Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетического контроля ферментов и выявление групп сцепления у сахарной свеклы

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Денисова, Фердускай Шамиловна, Новосибирск

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

ДЕНИСОВА

ФЕРДУСКАЙ ШАМИЛОВНА

УДК 575.1 : 577.151.64 : 633.413

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ФЕРМЕНТОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГРУПП СЦЕПЛЕНИЯ У САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

03.00.15 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -кандидат биологических наук ЛЕВИТЕС Е.В.'

Новосибирск, 1999

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................... 4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие об изоферментах......<...................... 8

1.2. Номенклатура изоферментов...........................= 12

1.3. Изоферменты в генетических и селекционных исследованиях................................................ 15

1.4. Сведения о генетическом контроле ферментов у сахарной свеклы.......................................... 17

1.5. Изоферменты в группах сцепления сахарной свеклы..... 25

1.6. Способы хромосомной локализации генов у сахарной свеклы.............................................. 34

1.6.1. Метод дополненных линий............................. 34

1.6.2. Хромосомная локализация генов с помощью дозовых эффектов.............................'............... 35

1.6.3. Метод трисомного анализа............................ 38

1.6.4. Метод хромосомной локализации генов с использованием гаметной автосегрегации в агамоспермных потомствах сахарной свеклы..................................... 40

1.7. Молекулярные методы картирования генома сахарной

свеклы.............................................. 42

Заключение к обзору литературы...................... 45

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Сорта и линии сахарной свеклы, используемые в работе 47

2.2. Проведение гибридизации и постановка генетических экспериментов....................................... 47

2.3. Электрофоретический анализ ферментов................ 49

2.4. Статистическая обработка результатов................ 53

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Полиморфизм и генетический контроль ферментов у сахарной свеклы ...................................... 54

3.1.1. Алкогольдегидрогеназа............................... 54

3.1.2. Малик-фермент....................................... 60

3.1.3.'Малатдегидрогеназ а.......•........................... 65

3.1.4. Глутаматдегидрогеназа...........-.................... 68

3.1.5. Изоцитратдегидрогеназа............................. 69

3.1.6. 6-фосфоглюконатдегидрогеназа.......................72

3.1.7. Фосфоглюкоизомераза................................. 73

3.1.8. Шикиматдегидрогеназа................................ 75

3.1.9. Фосфоглюкомутаза.................................... 77

3.1. Ю.Гексокиназа......................................... 79

3.1.11. НАДН-дегидрогеназа.................................. 81

3.2. Идентификация сортов сахарной свеклы с помощью маркерных ферментов.................................... 84

3.3. Анализ сцепления ферментных локусов................. 92

3.4. Определение групп синтенных генов...................юз

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................116

ВЫВОДЫ..................................'...................119

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..........................................121

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Развитие частной генетики растений является одним из важных направлений генетических исследований.

■в \

Данные о генетическом контроле признаков и хромосомной локализации кодирующих их генов необходимы для решения многих теоретических и практических задач.

Сахарная свекла (Beta vulgaris L.) - ценная сельскохозяйственная культура. Ее возделывание было начато более 200 лет назад в Германии и распространилось в другие страны. Beta vulgaris L. относится к перекрестноопыляющемуся виду с двухлетним циклом развития.

Как объект генетических исследований сахарная свекла имеет ряд особенностей, которые затрудняют ее изучение. Она обладает малым числом удобных морфологических признаков, пригодных для использования их в качестве генетических маркеров, и имеет хромосомы (2п=18), слабо различающие сяу по размеру и морфологии, что сильно осложняет их цитологическую идентификацию.

Эти причины были серьезным препятствием в изучении генома сахарной свеклы. В развитии частной генетики данной культуры можно выделить промежуток, примерно в 25-30 лет, в течение которого не было получено существенной информации о генах и группах сцепления сахарной свеклы. Поэтому до последнего времени сахарную свеклу относили к слабо изученным генетическим объектам.

Лишь с появлением биохимических методов исследования, в частности изоферментного анализа, были созданы дополнительные возможности для решения этих проблем.

Изоферменты оказались удобными генетическими маркерами по

ряду причин. Для растений в настоящее время разработаны методы анализа более 50 ' ферментных систем. Поскольку каждая из них, как правило, контролируется двумя - тремя генами, то число локусов у сахарной свеклы, потенциально пригодных для изучения, достаточно велико. Изоферменты обладают кодоминантным характером проявления, позволяющим оценивать гомо- и гетерози-готность растений по генам, контролирующим данные ферменты. Изоферменты, являясь прямыми продуктами генной активности, менее подвержены влиянию внешней среды и поэтому более надежны как маркеры.

Эта область исследования развивалась достаточно интенсивно, и по мере накопления информации о полиморфизме и генетическом контроле ферментов, стали появляться данные о группах сцепления у сахарной свеклы.

На сегодняшний день, наряду с изоферментным анализом, широко используется способ определения групп сцепления с помощью фрагментов ДНК. 'Созданы карты сцепления, в которых расстояние между фрагментами составляет около 1,5 сантиморганид. Обогащение таких карт реальными маркерными генами делает их более ценными .

Несмотря на возросший интерес исследователей к изучению генома сахарной свеклы, к настоящему^моменту у данного объекта в пяти из девяти известных групп сцепления имеется небольшое число (по 1- 3) маркерных генов, причем для двух групп сцепления вообще не выявлены изоферментные гены. Поэтому выявление дополнительных маркерных признаков, изучение их генетического контроля, а также определение сцепленных или синтенных генов представляет актуальную задачу.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования заключалась в выявлении неизученных ранее маркерных ферментов и групп сцепления, включающих ферментные локусы, а также в разработке новых подходов для определения синтенных групп генов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1 .^Выявление методом ~ электрофореза в крахмальном геле генетического полиморфизма по неизученным ранеб ферментам: гексокина-зе (НК), НАДН-дегидрогеназе (гон), 6-фосфоглюконатдегидрогеназе (6РОВ), а также выявление новых типов спектров по изученным ранее ферментам: алкогольдегидрогеназе (АШ), глутаматдегидроге-назе (ОШ), изоцитратдегидрогеназе (\ГШ), малатдегидрогеназе (МШ), малик-ферменту (МЕ), фосфоглюкоизомеразе (РОГ), фосфог-люкомутазе (рсм), шикиматдегидрогеназе (ЗСБН) в сортах и инб-редных линиях сахарной свеклы.

2. Изучение генетического контроля ферментов гексокиназы и НАДН-дегидрогеназы.

3. Анализ наследования новых типов изоферментных спектров, обнаруженных в сортах и инбредных линиях сахарной свеклы, у ферментов с известным генетическим контролем.

4. Выявление групп сцепления, включающих ферментные локусы.

5. Отработка новых методических приемов для выявления синтенных групп генов.

/

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

- описан полиморфизм по ферментам: гексокиназе, НАДН - дегидро-геназе, 6-фосфоглюконатдегидрогеназе;

- изучен генетический контроль ферментов НК1, и показано, что изоферментные спектры каждого из этих ферментов контролируются одним локусом с двумя аллелями;

- в генетической системе, контролирующей фермент изоцитратде-гидрогеназу, обнаружен неизвестный ранее ген,' обозначенный как Idii3, в котором выявлено два аллеля: Idli3-F и Idh3-S;

- для ферментных локусов Adhi и Ме1 выявлены новые аллели, обозначенные соответственно как Adh1-N и Ме1-0;

- выявлены три группы сцепления: Adh1-Idii3, Pgm1'-Mclh2, Pgi2-Si;

- предложен новый способ определения синтенных групп генов, основанный на ■специфике расхождения хромосом в первом делении мейоза у триплоидных растений..

Практическая значимость. Выявленные в работе маркерные ферменты можно использовать для идентификации, паспортизации и контроля гибридизации сортов и .пиний сахарной свеклы. Предложенный и апробированный экспрессный способ оценки принадлежности генов одной хромосоме в дальнейшем может быть развит для выявления синтенных групп, включающих в себя как изоферментные гены, так и гены, контролирующие морфологические признаки, не только у сахарной свеклы, но и у других видов растений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Понятие об изоферментах

Впервые термин "изоферменты" был введен Маркертом К. и Меллером Ф. (Markert, Moller, 1959) для обозначения множественных молекулярных форм ферментов в одном организме.

Теперь под изоферментами понимают генетически детерминированные множественные молекулярные формы одного и того же фермента, присутствующие в одном "и том же организме, обладающие одинаковой субстратной специфичностью, но различающиеся по своим физико-химическим свойствам (JUPAC -JTJB..., 1971 ).

Наибольшее практическое значение имеют различия изофермен-тов по подвижности в электрическим поле.

Изучение генетики ферментов у растений было начато в 1960 году работой Шварца Д., установившего генетический контроль эс-теразы у кукурузы (Schwartz,1960). В настоящее время у растений описано более 50 ферментов, представленных изоформами (Левитес, 1986).

При исследовании изоферментов основным методом является электрофорез белковых экстрактов из тканей или органов растений с последующим гистохимическим выявлением ферментов непосредственно в геле (Hunter,Markert,1957). Генетический контроль ферментов осуществляется одним или несколькими неаллельными генами.

Тип изоферментного спектра, выявляемого у растений данного вида и-на данной стадии развития, определяется числом активных локусов, их гомо или гетерозиготностью. Например, если у диплоидного растения фермент находится под контролем одного гена,

находящегося в гомозиготном состоянии, то, как правило, независимо от четвертичной структуры фермента на электрофореграмме выявляется один изофермент.

Если растение гетерозиготно по локусу, контролирующему фермент, то число изоферментов зависит от характера аллельного взаимодействия. Если гетеромультимеры не образуются, то на электрофореграмме у гетерозиготного растения выявляются две зоны ферментативной активности.

Если продукты активности аллельных генов свободно ассоциируют, общее число изоферментов в спектре будет соответствовать числу всевозможных сочетаний (п), которое определяется по формуле:

( Б + р - 1 ) ! п = ,

р! ( Э - 1 ) !

где р - число субъединиц, составляющих молекулу фермента, а в - число различных типов субьединиц (БЬсж, 1964). Если растение диплоидное и фермент контролируется одним геном, формула приобретает простой вид :

п = р + 1 .

Формирование изоферментных спектров мономерных, димерных и тетрамерных ферментов показано на рисунке 1.

От числа субьединиц (р)' зависит также и относительная интенсивность полос изоферментов в выявляемом спектре.

В случае равновероятного объединения субъединиц в димерную молекулу фермента на электрофореграмме выявляются три полосы

+

□ О Ш

55 FS FF SS

А

Рис.1. Изоферменты мономерного (А), димерного (Б) и тетрамерно-го ферментов (В) у гомозигот (FF и ss) и их гибридов (FS).

ферментативной активности с относительной интенсивностью 1:2:1. В общем случае интенсивность полос соответствует биномиальному распределению : (F + S)p , где F и S - относительная концентрация субьединиц фермента, контролируемых двумя аллельными генами, ар- число субьединиц в молекуле фермента.

Например, у растений кукурузы гетерозиготных по локусу Catl, контролирующему фермент каталазу, в спектре выявляются пять изоферментов с относительной" интенсивностью 1:4:6:4:1 (Scandalios, 1969).

Ассоциировать могут субъединицы, контролируемые не только аллелями одного гена, но и субъединицы, контролируемые разными локусами. В качестве примера можно привести малик-фермент сахарной свеклы [рис.2], который контролируется двумя локусами, один из которых полиморфен (Mel), а другой мономорфен (Ме2). В тканях черешка ' активен лишь локус Ме1, и гибридный

□I □I

, „ , □□ IZO

□J □□ □□

FS FF SS FS FF Б В

изоферментный спектр образуется за счет ассоциации продуктов аллельных генов (Левитес, 1979 а). В листьях сахарной свеклы активны оба локуса, и между их продуктами происходит взаимодействие ( ассоциация ), приводящая к образованию меж-локусных гетеротетрамеров (Левитес, 1979 а; Агафонов, Коновалов, 1984; Левитес, 1986).

--- NNNP

1 - NNNS

/

--- SNPF

__" НЯРЗ

- - HFPP

- KPFS

__ZZZZZ

---PP3S

---iSSS

■ - ---ssss J

12 3^56

Рис.2. Схема изоферментных спектров малик-фермента при межаллельном и межгенном взаимодействии (Левитес,1986). 1,2,3 - черешок (активен лишь локус Ме1); 4,5,6 - лист (активны локусы Ме1 и Ме2). Справа указан субъединичный состав тетрамерных молекул фермента.

1,4- растение генотипа Me1-S/Me1-S, Me2-N/Me~2-N; 2, 5-Me1-F/Me1-S, Me2-N/Me2-N; 3, 6- Me1-F/Mei-F, Me2-N/Me2-N.

Отсутствие межлокусных взаимодействий зачастую свидетельствует о принадлежности контролируемых ими изоферментов разным субклеточным структурам (Тарасова и др.,1990).

1.2. Номенклатура изоферментов

Существуют определенные правила, по которым обозначают изоферменты и контролирующие их локусы. Изоферменты обозначают прописными латинскими буквами, представляющими сокращенное название данного фермента (Schwartz, 1966; Scandalios, 1967). Например, для алкогольдегидрогеназы - ADH, для малатдегидрогена-зы MDH. В обозначении локусов пишут первую букву прописной, а остальные строчными, например - Adh, Mdh. Если фермент контролируется двумя и более локусами, то локусы нумеруются чаще всего в порядке уменьшения анодной электрофоретической подвижности, контролируемых ими изоферментов, например, Mdhl, а контролируемые им изоферменты обозначают MDH1 и, соответственно локус Mdli2 - изоферменты MDH2. Для обозначения аллельных генов и соответствующих им изоферментов чаще всего применяют буквенную символику, например, Adhl-F (быстромигрирующий вариант фермента), Aclh1 -S (медленномигрирующий вариант фермента); реже применяют цифровую символику.

Поскольку для некоторых ферментов существует несколько тривиальных названий, и некоторые локусы одного фермента обозначались последовательно по мере их обнаружения, а не так, как принято, становится все более очевидной необходимость в стандартизации обозначений изоферментов и контролирующих их локусов у сахарной свеклы. Для того, чтобы избежать разночтений при обзоре литературы, в-'данной работе используются общепринятые и наиболее устоявшиеся обозначения, согласно правилам, перечисле-ным выше. В таблице 1 приведены различные обозначения одних и тех же локусов, применяемые разными авторами.

Таблица 1

Обозначения ферментных локусов, используемые разными авторами

Фермент Различные обозначения одного и того же локуса разными авторами Обозначения, используемые в данной работе

MDH Morl[N,P](19796)1; Mdh1[PfS](1990)5; Mdh1 [3,5] (1993)4; Mühl Ш,Р] (1994)1 Mdh1 [N,P]

Mor2CF,S]С19796)1; Mdh3[F,S]U990)5; Mdh3[1,2](1993)4; Mdh2[F,S](1994)1 Mdii2 [F,S]

Mor3(1987)3; Mdh2(1990)5; Mdh3(1994)1 Mdh3

GDH Gdh2(1988)2; Gdh1(1993)4 Gdh1

Gdh1[F,S](1988)2; Gdh2[2,3]С1993)4; Gdh2[P,S](1994)1 Gdh2[F,S]

ME Modi[F,S,C](1979a)1; Me2[F,S](1990)5; Me1[F,S,C](1994)1 Me1[F, S, С ]

Mod2(1979a)1 ; Me1(1990)5; Me2(1994)1 Me2

IDH Icd1 [F,S] (1988)7; Idh1 [1 ,2] (1993)4; Idh1[F,S]

Idh1 [F,S] (1986)1 ; Idh1 [F,S] (1994)1 '

Icd2(1988)7; Idh2(1993)4; Idh2(1994)1 Idh2

Idh2[F,S3(1986)1; Idh3[F,S](1994)1 Idh3CF,S3

PGM Pgm1[P,S](1989)6; Pgm1[1,2,30(1993)4; Pgm1[F,S](1994)1 Pgm1[F,S]

Pgm2(1989)6 Pgm2

PGI Gpi1(1989)6; Pgi1(1993)4 Gpl2[F,S](1989)6; Pgi2[2,3](1993)4; Pgi1[F,S3(1990)7; Pgi2[F,S](1994)1 Pgi1 Pgi2[F,S]

SCDH Scdh.1 (1993 )4 Scdhl

ScdhltP,S](1990)7; Scdh2[1,2](1993)4; Scdh2[F,S,N](1994)\ / Scdh2[F,S]

Пояснение. Надстрочные цифры обозначают работы, в которых используются данные обозначения: 1- Левитес Е.В., 1979 а, б, 1936, Левитес и др., 1989, Левитес и др., 1994; 2- Коновалов А.А., 1988; 3- Тарасова, 1987; 4- Abe et al., 1993; 5- Aicher, Saunders, 1990; 6- Smed et al., 1989; 7- Van Geyt et. al, 1988, Yan Geyt et al., 1990.

В квадратных скобках указаны обозначения аллелей

1.3. Изоферменты в генетических и селекционных исследованиях

Изофементы, как удобные генетические маркеры, активно применяются в различного рода исследованиях. Например, они используются для построения генетических карт у ряда видов растений. Их применение существенно обогатило эти карты дополнительными маркерными генами у кукурузы (Hoisington, 1985), томатов (Tanksley, 1983), пшеницы (Mcintosh, Gusîk, 1984), ржи (Vaguero et al., 1990), гороха (Weeden, Marx, 1'984) и y многих других видов растений.

У некоторых видов растений, например, ржи, изоферменты используются для маркирования участков хромосом, вовлеченных в транслокации в пределах ее генома (Priyatkina et al.,1994) или же при перенесении участков хромосом ржи в геном пшеницы (Hartmann et al., 1994). С помощью изоферментов можно также картировать хромосомы вида реципиента, получившего путем транслокации генетический материал донора. Такая работа проведена на пшенице сорта Salmon, у которой на коротком плече хромосомы 1В имеется генетический материал ржи (Гончаров и др., 1997). На сахарной свекле такого рода исследования пока не проводятся, это, видимо, связано со сложностью идентификации хромосом у данной культуры.

Особенно эффективно использование изоферментных маркеров в тех случаях, когда изоферментные локусы оказываются тесно сцепленными с генами �