатольевна

VI. Выводы

1. Разработаны оригинальные количественные ПЦР и ОТ-ПЦР системы для исследования экспрессии генов М. tuberculosis: dnaK, sigH, recA, sigA, sigB, sigF, dosR, acr, fbpB, 16S, Rv3133c, Rv2623, IS6110 с целью определения возможности использования этих генов в качестве маркеров жизнеспособности и персистенции микобактерий на моделях in vitro.

2. Среди исследованных генов выбран термо - индуцибельный ген dnaK в качестве маркера, оптимального для оценки степени жизнеспособности культуры М. tuberculosis как показателя действия рифампицина и изониазида.

3. Впервые определена возможность применения генов sigH, dnaK, jbpB для экспресс - определения жизнеспособности М. tuberculosis при действии рифампи-цином в течение 24 часов.

- проводить сравнительное изучение экспрессии генов микобактерий на разных стадиях персистенции в условиях разных моделей персистенции in vitro-,

- определить стадию «глубокой» персистенции популяции микобактерий на моделях in vitro, которая характеризуется стабильным минимальным уровнем метаболической активности и является наиболее адекватной для исследования процессов, обеспечивающих выживание микобактерий в течение длительного времени.

На основании сравнительного изучения организации геномов М. bovis BCG и M. tuberculosis было сделано заключение о высокой степени гомологии геномов этих микроорганизмов (S.Cole et al., 1998). С учетом морфологических, гистопато-логических особенностей, особенностей клинического течения заболевания, M bovis (BCG) отнесена к комплексу М. tuberculosis. Эти факты позволили исследователям использовать M bovis BCG в качестве безопасной лабораторной модели. В частности, некоторые авторы использовали М. bovis BCG для изучения экспрессии генов и продукции белков, ассоциированных с персистенцией микобактерий на моделях in vitro (С.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999). Анализ работ и выводы авторов позволяют сделать заключение о том, что некоторые вопросы, касающиеся генетических механизмов длительного выживания микобактерий в модельных условиях in vitro могут быть изучены с использованием штамма M bovis BCG в качестве модельного, с последующей экстраполяцией результатов для М. tuberculosis. Это особенно актуально в том случае, если постановка эксперимента включает необходимость получения больших объемов культуры М. tuberculosis (более 5-10 мл.), но при этом должна соответствовать нормам безопасности, соблюдение которых является обязательным при работе с патогенными микроорганизмами. Выбор М. bovis BCG в качестве модельного штамма был обусловлен необходимостью работать с большими объемами культуры микобактерий (200 мл.) при изучении динамики экспрессии генов микобактерий на поздних стадиях персистенции в моделях in vitro, где низкий уровень метаболической активности популяции микобактерий не позволяет получить достаточное количество мишени для проведения количественной ОТ-ПЦР с использованием малого количества клеточного материала.

Очевидно, что при изучении некоторых иммунологических, эпидемиологических и биохимических аспектов жизнедеятельности M tuberculosis, нельзя использовать М. bovis BCG в качестве модельного штамма. Причина этого заключается в существовании ряда генетических различий между этими микроорганизмами, определяющих разницу в антигенных свойствах и некоторых стадиях биохимических процессов.

В этой связи, в своей работе мы использовали только те гены, идентичность которых доказана как для М. tuberculosis, так и М. bovis BCG (C.Boon et al.„ 2001; Lim A. et al., 1999).

Выращивание культур M. tuberculosis и M. bovis BCG проводили в жидкой питательной среде Middlebrook 7НВ Broth («Difco», №0713-17) в различных модельных условиях, определенных целями данной работы:

• Аэробные условия роста М. tuberculosis и М. bovis BCG

Выращивание культур М. tuberculosis и М. bovis BCG проводили в колбах объемом 200 мл с объемом среды 100 мл. Культуру микобактерий выращивали до логарифмической фазы роста (OD58o= 0,5) и разводили до OD580= 0,005 в конечном объеме свежей ростовой среды.

• Модель Wayne «без перемешивания» («Wayne dormancy model without stirring»).

Культуру M. bovis BCG выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом пластиковом матраце (объемом 25 мл фирмы "Linbro") при 37°С без перемешивания. Получаемая таким образом анаэробная культура соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model without string» (Wayne L.G. et al, 2001):

• Модель «поздней стационарной фазы» («Wayne old stationary phase model»)

Культуру M. bovis BCG выращивали в 100 мл среды в колбе объемом 200мл. при 37°С без перемешивания в течение 240 дней.

• Модель Wayne «с перемешиванием» («Wayne dormancy model with stirring»)

Культуру M. tuberculosis выращивали в 10 мл среды в плотно закрытом матраце (объемом 25 мл) с медленным перемешиванием (40 об./мин.). Получаемая таким образом анаэробная культура микобактерий соответствовала описанной в литературе модели персистенции «Wayne dormancy model with string») (Wayne LG. et al., 2001).

Выращивание культуры M. tuberculosis в условиях модели «Wayne dormancy model with stirring» проводилось в National Jewish Center, Денвер, Колорадо, США).

Выращенную микобактериальную культуру разливали по 1 мл в пробирки (1,5 мл типа Эппендорф), центрифугировали при 5000 об./мин. в течение 5 минут при комнатной температуре, супернатант удаляли.

Осадок микобактерий хранили при - 70°С до момента использования.

2. Состав сред, используемых для культивирования микобактерий.

Middlebrook-бульон (1 литр): Н20 - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл.

Middlebrook - агар (1 литр): Н2О - 900 мл, сухая среда Middlebrook - 47 г, глицерин - 2 мл, Tween 20 - 0,5 г, добавка ADC - 20 мл, агар -3,75 г.

3. Выделение тотальных нуклеиновых кислот (НК).

Центрифугировали 1 мл пробы при 5 000 об./мин. в течение 5 мин. К осадку клеток добавляли 1 мл 0,5 % раствора Tween 80. Встряхивали на вортексе до получения гомогенной взвеси. Центрифугировали при 10 000 об./мин. - 30 сек. Супернатант удаляли. К осадку клеток добавляли 100 мкл стеклянной дроби (Glass Beads 0,1 мм диаметром, обработанных НС1 - рН = 2). Добавляли 100 мкл холодного ли-зирующего буфера (100 мМ Li С1 ; 10 мМ трис рН = 7,8; 10 тМ ЭДТА; додецил -сульфат Na - 1% ). Встряхивали на вортексе при максимальной скорости в течение 4 мин. Однократно заморозили (- 70°С) в течение 20 мин. Добавляли еще 200 мкл того же буфера, встряхнули на вортексе 10 сек. Добавляли 750 мкл смеси - фенол: хлороформ: изоамиловый спирт - 25: 24:1 (ICN Biomedical Inc.) перемешали переворачиванием 5-6 раз. Инкубировали в ледяной бане 15 мин. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4°С. Переносили водную фазу в чистую пробирку и добавили равный объем изопропанола. Выдерживали при - 70°С в течение 2 часов. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 20 мин при + 4°С. Осторожно удаляли супернатант. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5-6 раз. Центрифугировали при 12 000 об./мин. - 5 мин. Добавляли 1 мл 75% этанола. Перемешивали переворачиванием 5-6 раз. Центрифугировали при 12

ООО об./мин. - 5 мин. Максимально удаляли супернатант, не затрагивая осадка. Подсушивали открытые пробирки на столе 15 мин. при комнатной температуре. Элюировали осадок в 100 мкл деионизированной воды.

4. Выделение тотальных рибонуклеиновых кислот (РНК).

Препараты тотальных РНК получали так же, как и тотальных НК до этапа элю-ции. Затем в каждую пробирку добавляли 30 мкл смеси: из расчета 2 ед. фермента ДНК-азы I («Fermentas») - 2 мкл, 40 ед. ингибитора РНК - аз (Rnasin, Ribonuclease Ingibitor «Fermentas») - 1 мкл, 10 x реакционный буфер - 3 мкл, 24 мкл деионизо-ванной Н20. Перемешивали на вортексе 10 сек, центрифугировали 2500 об./мин. -10 сек. Инкубировали при 37°С - 15 мин. Потом добавляли 20 мкл 0,5 мМ раствора ЭДТА. Перемешивали пипетированием и ставили в термостат для инактивации ДНК-азы при 65°С в течение 10 мин. Полученные пробы хранили при - 70°С.

В опытах по выделению тотальной РНК использовали осадки содержащие от 106 до 109 клеток. Использованный протокол выделения позволял получать в среднем 5 - 8 нг тотальной РНК в расчете на 106 клеток.

5. Конструирование внутреннего калибровочного стандарта (ВКС) для определения количества мишени с использованием ПЦР и ОТ-ПЦР.

Принцип конструирования ДНК-ВКС заключается в получении вектора со встроенной генетической последовательностью специфического гена, содержащего неспецифическую вставку размером 80 - 120 н.п. (Рис. 3).

80 -120 н.п. рВЮ22

80-12« н.п. . рВК322 специфическая последовательность дли посадки нары праймеров неспецифическая нуклеотидная последовательность промотеры фагов 8Р6 и Т7.

ДНК-ИКС

РНК - транскрипт

Рисунок 3. Принцип конструирования внутреннего калибровочного стандарта (ДНК-ВКС и РНК-ВКС).

Генетические конструкции для наработки специфических ДНК - и РНК - ВКС были получены в Центре Биоинженерии РАН. Препараты ДНК - ВКС ( специфические ДНК - фрагменты) и РНК - ВКС (специфические РНК - транскрипты) предоставлены нам в готовом для использования виде.

6. Применение ВКС для определения количества мишени в ПЦР и ОТ-ПЦР реакциях.

Принцип определения количества исследуемой генетической мишени в реакции ПЦР и ОТ-ПЦР состоял в титровании продуктов амплификации исследуемой мишени относительно известного количества внутреннего калибровочного стандарта (ВКС). Точно определить число копий мишени возможно в том случае, если полосы свечения продуктов амплификации мишени и ВКС совпадают по интенсивности на электрофорезе. В разработанных нами количественных ПЦР и ОТ-ПЦР системах такой подход позволил детектировать двукратное изменение количества исследуемой мишени (Рис. 4).

ДНК - ВКС (360 н.п.) мишень - ген dnaK (247 н.п.)

Рисунок. 4. Двукратное титрование мишени - гена dnaK относительно ВКС. Количество ДНК - ВКС - 80 копий в каждой ПЦР реакции; количество мишени соответственно: 1 - 160; 2 - 80; 3 - 40; 4 - 20 копий ДНК; 5 - маркер молекулярных масс.

Приведены результаты одного из многих однотипных экспериментов.

В данном примере количество исследуемой мишени определяли, учитывая, что интенсивность сигналов на электрофореграмме от продуктов амплификации ДНК - ВКС и исследуемой мишени совпадала в треке №2 и соответствовала 80 - и копиям ДНК мишени.

7. Подбор праймеров для исследования экспрессии генов М. tuberculosis.

На каждый ген М tubérculo sis было подобрано по 2 - 3 пары праймеров. В результате работы на каждый ген отобрана одна оптимальная пара праймеров по критерию наибольшей чувствительности ПЦР систем (Таб.2).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Обозова, Татьяна Анатольевна, Москва

1. Богаделышкова И.В., Перельман М.И. Антибактериальная терапия туберкулеза легких. -М- 1997.- 80с.

2. Вишневская Е.Б., А.П.Бобченок, Н.Н.Мельникова, Б.И.Вишневский. Идентификация L форм микобактерий туберкулезного комплекса с применением полиме-разной цепной реакции (ПЦР). Проблемы туберкулеза. - 2001. - №4. - С.38 - 40.

3. Владимирский М.А. Методы молекулярной биологии в диагностике туберкулеза. 2003.- №3. - С.20 - 31.

4. Власов В.В., Филипенко M.JL, Никонова A.B., Норкипа О.В., Краснов В.А., Ку-рунов Ю.Н., Киншт В.Н., Попов А.Н. Применение молекулярно биологических методов в диагностике туберкулеза. 2000.- №4.- С. 16 - 24.

5. Герасимов В.Н., С.Ф.Бикетов, Е.А.Голов, В.Д.Потапов, И.В.Бахтеева, О.Г.Николаева. Особенности тонкой структуры микобактерий туберкулеза, культивированных в макрофагах мыши. Проблемы туберкулеза. 2003. - №7. - С.52 -58.

6. Дорожкова И.Р., З.С.Земскова, В.П.Круду. L трансформация микобактерий в свете современной эпидемиологической ситуации по туберкулезу в мире. Проблемы туберкулеза. - 1995. - №7. - С.30 - 33.

7. Мишин В.Ю. Современные режимы химиотерапии туберкулеза легких, вызванного лекарственно чувствительными и лекарственно - резистентными микобакте-риями // РМЖ.- 2003.- №21.- С.23.

8. Морозова Т.И., В.И. Завалев, E.H. Моклецов, A.B. Абузов. Микробиологические исследования при туберкулезе и пути их совершенствования. VII съезд фтизиатров. Москва. 2003.

9. Прозоровский С. В. Роль L форм в персистенции патогенных бактерий. Вестник Академии Медицинских Наук. - 1985.- №3,- С.З - 9.

10. Прозоровский С. В., Л.Н.Кац, Г.Я.Каган. L формы бактерий. - М.- 1981.-161с.

11. Степаншина В.Н., Панферцев Е.А., Митрофанова Г.Н., Коробова О.В.,Степаншин Ю.Г., Шемякин И.Г.,Медведева WM.il Проблемы Туберкулеза.-2000.-№1 .-С.32-36.

12. Хейфец Л.Б. Современные подходы к выявлению лекарственной устойчивости у больных туберкулезом. VII съезд фтизиатров. Москва. 2003.

13. Туберкулез. Руководство для врачей // Под редакцией Хомеико А.Г. М. -1996.-493 с.

14. Хоменко А.Г., Чуканов В.И. Туберкулез возвращается // Медицина и жизнь,-1999. нояб. - дек. - С.14 - 21.

15. Четверин А.Б., Е.В.Четверина. Преодоление проблем ПЦР диагностики с помощью метода молекулярных колоний. Молекулярная медицина.- 2002.- №4. - С.20 -31.

16. Belasco, J. G., G. Nilsson, A. von Gabain, and S. N. Cohen. The stability of colt gene transcripts is dependent on determinants localized to specific mRNA segments // Cell. -1986.- Vol.46. -P.245 251.

17. Brown David H., Beth A.Miles and Bruce S.Zwilling. Growth of Mycobacterium tuberculosis in BCG Resistant and - Susceptible Mice: Establishment of Latency and Reactivation // Infection and Immunity.-1995.-Vol.63.- P.2243 - 2247.

18. Boon Calvin, Rong Li, Robert Qi, and Thomas Dick. Proteins of Mycobacterium bo-vis BCG induced in Wayne dormancy model // J. Bacteriol. -2001. Vol.183.- P.2672 -2676.

19. Boon Calvin and Thomas Dick. Mycobacterium bovis BCG response regulator essential for hypoxic dormancy // J.Bacteriol. 2000. - Vol.184.- P.6760 - 6767.

20. Butcher, P.D., Mangan, J.A., Monahan, M., Intracellular gene expression analysis of RNA from mycobacteria in macrophages using RT-PCR // Methods Mol. Biol.- 1998. -Vol. 101.- P. 285 -306.

21. Collins С. H., J. M.Grange, and M. D.Yates. // Tuberculosis bacteriology ¡organization and practice // Butterworth Heinemann, Oxford, England. 1997.- P. 98-110.

22. Chaves, F., Alonso-Sanz, M., Rebollo, M.J., Tercero, J.C., Jimenez, M.S., Noriega, A.R. rpoB mutations as an epidemiologic marker in rifampin resistant Mycobacterium tuberculosis //Int. J. Tuberc. Lung Dis. - 2004. - Vol.2 - P. 765-770.

23. Cole, S.T. Comparative mycobacterial genomics // Curr. Opin. Microbiol. 1998. -Vol.1.-P.567-571.

24. Tuberculosis and Tubercle Bacillus. Edited by Stewart T.Cole et al. 2005. - ASM Press, Washington,D.C.

25. Cox, J. S., B. Chen, M. McNeil, and W. R. Jacobs, Jr. Complex lipid determines tissue-specific replication of Mycobacterium tuberculosis in mice // Nature. -1999. -Vol.402.-P.79-83.

26. Adam F.Cunningham and Claire L.Spreadbury. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen depletion: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton a-crystallin homolog//J.Bacteriol. 1997. - Vol.180. - P.801- 808.

27. DeMario J., Zhang J, C.Ko, Bishai WR. Mycobacteria tuberculosis sigF is part of a gene cluster with similarities to the Bacillus sigF and sigB operon // Tubercl.Lung Dis.-1997.-Vol.78.-P.3 -12.

28. DeMario J., Y.Zhang, C.Ko, D.B. Joung, and W.R.Bishai. A stationary phase stress response sigma facrtors from Mycobacterium tuberculosis // Proc. Natl.Acad.Sci USA. -1996. - Vol.93.- P.2790 - 2794.

29. DesJardin, L. E., Y. Chen, M. D. Perkins, L. Teixiera, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Microbial markers as surrogates for response to chemotherapy of tuberculosis // Am. J. Respir. Cril. Care Med.- 1996. Vol.155. - P.255.

30. DesJardin, L. E., M. D. Perkins, L. Teixeira, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Alkaline decontamination of sputum specimens adversely affects stability of mycobacterial mRNA // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P.2435 - 2439.

31. Dye, C., Scheele, S., Dolin, R, Pathania, V., Raviglione, M.C. Global burden of tuberculosis. Estimated incidence, prevalence and mortality by country // JAMA. 1999. -Vol.282. - P.677 - 686.

32. Eisenach, K. D., M. D. Sifford, M. D. Cave, J. H. Bates, and J. T. Crawford. Detection of Mycobaclerium tuberculosis in sputum samples using a polymerase chain reaction //Am. Rev. Respir. Dis.- 1991. Vol.144.- 1160- 1163.

33. Ellner, J. J., A. R. Hinman, S. W. Dooley, M. A. FischI, K. A. Sepkowitz, M. J. Goldberger, T. M. Shinnick, M. D. Iseman, and W. R. Jacobs. Tuberculosis symposium: emerging problems and promise // J. Infect. Dis. -1993. Vol.168. - P.537 - 551.

34. Gabain Von, A, J. G. Belasco, J. L. Schottel, A- C. Y. Chang, and S. N. Cohen. Decay of mRNA in Escherichia coli: investigation of the fate of specific segments of transcripts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - Vol.80. - P.653 - 657.

35. Gomez J.E. and J.D. McKinney. Mycobacterium tuberculosis persistence, latency, and drug tolerance // Tuberculosis. 2004. - Vol.84. - P.29 - 44.

36. Gamboa, F., J. M. Manterola, B. Vinado, L. Mates, M. Gimenez, J. Lonca, J. R. Manzano, C. Rodrigo, P. J. Cardona, E. Padilla, J. Dominguez, and V. Ausina. Direct detection of Mycobaclerium tuberculosis complex in nonrespiratory specimens by Gen-Probe

37. Amplified Mycobacterium tuberculosis Direct Test // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol.35. - P.307 - 310.

38. Goble, M., M. D. Iseman, L. A. Madsen, D. Waite, L. Ackerson, and C. R. Hors-burgh. Treatment of 171 patients with pulmonary tuberculosis resistant to isoniazid and rifampin//N. Engl. J. Med. 1993. Vol.328.-P.527-532.

39. Haiford, W. P., V. C. Falco, B. M. Gebbhardt, and D. J. J. Carr. The inherent quantitative capacity of the reverse transcription-polymerase chain reaction // Anal. Biochem. -1999.-Vol.266.-P.181 191.

40. Hellyer, T. J., L. E. DesJardin, G. L. Hehman, M. D. Cave, and K. D. Eisenach. Quantitative analysis of mRNA as a marker for viability of Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. - P.290 - 295.

41. Hu Yanmin, Coates ARM. Transcription of two sigma 70 gomologue genes sigA and sigB in stationary phase Mycobacterium tuberculosis //J.Bacteriol. 1998. - Vol.181. -P.469 - 476.

42. Hu Yanmin, Antony R.M.Coates, Danis A.Mitchison. Sterilizing activities of fluoroquinolones against rifampin tolerant population of Mycobacterium tuberculosis II Antimicrobial agents and chemotherapy. - 2003. - Vol.47. - P.653 - 657.

43. Jou, N.-T., R. B. Yoshimori, G. R. Mason, J. S. Louie, and M. R. Liebling. Singletube, nested, reverse transcriptase PCR for detection of viable Mycobacierium tuberculosis //Clin. Microbiol. -1997.- Vol.35. P.l 161 - 1165.

44. Kaprelyants A.S., J.C.Gottschal, and D.B.Kell. Dormancy in nonsporulating bacteria // FEMS Microbiol. Rev.- 2000. Vol.104. - P.271 - 286.

45. Kobzik, L., Schoen, F.J. The lung. In: Cotran, R.S., Kumar, V.K., Robbins, S.L., Schoen, F.J. (Eds.), Pathologic Basis of Disease // Saunders, Philadelphia, PA. 1994.-Vol.12-P.673 - 735.

46. Lovannisci, D. M., and E. S. Winn-Deen. Ligalion amplification and fluorescence detection of Mycobaclerium tuberculosis DNA // Mol. Cell. Probes. 1993. - Vol.7. - P.35.

47. Lim A., M.Eleuterio, B.Hutter, B.Murugasu-Oei, and T.Dick. Oxygen depletion induced dormancy in Mycobacterium bovis BCG //J.Bacteriol. 1999. - Vol.181. - P.2252- 2256.

48. Manabe Yukari C., Jong Min Chen, Chiew G. Ko, Ping Chen, and William Bishai.

49. Conditional Sigma Factor Expression, Using the Inducible Acetamidase Promotor, Reveals that the M. tuberculosis sig F Gene Modulaters Expression of the 16-Kilodalton Alopha-Crystallin Homologue // J.Bacteriol. 2003. - Vol.181. - P. 7629 -7633.

50. Mangan, J. A., K. M. Sole, D. A. Mitchison, and P. D. Butcher. Aneffective method of RNA extraction from bacteria refractory to disruption, including mycobacteria // Nucleic Acids Res. -1997. Vol.25. - P.675 - 676.

51. Manganelli R., E .Dubnau, S.Tyagi, F. R .Kramer and I .Smith Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis II Molecular Microbiology.-1999.- Vol.31.-P. 715 724.

52. Martin Casabona, N., D. Xairo Mimo, T. Gonzalez, J. Rossello, and L. Arcalis. Rapid method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis by using DNA probes // J. Clin. Microbiol. -1997. - Vol.35. - P.2521 - 2525.

53. Mitchison, D. A. Basic mechanisms of chemotherapy // Chest. 1979. - Vol.3. -P.771.

54. Mitchison, D. A. Understanding the chemotherapy of tuberculosis current problems // J. Antimicrob. Chemother. - 1992. - Vol.29. - P.477 - 493.

55. Miyamoto, J., H. Koga, S. Kohno, T. Tashiro, and K. Hara. New drug susceptibility test for Mycobacterium tuberculosis using the hybridization protection assay // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P.1323 - 1326.

56. Moore, D. F., J. L Curry, C. A. Knot, and V. Jonas. Amplification of rRNA for assessment of treatment response of pulmonary tuberculosis patients during antimicrobial therapy // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34. - P. 1745 - 1749.

57. Mshana, R. N., G. Tadesse, G. Abate, and H. Miorner. Use of 4,5 dimethylthiazol -2,5 -diphenyl tetrazolium bromide for rapid detection of rifampin - resistant Mycobacterium tuberculosa/}. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol.36. - P. 1214 - 1219.

58. Musser, J. M. Antimicrobial agent resistance in mycob.iclcria: molecular genetic insights II Clin. Microbiol. Rev.- 1995. Vol.8. - P.496 - 514.

59. Michel T.M., C.Ko, and W.R.Bishai. Exposure to antibiotics induces expression of the Mycobacterium tuberculosis sigF gene: implication for chemotherapy against mycobacterial persistors //Antimicrob.Agents Chemother. 1999. - Vol.43. - P.218 - 225.

60. Smeulders Marjan J., Jacquie Keep, Richard A.Speight, and Huw D. Williams. Adaptation of Mycobacterium smegmatis to Stationary Phase // Journal of Bacteriology. -1999.-Vol.181.-P. 270-283.

61. Voscuil Martin I. Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency // Tuberculosis. 2004. - Vol.84. - P.138 - 143.

62. Voscuil Martin I., K.C.Visconti, G.K.Schoolnik. Mycobacterium tuberculosis gene expression during adaptation to stationary phase and low-oxygen dormancy // Tuberculosis. 2004. -Vol.84. - P.218 - 227.

63. Mariani, R, Cappelli, G., Riccardi, G„ Colizzi, V. Mycobacterium tuberculosis H37Rv comparative gene expression analysis in synthetic medium and human macrophage// Gene. 2000. - Vol.253. - P.281 - 291.

64. Mahairas, G. G., P. J. Sabo, M. J. Hiekey, D. C. Singh, and C. K. Stover. Molecular analysis of genetic differences between Mycobacterium bovis BCG and virulent M. bovis //J. Bacteriol. 1996. - Vol.178. - P.1274 - 1282.

65. Marino, M., T. Hoffmann, R. Schmid, H. Mobitz, and D. Jahn. Changes in protein synthesis during the adaptation of Bacillus subtilis to anaerobic growth conditions // Microbiology. 2000. - Vol.146. - P.97 - 105.

66. Monahan, I. M., J. Betts, D. K. Banerjee, and P. D. Butcher. Differential expression of mycobacterial proteins following phagocytosis by macrophages // Microbiology. -2001,- Vol.147. -P.459 471.

67. Naderi A., Ahmed A. A., Barbosa-Morais N. L., Aparicio S., Brenton J. D. and Caldas C. Expression microarray reproducibility is improved by optimising purification steps in RNA amplification and labeling II BMC Genomics. 2004. - Vol.5. - P.9 - 18.

68. Niranjala Muttucumary D.G., Gretta Roberts, Jason Hinds, Richard A. Stabler, Tanya

69. Parish. Gene expression profile of Mycobacterium tuberculosis in a nonereplicating state // Tuberculosis. 2004. -Vol.84. - P.239 - 246.

70. Narberhaus, F. Negative regulation of bacterial heat shock genes // Mol. Microbiol. -1999.-Vol. 31. P.l - 8.

71. Parrish, N.M., Dick, J.D., Bishai, W.R. Mechanisms of latency in Mycobacterium tuberculosis //Trends Microbiol. 1998. - Vol.6. - P. 107 - 112.

72. Patel, B.K., Banerjee, D.K., Butcher, P.D. Determination of Mycobacterium leprae viability by polymerase chain reaction amplification of 71-kDa heat-shock protein mRNA // J. Infect. Dis. 1993. - Vol.168. - P.799 - 800.

73. Raviglione, M. C., D. E. Snider, and A. Kochi. Global epidemiology of tuberculosis: morbidity and mortality of a worldwide epidemic // JAMA. 1995. - Vol.273. - P.220 -226.

74. Ratledge Colin and Jeremy Dale «Mycobacteria Molecular Biology and Virulence»// Blackwell Science Ltd Websiet.- 1999: wwvv.blackwell-science.com.

75. Scanga Charles A., V.P. Mohan, Heather Joseph, Keming Yu, John Chan, and JoAnne L.Flynn. Reactivation of Latent Tuberculosis: Variations on the Cornell Murine Model // Infection and Immunity. 1999. - Vol.67.- P. 4531-4538.

76. Smith Clare V. and James C. Sacchettini. TB drug discovery: addressing issues of persistence and resistance // Current Opinion in Structual Biology. 2003.- Vol.13.- P. 658-664.

77. Shinnick, T. M, and R. C. Good. Diagnostic mycobacteriology laboratory practices // Clin. Infect. Dis. 1995. - Vol.21. - P.291 - 299.

78. Schukkink, B. van Gemen, and P. R. Klatser. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification // Antimicrob.Agents Chemother. 1994. - Vol.38. - P. 1959 -1965.

79. Sherman, D. R., M. Voskuil, D. Schnappinger, R. Liao, M. I. Harrell, and L G. K. Schoolnik. Regulation of the Mycobacterium tuberculosis hypoxic response gene encoding alpha-crystallin // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2001. - Vol.98. - P.7534 - 7539.

80. Sudre, P., G. ten Dam, and A. Kochi. Tuberculosis: a global overview of the situation today // Bull. W. H. O. 1992. - Vol.70. - P. 149 -154.

81. Taniguchi, H., H. Aramaki, Y. Nikaido, Y. Mizuguchi, M. Nakamura, T. Koga, and S. Yoshida. Rifampin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis II FEMS Microbiol. Lett. 1996. - Vol.144. - P. 103 -108.

82. Telenti, A., P. Imboden, F. Marchasi, D. Lowrie, S. Cole, M. J. Colston, L. Matter, K. Schopfer, and T. Bodmer. Detection of rifampin resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis II Lancet. 1993. - Vol.341. - P.647 - 650.

83. Tenover, F. C., J. T. Crawford, R. E. Huebner, L. J. Geiter, C. R. Horsburgh, Jr., and R. C. Good. The resurgence of tuberculosis: is your laboratory ready? // J.Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. - P.767 - 770.

84. Van der Vliet, G. M. E, R. A. F. Schukkink, B. van Gemen, P. Schepers, and P. R. Klatser. Nucleic acid sequence-based amplification (NASBA) for the identification of mycobacteria// J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol.139. - P.2423 - 2429.

85. Van der Vliet, G.M., Schepers, P., Schukkink, R.A., Van Gemen, B., Klatser, P.R. Assessment of mycobacterial viability by RNA amplification // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. - Vol.38. - P.1959 - 1965.

86. Wayne L.G., Lin K-Y. Glyoxylate metabolism and adaptation of Mycobacterium tuberculosis to survival under anaerobic conditions // Infect.Immun. 1982. - Vol.37. -P. 1042 - 49.

87. Wayne L.G., and L.G.Hayes. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence // Infect. Immun. 1996. - Vol.64 - P.2062 - 2069.

88. Wayne L.G., Hayes LG. Nitrate reduction as a marker for hypoxic shiftdown of Mycobacterium tuberculosis II Tuberc.Lung.Dis. 1998. - Vol.79. - P. 127 - 132.

89. Wayne L.G. and Sohaskey C.D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis II Annu. Rev. Microbiol. 2001. - Vol.55. - P.139 - 163.

90. Watterson, S. A., S. M. Wilson, M. D. Yates, and F. A. Drobniewski. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis / /J. Clin. Microbiol. 1998.-Vol.36.-P.1969- 1973.

91. Wiker, H. G., and M. Harboe. The antigen 85 complex: a major secretion product of Mycobaclerium tuberculosis II Microbiol. Rev.- 1992. Vol.56. - P.648 - 661.

92. Yuan Y., D.D.Grane, C.E. Barry. Stationary phase-associated protein expression in Mycobacterium tuberculosis: Function of the mycobacterial a-crystallin homolog // J.Bacteriol. 1996. - Vol.178. - P.4484 - 4492.

93. Zhang, Y., B. Heym, B. Alien, D. Young, and S. Cole. The catalase-peroxidase geneand isoniazid resistance of Mycobacterium tuberculosis // Nature. 1992. - Vol. 358. -P.591 - 593.

Информация о работе

Обозова, Татьяна Анатольевна
кандидата биологических наук
Москва, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Генетические маркеры жизнеспособности и персистенции Mycobacterium tuberculosis на моделях in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы