Структурно-функциональный анализ транскриптома Mycobacterium tuberculosis при развитии инфекции in vivo

Скворцов, Тимофей Алексеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональный анализ транскриптома Mycobacterium tuberculosis при развитии инфекции in vivo
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ транскриптома Mycobacterium tuberculosis при развитии инфекции in vivo"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК Институт биоорганической химии им. академиков ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова

На правах рукописи

СКВОРЦОВ ТИМОФЕЙ АЛЕКСЕЕВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМА MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ПРИ РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИИ IN VIVO

Специальность 03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

2 ИЮН 2011

Москва-2011

4848421

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Научный руководитель:

докт. биол. наук

Татьяна Лёодоровна Ажикина

Официальные оппоненты:

докт. биол. наук, профессор чл.-корр. РАН, докт. биол. наук

Арсений Сумбатович Капрельянц Сергей Михайлович Деев

Ведущая организация:

Центр «Биоинженерия» РАН

Защита состоится «» ¿¿/гу-ся 2011г. в часов на

заседании диссертационного совета Д 002.019.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437,ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан « /3 » М&А- 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор физ.-мат. наук

В. А. Олейников

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Инфекционные заболевания, несмотря на все усилия, предпринимаемые мировым врачебным и научным сообществами, остаются серьёзной проблемой, унося каждый год миллионы человеческих жизней. Особую актуальность проблема инфекционных заболеваний приобретает в последнее время, что связано с рядом факторов, среди которых можно выделить увеличение плотности и мобильности населения, возникновение штаммов патогенов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью, появление и распространение новых заболеваний за счет расширения ареала обитания человека и создания в ходе хозяйственной деятельности новых ниш обитания микроорганизмов. Таким образом, в настоящее время особо необходима интенсификация исследований в области профилактики и лечения инфекционных заболеваний.

Туберкулез уносит каждый год около 2 млн жизней, занимая лидирующие позиции по числу смертей от инфекционного заболевания, вызываемого одним возбудителем, и уступая по этому показателю лишь ВИЧ/СПИД. Возбудителем туберкулёза является внутриклеточная паразитическая бактерия Mycobacterium tuberculosis. По данным ВОЗ, около 30% населения Земли инфицированы М tuberculosis, при этом вероятность развития активной формы туберкулёза в течение жизни у латентных носителей патогена составляет 10%, что соответствует возникновению 8-9 млн новых случаев туберкулеза в мире каждый год. Развитие инфекционного процесса проходит через несколько стадий, на каждой из которых Mycobacterium tuberculosis подвергается характерному спектру внешних негативных воздействий. Успешное выживание патогена на каждой из этих стадий требует от него быстрой адаптации к изменениям условий среды обитания, каковой является организм хозяина. В основе подобных адаптации лежит динамическое изменение экспрессии генов патогена.

Так как изменения в экспрессии генов, возникающие в ответ на защитную реакцию организма хозяина, являются необходимым условием для выживания и размножения патогенных бактерий, то изучение подобных изменений необходимо для лучшего понимания молекулярных механизмов патогенеза туберкулеза. Анализ микобактериального транскриптома in vivo позволяет установить гены, активирующиеся на различных стадиях заболевания, и, следовательно, помочь в разработке новых лекарственных препаратов и диагностических средств.

Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлось выявление динамических изменений экспрессии генов Mycobacterium tuberculosis в тканях модельных организмов, обладающих генетически детерминированными различиями устойчивости к заболеванию, а также их структурный и сравнительный анализ.

Были поставлены следующие задачи:

1. Разработать новый экспериментальный подход для изучения транскриптома внутриклеточных патогенов в системе in vivo. Оценить эффективность метода на модельной системе - охарактеризовать транскриптом М tuberculosis штамма H37Rv в инфекционной системе (легкое мыши, инфицированной М tuberculosis). Разработать программные алгоритмы статистической и биоинформатической обработки получаемых массивов данных.

2. С использованием разработанного метода получить наборы последовательностей М. tuberculosis H37Rv, транскрибирующихся в тканях легкого инфицированных мышей линии I/St, сверхчувствительных к инфекции, и В6, резистентных к инфекции, на 4-й и б-й неделях с момента заражения. Определить нуклеотидные последовательности транскриптов методом массированного секвенирования.

3. Провести сравнительный анализ экспрессии генов М. tuberculosis в легочной ткани инфицированных мышей; определить гены, меняющие уровень своей экспрессии при развитии инфекции; выявить биохимические пути, с помощью которых М. tuberculosis адаптируется к защитной реакции организма хозяина.

Научная новизна и практическая ценность работы

В ходе данной работы был разработан новый метод обогащения образца тотальной кДНК, полученной из инфицированной ткани хозяина, фрагментами кДНК бактериального патогена. Метод КлИП (Клонирование Идентичных Последовательностей) основан на гибридизации двух пулов ДНК и последующей избирательной амплификации целевой фракции фрагментов ДНК за счет эффекта супрессии ПЦР. Метод универсален и может быть применен для получения РНК как других внутриклеточных паразитических или симбиотических бактерий, так простейших и вирусов.

Разработанный нами метод был применен для анализа транскриптомов М. tuberculosis НЗ 7Rv из легочной ткани инфицированных мышей линии A/Sn на 9-й неделе с момента инфекции. Мыши линии A/SnYCit (A/Sn) при инфекциях М tuberculosis проявляют сравнительно высокий уровень резистентности к заболеванию. Анализ транскриптома М tuberculosis выявил изменения в профиле экспрессии генов патогена, характерные для хронической фазы инфекции, которая характеризуется определенными функциональными перестройками, в частности, усилением метаболизма липидов и переходом к нитратному клеточному дыханию.

В ходе экспериментальной работы были получены библиотеки кДНК М. tuberculosis из тканей легкого инфицированных модельных организмов (мышей), обладающих различными уровнями генетически детерминированной резистентности к заболеванию. Впервые был осуществлен анализ последовательностей микобактериальных кДНК при помощи метода полномасштабного секвенирования RNA-Seq. В ходе работы подобраны оптимальные способы статистического анализа данных и создан набор программ, позволяющих эффективно обрабатывать большое количество нуклеотидных последовательностей, отбирая необходимые по заданному ряду критериев.

Было установлено несколько молекулярно-генетических детерминант, характеризующих М. tuberculosis из различных моделей инфекции; выявлен ряд генов, продукты которых являются необходимыми для размножения бактерий и развития инфекции вне зависимости от генотипа хозяина и представляют тем самым объекты потенциального терапевтического воздействия. Дальнейшие исследования в области изучения экспрессии генов патогена позволят расширить спектр молекулярно-генетических детерминант, характеризующих развитие инфекции по тому или иному пути, что, в свою очередь, даст возможность более точной диагностики и достоверного прогнозирования течения заболевания и, следовательно, выбора оптимальной стратегии лечения.

Структура диссертации

Диссертация изложена на ^ ^ листах машинописного текста, имеет традиционную структуру и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, экспериментальной части, изложения результатов работы и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего Z33 ссылки, и Lf приложений.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МЕТОД КЛОНИРОВАНИЯ ИДЕНТИЧНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ (КлИП) И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ АНАЛИЗА БАКТЕРИАЛЬНОГО ТРАНСКРИПТОМА М. TUBERCULOSIS IN VIVO

Анализ специфической экспрессии генов патогенов (микроорганизмов и простейших) в инфицированном организме представляет собой широко распространенную задачу как в исследовательских лабораториях, где он нацелен на получение данных о взаимодействиях организма и патогена, так и, в перспективе, в клинике, где сведения о качественном и количественном содержании различных РНК патогена могут служить средством диагностики и прогноза течения болезни. Однако анализ существующими методами транскриптома патогенной бактерии в непосредственной инфекционной среде (пораженной ткани) затруднен из-за сложностей, связанных с выделением бактериальной РНК, ее чрезвычайно малого количества и проблемы отделения бактериальной РНК от подавляющего количества тотальной РНК хозяина, в то время как изучение экспрессии генов бактерий при их выращивании в жидкой среде и имитации реальных условий инфекции не отражает реальной картины, возникающей при развитии болезни.

Мы использовали метод Клонирование Идентичных Последовательностей (КлИП, Coincidence Cloning, СС) для извлечения кДНК бактериального патогена из смеси с кДНК мыши. Метод заключается в гибридизации тотальной кДНК, синтезированной из РНК, выделенной из инфицированных тканей, со значительным молярным избытком бактериальной геномной ДНК и последующей избирательной амплификацией фрагментов при помощи ПЦР. Реассоциация бактериальной кДНК с избытком бактериальной геномной ДНК является процессом с псевдомономолекулярной кинетикой. Вследствие этого гибридизация в течение достаточного времени позволяет предотвратить появдение искажений в представленности различных микобактериальных транскриптов и делает возможным количественный анализ бактериального транскриптома из инфицированных клеток хозяина.

Синтез тотальной кДНК

Тотальная РНК была выделена из ткани легкого инфицированных мышей линии A/SnYCit (далее - A/Sn) на 9-й неделе с момента заражения стандартным способом, заключающимся в обработке животных аэрозолем, содержащим 1-2хЮ2КОЕ М.

tuberculosis H37Rv'. кДНК была синтезирована при помощи технологии SMART (Clontech). Для затравки синтеза первой цепи кДНК был использован праймер, имеющий в составе нонануклеотид d(N)<j, соединенный на 5'-конце с последовательностью, идентичной олигонуклеотиду SMART и содержащей сайт рестрикции эндонуклеазы Rsal. После завершения обратной транскрипции кДНК была амплифицирована с использованием праймера, комплементарного константным участкам на 5'и З'-концах первых цепей кДНК.

Клонирование идентичных последовательностей (КлИП)

Для того чтобы выделить кДНК бактерии из смеси с кДНК мыши, был использован метод Клонирования Идентичных Последовательностей, позволяющий из двух образцов ДНК избирательно выделять фрагменты, одновременно присутствующие в обоих образцах (Рис. 1 А). Для этого два образца ДНК рестрицировали с помощью частощепящей эндонуклеазы рестрикции. Затем проводили лигирование супрессионных адаптеров к фрагментам рестрикции из обоих наборов. Далее два набора подготовленных таким образом фрагментов ДНК объединяли, денатурировали и медленно ренатурировали. Одинаковые последовательности из разных наборов образуют гибридные дуплексы, содержащие на 5'-концах различные супрессионные адаптеры. Последовательности, встречающиеся только в одном из 2-х наборов ДНК, могут образовывать лишь гомодуплексы с идентичными адаптерами на концах, что предотвращает возможность их амплификации в ходе ПЦР за счет эффекта ПЦР-супрессии, в то время как гибридные дуплексы эффективно амплифицируются (Luk'ianov el al, 1996).

Геномная ДНК М. tuberculosis H37Rv была рестрицирована эндонуклеазой рестрикции Rsal, после этого было осуществлено лигирование к полученным фрагментам адаптера I. Смесь кДНК мыши и М. tuberculosis также была обработана Rsal, затем к полученным фрагментам лигировали супрессионный адаптер II. Подготовленные подобным образом фрагменты геномной ДНК и кДНК были взяты в равных по массе количествах и смешаны. Известно, что содержание микобактериальной РНК составляет всего лишь 0,04-0,2% от тотальной РНК (Banaiee et al, 2006), поэтому молярное соотношение между микобактериальной ДНК и микобактериальной кДНК в смеси превысило 1:100. Полученная смесь была денатурирована при 99°С в течение 3 минут и

' Работа по инфицированию животных проведена сотрудниками ЦНИИ Туберкулеза РАМН.

медленно ренатурирована при 68°С в течение 16 часов. Полученные в результате дуплексы были амплифицированы. ПЦР-амплификация была проведена с использованием праймеров Pr I и Pr II, комплементарных внутренним участкам адаггтерных последовательностей I и II, соответственно. Селективность амплификации была продемонстрирована при помощи ПЦР с использованием одного из двух внутренних праймеров, при этом не происходило образования ампликонов (гомодуплексов), в то время как использование сразу обоих внутренних праймеров приводило к образованию целевого продукта (гибридного дуплекса) (Рис. 1Б).

ПЦР продукт представлял собой набор фрагментов, обогащенный кДНК М. tuberculosis, селективно амплифицированных из смеси фрагментов кДНК микобактерий и мыши. Чтобы оценить достигнутое обогащение ПЦР продукта бактериальной кДНК было проведено его молекулярное клонирование в Е. coli, и определена нуклеотидная последовательность 75 рекомбинантных клонов, отобранных случайным образом. 22 клона (24%) содержали вставки, нуклеотидная последовательность которых совпадала с последовательностями геномной ДНК мыши, в то время как остальные клоны (76%) содержали вставки, соответствующие различным участкам геномной последовательности М. tuberculosis. Наличие в последнем случае во вставках двух различных адаггтерных последовательностей указывало на то, что вставки были образованы из гетеродуплексов, т.е. гибридных последовательностей геномной ДНК и кДНК микобактерий. Все последовательности, картируемые на геном мыши, обладали лишь одной адаптерной последовательностью I, что свидетельствовало об отсутствии гибридных молекул кДНК мыши и геномной ДНК М. tuberculosis.

Суммарная кДНК из

инфицированной

ткани

КДНК Г)4ГО'1»Н<1

Лигирование Адаптер II супрессионных ;

адаптеров

Геномная ДНК iuron!H¡i

Адаптер I

Рг I Prl + Prll Pr II 100 Ьр íadder

1. Денатурация/рематурация

2, Достройка "липки*" концов

Гомо дуплексы

Гетеродупяексы

ПЦР с

прайме рами ото Pr I и Pr II

О)

(2)

Амплификация отсутствует

Рисунок 1. А) Схема метода КлИП. Б) Проверка эффективности супрессии ПЦР при использовании каждого из праймеров (Pr I и Pr II). В) Электрофореграмма результатов ПЦР гена Rvl664 с матрицы тотальной кДНК (1) и с матрицы ампликона КлИП (2). Цифрами обозначен цикл ПЦР, на котором был осуществлен отбор части образца для электрофоретического анализа; (+) - положительный контроль (ПЦР с матрицы геномной ДНК М tuberculosis, 40 циклов); (-) - отрицательный контроль (ПЦР без добавления матричной ДНК, 40 циклов).

Сравнительную оценку содержания транскриптов в исходном образце кДНК и в ампликоне провели для 15 случайным образом отобранных генов М. tuberculosis методом ПЦР с ген-специфическими праймерами. Так как относительное содержание бактериальной кДНК в тотальной кДНК чрезвычайно мало, в ходе ПЦР образовывались неспецифические продукты, поэтому мы использовали полуколичественную ПЦР с анализом накопления продукта через каждые 2 цикла (Рис. 1В). Несмотря на то, что наличие транскриптов всех 15 генов было обнаружено в ампликоне, лишь 10 из них было детектировано в образце тотальной кДНК, причиной чего являлось низкое относительно содержание бактериальной кДНК в препарате тотальной кДНК. Учитывая, что транскрипты 16S рРНК были визуализированы нами на 32 цикле ПЦР амплификации при использовании тотальной кДНК в качестве матрицы, мы разделили все тестируемые гены на 3 группы: 1) слаботранскрибируемые гены (5 из 15) не детектируются в исходном образце, но достоверно представлены (28-39 цикл ПЦР) в ампликоне; 2)

высокотранскрибируемые гены (5 генов, детектируемых на 35-36 циклах ПЦР для образца кДНК и 8-20 циклах для ампликона) и 3) среднетранскрибируемые гены (5 генов, детектируемых на 39-40 циклах ПЦР для образца кДНК и 22-28 циклах и 8-20 циклах для ампликона). Относительная представленность транскриптов разных геновв достаточной степени сохраняется в обоих сравниваемых образцах. Мы также сравнили полученные нами в результате ПЦР данные со схожими литературными данными (Talaat et al, 2007.). В целом, наблюдалась достаточно высокая степень согласования результатов, выявленные же различия можно отнести на счет как различий в инфекционных моделях (различное время инфекции, другие линии мышей), так и методических особенностей обоих экспериментальных подходов.

Таким образом, нами было продемонстрировано, что КлИП сохраняет не только качественный, но и количественный профиль транскриптома; кроме того, чувствительность метода позволяет анализировать даже самые низкопредставленные транскрипты (на примерах транскриптов, не детектируемых в образце тотальной кДНК).

Анализ библиотеки CC(ASN)

Было проведено массированное секвенирование полученного образца кДНК и получены данные для 98692 независимых реакций секвенирования (далее «прочтений»). Проведено картирование этих нуклеотидных последовательностей фрагментов кДНК при помощи алгоритма standalone BLASTn на последовательность генома М tuberculosis H37Rv (сборка GenBank AL123456.2). Картирование проводилось согласно следующим условиям: длина участка последовательности, картируемой на геном - не менее 40 нт, с идентичностью не менее 95%; последовательности, картируемые неуникально (на 2 или более места в геноме), либо не картируемые, были исключены из дальнейшего анализа. В результате было получено 53940 уникально картируемых прочтений. Эти последовательности были далее проанализированы с целью выявить гены и межгенные (IGR, intergenic region) последовательности. Выявлена экспрессия 554 генов (13,8% от общего количества генов М. tuberculosis), 158 из них экспрессировались на достаточно высоком уровне (более 20 прочтений на ген). Результаты картирования приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Результаты секвенирования и картирования библиотеки CC(ASN).

Прочтений, всего 98692

МЛ-специфических прочтений, уникальных 53940

МИ>специфических прочтений (уникальных), % от всех 54,7

Генов экепрессируется (прочтений>0) 554

Генов экепрессируется, % от общего количества генов 13,8

После завершения картирования гены, для которых были найдены кДНК, были

отнесены к основным биохимическим категориям согласно базе данных TubercuList (http://tiiberculist.epfl.ch (Таблица 2). Из-за высокой степени идентичности нуклеотидной последовательности генов транспозаз невозможно было провести однозначное отнесение фрагментов кДНК к генам этой функциональной категории (insertion sequences and phages), поэтому её не учитывали в дальнейшем анализе транскриптома.

Таблица 2. Аннотация генов, экспрессирующихся у М. tuberculosis H37Rv в легочной ткани мышей линии A/Sn на 9-й неделе с момента инфицирования, к биохимическим категориям.

Категория Количество экспрессирующихся генов в категории Количество генов категории в геноме % экспрессирующихся генов в категории

Cell wall and cell processes Conserved hypotheticals 111 149 773 1081 14,4 13,8

Information pathways Intermediary metabolism and respiration 31 139 241 923 12,9 15,1

Lipid metabolism 50 247 20,2

PE/PPE 15 168 В,9

Regulatory proteins 26 195 13,3

Unknown 2 16 12,5

Virulence,

detoxification, 22 228 9,6

adaptation

ВСЕГО 545 3872

В категории генов липидного метаболизма нами были найдены транскрипты 50 из 247 генов данной категории, что свидетельствует о высокой активности метаболизма липидов у микобактерий из изучаемого образца, среди них 18 генов семейства /ас!,

являющихся ацил-КоА синтезами. Повышенная экспрессия генов данного семейства является характерной для микобактерий in vivo, так как наблюдается усиление липолиза при переходе к использованию жирных кислот и холестерина в качестве источника ацильных групп для цикла Кребса. Отдельно стоит отметить экспрессию генов fadD26 и fadD28, продукты которых участвуют в пути биосинтеза фтиоцерол димикоцерозата (PDIM), сложного липида, присутствующего в клеточной стенке М. tuberculosis', генов ppsC и ppsD, поликетид-синтаз, также вовлеченных в синтез PDIM; генов семействаpks, pks2 и pks6, необходимых для синтеза сульфолипида SL и нового, пока ^охарактеризованного, класса полярных липидов (Waddell, 2007).

Известно, что при переходе инфекции в латентное состояние происходит ряд важных перестроек в энергетическом метаболизме микобактерий. Наиболее характерной из них является изменение клеточного дыхания, при этом осуществляется переход к использованию нитрата в качестве конечного акцептора электронов в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ). Мы обнаружили экспрессию генов кластера narGHIJ и гена пагХ, кодирующих субъединицы нитрат-редуктаз, а также гена пагКЗ, кодирующего транспортный белок, осуществляющий вывод нитрита из бактериальной клетки.

Обнаружена повышенная экспрессия генов, продукты которых тем или иным образом связаны с метаболизмом аминокислот (hisВ, aspC). Помимо этого мы выявили высокий уровень экспрессии генов phoHl и alsА. Ген phoHl кодирует белок с неизвестной функцией, экспрессия этого гена повышается при дефиците фосфатов; продукт гена alsA является арилсульфатазой, ферментом, осуществляющим отщепление сульфата от его ароматических производных. Несмотря на то, что точная функциональная роль в метаболизме микобактерий продуктов этих 2-х генов не установлена, можно предположить, что их экспрессия связана с дефицитом неорганических сульфата и фосфата в микроокружении М. tuberculosis и необходима для устранения этого дефицита.

Таким образом, можно говорить о том, что проанализированный бактериальный транскриптом действительно качественно и количественно соответствует хронической фазе инфекционного процесса, который характеризуется усилением метаболизма липидов и переходом к нитратному клеточному дыханию (Waddell, 2010). .

2. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ М. TUBERCULOSIS В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ИНФИЦИРОВАННЫХ МЫШЕЙ С РАЗЛИЧНОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К ЗАБОЛЕВАНИЮ.

Помимо механизмов, участвующих в защите хозяина, развитие инфекционного процесса во многом зависит от специфической экспрессии бактериальных генов. Изменения в экспрессии, возникающие в ответ на защитную реакцию организма-хозяина, являются необходимым условием для выживания и функционирования патогенных бактерий. Анализ этих изменений необходим для понимания патогенеза инфекционного заболевания и выработки подходов к наиболее эффективному лечению.

Нами было проведено сравнительное исследование транскриптомов М tuberculosis в условиях in vivo с тем, чтобы установить какие именно особенности профиля экспрессии генов микобактерий ведут к прогрессирующему заболеванию и чем эффективные механизмы защиты отличаются от дефектных на уровне экспрессии бактериальных генов. Для этого на разных этапах инфекционного процесса нами был предпринят сравнительный количественный и качественный анализ последовательностей, транскрибирующихся при инфекции мышей, генетически чувствительных (неэффективный иммунный ответ) и резистентных (эффективный ответ) к этим бактериям.

Мы провели сравнение транскриптомов М tuberculosis H37Rv при инфекции мышей двух линий, I/StSnEgYCit (I/St) и C57BL/6JCit (В6). Эти линии мышей ранее подробно описаны (Kondratieva, 2010), была показана повышенная устойчивость к инфекции М tuberculosis мышей линии В6 в сравнении с мышами линий I/St, что выражается в менее агрессивном течении инфекционного процесса у мышей линии В6 и более длительной выживаемости инфицированных животных (Рис. 2). Так, патологические изменения в легких мышей линии I/St, зараженных М tuberculosis, характеризуются наличием некротизирующейся грануломы, окруженной гипоксической зоной, и обширным притоком нейтрофилов, что является дополнительным фактором, приводящим к повреждениям тканей легкого, в то время как у мышей В6 подобной картины не наблюдается.

•ё1

-о 100 0>

ш Ol.

О 100 200 300 400 Days post infection

1000000001

10000000'

1000000

100000

10000

Weeks post-infection

Рисунок 2. Сравнение развития инфекции М. tuberculosis в тканях легкого мышей линий В6 и I/St. А) Выживаемость мышей обеих линий. В) Бактериальная нагрузка в легочной ткани мышей обеих линий (рисунок цитируется по Kondratieva etat, 2010).

Получение и количественная характеристика последовательностей М. tuberculosis, транскрибирующихся в легочной ткани мышей с генетически детерминированными различиями в устойчивости к инфекции.

Было осуществлено аэрогенное заражение самок мышей обеих линий бактериями М. tuberculosis*'. Спустя 4 и 6 недель с момента инфекции зараженные мыши обеих линий были умерщвлены, выделена тотальная РНК легких. Образцы тотальной РНК тканей легкого мышей I/St и В6 были использованы для синтеза кДНК, обогащенной далее фрагментами бактериальной кДНК при помощи метода КлИП. Получены 3 библиотеки последовательностей, представляющие собой транскриптомы М. tuberculosis из тканей мышей линии I/St на 6-й неделе с момента инфекции (CC6(SUS)) и из тканей мышей линии В6 на 4-й и 6-й неделях с момента инфекции (CC4(RES) и CC6(RES), соответственно). Библиотеки были проанализированы методом 454 пиросеквенирования (Центр «Биоинженерия» РАН). Общая схема эксперимента приведена на Рисунке 3, общая характеристика проанализированных библиотек приведена в Таблице 3. Всего были определены нуклеотидные последовательности 190031 фрагмента кДНК. Из них в

Работа по инфицированию животных проведена сотрудниками ЦНИИ Туберкулеза РАМН.

CC4(RES) были определены 73410 последовательности, 75655 - в образце CC4(SUS), 40966- в CC6(RES).

Картирование нуклеотидных последовательностей проводилось способом, описанным ранее для образца CC(ASN). По результатам картирования было установлено, что в образце CC4(RES) 14990 (20,42%) последовательностей являются последовательностями М. tuberculosis, в образце CC6(SUS)- 43618 (57,65%) и в образце CC6(RES) - 34234 (83,57%). Приведенные результаты свидетельствуют о том, что удалось достигнуть значительного обогащения образцов кДНК бактериальными последовательностями.

В6 (Res)

МТВ H37RV infection

l/St (Sus)

4,:' week 6я week 6" week

Total RNA

Total cDNA

Coincidence Cloning 454 pyrosequencing

Comparative analysis of transcriptomes

Рисунок 3. Общая схема эксперимента по сравнению экспрессии генов М. tuberculosis va тканей легкого мышей линий В6 и I/St на 4-й и 6-й неделях с момента инфекции.

Таблица 3. Результаты секвенирования и картирования библиотек CC4(RES), CC6(RES) и CC6(SUS)

Библиотека CC4(RES) CC6(SUS) CC6(RES)

Прочтений, всего 73410 75655 40966

МЛ-специфических прочтений, уникальных 14990 43618 34234

МЙэ-специфических прочтений (уникальных), % от всех 20,4 57,7 83,6

Генов экспрессируется (прочтений>0) 1012 1353 1940

Генов экспрессируется, % от общего количества генов 25,2 33,7 48,3

Анализ транскриптомов

Анализ полученных транскриптомов был проведен с использованием аннотации генома М. tuberculosis 1137Rv из базы данных Tuberculist fhttp://tuberculist.epfl.ch'). Для получения качественной и количественной оценки экспрессии генов картированные на геном последовательности были соотнесены с положением как кодирующих, так и некодирующих участков М. tuberculosis. При подсчете количества картированных на каждый ген и межгенный участок последовательностей была учтена возможность котранскрипции в рамках одной последовательности двух или более генов и/или межгенных участков. Из 4012 генов и 7 псевдогенов М. tuberculosis в образце CC4(RES) наблюдалась экспрессия 1012 (25,2%), в образце CC4(SUS) - 1353 (33,7%), в образце CC6(RES) - 1940 генов (48,3%). 1428 ген (35,5%) не показал экспрессию ни в одном из образцов, в то время как для 469 (11,7%) генов экспрессия наблюдалась в каждом из образцов. Распределение по функциональным категориям экспрессирующихся генов каждой из библиотек приведено на Рисунке 4. Мобильные элементы (инсерционные последовательности и фаги) были исключены из дальнейшего анализа, также как и ранее. Подробная функциональная аннотация генов проанализированных транскриптомов, а также их принадлежность к тем или иным метаболическим путям приведены в Приложении к диссертации.

Функциональные категории SKCC6(Res) , CC6(Sus) aCC4(Res)

Virulence, detoxification, adaptation Unknown Regulatory proteins PE/PPE Lipid metabolism Intermediary metabolism and respiration Information pathways Conserved hypothetlcals Cell wall and cell processes

Процентное содержание от всех генов в библиотеке

Рисунок 4. Аннотация генов M tuberculosis H37Rv, экспрессирующихся в образцах легочной ткани мышей линий В6 на 4-й и 6-й неделе с момента инфекции (CC4(RES) и CC6(RES)) и мышей линий I/St на 6-й неделе с момента инфекции (CC6(SUS)), к биохимическим категориям.

Гены, экспрессия которых повышается при развитии инфекции.

Нами было проведено сравнение транскриптомов при развитии инфекции в генетически устойчивой линии мышей (CC6(RES) vs CC4(RES)) и сравнение транскриптомов туберкулеза в одной временной точке в генетически различных мышах (CC6(RES) vs CC6(SUS)). Данные анализа суммированы на рисунке 5. Сравнение было направлено на поиск поиск генов, экспрессия которых повышается при развитии инфекции, т.е. в мышах линии В6 на 6 неделе по сравнению с другими точками. Определяли:

1) гены, повышенная экспрессия которых уникальна при сравнении генетически различных хозяев

2) гены, повышенная экспрессия которых независима от генетических особенностей организма хозяина. Эти гены представляют некий базовый набор генов, отражающий универсальную компенсаторную реакцию М. tuberculosis на неблагоприятные условия окружающей среды. Эти гены обозначены далее как CUG -Commonly Upregulated Genes.

Сравнение CC6(SUS) vs CC4(RES)

Сравнение CC6(RES) us CC6(SUS)

Гены, чья экспрессия

чья экспрессия

в обоих сравнениях

Повышенная экспрессия 8 CCSfRES] из сравнения CC6(RES) vs CC6(SUS]

Рисунок 5. Схема сравнения транскриптомов.

Для определения достоверно значащих различий в экспрессии, дифференциально экспрессирующимися считались последовательности, для которых как минимум в одном из образцов насчитывалось не менее 20 прочтений и для которых вероятность отсутствия статистически значимых отличий втесте Audic-Claverie была менее 0.001 (pO.OOl) (Audic & Claverie, 1997) и q-value при вычислении FDR (меры контроля числа ложноположительных результатов) было менее 0.05 (Storey, 2003).

Сравнение CC6(RES) vs CC4(RES) позволило нам выявить 226 генов, экспрессия которых повышена в ходе развития инфекции в тканях мышей В6. В результате сравнения CC6(RES) vs CC6(SUS) установлено 253 гена с повышенной экспрессией в образце CCÔ(RES) (см. рис.5).

Уникальные для каждого сравнения гены, экспрессия которых повышается при развитии инфекции

В сравнении CC6(RES) vs CC4(RES) определено 17 уникальных генов, что меньше, чем в сравнении CC6(RES) vs CC4(SUS), где повышена экспрессия 44 генов. Вероятно, данная статистика отражает тот факт, что первое сравнение характеризует динамику изменения экспрессии генов патогена во времени в пределах одного микроокружения. Во втором случае сравнение выявляет различия между двумя разными микроокружениями, что и отражается в большем количестве генов, экспрессия которых повышена в CC6(RES).

Гены, экспрессия которых повышена в образце CC6(RES) только в сравнении с CC4(RES), преимущественно относятся к категориям cell wall and cell processes, intermediary metabolism and respiration и lipid metabolism. Белковые продукты 12 из 17 генов были обнаружены во фракции клеточной мембраны и/или клеточной стенки, где они выполняют преимущественно транспортные и защитные функции. Так, ген етЬА

кодирует индолилацетилинозитол арабинозилтрансферазу ЕшЬА, участвующую в синтезе арабинана, мутации в этом гене приводят к устойчивости к этамбутолу; ген Rv3273 кодирует карбонат-дегидратазу, функциональная активность которой связана с транспортом сульфатов (TubercuList, http://tuberculist.epfl.ch1. После проведенного нами анализа с использованием KEGG Pathways (http://www.genome. jp/kegg/pathwav.html) и TBCYC fhttp://tbcvc.tbdb.org/) мы не смогли обнаружить метаболических путей, активирующихся на более позднем сроке развития инфекции по сравнению с ранним. Этот факт может быть следствием случайных флуктуаций в экспрессии генов патогена, его реакцией на такие же случайные изменения свойств микроокружения, либо же отражать небольшие, но существенные различия функциональной активности М tuberculosis & различных временных точках.

В образце CC6(RES) из сравнения CC6(RES) vs CC4(SUS) было обнаружено больше генов, чья экспрессия была повышена исключительно в этом сравнении. Усиление энергетического обмена выражено в повышенной экспрессии генов 3-х субъединиц NADH-дегидрогеназы (пиоН, nuol, nuoL)\ более активной работе цикла трикарбоновых кислот (асп), а также наличии повышенной экспрессии гена Rvl916. Ген Rvl916является второй частью гена лсеЛ(/'с/2), разделенного у М tuberculosis H37Rv на два модуля, Rv¡915и Rvl916(aceAa и асеАЬ), которые экспрессируются по отдельности. Среди других важных отличий можно отметить также повышенную экспрессию генов, продукты которых отвечают за метаболизм и катаболизм липидов и аминокислот (lipV, lipF, Rv2S31c), а также ферментов, участвующих в репарации ДНК (гесО, гесВ). Подобная картина достаточно предсказуема, так как микроокружение резистентного хозяина представляет собой враждебную среду обитания, что объясняет необходимость большей активности систем репарации. Повышенная экспрессия липолитических ферментов (lipF, lip V, plcA), ферментов цикла трикарбоновых кислот и асеАЬ могут указывать на большую степень использования липидов в качестве источника энергии и углерода.

CUGs - гены, необходимые М tuberculosis для адаптации к различным защитным механизмам организма хозяина

Было определено 209 генов, экспрессия которых была увеличена в обоих сравнениях. Продукты 44 генов являлись, согласно результатам транспозонного мутагенеза, незаменимыми (essential, Sassetti et al., 2003) y M tuberculosis H37Rv; ещё для трех генов (Rv3S69e, Rv3537, Rv3563) транспозонным мутагенезом ранее была показана

незаменимость для выживания в мышиных макрофагах (TubercuList, http://tuberculist.epfl.ch).

Чуть меньше трети генов приходилось суммарно на категории conserved hypothetical (59 генов) и unknown (2 гена). Несмотря на отсутствие известных функций, гены в данной категории представляют потенциальные терапевтические мишени, так как невысокая степень гомологии этих генов с генами других микроорганизмов означает, что данные гены являются характерными именно для микобактерий или конкретно для М. tuberculosis; возможно определяя вирулентные свойства.

Функция белков семейства РЕ/РРЕ, не вполне понятна, считается, что они необходимы для создания антигенной вариабельности у микобактерий (Karboul ct а/, 2008). Тем не менее, гены Rv0152c\\ RiúJSSc обладают высоким уровнем экспрессии в образце CC6(RES) и для них была обнаружена экспрессия в образцах CC4(RES) и CC4(SUS), а ген Rv3135относится к числу незаменимых у М tuberculosis H37Rv, что может указывать на какие-либо дополнительные функции, помимо обеспечения антигенной вариабельности.

В числе прочих особенностей, присущих CUG, можно отметить активность путей метаболизма аминокислот. Непонятно, вызвана ли активация экспрессии ферментов метаболизма аминокислот отсутствием в среде доступных аминокислот (и необходимостью их синтеза) либо же их присутствием (и использованием возможности их утилизации). В пользу того, что микобактерии оказываются в бедных питательными веществами условиях, указывает высокий уровень экспрессии генов различных систем захвата и накопления питательных веществ, например, фосфата (pstSI), железа {irtA, mbtC, mbtE, mbtF). На нехватку фосфата указывает и повышенная экспрессия гена senX3, являющегося сенсорным компонентом двухкомпонентной регуляторной senX3lregX3, активирующей так называемый «строгий ответ» (stringent response) в условиях дефицита фосфора. На переход к использованию в качестве основного источника энергии и углерода указывает экспрессия генов метаболизма липидов (fadD\ íkdE, lipU, lipJ). На переход к характерному для латентной инфекции анаэробному нитратному дыханию указывает повышенная экспрессия генов (пагНпагКЗ). Наконец, стоит отметить ген secA2. Этот ген кодирует транслоказу SecA2, являющуюся компонентом вспомогательной транспортной системы Sec М tuberculosis; обеспечивающей, помимо прочего, секрецию супероксид-дисмутазы SodA и каталазы KatG. Живая вакцина, созданная на основе мутанта М tuberculosis по гену «?сА2 (Hinchey etal, 2011), показала высокую

эффективность и безопасность при испытаниях на животных. В целом, можно сказать, что CUG отражает характерные особенности инфекции в мышиной модели, кроме того факта, что мы обнаружили повышение экспрессии генов atpF и atpH, хотя в литературе обычно описывается снижение их экспрессии при развитии инфекции, так как энергетические потребности патогена снижаются по мере того, как он входит в состояние латентной инфекции.

Представленность генов CUG в библиотеке CC(ASN)

После секвенирования обогащенных библиотек кДНК и соответствующей биоинформатической обработки в нашем распоряжении оказались данные о 4-х транскриптомах Mycobacterium tuberculosis (CC4(RES), CC6(RES), CC6(SUS) и CC9(ASN)). Для того чтобы выяснить, насколько экспрессия CUG характерна для микобактерий, мы предприняли анализ ранее полученного транскриптома CC(ASN) на предмет присутствия в нем транскриптов этих генов. В результате мы выявили 90 кодирующих различные белки генов, относящихся к CUG и присутствующих в библиотеке CC(ASN) (полный список приведен в приложении к диссертации). Среди этих генов, можно выделить ряд таких, уровень экспрессии которых высок как в образце CC6(RES), так и в образце CC(ASN) (Таблица 4). В их числе гены систем метаболизма жирных кислот (iadD26, ттаАЗ, ppsC, ppsD) и аминокислот (hisB, aspQ, гены pstSJ и phoHl, участвующие в реакции М. tuberculosis на дефицит фосфора; kstD и Rv! 106с, продукты которых участвуют в метаболизме холестерина, сюда также может быть отнесен ген Rv078$, предположительно так же, как и kstD, кодирующий З-кетостероид-5-1-дегидрогеназу; Rv0712 и atsA, кодирующие ферменты, необходимые для метаболизма серы; а также ряд генов, кодирующих продукты с неопределенной функцией.

Таблица 4. С110 гены с высоким уровнем экспрессии (число прочтений >20).

Gene Alt. Functional Functional description

name name category

Rv2930 fadD26 lipid metabolism Acyl-coa synthase

Rv0643c ттаАЗ lipid metabolism Methoxy mycolic acid synthase 3 mmaa3 (methyl mycolic acid synthase 3) (mma3) (hydroxy mycolic acid synthase)( ec:2.1.1.79 )

Rv2933 ppsC lipid metabolism Phenolpthiocerol synthesis type-i polyketide synthase ppsc

Rv2934 ppsD lipid metabolism Phenolpthiocerol synthesis type-i polyketide synthase ppsd

Rv0337c aspC intermediary metabolism and respiration Aspartate aminotransferase( EC:2.6.1.- )

RvlóOl hisB intermediary metabolism and respiration Imidazoleglycerol-phosphate dehydratase( EC:4.2.1.19 )

Rv0934 pstSl cell wall and cell processes Periplasmic phosphate-binding lipoprotein pstsl (pbp-1) (pstsl)

Rv2368c phoHl intermediary metabolism and respiration Probable phoh-like protein phohl (phosphate starvation-inducible protein psih)

Rv3537 kstD intermediary metabolism and respiration 3-ketosteroid-deIta-1 -dehydrogenase

Rv0785 Rv0785 conserved hypotheticals Hypothetical protein

Rv 1106c Rv 1106c intermediary metabolism and respiration Probable cholesterol dehydrogenase

Rv0711 atsA intermediary metabolism and respiration Possible arylsulfatase atsa (aryl-sulfate sulphohydrolase) (arylsulphatase)(ec:3.1.6.1 )

Rv0712 Rv0712 conserved hypotheticals Hypothetical protein

Заключение

В данной работе впервые проведен параллельный широкомасштабный анализ транскриптомов М tuberculosis в системе in vivo с использованием масштабного секвенирования. Получены данные о последовательностях М. tuberculosis, транскрибирующихся в легочных тканях генетически устойчивых и чувствительных к туберкулезу мышей в различных временных точках, что дало возможность установить факторы, ответственные за осуществление адаптации патогена к условиям конкретного микроокружения. Полученные транскриптомы М. tuberculosis были охарактеризованы качественно и количественно, выявлен ряд генов, уровень экспрессии которых инвариантно повышен при развитии инфекции. Экспрессия генов из этого ряда может рассматриваться как универсальная реакция микобактерий на различные стрессовые факторы внешней среды.

Выводы

1. Разработан новый универсальный метод анализа транскриптомов внутриклеточных патогенов из пораженной ткани организма хозяина, основанный на обогащении и последующем массированном секвенировании полученного набора бактериальной кДНК. Разработаны биоинформатические и статистические подходы к обработке полнотранскриптомных данных. Высокая чувствительность и специфичность метода продемонстрирована на примере анализа транскриптома М. tuberculosis в хронической фазе инфекции.

2. С помощью разработанного метода проведен анализ набора последовательностей M.tuberculosis H37Rv, транскрибирующихся в инфицированных тканях мышей, чувствительных и резистентных к инфекции, на 4-й и 6-й неделях развития болезни. В целом, структура транскриптома М. tuberculosis при развитии инфекции свидетельствует об активизации липидного метаболизма, метаболизма аминокислот, переходе к анаэробному дыханию, повышении экспрессии факторов модуляции иммунного ответа.

3. По результатам сравнительного анализа транскриптомов определено 209 генов, экспрессия которых повышается в ходе развития инфекции и не зависит от генетических особенностей организма-хозяина. Наибольший интерес представляют гены, относящиеся к функциональным категориям липидного метаболизма и клеточной стенки и клеточных процессов.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

Т. А. Скворцов, Т. Л. Ажикина. Анализ транскриптомов патогенных бактерий в инфицированном организме: проблемы и способы их решения. // Биоорганическая химия. 2010. Том 36, №5, с. 596—606.

Tatyana L. Azhikina, Timofey A. Skvortsov, Tatyana V. Radaeva, Andrey V. Mardanov, Nikolay V. Ravin, Alexander S. Apt, and Eugene D. Sverdlov. A new technique for obtaining whole pathogen transcriptomes from infected host tissues. // Biotechniques. 2010; 48(2): 139144.

Д. В. Игнатов, Т. А. Скворцов, К. Б. Майоров, А. С. Апт, Т. Л. Ажикина. Адаптивные изменения профиля экспрессии генов Mycobacterium avium при заражении мышей, генетически чувствительных и резистентных к инфекции. // Acta Naturae. 2010. Том 2, №3(6), с. 57-62.

Skvortsov Т, Ignatov D, Apt A, Azhikina Т. Profiling of Mycobacterium tuberculosis gene expression during infection in genetically different mouse models. // FEBS Journal. Abstracts of the 35й FEBS Congress. 2010; 277(S1): 104.

Skvortsov, Т., D. Ignatov, A. Apt, Azhikina, T. A novel universal and powerful method for studying transcriptomes of intracellular pathogens during in vivo infection. Host-Microbes Interactions Spetsai Summer school EMBO/FEBS/IUBMB Advanced Course, Spetses, Greece, 2010, Abstract book, 100

Скворцов ТА, Апт AC, Ажикина ТЛ. (2010). Изучение транскриптома Mycobacterium tuberculosis in vivo - новый эффективный подход к выявлению генетических детерминант патогенности. VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Молекулярная диагностика-2010". Сборник трудов: 178-80.

Скворцов, Т.А., Апт, A.C., Ажикина, Т.Л. Широкомасштабный анализ экспрессии генов М. tuberculosis в инфицированной легочной ткани мышей различных линий. 14 международная пущинская школа-конференция молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пущино, 2010, Сборниктезисов, 180.

Скворцов, Т.А., Апт, A.C., Ажикина, Т.Л. Сравнительный анализ транскриптомов М tuberculosis in vivo. XXII зимняя международная молодежная научная школа

"Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, 2010, Сборник тезисов, 13.

Скворцов, Т.А., Ажикина, T.J1. Инновационные подходы к выявлению молекулярно-генетических детерминант патогенности Mycobacterium tuberculosis. Школа-конференция "Фундаментальная наука для биотехнологии и медицины", Москва, 2010, Сборник тезисов, 80-82.

Скворцов, Т.А., Игнатов, Д.В., Апт, A.C., Ажикина, Т.Л., Свердлов, Е.Д. Новый метод анализа экспрессии генов внутриклеточных патегенов человека и животных и его применение для изучения транскриптома М tuberculosis in vivo. VI Международная конференция "Молекулярная медицина и биобезопасность", Москва, 2009, Сборник тезисов, 200-202.

Скворцов, Т.А., Игнатов, Д.В., Апт, A.C., Ажикина, Т.Л., Свердлов, Е.Д. Новый метод анализа экспрессии генов внутриклеточных патогенов человека и животных и его применение для изучения транскриптома М. tuberculosis in vivo. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологиии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва, 2009, Сборник тезисов, 216.

Подписано в печать: 10.05.2011

Заказ № 5491 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скворцов, Тимофей Алексеевич

Содержание.

Список сокращений и биологических терминов.

Обзор литературы.

Транскриптомика Mycobacterium tuberculosis in vivo.

Введение.

I. Методология исследования экспрессии генов внутриклеточных патогенов.

1.1. Свойства бактериальной РНК.

I. 2. Методы анализа экспрессии генов in vivo.

I. 3. Амплификация РНК и синтез бактериальной кДНК.

I. 4. Обогащение с использованием гибридизационных методов.

I. 5. Анализ бактериальных транскриптомов при помощи метода RNA-seq.

II. Функциональный анализ транскриптомов Mycobacterium tuberculosis.

II. 1. Mycobacterium tuberculosis', патогенез.

II. 2. Молекулярная биология M.tuberculosis.

II. 3. Функциональный анализ транскриптомов М. tuberculosis.

11. 4. Эксперименты по полнотранскриптомному анализу Mycobacterium tuberculosis in vivo, используемые модели инфекции.

II. 5. Модели инфекции Mycobacterium tuberculosis.

A) Искусственная гранулема.

B) Фагоциты хозяина.

В) Моделирование инфекции М. tuberculosis в лабораторных животных.

Г) Исследование транскриптома Mycobacterium tuberculosis из тканей человека.

II. 6. Внутриклеточный транскриптом М. tuberculosis.

A) Метаболизм липидов.

Б) Энергетический метаболизм: клеточное дыхание.

B) Биосинтез белков и клеточный рост.

Г) Защитные механизмы, репарация ДНК.

Д) Клеточная стенка, мембрана и транспорт.

Е) Факторы вирулентности Mycobacterium tuberculosis.

Ж) Регуляция транскрипции.

II. 7. Динамика изменения транскриптома Mycobacterium tuberculosis - от первичного инфицирования через латентное состояние к реактивации.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Скворцов, Тимофей Алексеевич

Выводы

Заключение

В данной работе впервые проведен параллельный широкомасштабный анализ транскриптомов М. tuberculosis в системе in vivo с использованием технологий секвенирования нового поколения. Получены данные о последовательностях М. tuberculosis, транскрибирующихся в легочных тканях генетически устойчивых и чувствительных к туберкулезу мышей в различных временных точках, что дало возможность установить факторы, ответственные за осуществление адаптации патогена к условиям конкретного микроокружения. Полученные транскриптомы М. tuberculosis были охарактеризованы качественно и количественно, выявлен ряд генов, уровень экспрессии которых инвариантно повышен при развитии инфекции. Экспрессия генов из этого ряда может рассматриваться как универсальная реакция микобактерий на различные стрессовые факторы внешней среды.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скворцов, Тимофей Алексеевич, Москва

1. Abdallah, A. M., N. C. Gey van Pittius, et al. (2007). "Type VII secretion—mycobacteria show the wav." Nat Rev Microbiol 5(T H: 883-891.

2. Adilakshmi, T., P. D. Ayling, et al. (2000). "Polyadenylylation in mycobacteria: evidence for oligo(dT)-primed cDNA synthesis." Microbiology 146 ( Pt 3): 633-638.

3. Ahmad, S. (2011). "Pathogenesis, immunology, and diagnosis of latent Mycobacterium tuberculosis infection." Clin Dev Immunol 2011: 814943.

4. Aikawa, C., F. Maruyama, et al. (2010). "The dawning era of comprehensive transcriptome analysis in cellular microbiology." Frontiers in Microbiology 1.

5. Alber, T. (2009). "Signaling mechanisms of the Mycobacterium tuberculosis receptor Ser/Thr protein kinases." Curr Opin Struct Biol 19(6): 650-657.

6. Albrecht, M., C. M. Sharma, et al. (2010). "Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome." Nucleic Acids Res 38(3): 868-877.

7. Armour, C., J. Castle, et al. (2009). "Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis." Nature Methods 6(9): 647-649.

8. Arnvig, K. B. and D. B. Young (2009). "Identification of small RNAs in Mycobacterium tuberculosis." Mol Microbiol 73(3): 397-408.

9. Audic, S. and J. M. Claverie (1997). "The significance of digital gene expression profiles." Genome Res 7(10): 986-995.

10. Bacon, J., B. W. James, et al. (2004). "The influence of reduced oxygen availability onpathogenicity and gene expression in Mycobacterium tuberculosis." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 205-217.

11. Bacon, J. and P. D. Marsh (2007). "Transcriptional responses of Mycobacterium tuberculosis exposed to adverse conditions in vitro." Curr Mol Med 7(3): 277-286.

12. Bai, S. S. and R. L. Devi (2002). "Clinical spectrum of tuberculosis in BCG vaccinated children." Indian Pediatrics 39(5): 458-462.

13. Baltes, N., F. F. Buettner, et al. (2007). "Selective capture of transcribed sequences (SCOTS) of Actinobacillus pleuropneumoniae in the chronic stage of disease reveals an HlyX-regulated autotransporter protein." Vet Microbiol 123(1-3): 110-121.

14. Banaiee, N., W. R. Jacobs, Jr., et al. (2006). "Regulation of Mycobacterium tuberculosis whiB3 in the mouse lung and macrophages." Infect Immun 74(11): 6449-6457.

15. Banu, S., N. Honore, et al. (2002). "Are the PE-PGRS proteins of Mycobacterium tuberculosis variable surface antigens?" Mol Microbiol 44(1): 9-19.

16. Barry, C. E., 3rd, H. I. Boshoff, et al. (2009). "The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies." Nat Rev Microbiol 7(12): 845-855.

17. Bhatt, K., S. S. Gurcha, et al. (2007). "Two polyketide-synthase-associated acyltransferases are required for sulfolipid biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis." Microbiology 153(Pt 2): 513-520.

18. Bitter, W., E. N. Houben, et al. (2009). "Systematic genetic nomenclature for type VII secretion systems." PLoS Pathog 5(10): el000507.

19. Boshoff, H. I., T. G. Myers, et al. (2004). "The transcriptional responses of Mycobacteriumtuberculosis to inhibitors of metabolism: novel insights into drug mechanisms of action." J Biol Chem 279(38): 40174-40184.

20. Bottai, D. and R. Brosch (2009). "Mycobacterial PE, PPE and ESX clusters: novel insights into the secretion of these most unusual protein families." Mol Microbiol 73(3): 325-328.

21. Brennan, M. J. and G. Delogu (2002). "The PE multigene family: a 'molecular mantra' for mycobacteria." Trends Microbiol 10(5): 246-249.

22. Brosch, R., S. V. Gordon, et al. (2007). "Genome plasticity of BCG and impact on vaccine efficacy." Proceedings of the National Academy of Sciences 104(13): 5596-5601.

23. Brown, T. A. (2002). Genomes, Bios Scientific Publishers Ltd.

24. Butcher, P. D. (2004). "Microarrays for Mycobacterium tuberculosis." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 131-137.

25. Camus, J. C., M. J. Pryor, et al. (2002). "Re-annotation of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv." Microbiology 148(Pt 10): 2967-2973.

26. Cardona, P. J. (2009). "A dynamic reinfection hypothesis of latent tuberculosis infection." Infection 37(2): 80-86.

27. Cardona, P. J. and J. Ruiz-Manzano (2004). "On the nature of Mycobacterium tuberculosis-latent bacilli." Eur Respir J 24(6): 1044-1051.

28. Carninci, P., C. Kvam, et al. (1996). "High-efficiency full-length cDNA cloning by biotinylated CAP trapper." Genomics 37(3): 327-336.

29. Chao, M. C. and E. J. Rubin (2010). "Letting sleeping dos lie: does dormancy play a role in tuberculosis?" Annu Rev Microbiol 64: 293-311.

30. Chim, N., A. Iniguez, et al. (2010). "Unusual diheme conformation of the heme-degrading protein from Mycobacterium tuberculosis." J Mol Biol 395(3): 595-608.

31. Chopra, T. and R. S. Gokhale (2009). "Polyketide versatility in the biosynthesis of complex mycobacterial cell wall lipids." Methods Enzvmol 459: 259-294.

32. Cole, S. T., R. Brosch, et al. (1998). "Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the complete genome sequence." Nature 393(6685): 537-544.

33. Cole, S. T., K. Eiglmeier, et al. (2001). "Massive gene decay in the leprosy bacillus." Nature 409(6823): 1007-1011.

34. Converse, P. J., P. C. Karakousis, et al. (2009). "Role of the dosR-dosS two-componentregulatory system in Mycobacterium tuberculosis virulence in three animal models." Infect Immun 77(3): 1230-1237.

35. Converse, S. E., J. D. Mougous, et al. (2003). "MmpL8 is required for sulfolipid-1 biosynthesis and Mycobacterium tuberculosis virulence." Proc Natl Acad Sci U S A 100(10): 61216126.

36. Cook, G. M., M. Berney, et al. (2009). "Physiology of mycobacteria." Adv Microb Physiol 55: 81-182, 318-189.

37. Cosma, C. L., D. R. Sherman, et al. (2003). "The secret lives of the pathogenic mycobacteria." Annu Rev Microbiol 57: 641-676.

38. Croucher, N. J. and N. R. Thomson (2010). "Studying bacterial transcriptomes using RNA-seq." Curr Opin Microbiol 13(5): 619-624.

39. Demina, G. R., V. A. Makarov, et al. (2009). "Finding of the low molecular weight inhibitors of resuscitation promoting factor enzymatic and resuscitation activity." PLoS One 4(12): e8174.

40. Domenech, P., C. E. Barry, 3rd, et al. (2001). "Mycobacterium tuberculosis in the post-genomic age." Curr Opin Microbiol 4(1): 28-34.

41. Dye, C., S. Scheele, et al. (1999). "Consensus statement. Global burden of tuberculosis:estimated incidence, prevalence, and mortality by country. WHO Global Surveillance and Monitoring Project." JAMA 282(7): 677-686.

42. Edery, I., L. Chu, et al. (1995). "An efficient strategy to isolate full-length cDNAs based on anmRNA cap retention procedure (CAPture)." Molecular and Cellular Biology 15(6): 3363.

43. Ehlers, S. (2009). "Lazy, dynamic or minimally recrudescent? On the elusive nature and location of the mycobacterium responsible for latent tuberculosis." Infection 37(2): 87-95.

44. Ehrt, S. and D. Schnappinger (2009). "Mycobacterial survival strategies in the phagosome: defence against host stresses." Cell Microbiol 11(8): 1170-1178.

45. Eisenreich, W., T. Dandekar, et al. (2010). "Carbon metabolism of intracellular bacterial pathogens and possible links to virulence." Nat Rev Microbiol 8(6): 401-412.

46. Eruslanov, E. B., I. V. Lyadova, et al. (2005). "Neutrophil responses to Mycobacteriumtuberculosis infection in genetically susceptible and resistant mice." Infect Immun 73(3): 1744-1753.

47. Faucher, S. P., R. Curtiss, 3rd, et al. (2005)."Selective capture of Salmonella enterica serovar typhi genes expressed in macrophages that are absent from the Salmonella enterica serovar Typhimurium genome." Infect Immun 73(8): 5217-5221.

48. Faucher, S. P., C. A. Mueller, et al. (2011). "Legionella pneumophila transcriptome during intracellular multiplication in human macrophages." Frontiers in Microbiology 2.

49. Faucher, S. P., S. Porvvollik, et al. (2006). "Transcriptome of Salmonella enterica serovar Typhi within macrophages revealed through the selective capture of transcribed sequences." Proc Natl Acad Sei ü S A 103(6): 1906-1911.

50. Fenhalls, G., L. Stevens, et al. (2002). "In situ detection of Mycobacterium tuberculosistranscripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions." Infect Immun 70(11): 6330-6338.

51. Ferrer, N. L., A. B. Gomez, et al. (2010). "Interactions of attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP mutant with human macrophages." PLoS One 5(9): e 12978.

52. Fleischmann, R. D., D. Alland, et al. (2002). "Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains." J Bacteriol 184(19): 5479-5490.

53. Flynn, J. L. and J. Chan (2001). "Immunology of tuberculosis." Annu Rev Immunol 19: 93-129.

54. Flynn, J. L. and J. Chan (2003). "Immune evasion by Mycobacterium tuberculosis: living with the enemy." Curr Opin Immunol 15(4): 450-455.

55. Fontan, P., V. Aris, et al. (2008). "Global transcriptional profile of Mycobacterium tuberculosis during THP-1 human macrophage infection." Infect Immun 76(2): 717-725.

56. Gamier, T., K. Eiglmeier, et al. (2003). "The complete genome sequence of Mycobacterium bovis." Proc Natl Acad Sei U S A 100(13): 7877-7882.

57. Garton, N. J., S. J. Waddell, et al. (2008). "Cytological and transcript analyses reveal fat and lazy persister-like bacilli in tuberculous sputum." PLoS Med 5(4): e75.

58. Gheorghiu, M., M. Lagranderie, et al. (2010). "Tuberculosis and BCG." Vaccines: A Biography: 125-140.

59. Gill, W. P., N. S. Harik, et al. (2009). "A replication clock for Mycobacterium tuberculosis." Nat Med 15(2): 211-214.

60. Glickman, M. S. and W. R. Jacobs, Jr. (2001). "Microbial pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis: dawn of a discipline." CeH 104(4): 477-485.

61. Gonzalez, J. M. and F. T. Robb (2007). "Counterselection of prokaryotic ribosomal RNA during reverse transcription using non-random hexameric oligonucleotides." J Microbiol Methods 71(3): 288-291.

62. Gonzalo-Asensio, J., S. Mostowy, et al. (2008). "PhoP: a missing piece in the intricate puzzle of Mycobacterium tuberculosis virulence." PLoS One 3(10): e3496.

63. Graham, J. E. and R. Curtiss, 3rd (2001). "Identification of Salmonella typhi genes expressed within macrophages by selective capture of transcribed sequences (SCOTS)." Mol Microbiol 41(5): 1211-1222.

64. Hambraeus, G., C. von Wachenfeldt, et al. (2003). "Genome-wide survey of mRNA half-lives in Bacillus subtilis identifies extremely stable mRNAs." Mol Genet Genomics 269(5): 706714.

65. Hansen, K. D., S. E. Brenner, et al. (2010). "Biases in Illumina transcriptome sequencing caused by random hexamer priming." Nucleic Acids Res 38(12): el31.

66. Hatzios, S. K., M. W. Schelle, et al. (2009). "PapA3 is an acyltransferase required forpolyacyltrehalose biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis." J Biol Chem 284(19): 12745-12751.

67. Haydel, S. E. and J. E. Clark-Curtiss (2004). "Global expression analysis of two-component system regulator genes during Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages." FEMS Microbiol Lett 236(2): 341-347.

68. Hinchey, J., B. Y. Jeon, et al. (2011). "Lysine auxotrophy combined with deletion of the SecA2 gene results in a safe and highly immunogenic candidate live attenuated vaccine for tuberculosis." PLoS One 6(1): el5857.

69. Jain, M., C. J. Petzold, et al. (2007). "Lipidomics reveals control of Mycobacterium tuberculosis virulence lipids via metabolic coupling." Proc Natl Acad Sci U S A 104(12): 5133-5138.

70. Jassal, M. and W. R. Bishai (2009). "Extensively drug-resistant tuberculosis." The Lancet Infectious Diseases 9(1): 19-30.

71. Jin, H., Y. Wan, et al. (2008). "Identification of genes transcribed by Haemophilus parasuis in necrotic porcine lung through the selective capture of transcribed sequences (SCOTS)." Environ Microbiol 10(12): 3326-3336.

72. Kana, B. D., B. G. Gordhan, et al. (2008). "The resuscitation-promoting factors of

73. Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro." Mol Microbiol 67(3): 672-684.

74. Kana, B. D. and V. Mizrahi (2010). "Resuscitation-promoting factors as lytic enzymes for bacterial growth and signaling." FEMS Immunol Med Microbiol 58(1): 39-50.

75. Kana, B. D. and V. Mizrahi (2010). "Resuscitation promoting factors in bacterial population dynamics during TB infection." Drug Discovery Today: Disease Mechanisms.

76. Karakousis, P. C., T. Yoshimatsu, et al. (2004). "Dormancy phenotype displayed by extracellular Mycobacterium tuberculosis within artificial granulomas in mice." J Exp Med 200(5): 647-657.

77. Kato-Maeda, M., P. J. Bifani, et al. (2001). "The nature and consequence of genetic variability within Mycobacterium tuberculosis." J Clin Invest 107(5): 533-537.

78. Kaufmann, S. H. (2005). "Robert Koch, the Nobel Prize, and the ongoing threat of tuberculosis." N Engl J Med 353(23): 2423-2426.

79. Kaufmann, S. H. (2010). "Future vaccination strategies against tuberculosis: thinking outside the box." Immunity 33(4): 567-577.

80. Kaur, D., M. E. Guerin, et al. (2009). "Chapter 2: Biogenesis of the cell wall and otherglycoconjugates of Mycobacterium tuberculosis." Adv Appl Microbiol 69: 23-78.

81. Kendall, S. L., F. Movahedzadeh, et al. (2004). "The Mycobacterium tuberculosis dosRS two-component system is induced by multiple stresses." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 247255.

82. Kendall, S. L., S. C. Rison, et al. (2004). "What do microarrays really tell us about M. tuberculosis?" Trends Microbiol 12(12): 537-544.

83. Kesavan, A. K., M. Brooks, et al. (2009). "Tuberculosis genes expressed during persistence and reactivation in the resistant rabbit model." Tuberculosis 89(1): 17-21.

84. Kinhikar, A. G., I. Verma, et al. (2010). "Potential role for ESAT6 in dissemination ofM. tuberculosis via human lung epithelial cells." Mol Microbiol 75(1): 92-106.

85. Koch, R. (1982). "Classics in infectious diseases. The etiology of tuberculosis: Robert Koch. Berlin, Germany 1882." Rev Infect Pis 4(6): 1270-1274.

86. Kondratieva, E., N. Logunova, et al. (2010). "Host genetics in granuloma formation: human-like lung pathology in mice with reciprocal genetic susceptibility to M. tuberculosis and M. avium." PLoS One 5(5): el0515.

87. Koul, A., E. Arnoult, et al. (2011). "The challenge of new drug discovery for tuberculosis." Nature 469(7331): 483-490.

88. Kushner, S. R. (2002). "mRNA decay in Escherichia coli comes of age." J Bacteriol 184(17): 4658-4665; discussion 4657.

89. Malm, S., Y. Tiffert, et al. (2009). "The roles of the nitrate reductase NarGHJI, the nitrite reductase NirBD and the response regulator GlnR in nitrate assimilation of Mycobacterium tuberculosis." Microbiology 155(Pt 4): 1332-1339.

90. Manganelli, R., E. Dubnau, et al. (1999). "Differential expression of 10 sigma factor genes in Mycobacterium tuberculosis." Mol Microbiol 31(2): 715-724.

91. Manganelli, R., R. Provvedi, et al. (2004). "Sigma factors and global gene regulation in Mycobacterium tuberculosis." J Bacteriol 186(4): 895-902.

92. Marguerat, S. and J. Bahler (2010). "RNA-seq: from technology to biology." Cell Mol Life Sci 67(4): 569-579.

93. Marrero, J., K. Y. Rhee, et al. (2010). "Gluconeogenic carbon flow of tricarboxylic acid cycle intermediates is critical for Mycobacterium tuberculosis to establish and maintain infection." Proc Natl Acad Sci U S A 107(21): 9819-9824.

94. Martin-Orozco, N., N. Touret, et al. (2006). "Visualization of vacuolar acidification-induced transcription of genes of pathogens inside macrophages." Molecular biology of the cell 17(1): 498.

95. Matz, M., D. Shagin, et al. (1999). "Amplification of cDNA ends based on template-switching effect and step-out PCR." Nucleic Acids Res 27(6): 1558-1560.

96. McKinney, J. D., K. Honer zu Bentrup, et al. (2000). "Persistence of Mycobacteriumtuberculosis in macrophages and mice requires the glyoxylate shunt enzyme isocitrate lyase." Nature 406(6797): 735-738.

97. Merza, M. and M. R. Masjedi (2010). "Extensively drug-resistant tuberculosis (XDR) andextremely drug-resistant tuberculosis (XXDR): risk factors and molecular perspectives." Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 5(3): 174-188.

98. Mohanty, B. K. and S. R. Kushner (2006). "The majority of Escherichia coli mRNAs undergo post-transcriptional modification in exponentially growing cells." Nucleic Acids Res 34(19): 5695-5704.

99. Mohn, W. W., R. van der Geize, et al. (2008). "The actinobacterial mce4 locus encodes a steroid transporter." J Biol Chcm 283(51): 35368-35374.

100. Mortazavi, A., B. A. Williams, et al. (2008). "Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq." Nat Methods 5(7): 621-628.

101. Mraheil, M. A., A. Billion, et al. (2011). "The intracellular sRNA transcriptome of Listeria monocytogenes during growth in macrophages." Nucleic Acids Res.

102. Munoz-Elias, E. J. and J. D. McKinney (2006). "Carbon metabolism of intracellular bacteria." Cell Microbiol 8(1): 10-22.

103. Munoz-Elias, E. J., J. Timm, et al. (2005). "Replication dynamics of Mycobacterium tuberculosis in chronically infected mice." Infect Immun 73(1): 546-551.

104. Murray, J. F. (2004). "Mycobacterium tuberculosis and the cause of consumption: from discovery to fact." Am J Respir Crit Care Med 169(10): 1086-1088.

105. Narasimhan, S., M. J. Caimano, et al. (2003). "Borrelia burgdorferi transcriptome in the central nervous system of non-human primates." Proc Natl Acad Sci U S A 100(26): 1595315958.

106. Nikonenko, B. V., M. M. Averbakh, Jr., et al. (2000). "Comparative analysis of mycobacterial infections in susceptible I/St and resistant A/Sn inbred mice." Tuber Lung Pis 80(1): 1525.

107. Nygaard, V. and E. Hovig (2006). "Options available for profiling small samples: a review of sample amplification technology when combined with microarray profiling." Nucleic acids research 34(3): 996.

108. Ormerod, L. P. (2005). "Multidrug-resistant tuberculosis (MDR-TB): epidemiology, prevention and treatment." Br Med Bull 73-74: 17-24.

109. Ottenhoff, T. H. (2009). "Overcoming the global crisis: "yes, we can", but also for TB . ?" Eur J Immunol 39(8): 2014-2020.

110. Pallen, M. J., N. J. Loman, et al. (2010). "High-throughput sequencing and clinicalmicrobiology: progress, opportunities and challenges." Curr Opin Microbiol 13(5): 625631.

111. Pandey, A. K. and C. M. Sassetti (2008). "Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol." Proc Natl Acad Sei U S A 105(11): 4376-4380.

112. Park, H. D., K. M. Guinn, et al. (2003). "Rv3133c/dosR is a transcription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis." Mol Microbiol 48(3): 833-843.

113. Pearson, W. R. and D. J. Lipman (1988). "Improved tools for biological sequence comparison." Proc Natl Acad Sei U S A 85(8): 2444-2448.

114. Pereira, S. M., O. M. Dantas, et al. (2007). "BCG vaccine against tuberculosis: its protective effect and vaccination policies." Rev Saude Publica 41 Suppl 1: 59-66.

115. Perez, E., S. Samper, et al. (2001). "An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence." Mol Microbiol 41(1): 179-187.

116. Portnoy, V. and G. Schuster (2008). "Mycoplasma gallisepticum as the first analyzed bacterium in which RNA is not polvadenvlated." FEMS Microbiol Lett 283m: 97-103.

117. Pounds, S. and C. Cheng (2006). "Robust estimation of the false discovery rate." Bioinformatics 22(16): 1979-1987.

118. Rachman, H., M. Strong, et al. (2006). "Mycobacterium tuberculosis gene expression profiling within the context of protein networks." Microbes Infect 8(3): 747-757.

119. Rachman, H., M. Strong, et al. (2006). "Unique transcriptome signature of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary tuberculosis." Infect Immun 74(2): 1233-1242.

120. Radaeva, T. V., E. V. Kondratieva, et al. (2008). "A human-like TB in genetically susceptible mice followed by the true dormancy in a Cornell-like model." Tuberculosis 88(6): 576585.

121. Ramage, H. R., L. E. Connolly, et al. (2009). "Comprehensive functional analysis of

122. Mycobacterium tuberculosis toxin-antitoxin systems: implications for pathogenesis, stress responses, and evolution." PLoS Genet 5(12): el000767.

123. Raman, K. and N. Chandra (2011). "Systems Biology of Tuberculosis: Insights for Drug Discovery." Understanding the Dynamics of Biological Systems: 83-110.

124. Regnier, P. and E. Hajnsdorf (2009). Poly(A)-Assisted RNA Decay and Modulators of RNA

125. Stability. Molecular Biology of RNA Processing and Decay in Prokaryotes. C. Condon, Elsevier. 85: 142-144.

126. Rengarajan, J., B. R. Bloom, et al. (2005). "Genome-wide requirements for Mycobacterium tuberculosis adaptation and survival in macrophages." Proc Natl Acad Sei U S A 102(23): 8327-8332.

127. Resuehr, D. and A. N. Spiess (2003). "A real-time polymerase chain reaction-based evaluation of cDNA synthesis priming methods." Anal Biochem 322(2): 287-291.

128. Revel, A. T., A. M. Talaat, et al. (2002). "DNA microarray analysis of differential geneexpression in Borrelia burgdorferi, the Lyme disease spirochete." Proc Natl Acad Sei U S A 99(3): 1562-1567.

129. Rifat, D., W. R. Bishai, et al. (2009). "Phosphate depletion: a novel trigger for Mycobacterium tuberculosis persistence." J Infect Pis 200(7): 1126-1135.

130. Rodrigue, S., R. Provvedi, et al. (2006). "The sigrna factors of Mycobacterium tuberculosis." FEMS Microbiol Rev 30(6): 926-941.

131. Rohde, K., R. M. Yates, et al. (2007). "Mycobacterium tuberculosis and the environment within the phagosome." Immunol Rev 219: 37-54.

132. Rohde, K. H., R. B. Abramovitch, et al. (2007). "Mycobacterium tuberculosis invasion of macrophages: linking bacterial gene expression to environmental cues." Cell Host Microbe 2(5): 352-364.

133. Rosenow, C., R. M. Saxena, et al. (2001). "Prokaryotic RNA preparation methods useful for high density array analysis: comparison of two approaches." Nucleic Acids Res 29(22): El 12.

134. Russell, D. G. (2001). "Mycobacterium tuberculosis: here today, and here tomorrow." Nat Rev Mol Cell Biol 2(8): 569-577.

135. Russell, D. G., B. C. VanderVen, et al. (2010). "Mycobacterium tuberculosis wears what it eats." Cell Host Microbe 8(1): 68-76.

136. Rustad, T. R., M. I. Harrell, et al. (2008). "The enduring hypoxic response of Mycobacterium tuberculosis." PLoS One 3(1): el502.

137. Rustad, T. R., A. M. Sherrid, et al. (2009). "Hypoxia: a window into Mycobacterium tuberculosis latency." Cell Microbiol 11(8): 1151-1159.

138. Sampson, S. L. (2011). "Mycobacterial PE/PPE proteins at the host-pathogen interface." Clin Dev Immunol 2011: 497203.

139. Sarkar, N. (1997). "Polyadenylation of mRNA in prokaryotes." Annu Rev Biochem 66: 173-197.

140. Savvi, S., D. F. Warner, et al. (2008). "Functional characterization of a vitamin B12-dependent methylmalonyl pathway in Mycobacterium tuberculosis: implications for propionate metabolism during growth on fatty acids." J Bacteriol 190(11): 3886-3895.

141. Schnappinger, D., S. Ehrt, et al. (2003). "Transcriptional Adaptation of Mycobacteriumtuberculosis within Macrophages: Insights into the Phagosomal Environment." J Exp Med 198(5): 693-704.

142. Schnappinger, D., G. K. Schoolnik, et al. (2006). "Expression profiling of host pathogeninteractions: how Mycobacterium tuberculosis and the macrophage adapt to one another." Microbes Infect 8(4): 1132-1140.

143. Seiinger, D. W., R. M. Saxena, et al. (2003). "Global RNA half-life analysis in Escherichia coli reveals positional patterns of transcript degradation." Genome Res 13(2): 216-223.

144. Shendure, J. (2008). "The beginning of the end for microarrays?" Nat Methods 5(7): 585-587.

145. Shi, L., C. D. Sohaskey, et al. (2005). "Changes in energy metabolism of Mycobacteriumtuberculosis in mouse lung and under in vitro conditions affecting aerobic respiration." Proc Natl Acad Sei U S A 102(43^1: 15629-15634.

146. Shi, L., C. D. Sohaskey, et al. (2010). "Carbon flux rerouting during Mycobacterium tuberculosis growth arrest." Mol Microbiol 78(5): 1199-1215.

147. Sidders, B., M. Withers, et al. (2007). "Quantification of global transcription patterns in prokaryotes using spotted microarrays." Genome Biol 8(12): R265.

148. Siezen, R. J., G. Wilson, et al. (2010). "Prokaryotic whole-transcriptome analysis: deep sequencing and tiling arrays." Microb Biotechnol 3(2): 125-130.

149. Simeone, R., D. Bottai, et al. (2009). "ESX/type VII secretion systems and their role in host-pathogen interaction." Curr Opin Microbiol 12(1): 4-10.

150. Simon, S. A., J. Zhai, et al. (2009). "Short-read sequencing technologies for transcriptional analyses." Annu Rev Plant Biol 60: 305-333.

151. Singh, K. K., Y. Dong, et al. (2005). "Immunogenicity of the Mycobacterium tuberculosis PPE55 (Rv3347c) protein during incipient and clinical tuberculosis." Infect Immun 73(8): 5004-5014.

152. Sirakova, T. D., A. K. Thirumala, et al. (2001). "The Mycobacterium tuberculosis pks2 gene encodes the synthase for the hepta- and octamethyl-branched fatty acids required for sulfolipid synthesis." J Biol Chem 276(20): 16833-16839.

153. Smith, I. (2003). "Mycobacterium tuberculosis pathogenesis and molecular determinants of virulence." Clin Microbiol Rev 16(3): 463-496.

154. Sorensen, A. L., S. Nagai, et al. (1995). "Purification and characterization of a low-molecularmass T-cell antigen secreted by Mycobacterium tuberculosis." Infect Immun 63(5): 17101717.

155. Stahlberg, A., J. Hakansson, et al. (2004). "Properties of the reverse transcription reaction in mRNA quantification." Clin Chem 50(3): 509-515.

156. Stangegaard, M., I. H. Dufva, et al. (2006). "Reverse transcription using random pentadecamer primers increases yield and quality of resulting cDNA." BioTechniques 40(5): 649-657.

157. Stincar, T. P., T. Seemann, et al. (2008). "Insights from the complete genome sequence of

158. Mycobacterium marinum on the evolution of Mycobacterium tuberculosis." Genome Res 18(5): 729-741.

159. Stokes, R. W. and S. J. Waddell (2009). "Adjusting to a new home: Mycobacterium tuberculosis gene expression in response to an intracellular lifestyle." Future Microbiol 4(10): 13171335.

160. Sureka, K., T. Hossain, et al. (2010). "Novel role of phosphorylation-dependent interaction between FtsZ and FipA in mycobacterial cell division." PLoS One 5(1): e8590.

161. Sutcliffe, I. C. and D. J. Harrington (2004). "Lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis: anabundant and functionally diverse class of cell envelope components." FEMS Microbiol Rev 28(5): 645-659.

162. Tailleux, L., S. J. Waddell, et al. (2008). "Probing host pathogen cross-talk by transcriptional profiling of both Mycobacterium tuberculosis and infected human dendritic cells and macrophages." PLoS One 3(1): el403.

163. Talaat, A. M., S. T. Howard, et al. (2002). "Genomic DNA standards for gene expression profiling in Mycobacterium tuberculosis." Nucleic Acids Res 30(20): el04.

164. Talaat, A. M., P. Hunter, et al. (2000). "Genome-directed primers for selective labeling of bacterial transcripts for DNA microarray analysis." Nat Biotechnol 18(6): 679-682.

165. Talaat, A. M., R. Lyons, et al. (2004). "The temporal expression profile of Mycobacterium tuberculosis infection in mice." Proc Natl Acad Sei U S A 101(13): 4602-4607.

166. Talaat, A. M., S. K. Ward, et al. (2007). "Mycobacterial bacilli are metabolically active during chronic tuberculosis in murine lungs: insights from genome-wide transcriptional profiling." J Bacteriol 189(11): 4265-4274.

167. Tan, M. P., P. Sequeira, et al. (2010). "Nitrate respiration protects hypoxic Mycobacterium tuberculosis against acid- and reactive nitrogen species stresses." PLoS One 5(10): el3356.

168. Theissen, H., M. Etzerodt, et al. (1986). "Cloning of the human cDNA for the U1 RNA-associated 70K protein." The EMBO Journal 5(12): 3209.

169. Timm, J., F. A. Post, et al. (2003). "Differential expression of iron-, carbon-, and oxygenresponsive mycobacterial genes in the lungs of chronically infected mice and tuberculosis patients." Proc Natl Acad Sei U S A 100(24): 14321-14326.

170. Trunz, B. B., P. Fine, et al. (2006). "Effect of BCG vaccination on childhood tuberculousmeningitis and miliary tuberculosis worldwide: a meta-analysis and assessment of cost-effectiveness." Lancet 367(9517): 1173-1180.

171. Tucker, P. A., E. Nowak, et al. (2007). "Two-component systems of Mycobacterium tuberculosis: structure-based approaches." Methods Enzvmol 423: 479-501.

172. Tyagi, S. (2010). "Genomics. E. coli, what a noisy bug." Science 329(5991): 518-519.

173. Verbon, A., R. A. Hartskeerl, et al. (1992). "The 14,000-molecular-weight antigen of

174. Mycobacterium tuberculosis is related to the alpha-crystallin family of Iow-molecular-weight heat shock proteins." J Bacteriol 174(4): 1352-1359.

175. Vergne, I., J. Chua, et al. (2004). "Cell biology of mycobacterium tuberculosis phagosome." Annu Rev Cell Dev Biol 20: 367-394.

176. Voskuil, M. I. (2004). "Mycobacterium tuberculosis gene expression during environmental conditions associated with latency." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 138-143.

177. Voskuil, M. I., D. Schnappinger, et al. (2004). "Regulation of the Mycobacterium tuberculosis PE/PPE genes." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 256-262.

178. Waddell, S. J. (2010). "Reprogramming the Mycobacterium tuberculosis transcriptome during pathogenesis." Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 7(1): e67-e73.

179. Waddell, S. J., P. D. Butcher, et al. (2007). "RNA profiling in host-pathogen interactions." Curr Qpin Microbiol 10(3): 297-302.

180. Waddell, S. J., K. Laing, et al. (2008). "Microarray analysis of defined Mycobacteriumtuberculosis populations using RNA amplification strategies." BMC Genomics 9: 94.

181. Waddell, S. J., R. A. Stabler, et al. (2004). "The use of microarray analysis to determine the gene expression profiles of Mycobacterium tuberculosis in response to anti-bacterial compounds." Tuberculosis (Edinb) 84(3-4): 263-274.

182. Walters, S. B., E. Dubnau, et al. (2006). "The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two component system regulates genes essential for virulence and complex lipid biosynthesis." Molecular microbiology 60(2): 312-330.

183. Wang, E. (2005). "RNA amplification for successful gene profiling analysis." Journal of translational medicine 3(1): 28.

184. Wang, Z., M. Gerstein, et al. (2009). "RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics." Nat Rev Genet 10(1): 57-63.

185. Wayne, L. and L. Hayes (1996). "An in vitro model for sequential study of shiftdown of

186. Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence." Infect. Immun. 64(6): 2062-2069.

187. Weber, M. H. and M. A. Marahiel (2003). "Bacterial cold shock responses." Sei Prog 86(Pt 1-2): 9-75.

188. Wilson, M., J. DeRisi, et al. (1999). "Exploring drug-induced alterations in gene expression in Mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization." Proc Natl Acad Sei U S A 96(22): 12833-12838.

189. World Health Organization. (2010). Global tuberculosis control: WHO report 2010. Geneva, World Health Organization.

190. World Health Organization. Stop TB Dept. (2010). Treatment of tuberculosis: guidelines. Geneva, World Health Organization.

191. Yang, X., N. M. Nesbitt, et al. (2009). "Cholesterol metabolism increases the metabolic pool of propionate in Mycobacterium tuberculosis." Biochemistry 48(18): 3819-3821.

192. Young, D. (2009). "Animal models of tuberculosis." Eur J Immunol 39(8): 2011-2014.

193. Young, D., J. Stark, et al. (2008). "Systems biology of persistent infection: tuberculosis as a case study." Nature Reviews Microbiology 6(7): 520-528.

194. Yuan, Y., D. D. Crane, et al. (1998). "The 16-kDa alpha-crystallin (Acr) protein of

195. Mycobacterium tuberculosis is required for growth in macrophages." Proc Natl Acad Sei USA 95(16): 9578-9583.

196. Zhang, Y. (2004). "Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis." Front Biosci 9: 1136-1156.

197. Zhu, X., S. Chang, et al. (2009). "MyBASE: a database for genome polymorphism and gene function studies of Mycobacterium." BMC Microbiol 9: 40.

198. Zvi, A., N. Ariel, etal. (2008). "Whole genome identification of Mycobacterium tuberculosis vaccine candidates by comprehensive data mining and bioinformatic analyses." BMC Med Genomics 1: 18.

199. Zwerling, A., M. A. Behr, et al. (2011). "The BCG World Atlas: A Database of Global BCG Vaccination Policies and Practices." PLoS Med 8(3): el001012.

200. Игнатов, Д. В., Т. А. Скворцов, et al. (2010). "Адаптивные изменения профиля экспрессии генов Mycobacterium avium при заражении мышей, генетически чувствительных и резистентных к инфекции." Acta Naturae 2(3(6)): 57-62.

Информация о работе

Скворцов, Тимофей Алексеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Структурно-функциональный анализ транскриптома Mycobacterium tuberculosis при развитии инфекции in vivo - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы