Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Теоретические и практические аспекты молекулярно-генетического маркирования в селекции сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Теоретические и практические аспекты молекулярно-генетического маркирования в селекции сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)"

На правах рукописи

(Ж

ФЕДУЛОВА ТАТЬЯНА ПЕТРОВНА

ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ (Beta vulgaris L.)

Специальность 06.01.05 - Селекция и семеноводство

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Рамонь-2005

Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении "Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова"

Научный консультант - доктор биологических наук, профессор Жужжалова Татьяна Петровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Буторина Анастасия Константиновна

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Гончаров Сергей Владимирович

доктор сельскохозяйственных наук, профессор Тароп Александр Андреевич

Ведущая организация - ГНУ "Всероссийский научно-исследовагельский институт сельскохозяйственной биотехнологии"

Защита диссертации состоится « 2 » декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006. 065. 01 Государственного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт сахарной свеклы и сахара имени А.Л. Мазлумова» по адресу: 396030, Воронежская обл., Рамонский район, ВНИИСС; факс (07340) 2-19-93.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского 'института сахарной свеклы и сахара имени • А.Л. Мазлумова.

Автореферат диссертации разослан « 1 » ноября 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, к.с.-х.н.

Путилина Л.Н.

zoog-4

2-117

тгш

Общая характеристика работы

Актуальность. Одной из важных проблем в селекции растений является разработка методов и приемов, позволяющих интенсифицировать селекционный процесс для ускоренного создания высокопродуктивных сортов и гибридов.

Особое значение при разработке этих методов приобретает поиск и изучение новых маркерных признаков, облегчающих не только проведение генетического анализа исходного материала, но и ускоряющих работу по его созданию. На сегодняшний день известны три основные группы маркеров: морфологические, белковые и ДНК. Все они имеют как достоинства, так и недостатки.

В селекции сахарной свеклы используют в основном морфологические признаки, использование которых позволило создать большое количество исходного материала, сортов и гибридов. Однако возможность использования этих признаков ограничена временем и четкостью генетического проявления. Набор их в сравнении с числом генов и генетических систем в организме весьма ограничен.

Принципиально новые возможности использования генетических маркеров в генетике и селекции появились с открытием полиморфизма белков, в особенности изоферментов. Кодоминантный тип наследования, позволяющий оценить гомо- и гетерозиготность растения и простота анализа делает их надежными метинами в процессе селекции. Преимущество белковых маркеров по сравнению с морфологическими связано с тем, что они являются прямыми продуктами активности генов, менее подвержены воздействию внешней среды и поэтому более надежны (Конарев, 1983, 1987, 1989; Сози-нов, 1985; Левитес, 1986; Попереля, Асыка, 1988; Глазко, Созинов, 1993; Лесневич, 1999).

У сахарной свеклы разными исследователями изучен полиморфизм и генетический контроль многих изоферментных систем (Левитес, 1984; 1986; Коновалов, 1987; Тарасова, 1987; Филатов, 1993; Денисова, 2001).

И.П. Гаврилюк с коллегами (1987) и Л.А. Лесневич (1999) исследованы физиолого биохимические свойства и роль запасных белков свеклы и показана возможность оценки генофонда по их компонентам.

Вместе с тем, вопросы использования молекулярно - генетических маркеров в практической селекции сахарной свеклы изучены недостаточно и требуют углубления и расширения.

Применение нового класса молекулярных маркеров - фрагментов ДНК для сахарной свеклы в России пока ограничено, так как этот метод является дорогостоящим и недостаточно разработанным. Однако метод ДНК-анализа позволит ускорить перенос хозяйственно ценных генов и локусов количественных признаков в процессе селекции и обеспечить создание новых сортов с целым комплексом заданных свойств, а также конструирование новых генотипов растений методами генетической инженерии (Хавкин, 1997,2003; Кочиева, 1999).

В связи с этим большую актуальность приобретает разработка методов молекулярно-генетического маркирования для практического использования в селекционном процессе сахарной свеклы, включая отборы при создании исходного материала и оценку при гибридизации.

Цель наших исследований заключалась в теоретическом обосновании принципов молекулярно-генетического маркирования генома сахарной свеклы как научной основы при подборе родительских компонентов и проведении идентификации и регистрации линий, сортов и гибридов для повышения эффективности селекции этой сельскохозяйственной культуры.

Для реализации данной проблемы было предусмотрено решение следующих задач:

1. Изучить экспрессию, полиморфизм маркерных 1енов у сахарной свеклы и их сопряженность с хозяйственно-полезными признаками.

2. Оценить степень гомозиготности инбредных линий и провести контроль г ибридизации с использованием изоферментных спектров.

3. Разработать принцип подбора родительских компонентов для скрещивания на основе генетических расстояний.

4. Создать гибриды сахарной свеклы с использованием генетически маркированных линий, отвечающие требованиям современного сельскохозяйственного производства.

5. Разработать способ идентификации сортов сахарной свеклы по изо-ферментным маркерам.

6. Разработать научно-методологические основы информационных технологий для идентификации и регистрации сортов и гибридов сахарной свеклы.

Научная новизна исследований. Впервые установлены научно-методические приемы проведения амплификации последовательностей геномной ДНК сахарной свеклы с помощью ПЦР с произвольно выбранными прайме-рами. Эти исследования имеют значение в практической селекции при отборе и идентификации ценных генотипов. Показано, что использование праймеров к последовательностям ДНК позволяет определять гомозиготность инбредных линий, идентифицировать родительские формы и их гибриды. Методом полиме-разной цепной реакции с праймерами на 35 8 промотор доказана трансгенная природа четырех регенерантов сахарной свеклы, несущих ген в дефензина редьки, определяющий устойчивость к фитопатогенам.

Разработан критерий оценки степени гомозиготности инбредных линий сахарной свеклы на основе индекса 1,2, что позволяет использовать его для контроля процесса создания линий.

Впервые на сахарной свекле выявлена достоверная положительная связь изоферментных локусов, контролирующих НАД-зависимую малатде-гидрогеназу и мапик-фермент. с массой корнеплода, что вносит определенный вклад в развитие теории селекции и совершенствование методов отбора.

Оценка генетических взаимоотношений селекционных материалов сахарной свеклы по изоферментным и белковым маркерам позволила выявить

степень их генетического родства. Это явилось основой для разработки метода подбора пар для гибридизации при создании высокопродуктивных гибридов, обладающих гетерозисным эффектом.

Создан и включен в Государственный реестр селекционных достижений России и с 2001 года допущен к использованию по Поволжскому и Центрально-Черноземному регионам гибрид РМС-90, (A.C. № 31185) с использованием маркированной по изоферментному составу гамма-линии у-РФ-2113, превышающий стандарт по урожайности на 18,6% и сбору сахара на 17,3%.

Получены новые данные по полиморфизму сортов-популяций сахарной свеклы по семи изоферментным локусам. На основе полученных результатов разработан способ идентификации сортов по частотам встречаемости аллельных вариантов ферментов (А. С. №1672999), позволяющий определять сортовую чистоту при семенном контроле и проводить идентификацию их в сортоиспытании.

Экспериментально установлены различия селекционного материала сахарной свеклы по запасному белку 11S глобулину при его идентификации по критерию идентичности, что углубляет теоретические представления о значении IIS глобулина запасного белка семян в оценке генофонда сахарной свеклы. Установлено, что низкий уровень полиморфизма глобулинов ин-бредных линий (1-2 типа электрофоретического спектра) может быть критерием оценки их генетической чистоты.

Впервые создана информационная система с электронной базой данных, осуществляющая хранение результатов электрофоретического анализа и расчет критериев идентичности при сравнении генотипов сахарной свеклы по белковым маркерам, что имеет важное теоретическое и прикладное значение в селекционно-семеноводческой работе.

Практическая ценность и реализация результатов исследований.

Модифицированная методика выделения геномной ДНК сахарной свеклы и проведения ПЦР анализа может найти широкое применение в селекции сахарной свеклы для проведения генотипирования селекционных материалов, сортов, гибридов и идентификации трансгенных форм.

Предложен критерий оценки селекционных материалов сахарной свеклы - индекс изоферментной гомозиготности IIZ, который может быть использован в селекции для выделения и отбора линий с высокой степенью генетической выравненное™, в пределах от 0,85 до 0,91.

На основе установленных генетических расстояний разработан метод подбора родительских компонентов, который может служить принципиальной основой создания новых высокопродуктивных сортов и гибридов.

Наиболее перспективные маркированные по изоферментному составу линии зарегистрированы в селекцентре ВНИИСС в качестве нового исходного материала и использованы, как компоненты гибрида РМС-90.

Выявленные различия сортов и гибридов по типам электрофоретиче-ских спектров запасного белка и изоферментных локусов и частотам их

встречаемости являются основой для проведения их надежной идентификации и паспортизации, и вносят существенный вклад в развитие методов селекционного отбора.

Разработанные методические рекомендации по проведению паспортизации на основе информационных технологий могут найти широкое применение для оперативною управления информацией в селекции, семеноводстве и сортоиспытании.

Разработанные в процессе исследований методические подходы апробированы и могут использоваться в селекции, семеноводстве и сортоиспытании сельскохозяйственных культур, а также быть включены в программы по биологии, генетике, селекции в высших и средних учебных заведениях.

Положения, выносимые на защиту:

- экспериментальное обоснование использования изоферментов в качестве генетических маркеров при оценке селекционных материалов, позволяющее проводить отбор гомозиготных линий и контролировать процесс гибридизации.

- научное обоснование и реализация метода подбора родительских компонентов для гибридизации на основе генетических расстояний, способствующего получению гибридов, обладающих гетерозисным эффектом.

- использование генетического маркирования в процессе создания новых гибридов, обеспечивающих высокую продуктивность.

- информационная технология на основе генетического маркирования, позволяющая проводить идентификацию и паспортизацию линий, сортов и гибридов сахарной свеклы в селекции, семеноводстве и сорюиспытании, что будет способствовать повышению эффективности этих процессов.

Апробация работы. Результаты научных исследований, основное содержание работы были представлены автором на зональной конференции молодых ученых и специалистов (Каменная степь, 1986); районных научно-производственных конференциях молодых ученых и специалистов (Рамонь, 1987-89); III Всероссийской конференции молодых ученых ВНИИС (Киев, 1988); Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Воронеж, 1993); I Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений» (Киев, 1994); научно-методическом совещании «Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости сельскохозяйственных растений» (Москва, 1994); Международной научно-практической конференции «Повышение эффективности ai ропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования» (Воронеж, 1995); Всероссийской научно-практической конференции «Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики» (Рамонь, 1996); 1-й Международной конференции «Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 1996); VII Международной конференции «Биология клетки растений in vitro. Биотехнология и сохранение генофонда» (Москва, 1997); И Съезде Русского ботанического общества (Санкт-Петербург, 1998); II Съезде

Всероссийского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000); 63 конгрессе Международного института исследований свеклы (IIRB) (Interlaken, 2000); II Международной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва. 2000); International conference "Genetic collections, isogenic and alloplasmic lines" (Novosibirsk, 2001); IV Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); Международной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения профессора С.И. Машкина (Воронеж, 2002); Международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию ВНИИСС, «Научное обеспечение устойчивости свекловодства в России» (Воронеж, 2003); Всероссийском совещании «Современные системы защиты растений от болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии» (Голицыно, 2003); Международной научно-практической конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов» (Киев, 2003); Международной научно-практической конференции «Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003); 1st Joint IIRB-ASSBT Congress (San-Antonio, 2003); III Съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); XIII Международном симпозиуме «Нетрадиционное растениеводство. Эниология. Экология и здоровье» (Алушта, 2004); III Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2004); заседаниях Ученого совета ВНИИСС (Рамонь, 1982-2005).

Экспериментальные данные получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии, которое выразилось в подборе, создании, оценке исходного материала, выборе методов и техники проведения исследований, обработке результатов и формулировании выводов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 326 страницах машинописного текста, состоит из введения, пяти глав, общих выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложений.

Она содержит 64 таблицы и 37 рисунков. В приложения включены: авторские свидетельства: на линии сахарной свеклы, на гибрид сахарной свеклы РМС-90 (а.с. № 31185), на способ идентификации сортов сахарной свеклы (№ 1672999), на способ получения гомозиготных линий сахарной свеклы (№ 17008210), справки о внедрении научных разработок в производство.

Список использованной литературы включает 480 наименований, в том числе 205 иностранных авторов.

Публикации. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 55 научных работах, в том числе в центральной печати, среди которых 3 авторских свидетельства.

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам НИИ сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова и других научных учреждений страны, содействовавших выполнению настоящей работы.

Содержание работы МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальная работа выполнена во Всероссийском НИИ сахарной свеклы и сахара им. А.Л. Мазлумова в 1982-2004 гг. (ВНИИСС, Рамон-ский район Воронежской области).

Исследования проводились в рамках отраслевой научно-технической программы «Сахароносные растения и сахар» и тематического плана ВНИИСС (раздел 11.02.01 - Провести изучение селекционного материала сахарной свеклы с использованием молекулярно-генетических маркеров).

Материалом для исследований служили сорта Рамонской, Белоцерков-ской, Уладовской, Льговской, Бийской, Веселоподолянской, Ялтушковской селекции; фертильные и стерильные линии, гибриды F| на стерильной основе, созданные в селекцентре ВНИИСС (Ошевнев, Мазепин, Богомолов, Го-лев, Юсубов, Бычкова, Нуждина); фертильные линии из коллекции ИЦиГСО РАН (Малецкий) и дикие виды свеклы Beta corolliflora и Beta trigyna; селекционные материалы с ЦМС из фирм-ICI (Бельгия), Hilleshog (Швеция), Beta Seed (США), KWS (Германия). Экспериментальная часть работы выполнялась в полевых и лабораторных условиях отдела биотехнологии ВНИИСС.

Самоопыление и принудительное опыление проводили, используя пергаментные или бязевые изоляторы, а также изоляторы-«вертушки». Внутрисемейное размножение линий осуществляли в групповых изоляторах и на изолированных участках в посевах озимых зерновых культур.

Для проведения искусственных опылений облученной пыльцой в качестве материнских компонентов использовали мужскостерильные формы, имеющие зеленую окраску вегетативных органов (гг). В качестве опылителя использовали форму из коллекции ВИР (г. Санкт-Петербург), имеющую доминантный признак окраски вегетативных органов Red tester (RR), а также дикие виды свеклы Beta corolliflora L (2п=36) и Beta trigyna L. (2n=54) с элементами апомиксиса. Пыльцу опылителя подвергали воздействию различных доз гамма-радиации от 1000 до 2500 Гр на установке РХМ-у-20 с источником излучения '^Со.

Анализ изоферментов проводили с помощью электрофореза в крахмальном геле с последующей окраской на специфическую активность алкогольде-гидрогеназы (АДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), мапатдсгидрогеназы (МДГ), малик-фермента (МФ), изоцитратдегидрогеназы (ИДГ) по методам, предложенным Е.В. Левитесом (1986) с нашими модификациями (Федулова, 1995).

Электрофоретическое изучение запасного белка 11-S глобулина было проведено согласно общепринятой методике (Конарев, 2000).

Содержание сахара и массу корнеплодов определяли на автоматической линии «Венема» методом холодной дигестии.

Генетические расстояния между селекционными материалами вычисляли по М Нею (Nei М., 1978). Показатель сходства популяций сахарной свеклы определяли по методике Л.А. Животовского (1982). Математическую

обработку результатов исследований проводили с использованием однофак-торного дисперсионного анализа по Б.А. Доспехову (1985). Создание электронной базы данных осуществляли в объектио-ориен тированном пакете средств визуальной разработки программного обеспечения С++ Builder 6.0.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ГЕНОМНОМ АНАЛИЗЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

Органная специфика экспрессии белков и изоферментов в онтогенезе

сахарной свеклы

Подобно другим двудольным растениям большая часть белков сахарной свеклы представлена глобулинами (Лесневич, 1982).

В результате проведенных нами экспериментов показано, что в семенах сахарной свеклы отсутствовали в течение длительного периода изменения в экспрессивности генов, контролирующих синтез глобулинов. Поэтому семена являются наиболее удобным объектом для проведения генетического маркирования.

В процессе изучения экспрессии запасного белка 11S глобулина в геноме сахарной свеклы выявлен суммарный электрофоретический спектр, состоящий из 18 полипептидов, разных по своей электрофоретической подвижности и отличающихся по интенсивности их окрашивания. Стандартный гип спектра на примере сорта Белоцерковская односемянная 34 включает 10 полипептидов.

Нами установлено, что полипептидный состав генома сахарной свеклы изменяется в результате инбридинга, при котором уменьшается его полиморфизм и увеличивается частота одного - двух типов спектров. У инбред-ных линий сахарной свеклы обнаружено 1-2 типа электрофоретических спектра, что свидетельствует о незначительном их полиморфизме. Низкий уровень полиморфизма глобулина является показателем генетической чистоты инбредных линий сахарной свеклы. Это предполагает возможность его использования для целей идентификации и паспортизации.

Другим важным маркером являются изофермешы. Вследствие избирательной экспрессии генов во взрослом организме появляются тканеспеци-фичные спектры изоферментов, так как все они происходят от одного и того же спектра-предшественника, свойственного исходной оплодотворенной клетке, и по мере индивидуального развития происходит замена одних аллелей другими (Райдер, Тейлор, 1983).

Наиболее изученным ферментом растений является алкогольдегидро-геназа. При обследовании популяций и инбредных линий сахарной свеклы выявлены три фенотипа алкогольдегидрогеназы (АДГ): а) одна зона с высокой подвижностью (FF); б) одна зона с низкой подвижностью (SS); в) три зоны (FS), из которых две крайние совпадают с зонами предыдущих классов, а третья имеет промежуточную подвижность.

Электрофоретический анализ различных органов и тканей сахарной свеклы показал, что активность АДГ выявляется в пыльце, семенах, корнеплодах и отсутствует в вегетативных органах надземной части растения.

В результате проведенных A.A. Коноваловым (1985) исследований выявлен моногенный контроль АДГ в семенах сахарной свеклы.

В нашей работе изучалась глутаматдегидрогеназа (ГДГ) медленной зоны, предположительно участвующая в реакциях дезаминирования и активная во многих тканях свеклы (пыльца, семена, листья, корнеплоды). При анализе коллекции инбредных линий были выделены материалы, имеющие различия по электрофоретической подвижности ГДГ в семенах. Гибриды F, имели диффузную зону активности ГДГ, границы которой совпадали с зонами родительских классов. По аналогии с ГДГ кукурузы было предположено, что ГДГ в семенах сахарной свеклы контролируется одним структурным локусом Gdh-1 с аллелями F и S. Гомозиготные растения имеют гомомерные варианты фермента, а в гетерозиготе образуется ряд гомо- и гетеромультимеров, имеющих близкую элекгро-форетическую подвижность и образующих на электрофореграмме сплошную зону. Моногенный контроль ГДГ в семенах сахарной свеклы установлен A.A. Коноваловым (1985).

Изучение экспрессии НАДФ-зависимого малик-фермента показало, что в черешках исследованных линий сахарной свеклы обнаружено два изофермента малик-энзима, отличающихся по своей электрофоретической подвижности и обозначенных как «быстрый» (F-тип) и «медленный» (S-тип). Изоферментный спектр малик-энзима листьев состоит из пяти изоферментов, самый быстрый из которых имеет одинаковую элек-трофоретическую подвижность у всех исследованных линий, а самый медленный изофермент по своей электрофоретической подвижности соответствует изоферменту либо F, либо S-типа, выявляемому у данного растения в черешке. Подвижность трех средних из пяти изоферментов соответственно выше у линий, имеющих изофермент F-типа, и ниже, у линий, имеющих изофермент S-типа. Поскольку пятиполосный изоферментный спектр характерен для ферментов, являющихся по своей структуре тетрамерами (Markert. 1963), и тетрамером является малик-энзим у животных (Baker, Mintz, 1969; Shows et al., 1970), E.B. Левитесом установлено, что малик-энзим сахарной свеклы также является тетрамером и контролируется двумя генами Ме-1 и Ме-2. Пятиполосный изоферментный спекгр малик-энзима выявляется у всех растений в ряду поколений размножения линий. Это указывает на то, что исследованные линии сахарной свеклы гомозиготны по генам, контролирующим малик-энзим. В тканях семян и в основании черешка активен лишь локус Ме-1.

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что экспрессия того или иного ферментного локуса определяется структурно-функциональной организацией не только самого локуса, но и всего генома.

Взаимосвязь между изоферментами и изменчивостью количественных признаков

Большинство хозяйственно-ценных признаков контролируется множеством генов, а их изменчивость зависш от аллельного состояния небольшого числа генов. Это положение было сформулировано еще в начале 80-х годов (Животовский, 1984; Созинов, 1985).

При наличии предполагаемого сцепления изоферментных маркеров с генными системами, детерминирующими развитие морфологических признаков, возможно будет проводить эффективный отбор на ранних этапах селекции (Конарев, 1993). Работ по анализу селекционной ценности аллелей изоферментных локусов у сахарной свеклы нам не встречалось.

Изучение зависимости между пятью изоферментными локусами (МсШ-1, МсШ-2, Ме-1,Ас111-1, всШ-!) и сахаристостью показало отсутствие достоверной связи (Федулова, Жужжалова, Корниенко, 1998), чю связано, по-видимому, с тем, что гены, контролирующие сахаристость и изученные изо-ферментные локусы находятся в разных группах сцепления. Между генотипами Мс111-1РР, МсШ-2РР и Мс111-2Р8 и Ме-1 Р8 и массой корнеплода установлено наличие достоверной положительной связи, т.е. данные генотипы характеризуются повышенной массой корнеплода, что позволяет проводить отбор на повышенную продуктивность с использованием данных маркеров на ранних этапах развития растения. Между массой корнеплода и генотипами МсШ-1№1 и Ме-188 нами выявлена достоверная отрицательная взаимосвязь, т .е. данные генотипы оишчакнея пониженной массой корнеплода.

Вместе с тем исследования в этом направлении не закончены и использование новых изоферментных локусов, возможно, позволит найти корреляцию с другими хозяйственно-полезными признаками.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ В СЕЛЕКЦИИ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ Изоферментный контроль гомозиготности

Использование в селекционном процессе сахарной свеклы гетерозис-ной схемы основано на необходимости создания линейного исходного материала, который можно получить с помощью различных систем инбридинга. Как известно, у растений самой интенсивной формой инбридинга является самоопыление.

Основным требованием, предъявляемым к родительским компонентам, используемым в селекции, является их гомозиготиость по большинству генов, которую невозможно оценить без глубокого изучения теоретических основ и закономерностей процесса гомозиготизации с использованием молекулярно-генетических маркеров.

Наши исследования показали, что изученные селекционные материалы сахарной свеклы имеют различное соотношение гомо - и гетерозигот по семи изоферментным локусам В связи с этим генетическая выравненноегь се-

лекционных материалов зависит от количества гомозигот каждого проанализированного локуса. Для оценки гомозиготности линий и популяций по изо-ферментным локусам нами было введено понятие индекса изоферментной гомозиготности (Филатов, Федулова, 1993), который вычисляется но фор-

л

ур

муле: 1,7 = а-1 ", где Р - частота встречаемости гомозигот по каждому из (п) п

локусов. Теоретически ожидаемое значение 112, рассчитанное, исходя из условия гетерозиготности исходного растения, соответствует коэффициенту инбридинга Р, который вычисляется по формуле:

Т = 1-2где к- число самоопылений (Гуляев, Мальченко, 1983). Для характеристики 11г нами введена величина ш - достоверность 1,7:

т = ]Гх,, где х, - величина, отражающая вклад каждого из (п) локусов в

1.1

величину т. Если редкий аллель какого-либо локуса отсутствует в линии, то величина х для него вычисляется по формуле:

х = 1 - 4(0,5 - с1) ^ где ^ частота встречаемости редкого аллеля в популяции. из которой берет начало линия, если же такой информации нет, усредненная частота в возможно большей выборке популяций.

Основываясь на этом принципе, проведение молскулярно-генетической оценки многосемянных опылителей сахарной свеклы по семи изоферментным локусам показало, что уровень их гомозиготности оказался значительно выше коэффициента инбридинга Р, рассчитанного на основании менделевских закономерностей при случайном отборе растений (табл.1).

Таблица 1 - Изоферментный контроль гомозиготности селекционных _______1_материалов сахарной свеклы, 1986-1990 гг.

Образец Поколение Кочичество гомозигот по локусам, % г \а т

инбридинга Ме-1 М<№-1 МсШ-2 ШЬ-1 1с№-2 оаы А<1Ы

86170 Ь 72 54 100 100 94 100 100 0,50 0,88 3,83

510-4 Ь 90 40 100 100 100 100 100 0,75 0,90 3,73

88231 12 43 50 100 100 94 100 100 0,75 0,84 3,60

88291 ь 56 24 100 100 86 100 100, 0,75 0.80 3,83

90182 1з 97 100 100 100 83 100 юо"1 0,87 0,97 3,60

90188 1з 83 70 100 98 88 93 100 0,87 0,90 3,83

_8515 и 91 • 94 98 100 68 99 0,94 0,92 4,04

545-5 и 100 100 г 100 100 100 100 100 0,94 1,00 3,60

546-6 и 100 100 Лоо 100 100 100 100 0,94 1,00 3,60

547-1 и 57 100 100 100 100 80 100 0,97 0,91 4,14

Среднее - 79 73 99,8 99,8 94 94 99 - 0,91 3,78

ВП одн 29 Популяция 72 41 97 87 60 65 100 0 0,75 3,83

Ялтуш одн 2 Популяция 68 51 89 91 86 70 100 0 0,79 3,72

Рам 06 Популяция 62 56 95 93 60 66 99 0 0,76 3,60

Средее - 67 49 94 90 69 67 99 - 0,77 3,72

Результаты проведенных экспериментов показали, ч го гомозиготность селекционных материалов сахарной свеклы зависит от глубины инбридинга и варьирует от 0,80 до 1,00, составляя в среднем 0,91 у линейных материалов, полученных в результате последовательных самоопылений, что свидетельствует о достаточной их генетической выравненное ги. Это позволило нам выделить инбредные линии с высокой степенью гомозиготности. Индекс изоферментной гомозиготности изученных инбредных линий сахарной свеклы также значительно выше \и популяций, который составляет у последних 0,77, что согласуется с результатами исследований Г.П. Филатова (1993). Это объясняется тем, что при инбридинге в пределах инцухтируемой аутофертильной расы идет процесс накопления однородности в пределах линий, причем этот процесс развивается довольно быстро, так что в 4-5поколениях инцухт-линии практически становятся однородными, на что указывали еще Т.Ф. Гринько (1940), A. J1. Мазлумов (1950), CMdmeyer (1965), В. Ф. Добросотсков (1972), И. А. Шевцов (1981) и др.

Увеличение индекса I,z связано с возрастанием iомозиготности в результате самоопыления, что согласуется с литературными данными многих авторов (Ригер, Михаэлис, 1967; Айапа, Кайгер, 1988).

Однако в процессе инцухтирования индивидуальных растений у пере-кресгноопылителей наблюдается депрессия в урожайности и мощности развития, что отмечали исследователи Т.Ф. Гринько (1940), А.Л. Мазлумов (1950),

A.B. Корниенко, С. Д. Орлов (1990), И.Ф. Голев (1991), Е. А. Павленко (1991),

B.А. Бычкова (1993). Инбредная депрессия обусловлена повышением степени гомозиготности по вредным рецессивным аллелям (Айапа, Кайгер, 1988).

Альтернативным путем получения гомозиготных линий сахарной свеклы является метод индукции гаплоидии из неоплодотворенных семяпочек в условиях in vitro, позволяющий в короткий срок получать гомозиготный материал практически по всем генам (Знаменская, 1999; Жужжапова, 1999; Подвигина, 2003).

Изоферментный анализ позволил проводить контроль при получении гаплоидов путем культивирования неоплодотворенных семяпочек in vitro, включающий отбор донорских растений, гетерозиготных по ферментным локусам, и выявление на ранних этапах развития гаплоидных регенерантов. Это дало нам возможность отобрать формы, гемизиготные по трем маркерным генам: Ме-1, Idh-1, Gdh-1 (Федулова, Подвигина, 1994).

В ходе проведенных исследований выявлено, что донорские генотипы, гетерозиготные по изоферментным локусам, сформировали наибольшее количество гаплоидных регенерантов 64,7% от общего количества микроклонов. Наши данные находят подтверждение в экспериментах других исследователей (Zagorska et al., 1998; Chekurov, Razmakhnin, 1999; Подвигина, 2003), отмечавших повышение выхода гаплоидных регенерантов у гетерозиготного материала в сравнении с линейным.

Нашими исследованиями установлено, что индекс изоферментной гомозиготности по семи изоферментным локусам у дигаплоидных линий са-

харной свеклы варьировал от 0,81 до 1 и в среднем составлял 0,96, тогда как у обычных самоопыленных линий - всего 0,85. Это свидетельствует о достаточно высокой чистоте дигаплоидных линий, полученных в культуре in vitro.

Гомозиготная природа полученных дигаплоидов была доказана биохимическим путем по анализу изоферментных спектров и другими исследователями (Gorduan, 1976; Wu, King, 1979; Schnepf, Whitely, 1981).

Для преодоления инбредной депрессии в селекции сахарной свеклы используется метод сестринских или сибсовых скрещиваний.

В результате проведенных экспериментов нами выявлено, что индекс изоферментной гомозиготности у большинства изученных нами сибсовых материалов оказался ниже коэффициента инбридинга F и варьировал от 0,75 до 0,81 (табл. 2).

Таблица 2 - Изоферментная оценка степени гомозигопюсти сибсов

сахарной свеклы, 1990-1993 гг.

Образец Количество гомозигот по локусам, % F l,z

Ме-1 Idh-l ldh-2 Mdh-1 Mdh-2 Gdh-1 Adh-1

Популяция 65 88 73 46 66 66 100 1 0,00 0,73

iig, 73 89 75 69 89 70 99 0,50 0,80

i2g, 76 91 76 65 92 56 100 0,75 0,80

i,g, 55 96 71 30 100 77 96 0,88 0,75

ug, 59 [90 79 70 100 69 100 0,94 0,81

Ьфакт~278,46 FTe0p 3,84 HCP(0-o5 >"=0,021

Как известно, показателем доли родственных скрещиваний в популяции со смешанным размножением служит коэффициент инбридинга растений F, а показателем доли случайных скрещиваний - коэффициент панмиксии Р (пан-миктический индекс (Wright, 1921)). Оба коэффициента находятся в отношении Р + F = ). Генетическую близость особей в популяции мы оценивали долей генов, идентичных по происхождению. Панмиктический индекс у данных селекционных материалов, отражающий степень гетерозиготности популяций, был невысокий и колебался у отдельных образцов от 0,03 до 0,25.

Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют также о том, что l,z выше у инбредных линий сахарной свеклы, чем у форм от близкородственных скрещиваний и составляет в среднем 0,91 и 0,79, соответственно. Что связано, по-видимому, с методом поддержания сибсовых материалов, которое осуществляется на изолированных участках, где, вероятно, и произошли засорения этих линий чужеродной пыльцой из-за недостаточной изоляции, 'что согласуется с результатами исследований Г.П. Филатова (1993).

По данным Ф. Бригса и П. Ноулза (1972) I, при самоопылении по уровню гомозиготности соответствует G|0, полученному от близкородственного размножения и отбора. Сравнение гомозиготных линий при репродуцировании их путем скрещивания близкородственных форм и самоопыления также выявили различия в генетической стабильности в популяциях.

Результаты проведенных нами исследований показали, что степень го-мозиготности линий сахарной свеклы с ЦМС зависит от количества беккрос-сов с «0»-типом. Так, нами выявлено повышение 112 по семи изоферментным локусам (от 0,63 до 0,92) при увеличении количества возвратных скрещиваний МС-формы с «0»-типом (от ВС! до ВС6), что согласуется с результатами исследований других авторов, отмечавших, что по всем признакам, по которым форма-опылитель является гомозиготной, происходит из поколения в поколение быстрое возрастание гомозиготности и увеличение числа форм, соответствующих родительскому типу (Савицкий, 1940; Балков, 1978; Ма-лецкий, 1985, 1995; Ошевнев, 1999).

Таким образом, полученные нами данные показали возможность использования изоферментных маркеров для оценки гомозиготности инбред-ных линий сахарной свеклы. Индекс изоферментной гомозиготности \а реально отражает их гомозиготность. Используя же только коэффициент инбридинга Р, не учитываются засорения чужеродной пыльцой, которые могут происходить при проведении сибсовых скрещиваний на изолированных участках. Причем, изоферментную оценку необходимо проводить на всех этапах создания линейного материала, что позволит сразу отбраковывать гетерозиготные формы.

Изоферментный контроль гибридизации

Основой современной гетерозисной селекции сахарной свеклы является межлинейная гибридизация. Гибриды, полученные от скрещивания специально подобранных линий, позволили повысить урожайность сахарной свеклы на 20-30% и более. Необходимым условием получения наибольшего эффекта гетерозиса у свеклы является достижение наиболее полного переопыления при скрещивании и получение наибольшего количества гибридных семян. Как правило, при высокой степени переопыления достигается и более высокая продуктивность гибридов (Бабьяж, 1966; Буренин, 1970; Маз-лумов и др., 1972). В этой связи важным условием является контроль за ходом гибридизации. Большое практическое значение имеет использование для этих целей изоферментов. Кодоминантный характер проявления аллель-ных вариантов фермента в гетерозиготе позволяет определять процент гибридов на обоих компонентах скрещивания (Левитес, 1979а; Ма^ку, ЬеуИев, 1982; Левитес, Котляревский, 1984).

Изоферментная оценка показала, что количество гибридных семян, полученных в результате гибридизации фертильных линий, контрастных по аллельным вариантам малик-фермента варьировало в прямой комбинации от 25, 9 до 97,8%, тогда как в обратной комбинации этот показатель был почти в два раза меньше (17,1-54,2%) (табл. 3).

Вместе с тем, нами выявлено, что полной гибридизации между линиями не происходит, и выход гибридов в среднем составляет 53%. Остальные семена формируются за счет само- и внутрилинейного переопыления.

Таблица 3 - Гетерозиготносгь и продуктивность межлинейных гибридов, 1989-1990 гг

Комбинация скрещивания Прямая комбинация Обратная комбинация

Кол-во гетерозигот, % Урожайность, т/га Сахаристость, % Кол-во гетерозигот, % Урожайность. т/ia Сахаристость. %

613(SS)x619(FF) 97,8 54,91 15,98 54,20 43,13 15,64

625(FF)x612(SS) 95,0 54,26 16,00 34.00 50,41 15.80

625(FF)x618(SS) 44,2 40,27 15,52 42,90 31,72 15,93

622(SS)x619(FF) 80,4 36,97 16,00 26,70 37,46 16,00

622(SS)x626(FF) 25,9 37,93 16,14 26,50 38,96 16,05

622(SS)x615(FF) 50,9 42,39 15,72 17,10 41,27 15,20

614(SS)x624(FF) 44,3 43,71 15,23 48,00 41,90 15,35

HCP(0,05) 5,52 0,42 4,95 0,48

Наши данные согласуются с результатами других исследователей (Ко-былянский, Косов, 1971; Мирюта, Перетятько, 1963; Знаменская, 1985; Бычкова, 1993). Разное количество гибридных семян объясняется наличием у сахарной свеклы системы само- и перекрестной совместимости.

В результате наших экспериментов установлено, что зависимость между количеством гибридных семян и продуктивностью гибридов прослеживается не всегда, что подтверждается данными (Sedlmayr, 1957; Jinks, 1983; Бычкова, 1992).

Проведенные нами исследования (Филатов, Федулова, Жужжалова, 1990) показали, что, используя изоферментные маркеры, можно уверенно подбирать пары для гибридизации, дающие наибольший выход гибридных семян

Изоферменты являются единственными маркерами также для оценки переопыления нескольких линий (поликросса) гомозиготных по разным аллелям маркерных локусов. Изоферментпый анализ показал, что поликроссные гибриды значительно варьируют по содержанию гибридных семян. Некоторые из них склонны к внутрилинейному переопылению, а другие к межлинейному. Отмечена тенденция к улучшению продуктивных показателей с увеличением частоты встречаемости переопыленных семян у поликроссных гибридов. В 33% случаев обнаружено достоверное отличие по показателям продуктивности между опытными поликроссными гибридами и контролем, что свидетельствует об отличиях между исходными полиморфными линиями и сформированными с использованием изоферментньгх маркеров. Следует отметить, что для проведения подобных поликроссов необходимы гомозиготные инцухт-линии или дигаплоидные линии.

Изоферментный анализ гибридов на ЦМС-основе показал, что количество гетерозигот у них по четырем изоферментным локусам варьировало в значительных пределах, от 38% у гибрида Ризор до 75% у гибрида РМС-46. Это зависело, по-видимому, от типа стерильности материнского компонента, степени гомозиготности родительских форм по маркерным генам и одновременности цветения скрещиваемых компонентов. Данное явление под-

тверждается исследованиями В.П. Ошевнева и Н П. Грибановой (2003), которые также отмечают, что при размножении МС-компонентов гибридов и без постоянной идентификации по признакам ЦМС и закрепительной способности компоненты становятся фертильными и не обеспечивают получения 100% гибридных семян.

Таким образом, маркирование линий - компонентов гибридов по изо-ферментным локусам позволяет контролировать процесс гибридизации, выявлять количество гибридных семян и идентифицировать родительские пары, дающие наибольший выход гетерозиготных генотипов.

Метод подбора родительских компонентов для гибридизации

Успех селекционной программы во многом зависит от правильного выбора родительских форм для скрещивания и от степени их различия. Наилучшие результаты получаются при скрещивании форм, значительно различающихся между собой в генетическом отношении. Поэтому немалый интерес представляет вопрос о количественной оценке степени различия между линиями, сортами по комплексу важнейших биологических и хозяйственных признаков. Для этих целей может быть использован кластерный анализ, который позволяет сгруппировать генетически близкие селекционные материалы.

Биохимический анализ селекционных материалов сахарной свеклы дал возможность выявить состав изоферментных локусов, по которым можно установить генетическую удаленность их друг от друга.

Изучение генетических расстояний инбредных линий и популяций сахарной свеклы, рассчитанных по М. Нею М., 1978), показало, что большинс1во из них находились на небольшом генетическом удалении друг от друга, которое колебалось от 0,020 до 0, 699, в среднем составляя 0,238. Полученные результаты соответствовали происхождению указанных инбредных линий сахарной свеклы, то есть генетические расстояния отражали реальные взаимоотношения, исторически сложившиеся между селекционными материалами.

Как известно, успех селекции определяется двумя основными факторами: подбором компонентов, обладающих высокой комбинационной способностью, и получением максимального выхода гибридных семян при скрещивании (Мазлумов, 1966). Последнее наиболее полно реализуется при использовании форм с цитоплазматической мужской стерильностью (ЦМС). Вместе с тем использование стерильных материалов открывает широкие возможности для более точной оценки общей и специфической комбинационной способности (Бабьяж, 1967; Багжов, Ошевнев, Прохорова, 1973). Однако определение ОКС и СКС довольно трудоемкий и длительный селекционный процесс, который существенно изменить и ускорить можно, используя молекулярно-генетические маркеры для подбора родительских компонентов, тогда отпадет необходимость в проведении длительной процедуры оценки линий на комбинационную способность (Корниенко, Орлов, 2002).

Наши исследования показали, что формы с ЦМС характеризуются большими значениями генетических дистанций. Дендрограмма, построенная на основании матрицы генетических расстояний, позволила сгруппировать близкие селекционные номера и выделить линии, резко отличающиеся в генетическом отношении друг от друга (рис. 1.).

о,, 267481935

0,000 0,093 0,185 0,278 0,371 ь 0,463

Рис.1. Графическое изображение генетических взаимоотношений между селекционными материалами на МС-основе

Так, образцы 87388 (№2) и 88115 (№4) не входят ни в один кластер, так как имеют довольно высокие значения генетических расстояний с остальными селекционными материалами. DN варьирует от 0,333 до 0, 514 и от 0,195 до 0,556, соответственно, что свидетельствует о глубоких их генетических различиях. Мы полагаем, что это связано, вероятно, с генетическими особенностями изученных форм. Номера 89530 (№ 6) и 89531(№ 7) образуют на дендрограмме один кластер, что предполагает их родственное происхождение. И, действительно, эти материалы получены из фирмы ICI (Бельгия). Они находятся на большом генетическом удалении от рамонских МС-линий, Dn от 0,220 до 0, 528. А среднее значение генетического расстояния между представленными зарубежными номерами и рамонскими МС-линиями составило Dn "= 0,368. Селекционные номера 89331(№ 8) и 89332 (№ 9) представляют собой гибриды F, от скрещивания рамонских О-типов и МС-линий из США (89332) и Швеции (89331) и стоят ближе в генетическом плане к рамонским материалам, DN варьирует у них от 0,067 до 0,556. Среднее значение генетической дистанции между этими гибридами и рамонскими МС-линиями составило DN = 0,196.

Результаты кластеризации показали, что в большинстве случаев сходство между выведенными в одном регионе материалами значимо выше, чем между образцами различных селекцентров, что согласуется с результатами исследований С.Т. Мартынова и Т.В. Добротворской (1996), полученными при анализе генетических профилей яровой мягкой пшеницы.

В наших исследованиях в результате изучения генетической дифференциации МС-линий и многосемянных опылителей установлено, что они

находятся на большом генетическом удалении друг от друга. Ом варьирует от 0,497 до 2, 394 (рис. 2). Е^ 2 6 7 I 4 3 5 10 II 13 12 18 9 14 8 15 16 17

0,000

0,399

0,798

ir1

1,197 -

1,596 -

1,995 -

2,394 -

Рис.2. Дендрограмма генетических дистанций между МС-линиями (1-7) и многосемянными опылителями (8-18)

Дендрограмма, построенная по матрице генетических расстояний, отражает реальные взаимоотношения, сложившиеся между данными селекционными формами.

В процессе проведенных нами исследований прослеживается общая тенденция - с увеличением значений генетических расстояний, увеличивается частота проявления гетерозисного эффекта в гибридных комбинациях. Так. при гибридизации родительских форм сахарной свеклы, маркированных по изоферметному составу, различного географического происхождения в гибридном поколении (№6282) проявляется гетерозис (+28,4%) по урожаю корнеплодов (табл. 4).

Таблица 4- Продуктивность совместных гибридов, 1992-1994 гг.

Гибрид Происхождение Генетическое расстояние, В % от стандарта

МС-форма Опылитель Урожай корнеплодов Сахаристость Сбор сахара

5939 ICI ВНИИСС 1,526 117,4 103,7 121,6

, 5937 ICI ВНИИСС 1,126 113,4 103,0 116,6

' 6282 ICI ВНИИСС 1,748 128,4 101,7 130,6

901104 ВНИИСС ICI 0,954 108,3 102,6 111,3

901106 ВНИИСС ICI 1,043 117,9 100,3 118,0

901124 ВНИИСС ICI 0,998 110,9 105,7 116,9 111,8

6253 Льговск. ОСС ВНИИСС 0,937 109,3 102,2

6381 Льговск. ОСС ВНИИСС 0,823 106.6 101,1 107,8

В результате скрещивания льговских МС-форм с рамонскими многосемянными опылителями отмечался незначительный гетерозис как по урожаю корнеплодов (+9,3%), так и по сахаристости (+2,2%) при достаточно

высоком значении DN(0,823 0, 937). Это объясняется тем, что между данными селекционными учреждениями существуют давние тесные связи по обмену селекционными материалами, что свидетельствует о некотором сужении генного пула.

Результаты наших экспериментов подтверждают данные исследований, полученные ранее И.Я. Балковым с коллегами (1973), A.B. Корниенко и С.Д. Орловым (1996) отмечавшими, что гетерозис проявляется в гибридных комбинациях, как результат скрещивания неродственных линий.

Аналогичные данные были получены I. Grant и W Beversdorf (1985), В.И. Горшковым (1998) на рапсе. Установленное авторами проявление отрицательного гетерозиса по семенной продуктивности объясняется большим генетическим родством родительских компонентов.

Представляют интерес результаты, полученные М.Д. Варлаховым и U.M. Чекалиным (1984), отмечающими, что использование многомерного статистического анализа для подбора родительских форм позволяет сократить сроки создания сортов на 2-3 года.

Таким образом, анализ литературных источников и наших экспериментальных данных свидетельствует о том, что для создания гибридов сахарной свеклы, обладающих 1етсрозисным эффектом, необходимо использовать инбредные линии, находящиеся на большом генетическом удалении друг от друга. На основе полученных данных нами разработан метод подбора родительских компонентов для гибридизации, заключающийся в проведении изоферментного анализа скрещиваемых форм, определении частоты встречаемости аллелей ферментных локусов, вычислении генетических расстояний и проведении кластерного анализа.

Генетическое маркирование в процессе создания гомозиготных линий

Гомозиготные линии сахарной свеклы получают принудительным самоопылением растений исходной формы в течение нескольких поколений. Недостатками известного способа являются длительность получения линейного материала, большие затраты, невозможность получения линий от самонесовместимых растений и форм, обладающих мужской стерильностью.

На современном этапе широкое применение на других культурах нашел метод индуцирования гомозиготных линий с использованием молеку-лярно-генетического маркирования и ионизирующего излучения. Известно, что ионизирующие излучения, действуя на генеративные органы растений, в одних случаях вызывают апомиктическое развитие семян, ведущее к возникновению матроморфных форм (Петров, 1979; Жужжалова, Богомолов, Федулова, Ошевнев, 1978), в других - на основе «трансформации» формируют растения с рекомбинантными генами (Hess, 1975; Картель, 1981; Engwild, 1985).

В наших исследованиях при проведении индуцированных опылений мужскостерильных растений сахарной свеклы гамма - облученной пыльцой впервые было применено генетическое маркирование, основанное на цито-морфогенетической оценке потомства по числу хромосом, окраске вегетативных органов и аллельному составу маркерных генов. При эгом отличительным признаком материнской формы являлось рецессивное состояние (г) - зеленой окраски гипокотиля, а отличительным признаком отцовской формы - красная окраска гипокотиля, контролируемая доминантным геном (R).

Оказалось, что при опылении инактивированной пыльцой оплодотворения не происходило, и в потомстве при изоферментном анализе были выявлены гомозиготы по гену Ме-IF и Me-lS.

Как свидетельствуют результаты проведенного изоферментного анализа, наибольшее количество гомозиготных растений при опылении МС-форм у-облученной пыльцой маркированной свеклы Red tester составило 61,4%, при опылении облученной пыльцой дикой свеклы Beta corolliflora - 65,2%. Гомозиготность отдельных потомств при опылении облученной пыльцой в дозах 1500-2000 Гр составила 87,7-97,4%. Чтобы создать линии с такой степенью гомозиготности традиционным способом, необходимо провести цикл близкородственных (сибсовых) скрещиваний с чередующимся инцухтирова-нием в течение нескольких поколений, на что обращали внимание в своих исследованиях И.Я. Балков (1978), С И. Малецкий с коллегами (1988) и другие.

В результате наших экспериментов отмечено, что в потомстве Му1 растения со стерильными пыльниками формируют семена при самоопылении, завязываемость при этом варьировала от 2,9 до 55,5%.

Способность мужскостерильных растений образовывать семена была объяснена явлением диплоидного апомиксиса, вызванного индуцированным воздействием на систему размножения, сопровождаемым переносом отдельных генов из облученной пыльцы дикой свеклы в растения сахарной (Жуж-жалова, 1999; Богомолов, 2000).

В процессе дальнейших исследований (Фоменко, 2003; Фоменко, Жужжалова, Федулова, Богомолов, 2004) было эмбриологически подтверждено наличие у полученных нами гамма-линий сахарной свеклы агамос-пермного пути образования семян, проявляющегося в явлении диплоспории.

Отобранные гомозиготные по изоферментным локусам растения послужили основой для создания гамма-линий сахарной свеклы с ценными селекционными признаками (Богомолов, Жужжалова, Федулова, 1994; 1996) (табл.5).

Для линий была характерна высокая гомозиготность по трем маркерным генам: Ме-1, Mdh-1, Adh-1, выравненность морфологических признаков вегетативных органов, высокая раздельноплодность (от 96, 8% до 100%), способность закреплять ЦМС, склонность к апомиктиче-скому размножению.

Таблица 5 Характеристика маркированных гамма-линий по селекционно-ценным признакам, 2003-2004 гг.

Образец Генотипы по маркерным генам: Стерильность, % Раздель-ноплод-носгь, % Масса корнеплода, г Сахаристость, %

Ме-1 Mdh-1 Adh-1

у-РФ-2113 FF NN FF 0,0 98,0 480 17,6

у-МС-94-13 FF РР FF 100,0 100,0 520 15, 1

у-МС-94-73 FF FF 100,0 100,0 390 17,4

у-МС-94-80 SS РР FF 100,0 100, 0 350 17,5

у-МС-90-204 SS NN FF 100,0 96,8 403 16,8

у-МС-90-246 SS РР FF 100,0 100,0 490 18, 1

НСР(0,05) 6,49 0,38

Это позволяет успешно использовать их в селекционной работе в качестве компонентов создаваемых гетерозисных гибридов.

Создание гибридов на стерильной основе с использованием маркированных гамма-линий

На современном этапе развития селекции сахарной свеклы наиболее перспективным направлением является получение гетерозисных гибридов на стерильной основе (Корниенко, Орлов, 1996; Ошевнев, 1999; Орлов, 1999).

Затрудняет селекционную работу с мужской стерильностью у сахарной свеклы то обстоятельство, что в обычных фертильных сортах-популяциях имеется ограниченное число растений-опылителей закрепителей стерильности, так называемых растений нулевого или <Ю»-типа (Оуэн, 1942).

Среди новых приемов, позволяющих увеличить частоту встречаемости закрепителей О-типа, является индукция их с помощью облученной пыльцы с использованием генетического маркирования.

В наших исследованиях были получены материалы, различающиеся по генам самостерильности и самофертильности (Богомолов, Жужжалова, Фе-дулова, Корниенко, 1996). Появление закрепителей стерильности в данном случае мы объясняем тем, что облученная гамма-лучами пыльца вызывает изменения в структуре стерильной плазмы, в результате которой она превращается в нормальную, что было показано также В. П. Ошевневым (1999).

Как известно, схемой селекционной работы с гибридами на МС-основе предусмотрена двукратная проверка генотипа опылителей О-типа по закреплению полной мужской стерильности. Затем они изучаются на ОКС и СКС. Простые гибриды (базисные семена) проходят тестирование со сростноплодным опылителем. Лишь после этого начинается репродукция компонентов гибридов для получения фабричных семян (Ошевнев, 1999; Богомолов, 2000).

В наших исследованиях по данной схеме был получен гибрид РМС-90 (A.C. № 31185, 2001), обладающий гетерозисным эффектом. Гибрид создан на основе маркированных и отобранных по изоферментному составу МС-компонента, опылителя О-типа у-РФ-2113 и многоплодного опылителя № 14840.

По результатам сравнительного экологического испытания, проведенного в 1994-1998 гг., новый гибрид превысил стандартный сорт Рамонскую односемянную 47 в среднем на 5,29 т/га и групповой стандарт на 7,27 т/га по урожаю корнеплодов, по сахаристости на 0,28 и 0,31%, соответственно, и сбору сахара на 0,98 т/га и 1,36 т/га. соответственно.

Поражение корнеедом данного гибрида оказалось на 6,8% ниже стандарта Рамонской односемянной 47, а поражение кагат ной гнилью - на 2,2% ниже стандарта.

Расчет экономической эффективности гибрида РМС-90 (Богомолов, 2000) показал, что прибавка по урожайности за 1999 год по сравнению с групповым стандартом составляет 6,9 т/га, закупочная цена -1т- 400 руб., эффект от реализации - 2760 руб./га, прибавка по сбору сахара -1,16 т/га при цене реализации 6000 рубУт, эффективность - 6960 руб./га. Суммарный экономический эффект от внедрения нового гибрида составит 2760 руб. + 6960 руб. = 8720 руб./га.

За последние годы нами создана еще одна перспективная гибридная комбинация, где в качестве материнской формы была использована отобранная по изоферментному составу линия у-МС-2113, а в качестве отцовской формы - многосемянный гетерозисный опылитель № 15202.

Следует отметить, что данная гибридная комбинация превосходит групповой стандарт в среднем по урожаю корнеплодов на 115,6%, районированный стандарт на 122,2%, по сахаристости на 100,2% и 100,6%, соответственно, и сбору сахара - на 115,9 и 123%, соответственно (табл. 6).

Таблица 6 - Результаты основного сортоиспытания нового ____гибрида сахарной свеклы ____^________

Год Урожайность, 1/га В % от стандарта Сахаристость, % В % от стандарт Сбор сахара, т/га В % от стандарта

группового районированного группового районированного группового райони-рованн ого

2002 47,77 120,6 122,2 15,77 ' 99,6 101,0 7,53 120,2 123,4

2003 54,20 107,7 111,3 [ 17,44 ¡100,0 100,2 9,46 6,54 107ТГ 111,6

2004 39,90 118,6 1133,1 16,39 100,9 100,5 119,7 133,9

среднее 47,29 115,6 122,2 16,53 100,2 100,6 7,84 115,9 123,0

НСР(0. 051 5, 73 0, 26 0,92

В результате оценки по устойчивости к корнееду выявлено, что поражение растений сахарной свеклы в данной гибридной комбинации составило 25%, тогда как на контрольном варианте - 41%.

По итогам основного сортоиспытания данная гибридная комбинация передана в экологическое сортоиспытание.

Таким образом, в ходе проведенных экспериментов показано, что маркированные гамма-линии сахарной свеклы обеспечивают гетерозис в гибридных комбинациях по урожаю корнеплодов (133,1%) от районированного стандарта и по сбору сахара (121,5%) и могут быть использованы в качестве родительских компонентов гибридов.

Молекулярные маркеры в изучении генетической структуры популяций и гибридов сахарной свеклы.

Генетическая изменчивость в популяциях сахарной свеклы

Применение метода элсктрофоретического выявления ферментного полиморфизма привело к обнаружению достаточно большой генетической изменчивости в популяциях сахарной свеклы. В качестве показателей генетической изменчивости мы использовали долю полиморфных локусов и среднюю гетерозиготность на особь по изученным локусам, предложенную другими исследователями (Глазко, Созинов, 1993; Алтухов, 1983; 2003).

Средняя гетерозиготность на локус является непосредственно определяемым популяционно-генетическим параметром и характеризует особенности генетической структуры данной локальной популяции.

В результате проведенных экспериментов нам удалось оценить объем скрытой генетической изменчивости в популяциях сахарной свеклы. Выяснилось, что большинство сортов довольно гетерогенны, доля полиморфных локусов составляет 75-100% от всех исследованных (табл. 7).

Таблица 7 - Гетерозиготность изоферментных локусов в популяциях __сахарной свеклы _________

Сорт п пс Р Нн Н0

Белоцерковская одн. 34 70 1,45 0,75 0,309 0,425

Бийская одн. 12 69 1,25 0,75 0,199 0,405

Веселоподолянская одн. 29 80 1,51 0,75 0,338 0,331

Киргизская одн. 25 63 1,14 0,75 0,121 0,469

Рамонская одн. 9 62 1,59 0,75 0,371 0,468

Рамонская одн. 32 52 1,40 i 0,75 1 0,288 0,453

Рамонская одн. 47 64 1,37 0,75 0,271 0,340

Северокавказская одн. 42 68 1,51 0,75 0,338 0,535

Ялтушковская однос. 2 65 1,36 0,75 0,269 0,474

Уладовская 752 улучшен. 70 1,53 0,75 0,346 0,580

Верхнячская 072 68 1,08 1,00 0,078 0,481

Льговская 078 68 1,43 1,00 го,300 0,570

Межотненская 070 99 1,15 1,00 0,129 0,380

Межотненская 104 92 1,11 1,00 0,100 0,337

Рамонская 06 63 1,33 0,75 0,250 0,512

Рамонская 036 75 1,29 1,00 0,227 0,419

Рамонская 931 57 1,36 1,00 0,263 0,375

Среднее • - 1,34 0,84 0,250 0,444

Примечание: п - среднее количество растений, исследованных по каждому ло-кусу; пс - среднее число аллелей на локус; Р - доля полиморфных локусов; Н„ - наблюдаемая средняя гетерозиготность; Но - ожидаемая средняя гетерозиготность.

Средняя гетерозиготность на геном колеблется от 7,8 до 37%. Это означает, что примерно три из четырех генов представлены в популяции более

чем одним аллелем, а отдельные растения гетерозиготны по многим локу-сам, что сопоставимо с результатами, полученными по другим сельскохозяйственным культурам (Айала, 1988; Глазко, Созинов, 1993).

Расчет наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности по семи изученным изоферментным локусам в большинстве случаев выявил существенные отличия этих двух показателей. По локусам биохимических маркеров наблюдается низкий уровень гетерозиготности у большинства сортов. Тем не менее потенциальное число гетерозиготных генотипов оказалось почти в 2 раза больше (Но=0,331 - 0,580), чем наблюдаемое. По-видимому, эти данные могут свидетельствовать о постоянном селективном давлении, которые испытывают все сорта в процессе их селекции.

Другим важным параметром, используемым для оценки генетической изменчивости популяций, является эффективное число аллелей (п)е, который связан с гетерозиготностью простой зависимостью пе=1/(1-Н).

Среднее увеличение степени гетерозиготности в наших исследованиях составляет 0,194, соответствующее увеличение изменчивости в единицах пе/п'е колеблется от 10,8 до 15,9%. Чем более гетерозиготны локусы, тем больше скрытой изменчивости обнаруживается в популяциях.

Приведенные данные свидетельствуют о том, что генетическая изменчивость широко распространена в популяциях сахарной свеклы, вследствие чего создаются благоприятные условия для эволюционных изменений.

Эволюцию на генетическом уровне можно рассматривать как двухступенчатый процесс. С одной стороны, возникают мутации и рекомбинации -процессы, обусловливающие генетическую изменчивость; с другой стороны, наблюдается дрейф генов и естественный отбор, посредством которых генетические изменения передаются из поколения в поколение, и в связи с этим изменяются частоты аллелей в популяции. Частоты генотипов (но не аллелей!) могут изменяться также в результате ассортативного. г.е. неслучайного, формирования родительских пар.

Полиморфизм молекулярных маркеров в популяциях сахарной свеклы

Известно, что сорта-популяции сахарной свеклы создаются и поддерживаются по уникальным для каждого селекционного учреждения схемам. Являясь панмиктическими популяциями, они могут иметь особенности формирования, влияющие на частоту генов.

Согласно генетическому закону Харди-Вайнберга, если в популяции аллель Р встречается с частотой Р, а аллель 8 - с частотой я, и эти аллели и их частоты находятся в системе свободного скрещивания, то в популяции наступает равновесие при частоте появления генов, соответствующее коэффициентам разложения бинома Ньютона:

Р^ + гРяИБ + - 1

Результаты наших экспериментов (Жужжалова, Федулова и др., 1990) показали, что сорта сахарной свеклы различаются по частоте встречаемости аллелей изоферментных локусов. Так, большинство отечественных сортов моно-

морфны по нормальному аплелю Ас)Ы-Р. В некоторых сортах встречается аллель Ае)Ы-8 с низкой частотой 1-5% и почти исключительно в виде гетерозигот. Третий аллель АсИ|1^ встречается лишь в сортах Межотненской селекции (Латвия). Низкая концентрация или полное отсутствие аллеля АсИП-Б в сортах-популяциях обусловлено, как отмечают А. А. Коновалов и С. И. Малецкий (1985), его летальным действием в гомозиготном состоянии. Однако в гибридах сахарной свеклы частота аллеля АсШЬБ значительно выше, в особенности в западноевропейских, где она достигает 12%. Возможные причины этого связаны с различиями в методах селекции сахарной свеклы в России и на западе.

Значительные различия между популяциями были обнаружены по ло-кусу Ме-1: в раздельноплодных сортах частота аллеля МеНБ варьировала от 0,318 до 0,622, в сростноплодных - от 0,087 до 0,490. Частота встречаемости аллеля Ме-1Р у раздельноплодных сортов колебалась от 0,378 до 0,682, а у сростноплодных - от 0,510 до 0,913.

Нашими исследованиями установлено, что частоты встречаемости аллелей малик-фермента у раздельноплодных сортов показывают преобладание Я-аллеля. а у сростноплодных - Г-аллеля, что свидетельствует об их глубоких генетических различиях.

По глутаматдегидрогеназе, контролируемой локусом всИИ, показано, что резких отличий между сортами не выявлено по частотам аллелей. Аллель ОсШЧБ отмечен с частотой от 0,050 до 0,709. У сростноплодных она выше и достигает 1 у сорта Межотненская 104.

Установлено, что по локусу М<Ш-2 у всех изученных сортов присутствовал в основном аллель Мс)Ь-25 с частотой от 0,767 до 1. Аллель \4dh-2F отсутствовал почти у всех проанализированных популяций.

По изоцитратдегидрогеназе у сортов сахарной свеклы выявлены два ферментных локуса: и \dh-2. Аллель 1сШ-1 Р присутствовал у всех популяций с частотой от 0,820 до 1. Аллель МЫБ был представлен в основном в виде гетерозигот с низкой частотой от 0 до 0,175. По локусу М11-2 установлен больший полиморфизм, чем по МЬ-1, увеличилась частота встречаемости аллеля 1сШ-28 (от 0,033 до 0,340).

Различия между популяциями по частотам аллелей могут быть обусловлены следующими причинами: 1) функциональной неравноценностью аплельных вариантов данного фермента; 2) стохастическими процессами дрейфа генов (Левонтин, 1978; Алтухов 1983,2003; Кимура, 1985;Кнпига, 1990).

Таким образом, результаты наших исследований выявили значительный полиморфизм в популяциях сахарной свеклы по семи изученным ферментным локусам, что позволяет использовать их в качестве генетических маркеров,

Критерии сортовых и гибридных различий.

Метод кластерного анализа в изучении происхождения сортов и гибридов сахарной свеклы

Для дифференциации сортов сахарной свеклы, для выяснения их происхождения применяются различные сочетания агрономических и ботаниче-

ских характеристик, основными из которых являются морфологические особенности вегетативных и генеративных органов. Однако степень выражения морфологических признаков сильно зависит от условий окружающей среды. Поэтому в последнее время для решения названных проблем все шире проводятся исследования различных белков как ферментативной, так и неферментативной природы (Fedak, 1974; Bassiri, 1976).

Большой интерес в связи с этим представляет количественная оценка степени различия между сортами по комплексу важнейших биологических, хозяйственных и биохимических признаков (Перфильев, Лебедев, Тихонов, 1979).

В таких случаях используют интегральную характеристику, отражающую сходство или отдаленность популяции по всем изученным маркерам -генетические расстояния (Wright, 1978).

Генетическим расстоянием является степень генных (геномных) различий между популяциями, измеряемая количественным методом. Для измерения генетического расстояния могут использоваться различного рода молекулярные данные. В общем, анализ генетических расстояний между популяциями основан на оценке перекрывания распределения генных или (в зависимости от принятой оценки) генотипических частот в различных локу-сах совокупностей исследуемых генотипов.

Анализ полиморфных белков и изоферментов, как генетических маркеров соответствующих генов, позволил нам на новом уровне исследовать эволюционные взаимоотношения между популяциями, находящимися на различных ступенях генетического родства.

В результате наших экспериментов (Федулова, Жужжалова, Корниенко, 1994) выявлены наибольшие генетические различия у сортов Уладовская 752 улучшенная, Межотненская 070 и Межотненская 104 почти со всеми изученными сростноплодными популяциями. Среднее значение DN составило у них 0,225, 0,163 и 0,333, соответственно. Подобные генетические взаимоотношения связаны, по-видимому, с происхождением данных материалов. Так, при создании сортов Межотненской ОСС (Латвия) в гибридизации были использованы нецветушные немецкие и польские сорта, что существенным образом повлияло на изменение их генетической структуры.

Незначительные генетические расстояния выявлены для сортов Льговская 078 и Рамонская 06 (DN~0,051), что также подтверждает их родственные связи. Так, сорт Льговская 078 получен методом индивидуального отбора с применением внутрисортового и межсортового скрещивания биологически различных сортов (Рамонская 06 х Льговская 925), На основе генетических расстояний методом кластерного анализа была построена дендрограмма генетических взаимоотношений между сростноплодными сортами. В результате проведенных исследований установлено соответствие генотипов гомологичных по изоферментным спектрам сортов генеалогическим данным.

Анализ расчета по полиморфным локусам генетических дистанций М. Нея (1978) свидетельствует о том, что большинство из исследованных раз-

делыгаплодных сортов сахарной свеклы находились на небольшом генетическом удалении друг от друга (Ом среднее 0,121).

Дендрограмма, построенная на основе значений генетических расстояний, разделила раздельноплодные образцы на три основных кластера (рис.3). Генетические расстояния отражают реальные взаимоотношения данных сор-тообразцов. Так, отмечены незначительные генетические дистанции сорта Рамонская односемянная 9 с Белоцерковской односемянной 34 (0м=0,098) и Ялтушковской односемянной 2, что согласуется с данными о его происхождении Сорт Рамонская односемянная 9 создан методом индивидуального отбора из односемянных сортов Белоцерковской ОСС и Ялтушковского пункта (Якименко, Сушков, Юсубов, 1992).

О« 18437528

0,000 0,039 0,078 0,117 0,156 0,195

1 - Белоцерковская одн. 34

2 - Бийская одн. 12

3 Веселоподолянекая одн. 29

4 - Киргизская одн. 25

5 - Рамонская одн. 9

6 - Рамонская одн. 32

7 - Рамонская одн. 47

8 - Ялтушковская одн. 2

Рис.3. Дендрограмма генетических взаимоотношений раздельноплодных сортов

Таким образом, вычисление критерия идентичности, генетических расстояний и проведение кластерного анализа на основе частоты встречаемости типов изоферментных спектров является одном из способов измерения генетической дивергенции селекционных материалов.

Результаты кластерного анализа могут быть использованы для оптимального подбора родительских пар.

Способ идентификации сортов сахарной свеклы

Идентификация необходима в селекционном процессе для выявления и выделения желаемых генотипов из сложных, естественных, сортовых и гибридных популяций. Особенно актуальна идентификация по биологическим маркерам в связи с интенсификацией селекции и семеноводства, требующих семенного контроля высокой точности и оперативности (Конарев, 2000).

В этой связи на основании экспериментальных данных по изучению генетического полиморфизма по изоферментным локусам в сортах сахарной свеклы нами разработан способ идентификации (А.С.№ 1672999, 1991), за-

ключающийся в проведении электрофоретического анализа функциональных белков-ферментов отдельного семени и подсчете частоты встречаемости генотипов по изоферментным локусам.

В качестве показателя, позволяющего оценить различия между популяциями удобно использовать коэффициент сходства (г). Для оценки достоверности отличий или сходства сортов используют критерий идентичности I, предложенный Л.А.Животовским (1979).

Проведение идентификации сортов по одному изоферментному локусу не дает полной информации о сходстве или различии сравниваемых популяций.

Более полную и надежную информацию удалось получить при использовании в качестве критерия сортовых различий общего критерия идентичности по семи изоферментным локусам, рассчитанного по методу Л.А.Животовского (1982). В данном случае достоверные отличия между сравниваемыми популяциями были установлены в 90% случаев, что свидетельствует о достаточной надежности данных изоферментных маркеров.

Изучение по электрофоретическим спектрам запасного белка семян 11Б глобулинов позволило выявить в селекционных материалах различие по формулам глобулинов и соотношению биотипов. Сходные данные получены на столовой свекле (Буренин, Гаврилкж, 1994; Буренин, Садинов, 1996), а также на сахарной свекле (Лесневич, Гаврилюк, Конарев, 1988; Лисицын, 1980).

В процессе наших исследований, проведенных совместно с С. Н. Ми-тиным (Федулова, Митин, 2004), в родительских компонентах нескольких гибридных комбинаций было обнаружено 28 типов электрофоретических спектров. Родительские компоненты исследованных гибридов характеризовались незначительным полиморфизмом 5-8 типов спектров. Это, вероятно, связано с методами создания исходного материала - инцухтирование и близкородственные размножения. Девятнадцать типов спектров являются оригинальными, встречаются один раз. Часть спектров для опылителей и МС-форм совпадают, что обусловлено, возможно, перекрестным опылением сахарной свеклы.

Дальнейшее изучение взаимоотношений родительских компонентов I ибридов по структуре белковых спектров с использованием критерия иден-шчности показало, что они различимы между собой. При этом фактические значения критерия идентичности значительно превышают табличные.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена изменчивость изученных МС-форм и многосемянных опылителей по электрофоретическим спектрам 11Б глобулина, что может использоваться в качестве критерия для выбора дальнейшего направления отбора и дополняет существующие методы оценки селекционного материма, применяемые в селекции.

У сахарной свеклы, как перекрестноопыляющейся культуры, сорта -это сложные популяции с высоким уровнем генетической и биохимической изменчивости. Согласно данным Ф. Айалы (1984) степень этой изменчиво-

сти можно оценить, если выявить число вариантных форм белков и частоту, с которой они встречаются в популяциях. Этот подход был использован нами для анализа полиморфизма 11S глобулина у сортов, линий и гибридов сахарной свеклы, в результате чего было выявлено 53 фенотипических класса оригинальных типов спектра.

Каждый образец характеризовался определенным соотношением биотипов, имеющих различную встречаемость. Наименьший полиморфизм отмечен у гибрида Черноземец - 4 типа спектра, наибольший у сорта Льговская односемянная 52-18. Полученные данные свидетельствуют о достаточной гетерогенности исследованных материалов (Федулова, Митин, 2003).

По сравнению с другими культурами полиморфизм сахарной свеклы не высокий. Так, у 66-ти сортов, форм и линий ржи выявлено 315 спектров авенина (Пенева, Мартыненко, Конарев, 1989), одна линия кукурузы показала 26 типов спектра зеина (Конарев, Сидорова, 2003), один сорт подсолнечника - 45 типов спектров гелиантинина (Анисимова, 1993).

В результате наших экспериментов выявлено, что спектр № 3 оказался самым распространенным, частота его встречаемости варьировала от 5% у Льговской односемянной 52 до 31% у Черноземца и РМС 70. Каждый из спектров № 1, 2, 4, 23 был обнаружен у четырех различных образцов. Остальные спектры не являлись общими для нескольких сортов и гибридов.

Гибриды со стерильной цитоплазмой оказались менее полиморфны (410 типов спектров), что связано с особенностями их селекционного создания из линий-компонентов, полиморфизм которых значительно ниже, что согласуется с результатами исследований Л. А. Лесневич (1989), Е. М. Лисицина (1989),

Оценка изученных материалов по 11S глобулину показала, что по критерию идентичности большая часть сортов и гибридов различимы между собой при 1 %-ном уровне значимости.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о генетической обособленности сортов, что позволяет при достаточном количестве генетических маркеров надежно идентифицировать их в селекции, семеноводстве и сортоиспытании.

В ходе проведенных нами исследований по определению генетических взаимоотношений между срртами и гибридами на стерильной основе выявлены минимальные генетические дистанции (наибольший критерий сходства) для гибрида Черноземец и РМС 70 г =0,821; Льговской одн.52 и РМС 90 г=0,776. Для остальных образцов генетические дистанции варьировали в пределах от 0 до 0,666 (рис.4).

Таким образом, матрицы генетических расстояний и построенные на их основе дендрограммы дают возможность точнее определять родословные связи между селекционными материалами сахарной свеклы и идентифицировать их в сортоиспытании и семеноводстве для защиты авторских прав селекционеров.

ЬЕЛОЦЕРК одн 34 -

РАМОНСК одн 47 -■-

РМС90 -

ЛЬГОВСК одн 52 ---

БИЙСК одн 12 ---

РУСЬ -

ЧЕРНОЗЕМЕЦ-

РМС70 ---

РМС46 ---

РМС 73 -

0,1 0,2 0 3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8

Генетическое рассгоянпе {1 -ri

Рис.4. Дендрограмма генетических расстояний сортов и гибридов сахарной свеклы на основе белковых спектров

ДНК-технологии в исследовании генома сахарной свеклы. Разра-богка и внедрение в селекционную практику новых технологий связаны с исследованием ДНК-полиморфизма, выявляемого с помощью амплификации определенных участков генома. Использование различных вариантов поли-меразной ценной реакции (ПЦР) позволяет оценить генетическое разнообразие, классифицировать исходный селекционный материал, а также тестировать генетическую однородность инбредных линий и уровень гибридности партий семян Ft (Сиволап, 2003; Солоденко и др., 2003).

Для поиска новых молекулярных маркеров, позволяющих исследовать полиморфизм геномной ДНК у сахарной свеклы, нами были применены праймеры, ранее успешно использованные для различения сортов ржи, видов Brassica и Solanum другими исследователями (Забродина, Шаденков, Хавкин, 1998; Анискина и др., 2005). Пять праймеров (Paw S5, Paw S6, Paw Sil, Paw SI6, Paw SI7) характеризуют различные участки повторяющегося элемента R 173, картированного у ржи вблизи центромеры на хромосомном плече I RS(Rogovsky, Shepherd, 1992).

Результаты проведенных исследований показали, что использованные нами праймеры в изученных инбредных линиях сахарной свеклы давали четкие спектры с достаточной степенью полиморфизма. Указанные произвольно выбранные праймеры при амплификации с геномной ДНК сахарной свеклы выявляли от 5 до 18 полос (ампликонов) на образец с молекулярной массой от 250 до 300 пн. Полиморфные фрагменты, соответствующие продуктам ПЦР, мы расценивали как единичные локусы (рис.5).

Нами выявлено, что гамма-линии сахарной свеклы характеризовались большей выравненностью - количество амплифицированных продуктов варьировало от 2 до 4-х, тогда как у инбредных линий, созданных традиционными методами, их количество достигало 6-ти. Это связано, по-видимому, с тем, что в процессе создания у-линий были отобраны формы, гомозиготные по изоферментным локусам.

Анализ (1АРО- спектров гибридов и их родительских форм подтвердил гибридную природу полученных образцов с высоким уровнем интрогрессии геномов. Сравнительная оценка ЯАРО - профилей гибридных генотипов (Р| у-МС-2113 х 15465 и Р, у-МС-2113 х 14840) показала наличие специфического фрагмента ДНК, характерного для материнского компонента.

М 1 2 1 3 4 ш $ -6 7 в: 9 Ш 1 I 12 13 U

Йк... Stí¿ i

топ so

2--Ц

Рис.5. RAPD-профили геномной ДНК селекционных материалов сахарной свеклы.

М - маркер молекулярной массы lkb Gene Ruler (размер некоторых фрагментов указан слева)

Праймер№1: 1 -ДНК линииу-МС-2113; 2 -ДНК гибрида F, у-МС-2113 х 15465; 3 - ДНК линии №15465 (ГО); 4 ДНК гибрида F2 у-МС-2113 х 15465; 5 - ДНК гибрида F| у-МС-2113 х 14840; 6 - отрицательный контроль (вода). Праймер №2: 7 - ДНК линии у-МС-2113; 8 - ДНК гибрида F, у-МС-2113 х 15465; 9 - ДНК линии №15465 (ГО), 10 - ДНК гибрида F2 у-МС-2113 х 15465; 11 - ДНК гибрида F, у-МС-2113 х 14840; 12 - ДНК линии №14840 (ГО): 13 - ДНК линии «0»-типа у-РФ-2113; 14 - отрицательный контроль (вода).

В результате проведенного молекулярного анализа методом ПЦР у генотипов сахарной свеклы обнаружены существенные отличия между МС-формой (1,7) и фертильными многосемянными опылителями (3, 9, 12), как по количеству амплифицированных продуктов, так и по размеру этих фрагментов. Больший полиморфизм у исследованных материалов обнаружен при использовании праймера № 1. Вместе с тем, более четкое отличие всех изученных образцов выявлено при амплификации с праймером N° 2. Так, в наших исследованиях было показано, что линия у-МС 2113 отличается от всех

исследованных селекционных номеров присутствием фрагмента с молекулярной массой 1000 п.н. Данный компонент отсутствует в геномной ДНК многосемянных опылителей 14840 и 15465.

Анализируя данные 1*АР1Э - анализа, можно также отметить отличие линии закрепителя стерильности "О-типа" от ее МС-аналога по количеству и размеру амплифицированных фрагментов. Что, по-видимому, объясняется влиянием ядерных генов (\xzzfXXZZ,), определяющих стерильность или фертильность цитоплазмы.

Результаты, полученные с использованием ограниченного набора праймеров на примере инбредных линий сахарной свеклы и гибридных комбинаций с их участием позволили найти маркеры, специфические для некоторых селекционных материалов и идентифицировать их.

На основе полученных данных нами модифицирована методика проведения ПЦР-анализа для сахарной свеклы, включающая: выделение геномной ДНК из объединенных проб проростков или молодых листьев сахарной свеклы в жидком азоте с дополнительной очисткой фенольной экстракцией; амплификацию рассеянных умеренно повторяющихся последовательностей ДНК исследуемого растения; фракционирование фрагментов ДНК с помощью электрофореза в ага-розном геле и выявление полиморфизма продуктов амплификации.

Использование ДНК-маркеров для тестирования трансгенных растений. Использование маркеров ДНК позволяет идентифицировать отдельные гены и определить их функцию. Эта особенность является основным их преимуществом по сравнению с белковыми маркерами (Ежова и др., 2003).

Используя метод ПЦР анализа, нам удалось идентифицировать 35Б промотор, контролирующий ген гз - аГр2, определяющий устойчивость к фи-топатогенам, трансформированный в растения сахарной свеклы, (Черкасова, 2004). ПЦР - продукты размером в 162 п.н., обнаруженные в исследуемых образцах: МС № 39 р.2, 13, 17, 18, показали трансгенную природу данных растений. (Черкасова, Федулова и др., 2003; 2004) (рис. 6).

6 13 14 16 17 18 19 20 23 24 25 33 К+ К-

Рис.6. Амплификация ДНК из серии трансформантов свеклы

К - положительный контроль (плазмида со специфической для ПЦР вставкой-фрагментом 355 промотора) Исследованные образцы сахарной свеклы Трансгенная ДНК, выделеннафщо&а|1та сахарной свеклы

(вод^БИБЛИО*еКАНАЯ1 С.Яепч»б|фГ I

--—,1

К- отрицательный контроль

Гаким образом, результаты проведенных исследований позволили выявить нам полиморфизм ДНК у селекционных материалов, основанный на различии по длине фрагментов ДНК на электрофореграмме. Наличие данною полиморфизма является необходимым и достаточным условием для использования ДНК маркеров в генетическом анализе селекционных образцов. Это имеет важное теоретическое и практическое значение и в будущем может найти широкое применение в селекции сахарной свеклы.

Информационные технологии при проведении паспортизации селекционных материалов сахарной свеклы

Информационные системы в последние годы получили широкое распространение, функция которых состоит в поддержке надежного хранения информации в памяти компьютера, выполнение специфических для данного приложения преобразования информации и / или вычислений, представлении пользователям удобного и легко осваиваемого интерфейса.

Подобные системы уже нашли применение для таких культур, как пшеница, рожь, ячмень, гречиха, подсолнечник и многих других.

В ВИРе создана электронная коллекция "Генетические растительные ресурсы России", включающая в себя наряду с номенклатурно-таксо-номической информацией сведения о биологических особенностях, хозяйственно-ценных признаках, числе хромосом и т.д. (Лунева и др., 2001). В отделе интродукции ВИР создана база данных, позволяющая проводить регистрацию новых поступлений растений (Багмет, 2001), используя электрофоре-тические спектры запасных белков, проведена классификация и создан электронный каталог образцов озимой пшеницы ВИР (Алпатьева, 2001).

В последние годы с целью повышения результативности селекционных работ согласно данным Международного института исследований сахарной свеклы (URB, Бельгия) создан информационный банк данных генетических ресурсов этой культуры (Germeier, Frese, 2001). В России такого информационного банка пока не разработано.

Для решения практически важных проблем генного банка сахарной свеклы перспективным направлением использования белковых маркеров является создание информационно-поисковых систем и паспортных баз данных, основанных на белковых спектрах (формулах) и программного обеспечения, позволяющего управлять этими базами данных.

Основываясь на результатах электрофоретического анализа запасных белков семян, для проведения паспортизации линий, сортов и гибридов сахарной свеклы нами, (Митин, Федулова, 2004) была создана информационная технология, включающая молекулярный каталог, позволяющий сохранять информацию по образцам, проводить их попарное сравнение, а также, используя вспомогательные программы, выполнять их кластеризацию и использовать запасные белки в качестве дополнительных критериев в выяснении внутривидовых связей. Данная электронная база данных дает возможность изучать и систематизировать

селекционные номера, сорта и гибриды в генетических коллекциях, их характеристики, происхождение, морфологические и биохимические оценки. Вместо традиционного детального описания коллекций информационные технологии дают возможность использовать больший набор признаков и ка их основе приблизиться к созданию модели сорта или гибрида.

Основываясь на результатах кластерного анализа, можно подбирать родительские компоненты для гибридизации с учетом их генетического родства.

Созданная база данных позволяет добавлять, удалять и редактировать записи, а также осуществлять расчеты и вывод информации на бумажный носитель.

Использование электронной базы данных для характеристики селекционных материалов сахарной свеклы показано на примере гибрида РМС 90 (рис. 7).

Наименование: РМС 90 Описание: Оригинатор - ВНИИСС Гибрид на основе ЦМС. Компоненты гибрида размножаются раздельно. Происхождение: PC 106 х РФ J 4840 Тип семени - одноростковый 95% Плоидность - диплоид 100% Цвет проростка - розовые и зеленые (смесь) Размер листа - крупный Поверхность листовой пластинки - слабо гофрированная Наличие цветухи -цветушиость отсутствует Форма корня - конусовидная с маленькой ю-ловкой Розетка - прямостоячая Сахаристость корнеплодов -16,7-20,2% Урожай корнеплодов - 36,5-65.5 т/га Электрофоретические спектры запасного белка Попарное сравнение селекционных материалов по электрофоре гическим спектрам IIS глобулина

сравниваемые материалы Рамонская одн 47 РМС 90 критерий ИДенТИЧ-НОСГИ^ф 68,03 крше-рий х\* 32,00

РМС 90 РМС 73 РМС 90 Белоцерк. одн. 34 47.90 80,74 27,69 32,00

РМС 90 Льговская одн. 52 38,90 34,81

Тип спектра Белковая формула Количество, % РМС 90 | Бийская , 46,90 30,58

19 103000300000300 43 одн. 12

20 103000300200301 11 РМС 90 Русь 99,70 26,22

21 103000300000301 5

22 103000300200300 13 РМС 90 Чернозе-мец 65,38 23,21

4 003000300000030 13

3 ООЗОООЗОООООЗОО 3 РМС 90 РМС 46 46,03 30,58

23 103000300000030 6

24 103000300003000 3 *Р=0.01 (1ф>уД - различия достоверны)

25 Итого 103001300000300 3 100

Рис.7. Использование электронной базы данных для характеристики селекционных материалов на примере гибрида РМС 90

Таким образом, использование нашего молекулярного электронного каталога позволяет осуществлять оперативное управление информацией, основанной на данных электрофоретического изучения образцов по запасным белкам семян и проводить паспортизацию сортов и гибридов сахарной свеклы в системах семеноводства и сортоиспытания.

Заключение

Представленный в данной работе материал свидетельствует, что использование методов молекулярно-генетического маркирования на всех этапах селекции может способствовать решению проблем, связанных с созданием сортов и гибридов, отвечающих требованиям современного сельскохозяйственного производства.

Принципиальная сущность молекулярно-генетических маркеров (запасных белков, изоферментов, ДНК) дает возможность использовать их в селекции, сортоиспытании и семеноводстве сахарной свеклы для:

• оценки степени гомозиготности инбредных линий на основе индекса изоферментной гомозиготности;

• подбора родительских компонентов для скрещивания с учетом их генетического родства;

• контроля процесса гибридизации;

• проведения идентификации и паспортизации с использованием информационных технологий, что имеет большое теоретическое и практическое значение, так как способствует ускорению селекционного процесса.

Нами разработано схематическое изображение системы использования молекулярно-генетического маркирования сахарной свеклы (рис. 8).

Как показали наши исследования, генетические маркеры играют важную роль в разработке методов изучения генетической детерминации полигенных признаков, к которым относится большинство хозяйственно-ценных свойств. Биохимические маркеры могут быть использованы для увеличения эффективности отбора по количественным признакам.

Дальнейшее накопление экспериментальных данных по молекулярно-генетическому маркированию сахарной свеклы позволит более успешно решать многие теоретические вопросы и разрабатывать новые селекционные приемы.

Следует учесть, что генетические маркеры не могут полностью заменить морфологические, они взаимно дополняют друг друга. В тоже время у первых больше преимуществ: они напрямую характеризуют геном и позволяют выявлять многочисленные генетические изменения, не затрагивающие морфологические признаки.

г'

Рис. 8. Система использования молекулярно-генегического маркирования сахарной свеклы

выводы

1 Теоретически обоснована и практически реализована проблема использования молекулярно-генетических маркеров в процессе создания исходного и селекционного материала, сортов и гибридов сахарной свеклы.

2 Модифицирована методика выделения геномной ДНК сахарной свеклы и проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Подобраны производительно работающие праймеры к умеренно повторяшимся последовательностям ДНК, позволившие провести генотипирование селекционных материалов и идентифицировать родительские формы и их гибриды.

ПЦР-анализом подтверждена трансформация в растения сахарной свеклы целевого гена (ге) дефензина редьки, обеспечивающего устойчивость к фитопатогенам.

3. Установлено, что гомозиготность инбредных линий сахарной свеклы зависит от способа их создания и наиболее достоверно выражается индексом 1К.. У сортов-популяций 1ц составляет 0,72, у инбредных линий-0,91. у сибсов - 0,75. Показано, что фактический индекс изоферментной гомозиготиости превышает теоретическое значение коэффициента инбридинга Р у линейных и сибсовых материалов. В процессе инцухтирования, после периода стабилизации происходи г снижение этого показателя и составляет у линий четвертого инцухта 14 и сибсовых материалов 0,82 и 0,75, соответственно.

4 Положительная связь (г=0. 5-0, 8) между генотипами МПН-1РР и МЕИРЯ и массой корнеплода позволяет использовать данные изоферментные локусы при отборе на повышенную урожайность. Корреляционной зависимости между сахаристостью и изученными изоферментами не обнаружено.

5. Методом кластерного анализа показано, что генетические расстояния большинства изученных инбредных линий сахарной свеклы близки и в среднем составляют 0.238. Наиболее генетически удаленными друг от друга являются раз-дельноплодные формы на основе ЦМС и сростноплодные фертильные опылители, расстояние между которыми достигает 2,394. Установлено, что для гибридизации необходимо подбирать линии, находящиеся на большом генетическом удалении друг от друга При скрещивании родительских форм сахарной свеклы, находящихся на большом генетическом расстоянии друг от друга (Бщ от 1,120 до 1Л48) в гибридном поколении проявляется гетерозис по урожаю корнеплодов +28,4%.

6 Разработан и реализован в практике селекции сахарной свеклы метод подбора родительских пар для скрещиваний, включающий подсчет частоты встречаемости аллелей маркерных генов у родительских компонентов, определение генетического родства на основе генетических расстояний с учетом наибольшей их удаленности друг от друга, что является принципиальной основой для создания новых высокопродуктивных гибридов.

7. Выделены гамма-линии, маркированные по изоферментному составу, обладающие высокой закрепительной способностью, склонностью к апомиктическо-му способу размножения и повышенной продуктивностью, которые используются при селекции новых [ ибридов.

8. Создан и включен в Государственный реестр селекционных достижений России (а.с. № 31185), а с 2001т. допущен к использованию по Поволжскому региону и югу Воронежской и Белгородской областей высокопродуктивный гибрид сахарной свеклы РМС-90 (с использованием в качестве опылителя О-типа линии у-РФ-2113), превышающий групповой стандарт по урожаю корнеплодов на 6,74-7,07 т/та.

9. Разработан способ идентификации сортов сахарной свеклы по частотам варечаемости аллелей изоферментных локусов. позволяющий определять сортовую чистоту в семенном контроле и идентифицировать сорта при контроле их подлинности в сортоиспытании (а с. №1672999).

10. Анализ внутрисортового полиморфизма IIS глобулинов свидетельствует, что в составе изученных сортов и гибридов сахарной свеклы выявлено 53 оригинальных типов спектра Для сортов характерно наличие 11-18, а для инбредных линий 1 -2 типов спектров. Сорта и гибриды сахарной свеклы достоверно различаются между собой и от других материалов по критерию идентичности I, рассчитанному на основе частот выявленных i ипов спектров.

11. С использованием кластерного анализа оценены генетические расстояния между сортами и гибридами сахарной свеклы на основе белковых и изоферментных спектров. Показано, что наиболее удалены в генетическом плане от вссх изученных материалов гибрид РМС-73 и сорт Белоцерковская односемянная 34; Ра-монская односемянная 9, Межотненская 070 и Уладовская 752 улучшенная.

12. Разработана информационная технология, включающая биоморфологическую характеристику селекционных материалов сахарной свеклы, оценку его по чолекулярно-генетическим маркерам, позволяющая наряду с сохранением информации по образцам, проводить их попарное сравнение, а также, используя вспомогательные программы, выполнять кластеризацию линий, сорт он, гибридов.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

1. Использовать метод электрофоретического анализа запасных белков и изо-ферментов сахарной свеклы в селекционной работе для оценки линий на отличимость, однородность, стабильность и при паспортизации сортов и гибридов, что позволит получить более полную информацию об их генетической природе.

2. Идентификация селекционных материалов по изоферментным и белковым спектрам и генетические расстояния предлагаются для использования при подборе родительских компонентов для скрещиваний, что значительно повыст эффективность селекционной работы по сахарной свекле при создании новых перспективных 1ибридов с желаемыми признаками.

3. Рекомендовать созданную электронную базу данных для оперативного управления информацией в селекции, системах семеноводства и сортоиспытания.

4. Выделенные и отобранные но молекулярно - генетическим маркерам гомозиготные линии, характеризующиеся селекционно-ценными и хозяйственно - полезными признаками, рекомендуются для использования в селекционном процессе при создании гибридов сахарной свеклы, обладающих гетерозисным эффектом. Созданный новый гибрид сахарной свеклы РМС - 90 предлагается использовать в сельскохозяйственном производстве в Центрально-Чернозёмном и Поволжском регионах.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

ГЖужжалова Т.П. Влияние ионизирующей радиации на пыльцу опылителя, как модифицирующего фактора при получении гомонпошых линий сахарной свеклы /Т.П.Жужжалова, М.А.Богомолов, Т.П.Федулова, В П.Ошевнев // Тез.докл 111 Всес.конф. -Кишинев. Штиинца, -1987. -С. 198-199.

2.Бычкова В.А. Динамика цветения и продуктивность маркированных по гену Mod-!лнний сахарной свеклы / В.А.Бычкова, Н.М Крлвоклякин, Т.П.Жужжалова,

Т.П Федулова, В П.Ошевнев // Основные пути интенсификации свеклосахарного производства Сб научных трудов Всеросс.НИИ сахарной свеклы и сахара - Воронеж, 1988. - С. 46-53.

З.Филатов Г.П. Скрещивание растений сахарной свеклы с использованием изофер-ментного контроля / Г.П.Филатов, Т.П.Федулова, Т.ПЖужжалова. - Воронеж, 1990. -2с.(Информ. л/ Воронеж ЦНТИ; № 105-90).

4 Федулова Т.П. Проведение паспортизации селекционного материала сахарной свеклы с исполмованисм изоферментов /Т.П.Федулова, Т.П.Жужжалова, Н.С.Агафонов - Воронеж,, 1990. - 4с. (Информ. л./Воронеж, ЦНТИ; № 320-90).

5.Жужжалова Т.П Использование изоферментов в качестве белковых генетических маркеров в селекции сахарной свеклы /Т.П.Жужжалова, Т.П.Федулова, Г.П.Филатов // Науч.основы интенсификации свеклосахарного производства: Сб. на-уч.тр. - Воронеж, 1993. - С. 17.

6.Жужжалова Т.П. Генетическое маркирование сортов сахарной свеклы по иэофер-мет ному составу /Т.П.Жужжалова, ТП Федулова, Г.П.Филатов, П.С Агафонов // Резервы увеличения производства сахарной свеклы и сахара: Сб.науч. |р. - Воронеж, 1990. -С.22-28.

7.Д.С. 1672999 СССР, МКИ АО 1П/04 . Способ идентификации сортов сахарной свеклы. Заявл. 13.03.89 № 4661371/13; Опубл. 30.08.91. Бюл. №32. - 10с./ Н.С Агафонов, Т.П.Жужжалова, Р.В Левитес, А А.Коновалов. Т.П Федулова.

8 Филатов Г.П. Метод изоферментного контроля за чистой линий культурных растений /Г.П.Филатов, Т.П.Жужжалова, Т.П.Федулова - Воронеж, 1992 - 2с. - (Информ. л./Воронеж. ЦНТИ; № 16-92).

9.А С. 1708210 СССР, МКИ А 01 Н 1/04 Способ получения гомозиготных линий сахарной свеклы. Заявл 12.03.90 № 4818227/13 Приоритет изобр 12.03.1990; Опубл. 30.01.92. Бюл. № 4.- 6с. Н.С.Агафонов, М.А.Богомолов, А.В.Корниенко, Т.П.Федулова, И.Р.Попова.

Ю.Филатов Г П. Использование изоферментов для оценки степени гомозиготности инбредных линий сахарной свеклы /Т.П.Филатов, Т.П Федулова //Тез. докл межрегиональной научно-практической конф. молодых ученых и специалистов: "Обеспечение эффективного функционирования производственного потенциала АПК России в условиях рыночных отношений". - Воронеж, 1993. - С. 137-138.

П.Богомолов М.А. Использование изоферментов при создании у-индуцированных линий сахарной свеклы /М.А.Богомолов, Т.П.Жужжалова, Т.П.Федулова //Молеку-лярно-I енетические маркеры и селекция растений: Тез.докл.1 Международной конференции. -Киев. Аграрна наука, 1994.- С.14-15.

12.Федулова Т.П. Изоферментные маркеры в идентификации гаплоидов сахарной свеклы / Т.П.Федулова, О.А.Подвигина // Молекулярно-генетческие маркеры и селекция растений:Тез.докл Международной конф..- Киев: Аграрна наука, 1994 -С 69-70.

И.Федулова Т.П. Кластерный анализ в изучении сортов сахарной свеклы /Т.П.Федулова, Т.П Жужжалова, А.В.Корниенко // Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости с/х растений. Теэ.науч.-метод совещания. - п. Немчинов-ка Моск.обл. 15-17 ноября 1994. - М., 1994. - С. 53-54.

И.Федулова Т.П. Изучение генетических взаимоотношений селекционных материалов сахарной свеклы // Повышение эффективности агропромышленного производства в условиях современных форм хозяйствования: Тез докл.междунар. науч -практич.конф. молодых ученых и специалистов - Ч.Н. - Воронеж, 1995,- С.23-24.

15 Филатов Г.П. Изучение внутрисортовой изменчивости у сорта сахарной свеклы Рамонская 06 по изоферментным спектрам /Г.П.Филатов, Т.П Федулова, Т.П.Жужжалова, А.В.Корниенко // Сахарная свекла. - 1995. - № 3. - С.11

16 Федулова Т.П. Генетико-селекционное изучение исходного материала сахарной свеклы с применением биохимических маркеров /Т.П.Федулова // Лвтореф дис. ... к.с/х. н - Рамонь, 1995. -16с

17.Богомолов M А. Индукция гомозиготных гамма-линий сахарной свею1Ы с ценными селекционными признаками / М.А. Богомолов, Т.П. Жужжалова, Т.П. Федулова. A.B. Корниенко // Сб. Ilyra повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики. Тез. докл. Всерос. науч.-практач. конф., посвященной 100-лешю со дня рождения А.Л.Матлумова. - 4.1. - Рамонь, 1996. - С. 5-6.

18 Федулова Т.П. Генетическое маркирование при создании исходного материала в культуре in vitro // Сб. к 100-летию А.Л.Мазлумова. Ч.1.- Рамонь, 1996. - С. 67.

19 Федулова Т.П Изоферменты и генетическое маркирование сахарной свеклы / Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова, A.B. Корниенко //Пути повышения эффективности свеклосахарного производства России в условиях рыночной экономики: Тез.докл. Всерос. науч.-практич. конф, посвященной 100-летию А.Л. Мазлумова. - 4.1. - Рамонь, 1996. - С. 68-69.

20.Федулова Т.П. Молекулярные маркеры в процессе создания и идентификации сортов сахарной свеклы /Т П.Федулова, Т.П.Жужжалова, А.В.Корниенко //Актуальные проблемы с/х биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. Междунар. конф., октябрь. 1996 - Москва, 1996. - С.84.

21.Федулова ТП. Использование молекулярно-генетнчсских маркеров при культивировании растительных клеток сахарной свеклы in vitro /Т П. Федулова, Т.П. Жужжалова. O.A. Подвигала, И.Н. Горина // Биология клеток растений in vitro Биотехнология и сохранение генофонда: Тез. докл. VII Междунар. конф. - Москва. 1997. - С. 353.

22.Федулова Т.П. Изоферментные локусы и продуктивность сахарной свеклы /Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова, A.B. Корниенко // Сахарная свекла. -№ 1.-1998. - С. 20-21.

23.Федулова Т.П. Модифицирующее влияние облученной пыльцы на процесс опыления и формирование зародышей у сахарной свеклы /Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова, М.А. Богомолов // Проблемы ботаники на рубеже XX-XXI веков: Гез.докл., представленных 11(Х) съезду Русского ботанического об-ва 26-29 мая 1998 г., Санкт-Петербург. - Санкт-Петербург. 1998.- Том.1. - С. 137-138.

24.Корниенко А В Закономерность проявления признака растительных организмов /A.B. Корниенко. Т.П. Федулова // Тез.докл II съезда ВОГиС 1-5 февраля 2000 г. -Санкт-Петербург, 2000. - Т 1. - С. 187.

25.Корниенко A.B. Закономерность проявления признака у растительного организма /А.В.Корниенко, Т.П.Федулова. С Д.Орлов.- Воронеж, 2000. - Зс - (Информ..л. / Воронеж. ЦНТИ; № 79-098-00).

26.Komienko А V. Regularities of a trait expression in plant organisms /'A.V. Kornienko, S.D. Orlov, T.P. Fcdulova // Proceedings of the 63-d IIRB congress, 9-10 february, 2000, Interlaken (CH). - Interlaken, 2000. - P.569-578.

27.Федулова Т.П. Возможность протезирования проявления признака у растительно-I о организма с использованием изоферментного маркирования /Т П. Федулова, А В Корниенко //Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии- Тез. докл. П Междунар. конф, 18-19 октября 2000 г - Москва. - Москва. 2000. - С. 208-209.

28.Федулова Т.П. Изоферментные маркеры в селекции сахарной свеклы /Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова //Биотехнология в растениеводегве. животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Междунар. конф 18-19 октября 2000 г. г. Москва. - Москва, 2000.-С. 216-217.

29.Жужжалова ГII. Экзогенные факторы и индуцирование апомиксиса /Т.П. Жужжалова, Т П. Федулова. M А Богомолов // Сахарная свекла - 2000. - № 12 - С. 17-18.

ЗО.Жужжалова Т.П. Селекционно-генетические особенности апомиктичных форм /Т.П. Жужжалова, Т.П. Федулова, М.А. Богомолов //Сахарная свекла. - 2001. - № 6. -С. 15-16.

3!.Fedulova TP Prospects of isozymes usage for sugar beet genetic improvement /Т.Р. Fedulova. T.P Zhuzhzhalova //International Conference "Genetic collections, isogenic and al-loplasmis lines" Novosibirsk, July 30 - August 3,2001. -Novosibirsk. - 2001. - P. 153-154.

32.Федулова Т.П. Использование генетических маркеров для идентификации апомиктичных потомств сахарной свеклы/Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова, М.А. Богомолов //Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Тез. докл. IV Междунар. симпозиума, Пушино, Московской обл.20-22 июня 2001 г - Москва, 2001. -Т.2. - С 356-358.

33.Корниенко A.B. Определение направлений продуктивности свеклы /A.B. Корниенко, Т.П. Федулова, С.Д. Орлов // Сахарная свекла. - 2002. -№2. - С. 15-16.

34.Корниенко А В. Методы биотехнологии в селекционной практике /А В. Корниенко, Т.П. Жужжалова, В.В. Знаменская, Т.П. Федулова. O.A. Подвигина, М.А. Богомолов, H.H. Черкасова // Сахарная свекла. - 2002. - № 10. - С. 25.

35.Федулова Т.П. Молекулярные маркеры в селекции сахарной свеклы // Генетические основы эволюции и селекции: Мат. межрег конф., посвященной 90-летаю проф.С.И.Машкина. - Воронеж, 2002. - С. 59-62.

36.Федулова Т.П. Использование белковых маркеров для идентификации сортов и гибридов сахарной свеклы /Т.П. Федулова, С.Н. Митин //Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России' Матер, междунар. научно-практич. конф посвященной 80-летию ВНИИСС. - Воронеж, 2003. - С. 64-67.

37.Богомолов М.А. Создание самофертильных линий сахарной свеклы путем индуцированных опылений у сахарной свеклы /М.А. Богомолов. Т.П Федулова, Т.П. Жужжалова, A.B. Корниенко //Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России: Матер, междунар научно-практ. конф., посвященной 80-летию ВНИИСС. -Воронеж, 2003. - С. 50-54.

38.Богомолов М.А. Нетрадиционные методы получения гомозиготных диплоидных линий сахарной свеклы /М.А. Богомолов, Т.П. Федулова //Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России: Матер, междунар. научн.-практич. конф., посвященной 80-летию ВНИИСС. - Воронеж, 2003. - С. 54-58.

39 Богомолов М.А.Индуцированный диплоидный апомиксис у сахарной свеклы (B.vulgaris 2г>-48) /М.А. Богомолов, Т.П. Федулова, T.I1. Жужжалова, Н.Р. Фоменко //Научное обеспечение устойчивого свекловодства в России: Матер. Междунар .науч-практич. конф.. посвященной 80-летию ВНИИСС. - Воронеж, 2003. - С. 58-64.

40.Черкасова H.H. Использование гена дефензина редьки для получения трансгенных растений сахарной свеклы /Н.Н Черкасова, Т.П. Федулова, Т.П. Жужжалова, И.Л. Цветков, R Д. Аветисов //Современные системы защиты растений oi болезней и перспективы использования достижений биотехнологии и генной инженерии: Материалы Всероссийского совещания. -16-18 июля 2003 г. - Голшшно, 2003. - С. 211-212

41 Фоменко Н.Р. Цитоэмбриологическая и морфогенетическая характеристика растений апомиктичных гамма-линий сахарной свеклы /Н.Р. Фоменко, Т.П. Жужжалова. Т.П. Федулова. М.А. Богомолов //Факторы експериментальной еволюцп организм!^: 36ipHHK науковых праць за редакцию акадетжа УААН М.В. Роша. - Кшв: Аграрна наука, 2003. - С. 212-217.

42.Жужжалова Т.П. Направленное индуцирование апомиксиса у сахарной свеклы /Т.П. Жужжалова, М.А. Богомолов, Т.П. Федулова, Н.Р Фоменко //Сахарная свекла. -2003.- № 10 - С. 25-26.

43.Богомолов М.А. Создание нового исходного материала сахарной свеклы с обновленной цитоплазмой /М.А.Богомолов, Т.П.Федулова. Т.П.Жужжалова // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Материалы межлунар.науч.-практ конф. (15-18 декабря 2003г.) ,-М„ 2003.-С. 361-363.

44 Bogomolov М.А. New methodes for sugar beet starting material development /М.А. Bogomolov, T.P. Fedulova, T.P. Zhuzhzhalova, A.V. Koniienko// 1" joint 11RB-ASSBT Congress, 26 feb. -Iй March. 2003. - San Antonio (USA). - P. 947-950.

45.Komienko A.V. Biotechnology methods using in Sugar beet breeding /A.V. Kornienko, T P. Zhuzhzhalova, V.V. Znamenskaja, Г.Р. Fedulova, O.A. Podvigina, M.A. Bogomolov, N N. Cherkasova II Iй joint 11RB-ASSBT Congress, 26 feb. -1" March, 2003. -San Antonio (USA). - P. 955-956.

46.Fedulova T.P. Prospects of isozymes usage for sugar beet genetic improvement /Т.Р. Zhu7hzhalova. T.P. Fedulova // Iм joint IIRB-ASSBT Congress 26lh Feb.- 1" March 2003. -San Antonio (USA). - P. 951-953.

47.Федулова Т.П. Применение белковых маркеров в селекции сахарной свеклы ЛГ.П. Федулова, С.Н. Митин // Сахарная свекла. - 2004. - № 1. - С. 13-14.

48 а.с.№ 31185 Свекла сахарная РМС 90 - от 29.01.01 по заявке № 9802312 с датой приоритета 10.02.1998. Богомолов М.А, Бычкова В.А..Горячих НГ., Грибанова Н.П., Федулова Т.П.. Жужжалова Т П . Знаменская В.В , Корниенко А В., Маэепин М.Г., Нужяина В.В., Ошевнев В.П.

49.Федулова Т.П. Индуцированный апомиксис у сахарной свеклы и использование его в селекции / Т.П. Федулова. М.А Богомолов, Т.П. Жужжалова. Н.Р. Фомен-ко//Генетика в XXI веке' современное состояние и перспективы развития: Материалы 111 съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004 г. - М„ 2004. - С. 299.

50.Федулова Т.П. Полиморфизм 11S глобулина в изучении генома сахарной свеклы /Т.П. Федулова, С.Н. Мшин //Генешка в XXI веке: современное состояние и перспективы развития- Материалы 111 съезда ВОГиС, Москва, 6-12 июня 2004 г. - М., 2004.:.-С. 300.

51.Черкасова Н.Н. Получение растений сахарной свеклы, несущих ген дефензина редьки /Н.Н. Черкасова, E.I1. Васильченко, Т.П. Федулова, Т П. Жужжалова // Сахарная свекла. - 2004. - № 7. - С. 31.

52.Богомолов М А. Эволюционная роль апомиксиса у сахарной свеклы/М.А. Богомолов, Т.П. Федулова // Нетрадиционное растениеводство Эниология. Экология и здоровье. 1-й Учредительный съезд селекционеров и экологов: Материалы XIII Международного симпозиума.* 5-12 сентября 2004 г., Алушта - Симферополь, 2004. - С. 343-345.

53.Митин С.Н. Компьютерная программа паспортизации селекционных материалов сахарной свеклы на основе элсктрофоретических белковых спектров /С.Н. Митин, Т.П. Федулова // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Материалы научн. конф. 19 октября 2004 г. - М.. 2004. - С. 96-98.

54.Федулова Т.П. Информационные системы в селекции /Т.П. Федулова // Сахарная свекла. - 2005, №8. - С. 17-18.

55.Богомолов М.А. Новый гибрид РМС 90 /М. А. Богомолов, Т.П. Федулова // Сахарная свекла. - 2005, №9. - С. 25 - 26.

Н8 2 О 5 8 2

РНБ Русский фонд

2006-4 21775

Подписано в печать 28.10.2005. Формат 60х84!/16 Бумага кн.-журн. Печать офсетная. Усл.п.л. 2.0. Тираж 100 экз. Заказ №.2615.

Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки. Типография ВГАУ. 394087 Воронеж, ул. Мичурина, 1.

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Федулова, Татьяна Петровна

1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. Материалы исследований

1.2. Методика ироведения исследований

1.3. Электрофоретический анализ изоферментов

1.4. Электрофоретическое фракционирование глобулинов

1.5. Математическая обработка экснериментальных результатов исследо-ваний

2. МОЛЕКУЛЯРНО ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ГЕНОМНОМАНАЛИЗЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

2.1. ДНК-маркеры в изучении генома сахарной свеклы

2.2. Полиморфизм занасных белков в геноме сахарной свеклы

2.3. Органная снецифика экснрессии белков и изоферментов в онтогенезесахарной свеклы

3. ИСНОЛЬЗОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАРКИРОВАНИЯ В СЕ-ЛЕКЦИОННОМ НРОЦЕССЕ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

3.1. Изоферментный контроль гомозиготности

3.2. Оценка инбредных линий сахарной свеклы по структуре белковыхспектров

3.3. Изоферментный контроль гибридизации

3.4. Взаимосвязь ферментных локусов с хозяйственно-полезными призна-ками

3.5. Метод подбора родительских компонентов для гибридизации

3.7. Использование генетического маркирования в процессе создания гомо-зиготных линий сахарной свеклы

3.8. Создание гибридов сахарной свеклы на стерильной основе с использо-ванием маркированных гамма-линий

4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ В ИЗУЧЕНИИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙСТРУКТУРЫ СОРТОВ И ГИБРИДОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

4.1. Генетическая изменчивость в популяциях сахарной свеклы

4.2. Полиморфизм молекулярных маркеров у сортов и гибридов сахарнойсвеклы

4.3. Метод кластерного анализа в изучении нроисхождения сортов и гибри-дов сахарной свеклы

4.4. Внутрисортовая изменчивость по молекулярным маркерам

5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ И НАСНОРТИЗАЦИЯ СЕЛЕКЦИОННЫХ МА-ТЕРИАЛОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ

5.1. Способ идентификации сортов сахарной свеклы по изоферментным ло-кусам

5.2. Информационные технологии при проведении паспортизации селекци-онных материалов сахарпой свеклы

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Теоретические и практические аспекты молекулярно-генетического маркирования в селекции сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)"

Актуальность проблемы. Современное сельское хозяйство требует резкого ускорения процесса создания сортов и гибридов растений, сочетающихустойчивость к биотическим и абиотическим стрессам с высоким потенциалом продуктивности и приспособленностью к энергосберегающим, экологически безопасным технологиям. Селекция по большинству хозяйственноценных признаков подошла к биологическим границам повышения нродуктиБности. И сегодня главным становится новышение устойчивости организ')*' мов и улучшение качества полз^аемой от них продз^кции. Традиционные методы отбора по таким признакам становятся малоэффективными, поэтомунеобходим поиск новых подходов, одним из которых является использованиеф методов биохимической генетики. Они дают возмояшость объективно оценивать генетически детерминированные биохимические особенности растения, популяции, линии, сорта, сравнивать их между собой, а таюке планировать подбор пар для скрещиваний, контролировать нанравление и сокращатьвремя селекционного нроцесса (цри создании новых сортов и гибридов).Основная область применения методов биохимической генетики - се^ лекционная работа, ноиск и создание уникальных генофондов, поскольку из,щ менчивость, которую мы наблюдаем, есть реальное отражение микроэволюционных или формообразовательных процессов, протекающих в популяцияхв настоящее или прошедшее время (Глазко, Созинов, 1993).Обычно селекционеры в своей работе применяют традиционные методы селекции - гибридизацию, отборы, полиплоидию, привлечение форм сцитонлазматической мужской стерильностью (ЦМС). Данные методы оченьтрудоемки, затратны и ведут, как правило, к сужению генетической изменчивости и уменьшению многообразия исходного генетического материалаВ связи с этим цроблема получения нового исходного материала дляф селекции становится весьма актуальной.(Ф.5Успехи селекции сахарной свеклы и нерснективы ее развития определяются многими факторами, однако решающее значение имеют следующие:генетические ресурсы селекции, ее исходный материал; арсенал средств,приемов и методов селекции, в числе которых биотехнология; методы генетического анализа исходного и селекционного материала, быстрая, точная иэкономичная оценка генетической констрзлщии объекта, без чего даже самыесовременные средства селекции остаются эмпиричными.Независимо от средств и методов селекции самая сложная часть работы - выявление генетической изменчивости в исходном материале и отборжелаемых генотипов. Эти трудности обусловлены, во-первых, фенотипической изменчивостью, пределы которой особенно широки у таких важных, ногенетически слолшых признаков, как устойчивость к неблагоприятным факторам среды и возбудителям болезней, качество урожая и продуктивностьсорта; во-вторых, наличием у сортов, популяций и видов, так называемой,скрытой генетической изменчивости, обусловленной рецессивностью аллелей, супрессиями в межгеиных взаимодействиях. Запасы такой изменчивостисоставляют генетический потенциал формообразования вида и популяций, нов силу слолшости обнаружения селекционеру они малодоступны, а некоторые из них обычными методами генетического анализа совсем не раскрываются. Методы традиционной классической генетики часто громоздки, какправило, почти не эффективны в анализе сложных признаков и не выявляютмногие формы скрытой генетической изменчивости. Соответственно они немогут обеспечить переход селекции и семеноводства на полностью контролируемый технологический процесс (Конарев, 1993). Нужны донолнительные средства и новые подходы, которые позволили бы, во-первых, наиболееполно раскрыть генетический потенциал сортов, популяций и видов для селекции, во-вторых, оценивать генетическую конституцию растения непосредственно - без скрещиваний и длительных процедур генетического анализа, в-третьих, осуществлять точный и быстрый контроль включением желаемого генетического материала в создаваемые сорта и гибриды.6Решение данных нроблем возмояшо только нутем иснользования молекулярно-генетического маркирования (Конарев, 1983; 2001; Созинов, 1985;Глазко, Созинов, 1993). Генетические маркеры играют исключительно важную роль в оценке наследственной конституции организма и служат однимиз главных средств селекции. В основном для этого до сих нор иснользуютморфологические нризнаки. Однако набор их в сравнении с числом генов игенетических систем в организме весьма ограничен. К тому же нодавляюшаячасть их нестабильна, зависит от условий развития организма. Совершенноновые возможности генетического маркирования ноявились с нривлечениембелковых нризнаков, которые положены в основу нринцинов и методов маркирования генетических систем растения.Белковые маркеры имеют ряд с)шз;ественных преимуществ неред морфологическими на генном уровне. Они дают возможность более точно идентифицировать генные локусы и таким нутем позволяют в генетическом анализе избегать проблем, связанных с влиянием других локусов (Конарев,1983; Левитес, 1986; Созинов, 1993).Естественно, белковьш маркеры не могут полностью заменить морфологические, они взаимодополняют друг друга. В то же время у белковыхмаркеров больше преимуш;еств: они более генотипичны, позволяют точнееидентифицировать локусы генома и выявлять многочисленные генетическиеизменения, не затрагиваюп];ие морфологические нризнаки.С появлением биохимических методов исследования, в частности, изоферментного анализа, были созданы нринциниально новые возможности длярешения этих проблем.Изоферменты обладают кодоминантным характером проявления, позволяюшим оценивать гомо- и гетерозиготность растений по генам, контролирующим данные ферменты. Кроме того, для растений в настоящее времяразработаны методы электрофоретического и гистохимического анализа более 50 ферментных систем. Поскольку калодая из них, как правило, контро7# лируется тумя - тремя генами, то число локусов, нотенциально нригодныхдля изучения, достаточно велико.Генетический анализ многих важных в нрактическом отношении нризнаков культурных растении затруднен сложностью фенотинического нроявления этих признаков. Среди различных методических нриемов, облегчающих исследования, особое место занимает метод генетических маркеров или«сигнальных генов», нодробно разработанный известным генетиком А. Серебровским.«Сигнальными генами» или «сигналями» автор называл «удобные дляф менделистических наблюдений альтернативные гены, которые не влияя наизучаемый трансгрессирующий нризнак, или влияя достаточно онределенным образом, облегчают генетический анализ этого нризнака, позволяя слеф дить за наследованием того участка хромосомы, в котором эти сигпали расноложены» (Серебровский, 1970).В генетике маркером обычно называют ген известной локализации, покоторому молшо выявить другие гены. В практике генетического анализаэкспериментатор, как правило, имеет дело не с самим геном-маркером, а сего каким-либо фенотипическим выражением, представляющим собой конкретный, хорощо различимый, дискретный, то есть качественный признак.щ Такой нризнак молшо рассматривать как фактор идентификации соответствующего ему гена, то есть маркер самого гена (Конарев, 1983).Для успешного проведения исследований по селекции сахарной свеклыочень важно изучение маркерных генов, необходимых в работе но контролюскрещивания линий.Долгое время селекционное улучщение сортов сахарной свеклы проводили по морфологическим признакам таким, как форма розетки, форма листовой пластинки, скрученность или морщинистость корня, форма и массакорнеплода и др. (Гринько, 1940, Мазлумов, 1950; Неговский, 1963, Орловф ский, 1968 и др.).#8Результаты нервых исследований отдельных морфологических нризнаков сахарной свеклы, имеющих менделевское наследование, были отраженыв нескольких обзорах (Keller, 1936; Савицкий, 1940; Буренин, Красочкин,1971), ноложивщих начало генетическому изучению этих признаков для селекционных целей. В частности, в селекции используются в качестве маркеров гены Тг и С1, вызывающие у свеклы пятнистую окраску листьев. Популяции, маркированные этими генами, нрименяют для оныления линий с цельюоценки последних но признаку общей комбинационной способности (ОКС)(Парий, Долотий, 1983). Для контроля выхода гибридов в нарных скрещиваниях использовали ген R (red hypocotyl), контролирующий окраску гипокотиля (Мазепин, 1971).Показано, что окраска гипокотиля связана с продуктивностью и может использоваться для определения гибридности при скрещивании гомозиготных по генам г и R линий сахарной свеклы. Гибридностьмояшо установить только у линий, гомозиготных по рецессивному аллелю(гг). Эта особенность проявление генов окраски (отнощения доминантности и рецессивности) аллелей затрудняет их щирокое использование в селекционных работах.В работе польского исследователя М. Яссема (Jassem, 1997) предлагается использовать окраску гипокотиля в качестве сортового признака приидентификации. В исследованиях И. И. Лялько была выделена новая мутациялистового аппарата сахарной свеклы - опущенность листовых пластинок(Hairy leaf) и показана эффективность использования ее как маркера закрепителей стерильности (Лялько, 1999; Лялько и др., 1999).Наряду с морфологическими признаками в селекции сахарной свеклышироко применялся отбор по биологическим признакам таким, как скороспелость, величина и энергия роста проростков, окраска листьев и т.д. (Федорович, 1940;Мазлумов, 1950).Для повыщения эффективности селекционного процесса сахарнойсвеклы были привлечены различные физиолого-биохимические признаки,использование которых позволило создать известные сорта сахарной свеклы.9например, Рамонский-100 сахаристого направления с повышенными технологическими качествами, обеспечивающими высокий выход сахара на сахарном заводе.С использованием морфологических признаков было выведено большинство многоростковых сортов сахарной свеклы. Так, долгие годы возделывался в производстве сорт Рамонская 1537, отличаюш;ийся высокой энергией начального корнеобразования и листообразования, обеспечиваюш:их повышенную продуктивность.Более 40 лет вырап];ивался широко пластичный сорт Рамонская 06, созданный методом гибридизации и отбора по морфологическим признакам иотличаюпдийся засухоустойчивостью, скороспелостью и малоцветушностью(Якименко, Сушков, Юсубов, 1992).Возможность изменения принципов отбора и формирования сортов игибридов сахарной свеклы возникла благодаря успехам исследований по частной генетике. Это в первую очередь относится к результатам изучения систем размножения у сахарной свеклы (внутривидовой несовместимости и цитоплазматической мулсской стерильности, признака раздельноплодности ивозможности получения полиплоидных (тетраплоидных форм)) (Юсубов,Мосина, 1969; Голев, 1972; Жужжалова, 1972, 1999; Малецкий, 1974; Балков,1978; Знаменская, 1985).Это позволило увеличить количество маркерных генов у сахарнойсвеклы. Так, топкроссные гибриды получают, скреш;ивая линии с фертильным тестером, несущим маркерные гены окраски листьев, или со стерильнымтестером, сформированным на широкой генетической основе (Малецкий,1984).Важным событием в изз^ении морфологических маркерных признаковбыло открытие цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) у сахарной свеклы (Owen, 1945; 1948; 1950). Было выявлено, что признак ЦМС контролируется двумя рецессивными локусами (х и z) и предлолсена схема получения межлинейных гибридов. Оуэном (Owen, 1942) также описан генетиче10ский контроль самофертильности, и в дальнейшем самофертильность (S)стали широко использовать для поддержания и получения новых линий закрепителей стерильности (линии 0-типа). В то же время были выделены раздельноплодные линии сахарной свеклы и выяснено наследование признакараздельноплодности (Savitsky, 1952, 1958). В.Ф. Савицкому удалось выделить несколько раздельноплодных растений из сорта "Мичиганский гибрид18", причем одно из выделенных растений имело генотип mmS^ S^ xxzz (гомозигота по генам раздельноплодности, самофертильности и генам, закрепляюш,им стерильность). Потомство этого единичного растения дало линиюSLC 101, которая легла в основу работ по получению гибридных сортов раздельноплодной сахарной свеклы в США и странах Западной Европы.Все это свидетельствует о том, что морфологические маркерные признаки сыграли и играют большз^ ю роль в селекции сахарной свеклы. Вместе стем морфологические признаки, как генетические маркеры, малоинформативны, различия по ним между сортами не всегда достаточно четкие, самипризнаки подвержены модификационной изменчивости. Оценка их проводится, как правило, на взрослых растениях, получение которых требует немалых производственных затрат (Аржанцев, 1988).Идентифицировать сорта и гибриды сахарной свеклы по морфологическим признакам семян трудно. Поэтому сейчас ведутся активные исследования по поиску новых генетических маркеров у сахарной свеклы.Большие перспективы открылись при использовании в качестве маркеров генов, контролирующих синтез отдельных белков и ферментов. Как правило, биохимические маркеры имеют простое наследование, четкое фенотипическое проявление и кодоминантный тип наследования. Последнее свойство принципиально отличает биохимические признаки от признаков окраски,так как позволяет контролировать опыления в обоих направлениях скреш:ивания.К настояп];ему времени молекулярно-генетические маркеры (запасныебелки, изоферменты, ДНК-маркеры) нашли широкое применение в селекции11зерновых культур (Конарев, Гаврилюк, Губарева, 1970 а,б,в; Конарев, 1983,1998; Попереля, Созинов, 1977; Созинов, Нонереля, 1979 Созинов, 1985,1993).Однако на сахарной свекле генетическое маркирование не нолучило досих нор всестороннего распространения в селекционной практике. Данныевопросы изучены недостаточным образом.Наличие разнообразного и всесторонне изученного исходного материала, является основополагающим условием эффективности селекционной работы. При этом поиск новых маркеров, облегчающих проведение генетического анализа селекционных материалов и ускоряющих процесс но их созданию, играет особое значение. В этой связи использование молекулярногенетического маркирования в практической селекции сахарной свеклы является одной из важных и актуальных проблем.Ноэтому методы маркирования селекционных материалов с использованием белковых маркеров, направленные на идентификацию биотипов, прогнозирование генетической совместимости и контроль гибридизации у сахарной свеклы нотребовали активной разработки. Особенно щироко эти исследования были проведены в Новосибирске в ИЦиГ СО АН и во ВНИИСС вРамони (Воронежская область).Для сахарной свеклы перспективно использование в качестве биохимических маркеров генов, определяющих синтез отдельных ферментов.Преимущество использования изоферментов как фенотипических маркеров по сравнению с генетически обусловленными морфологическими признаками связано с тем, что ферменты являются прямыми продуктами активности генов и поэтому менее подвержены влиянию внешней среды (Scaiidalios, 1974).Изоферменты кодир5гются конкретными генами и имеют кодоминантный тип наследования, что дает возмояшость маркировать не только контролирующие их локусы, но и тесно сцепленные с ними блоки генов. Это делает12(# их весьма удобными для проведения генетических экспериментов (Корочкин,Серов, Пудовкин, 1977; Левитес, 1986).Сведения, касающиеся изучения ферментов у сахарной свеклы молшо^ разделить на три гр5^ны. Первая - данные о генетическом контроле ферментов. В настоящее время у сахарной свеклы изз^ен генетический контроль более десяти ферментов. Вторая гр5тша - данные о генетическом полиморфизме. К третьей группе относятся сведения по изучению свойств ферментов всвязи с различными физиологическими состояниями растений (Левитес,1984).,4() К настоящему моменту у сахарной свеклы в пяти из девяти известныхгрупп сцепления имеется по 2-3 маркерных гена (Денисова, 1999). Так, Смедом с соавторами выявлено спепление локуса Idh-1 с локусом красной окраФ ски гипокотиля (Smed, Van Geyt, Oleo, 1989). Показано сцепленное наследование структурного локуса алкогольдегидрогеназы, гена несовместимости илетального гена у сахарной свеклы (Малецкий, Коновалов, Агафонов, 1987;Коновалов, 2001).Изоферментные маркеры внесли большой вклад в из5Д1ение филогениив роде Beta (Abe Jim, Nakashima Hiroslii, Isuda Chikaliiro, 1987; Wagner, Gimbel, Wrickle , 1989; Abe Jun, 1991). С помощью изоферментов проведено тесщ тирование устойчивости сахарной свеклы к нематоде (Jung, Weliling, Zoplien,1986).Последующие исследования показали, что изоферментный состав урастений сахарной свеклы сортоспецифичен и не зависит от условий выращивания (Федулова, 1995).Было предложено использовать изоферменты для идентификации сортов сахарной свеклы в селекции, семеноводстве и сортоиснытании на основечастоты встречаемости маркерных генов (А.с. №1672999, 1999).Вместе с тем литературные данные об использовании молекулярноф генетических маркеров при создании и поддержании исходного и селекцион13ного материала сахарной свеклы ограничены и свидетельствуют о недостаточной изученности данного вопроса.Наибольшее распространение в качестве маркеров у сахарной свеклыполучили запасные белки семян - 11S глобулины. Доказана стабильность ихсостава в различных условиях произрастания растений, проверена их изменчивость в общей пробе и в индивидуальных генотипах. В результате электрофоретического изучения 11S глобулина показано, что белковые маркерымогут быть использованы для идентификации геномов на видовом и линейном уровне, нрогнозирования генетической совместимости и контроля гибридности семян при межвидовой гибридизации (Лесневич, Борисюк, Болелова, 1988; Лесневич, 1990; Корниенко, 1990; Лисицына, Лисицын, 1990; Лесневич, 1999).Анализ литературных источников позволяет заключить, что существуют все необходимые предпосылки для щирокого использования белковыхмаркеров в селекции. Однако их применение пока еще не стало повсеместным.Новые перспективы открываются в связи с возмолшостью использования в качестве молекулярно-генетических маркеров клонированных последовательностей ДНК, с помощью которых молшо выявлять различия между генотипами.Самым ваяшым для селекции и генетики растений является ПЦР - анализ, который определяет молекулярно - генетический полиморфизм и можетисследовать ДНК - специфичность и особенность генотипа (Сиволап, 2003).Нрименение ДНК-технологий позволяет существенно расщирить возможность традиционной селекции. Увеличению генетического разнообразияи вовлечению новых генов и аллелей в процесс селекции способствуют методы ДНК-генотипирования культурных растений и их диких сородичей,создание карт сцепления и физических карт генома с помощью ДНКмаркеров и клонирование генов на основе этих карт (mapbased gene cloning),а таюке конструирование новых генотипов растений методами генетической14инженерии. Методы ДНК-генотипирования и селекции при помощи молекулярных маркеров (marker-assisted selection-MAS) позволяют ускорить перенос хозяйственно-ценных генов и локусов количественных признаков (quantitative trait loci - QTLs) в процессе селекции и обеспечить создание новыхсортов с целым комплексом заданных свойств. Совокзшность всех этих технологий получила название молекулярной селекции (molecular breeding, molecular selection) (Хавкин, 2003). Строго говоря, молекулярными маркерамиявляются не только фрагменты ДНК, но и запасные белки и изоферменты,если известен характер их наследования и картированы кодирующие гены.За последние 5-7 лет в области молекулярной селекции целого рядакультур произопши решительные перемены: генетическая модификация растений стала практической технологией, и трансгенные сорта растений занимают сейчас свыше 50 млн га сельскохозяйственных земель; во многих странах стали общедоступными новые высокоразрешающие методы ДНКгенотипирования, основанные на полимеразной ценной реакции (ШДР); наоснове ПЦР-нроизводных ДНК-маркеров созданы генетические карты десятков видов экономически важных растений; клонированы сотни ключевых генов, определяющих агрономически важные признаки у ведущих сельскохозяйственных культур; все увереннее обсуждается роль ДНК-технологий в ускорении процесса селекции; охране авторских прав селекционеров и защитепродукции растениеводства от возмолшых фальсификаций (Хавкин, 1997;Кочиева, 1999).Анализ литературных источников показал, что у сахарной свеклы дляидентификации нормальной и стерильной цитонлазмы используются митохондриальные фрагменты ДНК. Стерильные и фертильные растения отличаются друг от друга низкомолекулярными суперспирализованными молекулами мтДНК, что было показано многими исследователями (Powling, 1981;Mandolino, Cocchi, Raaolli, 1988; Дударева и др., 1988; Комарницкий и др.,1988; Hallden, Lind, Bringelsson, 1989; Satoni e.a., 1991; Dikalova e.a., 1997;Хворостов и др., 1997; 1998; Senda Mineo, O.Yasuguld, Tetsuo, 1998).15m Оценка степени генетической изменчивости свеклы на основании анализа RFLP и таксономии рода Beta позволила подтвердить современную таксономию секции Beta vulgaris ( M t a е.а., 1991; Raybould, Mogg, Clarke, 1996;Yulong, Brian, John, 1998 и др.) Впоследствии схожие данные были полученыЛ.В.Шаюк с коллегами (2003) в результате изучения полиморфизма родаBeta с помощью ГЩР-анализа.Представляют интерес результаты работ по созданию генетическойкарты генома сахарной свеклы, включающей данные по сцецлению 248ПДРФ (RPLP)-MapKepoB и 50 маркеров RAPD (Barzen е.а., 1995; Uphoff,(t^ Wricke, 1995; Shondelmaier, Steinrucken, Jung, 1996; Schmidt, Helsop-Harison,1996). Исследования в этой области продолжаются и в настоящее время(Kraft, 2001).Ф Большое практическое значение имеют работы английских и итальянских исследователей по созданию и картированию молекулярных (RFLP иRAPD) маркеров, сцепленных с устойчивостью к ризомании (Redtearr, Asher,1997; Ciorio, Gallitele, Carriero, 1997).Польскими учеными проведена идентификация генотипов свеклы поRAPD-маркерам (Baranski е.а., 1995). Полученные данные подтвердили высокий уровень информативности RAPD-анализа, в частности, при проведе,j^ НИИ родословного тестирования отдельных сортов и линий.По данным межд>тнародного института исследований сахарной свеклы(IIRB, Бельгия) на основе современных компьютерных технологий с использованием ДНК-маркеров создан информационный банк данных по генетическим ресурсам сахарной свеклы (Germeier, Frese, 2001).Однако сравнительно медленная интеграция MAS в селекционные программы определяется многими причинами, среди которых следует отметитьвысокие первоначальные затраты на развитие ДПК-технологий, трудностивыявления полезных ДПК-маркеров селектируемых признаков и особенноф проблему полигенных признаков. Тем не менее, MAS быстро развивается,Щ лабораторные методы ДПК-анализа и их приборное и программное обеспе16чение совершенствуется, удельные затраты быстро снижаются и практические результаты становятся все более многочисленными. Создание геномныхбиблиотек и полное секвенирование геномов существенно облегчает поиск ииспользование ДНК-маркеров генов и признаков. В итоге из вспомогательного инструмента селекционеров MAS сможет стать фактором, который существенно изменит не только технологию, но и идеологию селекции (Gupta е.а.,1999; Вал- е.а., Dreher е.а., 2000; Dudley, 2002; Ribaut е.а., Ribaut, Hoisington,1998; Stuber, Polacco, Senior, 1999; Young, 1999; Young, Mudge, 2002).Таким образом, анализ литературных источников свидетельствует обольщой теоретической и практической значимости в селекции различныхметодов генетического маркирования.Однако наибольшее раснространение получили в качестве гепетических маркеров запасные белки и изоферменты из-за относительной дешевизны и быстроты проведения анализов.Это предполагает разработку для сахарной свеклы методов ускоренного получения нового исходного материала с использованием генетическогомаркирования для практического использования их в селекционном процессе.Все вышеизложенное определило валшость и актуальность настояшейработы, в ходе которой предполагалось более детальное изучение закономерностей молекулярно-генетического маркирования и использование их вселекционной работе по сахарной свекле. Решению данной проблемы и былипосвящены наши исследования.В связи с этим большую актуальность приобретает разработка методовмолекулярно-генетического маркирования для нрактического использованияв селекционном процессе сахарной свеклы, включая отборы при созданииисходного материала и оценку при гибридизации.Цель наших исследований заключалась в теоретическом обоснованиипринципов молекулярно-генетического маркирования генома сахарной свеклы, как научной обновы при подборе родительских компонентов и проведе17НИИ идентификации и регистрации линий, сортов и гибридов для повышенияэффективности селекции данной сельскохозяйственной культуры.Для реализации данной проблемы было предусмотрено решение следующих задач:1. Изз^ить экспрессию, полиморфизм маркерных генов у сахарнойсвеклы и их сопряженность с хозяйственно-полезными признаками.2. Оценить степень гомозиготности инбредных линий и провести контроль гибридизации с использованием изоферментных спектров.3. Разработать принцип подбора родительских компонентов для скрещивания на основе генетических расстояний.4. Создать гибриды сахарной свеклы с использованием генетическимаркированных линий, отвечающие требованиям современного сельскохозяйственного производства.5. Разработать снособ идентификации сортов сахарной свеклы по изоферментным маркерам.6. Разработать научно-методологические основы информационныхтехнологий для идентификации и регистрации сортов и гибридов сахарнойсвеклы.Научная новизна исследований. Впервые установлены научнометодические приемы проведения амплификации последовательностей геномной ДНК сахарной свеклы с номощью ПНР с произвольно выбраннымипраймерами. Эти исследования имеют значение в практической селекции приотборе и идентификации ценных генотипов. Показано, что использованиепраймеров к последовательностям ДНК позволяет определять гомозиготность инбредных линий, идентифицировать родительские формы и их гибриды. Методом полимеразной цепной реакции с праймерами на 35 S промотордоказана трансгенная природа четырех регенерантов сахарной свеклы, несущих ген rs дефензина редьки, определяющий устойчивость к фитопатогенам.18Разработан критерий оценки степени гомозиготности инбредных линийсахарной свеклы на основе индекса Iiz, что позволяет использовать его дляконтроля процесса создания линий.Впервые на сахарной свекле выявлена достоверная положительнаясвязь изоферментных локусов, контролирующих НАД-зависимую малатдегидрогеназу и малик-фермент, с массой корнеплода, что вносит определенный вклад в совершенствование методов отбора.Оценка генетических взаимоотношений селекционных материалов сахарной свеклы по изоферментным и белковым маркерам позволила выявитьстепень их генетического родства. Это явилось основой для разработки метода нодбора пар для гибридизации, использование которого позволяет создавать высокопродуктивные гибриды, обладающие гетерозисным эффектом.Создан и включен в Государственный реестр селекционных достижений России и с 2001 года доггущен к использованию по Новолжскому и Центрально-Черноземному регионам гибрид РМС-90, (А.С. № 31185, 2001, в соавторстве) с использованием маркированной по изоферментному составугамма-линии у -РФ-2113, превышающий стандарт по зфожайности на 18,6%и сбору сахара на 17,3%.Нолучены новые данные по полиморфизму сортов-популяций сахарнойсвеклы по семи изоферментным локусам. На основе полз^ченных результатовразработан способ идентификации сортов по частотам встречаемости аллельных вариантов ферментов (А. №1672999, 1991, в соавторстве), позволяющий определять сортовую чистоту при семенном контроле и проводитьидентификацию их в сортоиспытании.Экспериментально установлены различия селекционного материала сахарной свеклы по запасному белку 1 IS глобулину при его идентификации покритерию идентичности, что углубляет теоретические представления о значении 11S глобулина занасного белка семян в оценке генофонда сахарнойсвеклы. Установлено, что низкий уровень полиморфизма глобулинов ин19бредных линий (1-2 тина электрофоретического снектра) может быть критерием оценки их генетической чистоты.Внервые создана информационная система с электронной базой данных, осуществляющая хранение результатов электрофоретического аналнза ирасчет критериев идентичности нри сравнении генотинов сахарной свеклы нобелковым маркерам, что имеет важное теоретическое и нрикладное значениев селекционно-семеноводческой работе.Практическая ценность и реализация результатов исследований.Модифицированная методика выделения геномной ДНК сахарнойсвеклы и нроведения ПЦР анализа может найти широкое нрименение в селекции сахарной свеклы для нроведения генотинирования селекционных материалов, сортов, гибридов и идентификации трансгенных форм.Предложен критерий оценки селекционных материалов сахарной свеклы - индекс изоферментной гомозиготности Iiz, который может быть иснользован в селекции для выделения и отбора линий с высокой стененью генетической выравненности, в нределах от 0,85 до 0,91.На основе установленных генетических расстояний разработан методнодбора родительских комнонентов, который может слулшть нринциннальной основой создания новых высоконродуктивных сортов и гибридов.Наиболее нерснективные маркированные но изоферментному составулинии зарегистрированы в селекцентре ВНИИСС в качестве нового исходного материала и иснользованы, как комноненты гибрида РМС-90.Выявленные различия сортов и гибридов но тинам электрофоретических снектров занасного белка и изоферментных локусов и частотам ихвстречаемости являются основой для проведения их надежной идентификации и наспортизации, и вносят существенный вклад в развитие методов селекционного отбора.Разработанные методические рекомендации но проведению наспортизации на основе информационных технологий могут найти широкое нриме20нение для оперативного управления информацией в селекции, семеноводствеи сортоиспытании.Разработанные в процессе исследований методические подходы апробированы и могут использоваться в селекции, семеноводстве и сортоиспытании сельскохозяйственных культур, а также быть включены в программы побиологии, генетике, селекции в высших и средних учебных заведениях.Положения, выносимые на защиту:- экспериментальное обоснование использования изоферментов в качестве генетических маркеров при оцепке селекционных материалов, позволяющее проводить отбор гомозиготных линий и контролировать пропессгибридизации.- научное обоснование и реализация метода подбора родительскихкомпонентов для гибридизации на основе генетических расстояний, способствующего получению гибридов, обладающих гетерозисным эффектом.- использование генетического маркирования в процессе создания новых гибридов, обеспечивающих высокую продуктивность.- информационная технология на основе генетического маркирования,позволяющая проводить идентификацию и паспортизацию линий, сортов игибридов сахарной свеклы в селекции, семеноводстве и сортоиспытании, чтобудет способствовать повышению эффективности этих процессов.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, доктора биологических наук, Федулова, Татьяна Петровна, Рамонь

1. Агафонов Н.С, Богомолов М.А., Жужясалова Т.П., Корниенко А.В.,Федулова Т.П., Понова И.Р. Способ нолучения гомозиготных линий сахар-ной свеклы. - А.С. 1708210 СССР, МКИ, АОШ 1/04. - № 4818227/13. Заявл.12.03.90; Онубл. 30.01.92. - Бюлл. J^ o 4. - 6с.

2. Агафонов Н.С. Экснрессия генов Mod - 1 и Mod - 2 в онтогенезе са- харной свеклы / Н. Агафонов, А.А. Коновалов // Сельскохозяйственнаябиология. - 1984. -№7. - 31 - 34.

3. Агафонов П.С., Жужжалова Т.П., Левитес Е.В., Федулова Т.П., Ко- новалов А.А. Снособ идентификации сортов сахарной свеклы. - А.С. 1672999СССР, МКИ, АОШ 1/04. - № 4661371/13. Заявл. 13.03.89; Онубл. 30.08.91. -Бюлл. № 32. - 10с.

4. Авт. Свид. №507271 СССР, МКП АОШ 1/04 Снособ сортовой иден- тификации зерна и муки / В.Г. Конарев, П.П. Гаврилюк, П.К. Губарева. Заявл.01.09.72; Онубл. 11.10.75. бюл. J f^oll. -4 с.

5. Айала Ф. Введение в понуляционную и эволюционную генетику / Ф.Айала // - М.: Мир, 1984. - 230с.б.Айала Ф. Современная генетика / Ф. Айала, Дж. Кайгер. - М.: Мир,1988. - Т. 3.-335с.

6. Алтухов Ю.П. Генетические нроцессы в популяциях / Ю.П. Алтухов// -М.: Паука, 1983.-280 с.

7. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях / Ю.П. Алтухов //-М.: Наука, 2003.-С. 431.

8. Анисимова П.Н. Идентификация сортов, линий и гибридов подсол- нечника по составу полипептидов гелиатинина / И.Н. Анисимова // Труды поприкл. бот., ген. и сел. - 1987. -Т.114. -С. 114 - 125.

9. Аржанцев В.И. С международного симпозиума по биохимической идентификации сортов / В. И. Аржанцев // Селекция и семеноводство. - 1988.-№1.-С.61-62.

10. Архимович А.З. К вопросу об изоляции высадков сахарной свеклы / А.З. Архимович // Труды Белоцерковской селекционной станции.-1927.- Т.1.- 7-36.

11. Архимович А.З. Работы по инцухт-методу / А.З. Архимович // Тру- ды: Центральный НИИ сахарной промышленности. - 1929. Вып.2. - 183-185.

12. Архимович А.З. К вопросу об инцухт-методе у сахарной свеклы / А.З. Архимович // Труды Белоцерковской селекционной станции. - 1931.- Т.6,-ВЫП.З.-С.1-63.

13. Балков И.Я. Создание стерильных и фертильных линий сахарной свеклы с целью получения гетерозисных гибридов / И.Я. Балков, В.П. Ошев-нев, Т.П. Жужжалова, Л.П. Прохорова, Л.И. Чабала // Сахарная свекла вРСФСР. - Воронеж, 1973. - 25-28.

14. Балков И.Я. Цитоплазматическая мужская стерильность сахарной свеклы / И.Я. Балков // Селекция и семеноводство сахарной свеклы: Сб. на-учн. трудов. Т.5. - Вын.1. - Воронеж, 1975. - 3-69.

15. Балков И.Я. ЦМС сахарной свеклы / И.Я. Балков // М.: Агропромиз- дат, 1990.-240 с.

16. Барнаков П.В. Научные основы семеноводства зерновых культур / Н.В. Барнаков // Новосибирск, 1982. - 437 с.261ЗО.Батыгина Т.Б. Хлебное зерно / Т.Б. Батыгина // Л.: Наука. - 1987. -103 с.

17. Бормотов В.Е. Селективность онлодотворения тетрацлоидных и ди- нлоидных форм свеюгы и продуктивность гибридных популяций / В.Е. Бор-мотов, Б.Ф. Матросов, В.Н. Загрекова // Воцросы генетики и селекции. -Минск, 1970. - 187-196.

18. Бре>1шев Д.Д. Дикие сородичи культурных растений флоры СССР / Д.Д. Брежнев, О.Н. Коровина//Д.: Колос, 1981. - 3-5.Зб.Бриггс Ф. Научные основы селекции растений /Ф. Бриггс, П, Ноулз// Пер. с англ. - М.:Колос, 1972. - 399 с.

19. Буренин В.И. Генетические аспекты взучоиия свеклы / В.И. Буре- нин, В.Т. Красочкин // Тр. но нрикл. ботанике, генетике и селекции - Всесо-юзный ин-т растениеводства. - 1971. - Т.44., Вын.1. -С.189-215.

20. Буренин В.И. Гены и генетическая коллекция свеклы / В.И. Бзфенин // Генетика сахарной свеклы. - Новосибирск: Наука, 1984. - 37 - 45.

21. Буренин В.И. Свекла /В. И.Буренин, В.Ф. Иивоваров // Санкт- • Петербург, 1998.-211с.

22. Бурмакина И.В. Исследование мейоза у гаплоидов озимой пшеницы • / И.В. Бурмакина // Генетика: Ириложение. -1994. - Т. 30. - 20.

23. Бычкова В.А. Селекционно-генетическое изучение и использование инбредных линий сахарной свеклы нри создании гетерозисных гибридов нафертильной основе: Автореф. дис. ... канд. с. - х. наук / В.А. Бычкова -Санкт-Петербург, 1993. -22 с.

24. Вавилов И.И. Генетика на службе социалистического земледелия / Н.И. Вавилов // Избр.тр. - М.-Л., 1965, 5. - 32 - 56.

25. Вавилов И.И. Селекция как наука / Н.И.Вавилов// Изб.произ. - Л., 1967.-Т. 1.-С. 328-342.

26. Варлахов М.Д. Дивергенция в селекции растений / М.Д. Варлахов, Н.М. Чекалин // Физиолого-генетические основы интенсификации селекци-онного процесса: Материалы Всесоюз. конф., Саратов, 4-6 июля 1984 г. ч. П.- Саратов, 1984. - 59-60.

27. Глазко В.И. Генетика изоферментов лсивотных и растений / В.И. Глазко, А.А. Созинов - Киев: Урожай, 1993. - 526 с.

28. Глазко В.И. Природные и экспериментальные факторы органиче- ской эволюции / В.И. Глазко, А.А. Корчинский, И.В. Роик // Фактори експе-риментально1 еволюци1 организмив: Зб1рник наукавых прац1. - Ки1в: Аграрна# наука, 2003.-С 12-27.

29. Глазко В.И. ДПК-технология - метаболика, протеомика, трансгенез / В.И. Глазко, Г.В. Глазко // Вюник Украшського товариства генетик1в i селек-^ цюнер1в. - 2003. - № 1 - 3-16.

30. Голев И.Ф. Исследование методов селекции генетически новых форм раздельноплодной сахарной свеклы: Автореф. дис. ... канд. с. - .х. наук/ И.Ф. Голев - Киев, 1972. - 36 с.

31. Голев И.Ф. Раздельноплодные мутанты сахарной свеклы и факторы интенсификации их отбора в процессе селекции: Автореф.дис. ... докт. с.-х.наук / И.Ф. Голев - Киев, 1991. - 48с.

32. Горшков В.И. Изучение генофонда ярового рапса (Brassica napus L.) в условиях лесостепи ЦЧЗ: Автореф. дис. ... канд. с. - х.наук / В.И. Горшков,ф -Рамонь, 1999.-21 с.264

33. ГринеБа Г.М. Регуляция метаболизма у растений при недостатке ки- слорода / Г.М. Гринева - М.: Наука, 1975. - 279 с.

34. Гринько Т.Ф. Самооныляющиеся расы сахарной свеклы / Т.Ф. Гринько // Бюллетень Ивановской онытной станции -1927. - № 4. -С. 47-63.бО.Гринько Т.Ф. Инцухт у сахарной свеклы / Т.Ф. Гринько // Свекло-водство. - Киев, 1940. - Т. 1. - 727-750.

35. Гринько Т.Ф. Линейно-гетерозисный метод в селекции сахарной свеклы / Т.Ф. Гринько, В.Г. Перетятько // Вестник сельскохозяйственнойнауки. -1962. - № 8. - 43-49.

36. Гудвил В. Предварительные результаты опытов по скрещиванию различных рас сахарной свеклы / СВ. Гудвил // Труды Всесоюзного Центр.НИИ сахарной промышленности. - М., 1929. - Вып.2. - 187 - 188.

37. Гуляев Г.В. Селекция и семеноводство полевых культур с основами генетики /Г.В. Гуляев, А.Н. Дубинин // М.: Колос, 1980. - 375с.

38. Гуляев Г.В. Словарь терминов по генетике, цитологии, селещии, семеноводству и семеноведению /Г.В. Гуляев, В.В. Мальченко // М.: Рос-сельхозиздат, 1983. - 240 с.

39. Дальке Л. Самосовместимые инбредные линии сахарной свеклы и возможность их использования в селекции гибридных сортов / Л. Дальке//Советско-нольский симпози)^. - Киев, 1980. - 206.

40. Дарвин Ч. Действие перекрестного опыления и самоопыления в рас- тительном мире / Ч. Дарвин // Иер. с англ. - М.-Л.: Сельхозгиз, 1939. -339с.

41. Денисова Ф.Ш. Изучение генетического контроля ферментов и вы- явление групп сцепления у сахарной свеклы: Автореф. дис. ... канд. биол.наук/ Ф. Ш. Денисова. -Новосибирск, 1999. - 17 с.

42. Диксон М. Ферменты / М. Диксон, Э. Уэбб // Ферменты. - М.: Мир, 1966.-Т. 1.-С. 291-329.

43. Добросотсков В.В. Нути получепия линейного материала сахарной свеклы /В.В. Добросотсков // Селекция, генетика и физиология сахарнойсвеклы. - Киев, 1972. - 62-64.265

44. Добросотсков В.В. Сочетание различных систем инбридинга нри создании линейных материалов сахарной свеклы /В.В. Добросотсков, В.Г.Перетятько // Сельскохозяйственная биология. - 1975. - Т. X. - № 1. _ с. 26-31.

45. Добросотсков В.В. Изменчивость самосовместимости /В.В. Добро- сотсков // Сахарная свекла. -1983. - № 3. - 31-33.

46. Дорохов Д.Б. Быстрая технология RAPD-анализа генотииов луков / Д.Б. Дорохов, М.Н. Лантева // Сельскохозяйственная биология. - 1997. - М 5.- 22-32.

47. Дорохов Д.Б. Быстрая и экономичная технология RAPD-анализа растительных геномов / Д.Б. Дорохов, Э. Клоке // Генетика. - 1997. - 33. - 476-483.

48. Доспехов Б.А. Методика нолевого оныта / Б.А. Доснехов // М.: Ко- лос, 1973. - 366 с.

49. Дрейнер Д. Генная инженерия растений / Дж. Дрейнер, Р. Скотт, Ф. Армитидж // М.: Мир, 1991. - 236-276.

50. Дюран Б. Кластерный анализ / Б. Дюран, П. Оделл. - М.: Статисти- ка, 1977. - 128 с.

51. ЕВСЮКОВ А.Н. Компьютерный подход к изучению полиморфизма нуклеиновых кислот / А.И. Евсюков, О.Ю. Наумов, СЮ. Рычков // Генетика.-1996. - Т. 32, № 10. - С 1417-1420.

52. Ежова Т.А. Arabidopsis tlialiana - модельный обеъект генетики рас- тений / Т.А. Ежова, О.В. Лебедева, О.А. Огаркова, А.А. Нении, О.Н. Солда-това, СВ. Шестаков // Учебно-методическое нособие но генетике растений -М.: Макс Нресс, 2003. - 220 с.266

53. Железнов А.В. Новые экспериментальные данные по межлинейной гибридизации гречихи / А.В. Железнов // Апомиктическое размпожение и ге-терозис. - Новосибирск, 1974. - 137-144.

54. Животовский Л.А. Ноказатели сходства популяций по полиморф- ным признакам / Л.А. Животовский // Журнал общей биологии. - 1979. - Т.40, № 4. - 587-602.

55. Животовский Л.А. Ноказатели нонуляционной изменчивости по по- лиморфным признакам / Л .А. Животовский // Фенетика популяций. - М.:Наука, 1982.-С. 38-44.

56. Животовский Л.А. Интеграция полигенных систем в популяциях / Л.А. Животовский // М.: Наука, 1984. - 183 с.

57. Жулокалова Т.Н. Цитологические и гистохимические особенности репродуктивных органов сахарной свеклы с цитоплазматической мужскойстерильностью: Автореф. дне. ... канд. биол. наук / Т.Н. Жулокалова. - Киев,1972.-24 с.

58. Жулокалова Т.Н. Закономерности развития ренродуктивных органов сахарной свеклы (Beta vulgaris L.): Автореф. дне. ... док. биол. наук / Т.Н.Жулокалова - Воронелс, 1999. -41с.

59. Жуковский Н.М. Культурные растения и их сородичи / Н.М. Жуков- ский-Л.: Колос, 1971.-752 с.267

60. Знаменская В.В. Влияние некоторых регуляторных факторов на формирование семян и их качество у линий и гибридов сахарной свеклы: Ав-тореф. дис. ... канд. с.-х.наук/В.В. Знаменская. -Л., 1985. -17 с.

61. Знаменская В.В. Индукция гиногенеза у сахарной свеклы / В.В. Зна- менская, Т.П. Жулокалова, О.А. Подвигина // Новые методы биотехнологиирастений: Российский симпозиум, май 1993. - Пущино, 1993, - 141.

62. Знаменская В.В. Создание нового исходного материала в селекции сахарной свеклы /В.В. Знаменская, О.А. Подвигина, Т.П. Жуяокалова // Са-харная свекла. - 1994, №6. - 8.

63. Знаменская В.В. Принципы и методы создания и поддержания ис- ходного материала на современном этапе селекции сахарной свеклы: Авто-реф. дис. ... докт. с.-х. наук / Знаменская В.В. - Рамонь, 1999. - 40с.

64. Иогансен В. Элементы точного учения от изменчивости и насяедст- венности с основами биологической статистики. / В. Иогансен. - Д.: Сельхоз-гиз, 1933.-303С.

65. Картель Н.А. Эффекты экзогенной ДНК у высших растений. - Минск: Наука и техника, 1981.

66. Кирикович С. Эпигенетическая изменчивость ферментных локу- сов у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) при многофакторных воздействиях:Автореф. дис. ... канд. биол. наук / С. Кирикович . - Томск, 2005. - 17 с.

67. Комарницкий И.К. Методические рекомендации по применению молекулярно-биологического анализа в селекции сахарной свеклы / И.К. Ко-марницкий, А.М. Самойлов, В.И. Перетятько, Ю.Ю. Глеба. - Киев, 1988. - 28

68. Конарев В. Г. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких соро- дичей / В. Г. Конарев, И. П. Гаврилюк, Н. К. Губарева // Вестник с.-х. науки.- 1970 а. - Х28. - НО - 114.

69. КонареБ В. Г. Белковые маркеры геномов пшениц и их диких соро- дичей / В. Г. Конарев, И. П. Гаврилюк, Н. К. Губарева // Вестник с.-х. науки.-1970 6. - № 9 . - С . 91-103.

70. Конарев В. Г. О природе глютенина пшеницы по данным иммуно- химического анализа / В. Г. Конарев, И. П. Гаврилюк, Н. К. Губарева // Док-лады ВАСХНИЛ. - 1970 в. - №7. - 16-18.

71. Конарев В.Г. Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции / В.Г.Конарев.-1973.-№3.

72. Конарев В.Г. Молекулярно-биологические аснекты прикладной бо- таники, генетики и селекции / В.Г. Конарев. - М.: Колос, 1993. - 447 с.

73. Конарев В.Г. Идентификация сортов и регистрация генофонда культурных растений по белкам семян / В.Г. Конарев. - -Пб., 2000. - 186с.270

74. Коновалов А.А. Генетическое разнообразие в роде Beta: признаки, генные карты и перспективы использования / А.А. Коновалов // Генетическиеколлекции растений. - Новосибирск, 1994.- Вып. 2. - 33-86.

75. Коновалов А.А. Генетика гаметофит-спорофитных взаимодействий у свеклы (Beta viilgaris L.): Автореф. дис. ... д-ра биол. наук. / А.А. Коновалов- Новосибирск, 2001. - 33 с.

76. Корниенко А.В. Основы мутационной селекции свеклы - / А.В. Корниенко. - М . : Агропромиздат, 1990. -208 с.

77. Корниенко А.В. Методы селекции сахарной свеклы на гетерозис /А.В. Корниенко, Д. Орлов - М.: ИК "Родник". -1996. - 240 с.

78. Корниенко А.В. Закономерность проявления нризнака раститель- ного организма / А.В. Корниенко, Д. Орлов. - Рамонь, 2002. - 80 с.

79. Корочкин Л.И. Генетика изоферментов / Л.И. Корочкин. - М.: Нау- ка, 1977.-275 с.

80. Кочетков Е.А. Определение нодлинности семян пшеницы лабора- торным методом / Е.А. Кочетков // Тр. по прикл. бот., ген. и селекции. - 1971.-Т.44,Вьш.З.-С. 35-49.

81. Кочиева Е.З. Использование методов на основе полимеразной цеп- ной реакции для анализа и маркирования растительного генома /Е.З. Кочие-ва // Сельскохозяйственная биология, 1999. - № 3. - 3-14.271

82. Кочиева Е.З. Использование PCR-амплификации на основе сател- литных последовательностей для маркирования генома различных видовперца / Е.З. Кочиева, Н. Рыжова // Сельскохозяйственная биология. - 2001. -№ 1 . - С . 94-97.

83. Левитес Е.В. Изучение генетических систем, контролируюших ма- латдегидрогеназы у сахарной свеклы / Е.В. Левитес // Структурно-функциональная организация генома эукариот. - Иовосибирск: Наука, Сиб.отд., 1979а.-С.64-77

84. Левитес Е.В. Генетический контроль НАДФ-зависимого малик - фермента у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / Е.В. Левитес // Докл. АНСССР. -19796. - Т. 249, № 1. - 215-217.

85. Левитес Е.В. Генетический контроль НАД-зависимой малатдегид- рогеназы у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / Е.В. Левитес, Р.С. Юдина,СИ. Малецкий // Докл. АН СССР. -1980. - Т.255, № 4. - 989-991.

86. Левитес Е.В. Использование генетических маркеров для контроля перекрестного опыления самонесовместимых линий сахарной свеклы / Е.В.Левитес, Д.И. Котляревский // Генетика сахарной свеклы. - Новосибирск:Наука, Сиб.отд-ние, 1984. - 145-151.

87. Левитес Е.В. Генетика изоферментов у сахарной свеклы /Е.В. Ле- витес // Генетика сахарной свеклы. - Новосибирск: Назлка СО, 1984. - 45-60.

88. Левитес Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. - Но- восибирск: Наука, СО, 1986. -144 с.

89. Левонтин Р.С. Генетическая гетерогенность электрофоретических аллелей / Р.С. Левонтин: Тез. докл. 14 Междунар. генет. конгр. секц. заседа-ния. -М. : Наука, 1978 б. -Ч .1 . - 465.

90. Лесневич Л.А. Растительные белки и изоферментный состав на разных фазах развития сахарной свеклы / Л.А. Лесневич, З.А. Болелова // Фи-зиологические основы новышения нродуктивности сахарной свеклы. - Киев,1983.-С.41-46.

91. Лесневич Л.А. Комнонентный состав и снецифичностъ белков раз- личных форм рода Beta L.: Автореф. дис. ... к.б.н. / Л.А. Лесневич. - Минск,1983-16 с.

92. Лесневич Л.А. Оценка и изучение генофонда свеклы но белкам - маркерам / Л.А. Лесневич, З.А. Болелова // Сельскохозяйственная биология. -1987.-№4.-С. 58-63.

93. Лесневич Л.А. Нолиморфизм llS-глобулинов в изучении генома сахарной свеклы / Л.А. Лесневич // Частная генетика растений: Тез. докл.конф. 23-25 мая 1989 г. - Киев. - Т. 1. - 131-132.

94. Лесневич Л.А. Белковые маркеры в идентификации сортов и линий сахарной свеклы / Л.А. Лесневич // Докл. ВАСХНИЛ. - 1990. - № 1. - 28-31.

95. Лесневич Л.А. Идентификация генотина сахарной свеклы но бел- кам-маркерам / Л.А. Лесневич, В.А. Борисюк, З.А. Болелова // 6 съезд Укр. о-273ва генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова, Полтава, 1992: Тез. докл.Т.З.-Киев, 1992.-С. 29-30.

96. Лесневич Л.А. Полинептиды 11S -глобулина в анализе нодлинно- сти сортов сахарной свеклы / Л.А. Лесневич, В.А. Борисюк //Физиология ибиохимия культурных растений. - 1993. - Т. 25, № 2. - 175-191.

97. Лесневич Л.А. Электрофоретическое и иммунохимическое изуче- ние занасных белков семян свеклы /Л.А. Лесневич // Физиология и биохимиякультурных растений. - 1997. -Т. 29, №3. -С.200 - 208.

98. Л1сневич Л.О. Ф1з1олого - 6ioxiMi4Hi властивост1 та функц1ональна роль занасних б1лк1в буряк1в: Автореф. дис. ... докт. биологич. наук / Л.О.Лкневич. - Ки1в, 1999. - 37 с.15О.Ли Ч. Введение в нонуляционную генетику. - М.: Мир, 1978. - 556с.

100. Лялько И. И. Морфологическая мутация сахарной свеклы - оцу- шенность листовых нластинок / И.И. Лялько // Цитология и генетика. - 1999.-33,ЯоЗ.-С. 47-51.

101. Магомедов И.М. Изозимный состав основных ферментов С-4 пути фотосинтеза / И.М. Магомедов, Н.Н. Тищенко // Физиология растений. -1976. - Т. 23, № 6. - 1241 - 1247.

102. Мазепин М.Г. Использование окраски гипокотиля как генетическо- го маркера при определении гибридности потомства сахарной свеклы / М.Г.Мазепин// Сельскохозяйственная биология. - 1971. -Т. 6, Ш 6. -С. 922-923.

103. Мазлумов А.Л. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов // М.: Сельхозгиз, 1950. -176 с.

104. Мазлумов А.Л. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов: Сбор- ник трудов ВНИИСС. - Воронеж, 1966. - Т.П. - Выи. 3. - 3 - 53.

105. Мазлумов А.Л. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов. - М.: Колос, 1970.

106. Мазлумов А.Л. Селекция сахарной свеклы / А.Л. Мазлумов. - М., 1996.-208 с.163 .Максимович А.Е. Химический состав вегетирующей сахарнойсвеклы / А.Е. Максимович // Биология и селекция сахарной свеклы. - М.: Ко-лос, 1968. -С.462.

107. Малецкий СИ. Использование генетических маркеров в селекции сахарной свеклы на гетерозис / СИ. Малецкий, Э.В. Денисова // Сельскохо-зяйственная биология. - 1969. - Т.4, №5. - 740 - 744.

108. Малецкий СИ. Получение самоопыленных линий у самонесовмес- тимых растений сахарной свеклы / СИ. Малецкий, Э.В. Денисова, А.Н. Лут-ков // Генетика. -1970. - Т. 6, № 6. - 180-184.

109. Малецкий СИ. Наследование алкогольдегидрогеназы у сахарной свеклы. Сообщение I. Анализ отклонения от моногенного расщенления / СИ.Малецкий, А.А. Коновалов //Генетика. - 1985. -Т.21, №9. - С 1527 - 1540.

110. Малецкий СИ. Частота встречаемости линий - закрепителей сте- рильности у сахарной свеклы / СИ. Малецкий, СГ. Веирев, А.В. Мглинец,Ю.Н. Шавруков // Докл. АН СССР. - 1988. - Т. 301, №5. - С 1218 - 1221.

111. Малецкий СИ. Введение в популяционную биологию и генетику растений. / СИ. Малецкий. - Новосибирск, 1995. - 154с.

112. Маниатис Т. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фркч, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984. - 479 с.

113. Мартынов СП. Информационно-аналитическая система генетиче- ских ресурсов растений / СП. Мартынов // Аграрная Россия. - 1998. - № 1. -С. 10-13.

114. Мартынов СП. О генетическом разнообразии сортов мягкой яро- вой пшеницы / СП. Мартынов, Т.В. Добротворская // Селекция и семеновод-ство. -1998.-№ 3. - С 2-6.

115. Мендель Г. Опыты над растительными гибридами / Г. Мендель. - М.: Паука. - 158 с.

116. Мирюта Ю.П. О естественном самоопылении у кукурузы / Ю.П. Мирюта // Бюл.Укр.ПИИ растениеводства, селекции и генетики. - 1958. - №3.-С. 36-40.

117. Митин СП. Биоморфологическое и молекулярно - генетическое изз^ение селекционного материала сахарной свеклы: Автореф. дис.канд.биол. наук / П. Митин. - Рамонь, 2004. - 22 с.277

118. Неговский Н.А. Современное состояние селекции сахарной свеклы в СССР и нути ее улучшения / Н.А. Неговский // Селекция сахарной свеклына повышепие продуктивности и технологических качеств. - Киев, 1976. - 17-28.

119. Ней М. Генетические расстояния и молекулярная таксономия / М. Ней // Вопросы общей генетики: Труды 14-го Междунар. генет. конгресса. -Москва, 1978. - М.: Наука, 1981. - 34 - 45.

120. Нейман Ю. Случайные неременные и распределение вероятностей /Ю. Нейман // Вводный курс теории вероятностей и математической стати-стики. - М.: Наука, 1968. - 220-255.

121. Неттевич Э.Д. Нзучение гибридов яровой пшеницы в связи с про- блемой использования гетерозиса / Э.Д. Неттевич // Сельскохозяйственнаябиология. - 1969. - T.IV, № 3. - 332-340.

122. Оганесян А.С. Маркирование видов и сортов картофеля с помощью метода RAPD PCR / А.С. Оганесян, Е.В. Кочиева, А.Н. Рысков // Генетика. -1996. -Т.32. - №.3 -С. 448 - 451.278

123. Огаркова О.А. Инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana: полу- чение морфологических мутантов / О.А. Огаркова, Н.В. Хадеева, Н.Ю. Гор-дон, Т.А. Гапеева, В.А. Тарасов // Генетика. - 1997. - 33, №2. - 223 - 228.

124. Орловский Н.И. Рост сахарной свеклы / Н.И. Орловский // Биоло- гия и селекция сахарной свеклы. - М.: Колос, 1968. - 207 - 226.

125. Парий Ф.Н. Использование окрашенных образцов свеклы в качест- ве тестеров при оценке комбинационной способности /Ф.Н Парий, Л. А. До-лотий // Сельскохозяйственная биология. - 1983. - М9. - 31-33.279

126. Пасеков В.П. Родство и генетическая близость иопуляций / В.П. ПасекоБ // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Математическая биология имедицина. - 1978. - 1. - 166 - 209.

127. Иеретятько В.Г. Самооныление у сахарной свеклы / В.Г. Иеретять- ко // Сахарная свекла. -1963. - № 3. - 30-31.

128. Перетятько В.Г. Изучение комбинационной способности линейных материалов сахарной свеклы / В.Г. Иеретятько, И.И. Орловский // Вонросыгенетики, селекции и цитологии сахарной свеклы. - Киев, 1971. - 262-268.

129. Перетятько В.Г. Селекция самофертильных 0-типов сахарной свеклы / В.Г. Перетятько // Советско-польский симпозиум. - Киев, 1980. - 34-41.

130. Перетятько В.Г. Селекционно-генетические основы создания гете- розисных гибридов сахарной свеклы: Автореф. дис. ... докт. биол. наук /В.Г.Перетятько. - Киев. - 1981. - 26 с.

131. Перетятько В.Г. Ослабленный инбридинг в селекции / В.Г. Пере- тятько // Сахарная свекла. -19 86.-№12.-С. 26-29.

132. Перфильев В.Г. О возможности использования обобщенного пока- зателя расстояния между сортами в селекции плодовых растений / В.Е. Пер-фильев, А.В. Лебедев, В.А. Тихонов // Сельскохозяйственная биология. -1979. - Т. XIV, № 4. - 482-486.280

133. Подвигина О.А. Теоретическое обоснование и приемы иснользова- ния методов биотехнологии в селекции сахарной свеклы: Автореф. дис. ...докт. с.-х. наук / О.А. Подвигина. - Воронеж, 2003.- 44 с.

134. Поиереля Ф.А. Биохимическая генетика глиадина и селекция нше- ницы / Ф.А. Понереля, А.А.Созинов // Труды ВАСХНИЛ. - 1977. - 65 - 70.

135. ПОНОВ А.В. Результаты работ Ялтушковского селекционного П5шк- та но выведению и изучению односемянной сахарной свеклы / А.В. Понов //Односемянная сахарная свекла. - М., 1960. - 45 - 73.

136. Райдер К. Изоферменты / К. Райдер, К. Тейлор // Пер. с англ. - М.: Мир, 1983. -106 с.

137. Рао Кластер - анализ в применении к изучению перемешивания рас в популяциях людей / Рао // Классификация и кластер. - М.: Мир,1980.-С. 148-167.

138. Ревенкова Е.В. Трансформация хлопчатника (Gossipiiim hirsutum 1..) нри помощи супервирулентного штамма Agrobacretium tmnefaciens А 281/ Е.В. Ревенкова, А.С. Краев, К.Г. Скрябин // Молекулярная биология. - 1990.- 2 4 . - С . 1017-1021.

139. Ригер Р. Генетический и цитогенетический словарь / Р. Ригер, А. Михаэлис. - М.:Колос, 1967. - 607 с.22О.Рискина Биология и селекция сахарной свеклы / Рискина. -М.:Колос, 1968.-С. 462.

140. Савицкий В.Ф. Генетика сахарной свеклы / В.Ф. Савицкий //Свекловодство. -Киев: Госсельхозиздат, 1940. - Т. 1. - 551-686.

141. Серебровский А.С. Генетический анализ / А.С. Серебровский. - М.: Паука, 1970. - 342 с.281

142. Серов О.Л. Механизм образования гибридных изоферментов как модель для изз^ения взаимодействия генов / О.Л. Серов // Генетика изофер-ментов. - М.: Наука, 1977. - 187-197.

143. Сиволан Ю.М. Маркерный анализ некоторых QTL ячменя с помо- щью RAPD и изоферментов / Ю.М. Сиволап, Р.Н. Календарь, В.П. Нецветаев// Цитология и генетика. - 1997. -31, >fe4. - 39 - 45.

144. Сиволап Ю.М. ДНК i генетична специф1чность / Ю. М. Сиволап // Фактори експериментально! еволюци организм1в. - Киш: Аграрпа наука,2003.-С. 375-380.

145. Серов О. Л. Электрофоретические методы исследования изофер- ментов / О.Л. Серов, Л. И. Корочкин, Г. Н. Манченко // Генетика изофермен-тов.-М.: Наука, 1970.-С. 18-64.

146. Созинов А.А. Нолиморфизм проламинов и селекция / А.А. Сози- нов, Ф.А. Нопереля // Вестник с. - х. науки. - 1979, №10. - 21 - 34.

147. Созинов А.А. Нолиморфизм белков и его значение в генетике и се- лекции / Созинов А.А. - М.: Наука, 1985. - 271 с.

148. Созинов А.А. Генетические маркеры в частной генетике и селекции растений / А.А. Созинов // Частная генетика растений: Тез. докл., конф. 23-25мая 1989. - Киев, 1989. - Т. 2. - 81-82.

149. Созинов А.А. Генетические маркеры у растений / А.А. Созинов //Цитология и генетика. - 1993. - Т.27, №5. -С.З - 14.

150. Суворова Г.П. Филогенетическое родство некоторых сортов, видов и гибридов рода Fagopyrum Mill, установленное на основе К7\РВ-анализа/Т.Н. Суворова, X. Фунатсуки, Ф. Терами // Генетика. - 1999. - Т. 35, № 12. -С. 1659- 1664.

151. Тзфбин Н.В. Генетика гетерозиса и метод селекции растений на комбинационную снособность / Н.В. Турбин // Генетические основы селек-ции растений. - М.: Наука, 1971. - 112-155.

152. Туровский А.И. Создание межлинейнык гибридов с учетом само- совместимости инбредных линий / А.И. Туровский, В.А. Бычкова // Пути ин-тенсификации свекловодства и цроизводства сахара: Сб. науч. тр. ВНИИСС.- Воронеж, 1986. - 24-28.

153. Федорович Л.Н. Некоторые данные по вопросам, связанным с при- менением метода инцухта в свекловичном сортоводстве / Л.Н. Федорович//Сборник ССЦ. - Киев, 1928. -№ 4(12). - 41-57.

154. Федорович Л.И. Некоторые данные но вопросам, связанным с при- менением инцухт-метода в свекловичном сортоводстве / Л.И. Федорович//Труды ин-таЦНИС. -1929. - Вып. 2. - 186-187.

155. Федорович Л.Н. Массовый, групповой и индивидуальный методы отбора / Л.Н. Федорович // Свекловодство. - Т.1. - Киев, 1940. - 693 - 712.

156. Федулова Т.П. Изоферментные маркеры в идентификации гаплои- дов сахарной свеклы / Т.П. Федулова, О.А. Подвигина // Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений: Матер, конф., Киев 10-13 мая1994. - Киев: Аграрна наука, 1994. - 69.

157. Федулова Т.П. Генетико-селекционное изучение исходного мате- риала сахарной свеклы с нрименением биохимических маркеров //Автореф.дис. ... канд. с.-х. наук/Т.П. Федулова - Рамонь, 1995. -16с.

158. Федулова Т.П. Изоферментные локусы и нродуктивность сахарной свеклы / Т.П. Федулова, Т.П. Жуяокалова, А.В. Корниенко // Сахарная свек-ла.-№ 1.-1998. - 20-21.

159. Федулова Т.П. Применение белковых маркеров в селекции сахар- ной свеклы / Т.П. Федулова, СП. Митин // Сахарная свекла. - 2004. - К» 1. -С13-14.

160. Федулова Т.П. Полиморфизм 11S глобулина в изучении генома са- харной свеклы / Т.П. Федулова, СП. Митин // Генетика в XXI веке: совре-менное состояние и перспективы развития: Материалы Ш съезда ВОГиС,Москва, 6-12 июня 2004 г. - М., 2004. - С 300.

161. Филатов Г.П. Скрещивание растений сахарной свеклы с использо- ванием изоферментного контроля / Г.П. Филатов, Т.П. Федулова, Т.П. Жуж-жалова // Информ. листок № 105-90. - Воронеж: ЦПТП, 1990.-2с.

162. Филатов Г.П. Метод изоферментного контроля за чистотой линий культурных растений / Г.П. Филатов, Т.П. Жулокалова, Т.П. Федулова//Информ. листок № 16-92. - Воронеж, ЦПТИ, 1992. - 2с.284

163. Филатов Г.П. Теоретические и практические аспекты изучения ге- нетики и феногенетики изоферментов сахарной свеклы: Автореф. дис. ...канд. биол. наук / Г.П. Филатов - Новосибирск, 1993. -16 с.

164. Филатов Г.П. Изучение внутрисортовой изменчивости у сорта са- харной свеклы Рамонская 06 по изоферментным спектрам / Г.П. Филатов,Т.П. Федулова // Сахарная свекла. - 1995, №3. - 11.

165. Фоменко П.Р. Морфогенетические и цитоэмбриологические осо- бенности онтогенеза апомиктичных растений сахарной свеклы (Beta vulgais1..): Автореф. дис. ... канд. биол. наук/П.Р. Фоменко. -Рамонь, 2003. -24 с.

166. Хавкин Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е. Хав- кии // Сельскохозяйственная биология, 1997. - № 5. - 3-21.

167. Хавкин Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДПК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е. Хавкин//Сельскохозяйственная биология. - 2003. - № 3. - 26-41.

168. Хадлшнов М.П. Селекция перекрестноопыляющихся растений / М.И. Хаджинов, Б.А. Панпшн // Теоретические основы селекции. - Л., 1935.

169. Харечко-Савицкая Е.И. Метод нолучения семян при самоопылении аутостерильных рас свеклы / Е.И. Харечко-Савицкая // Докл. АП СССР, 1938.-Т. 18.-С. 469-474.285

170. Хворостов И.Б. ПЦР-анализ конверсии N-типа цитоплазмы в S-тип у сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / И.Б. Хворостов, Г. Венрев, СИ. Ма-лецкий, Г.М. Дымшиц // Докл. акад. наук. -1997. - Т. 357, № 4. - 572-574.

171. Хворостов И.Б. Сравнительный анализ молекулярных методов ти- пирования цитоплазмы сахарной свеклы (Beta vulgaris L.) / В.Б. Хворостов,А.Э. Дикалова, Г. Вепрев, СИ. Малецкий, Г.М. Дымшиц // Генетика. -1998. - Т.34, №5. - С 644 - 649.

172. Черкасова Н.И. Метод нолучения трансгенных растений, устойчи- вых к патогенам / И.И. Черкасова // Сахарная свекла. - 2003, J429. - С28.

173. Черкасова И.И. Иолучение растений сахарной свеклы, несущих ген дефензина редьки / И.И. Черкасова, Е.И. Васильченко, Т.И. Федулова, Т.И.Жужжалова // Сахарная свекла. - 2004. - № 7. - С 31

174. Чесноков Ю.В. ДИК - фингерпринтинг и анализ генетического раз- нообразия у растений / Ю.В. Чесноков // Сельскохозяйственная биология. -2005 .-№1.-С 58-63.

175. Чугункова Т.В. Изучение электрофоретических спектров глобули- нов семян для контроля гомозиготности линий сахарной свеклы / Т.В. Чугун-кова, О.В. Дубровная. В.И. Хризман, И.А. Шевцов // Цитология и генетика. -1992.-Т. 26, № 6 . - С 3 - 5 .

176. Шайхаев Г.О. Иабор реагентов для выделения ДИК из различного биологического материала / Г.О. Шайхаев // М., 2001. - 6 с.286

177. Шаюк Л.В. Исследование генетического полиморфизма рода Beta с помощью ПП-ПЦР / Л.В. Шаюк, Н.В. Роик, Ю.М. Сиволап // Гепом растений:Сб. тезисов IV Междунар. конф. 10-13 июня 2003 г., Одесса. - Одесса, 2003. -С. 43.

178. Шевцов И.А. Ирименение инбридинга у сахарной свеклы / И.А. Шевцов // Тез. докл. IV съезда генетиков и селекционеров Украины. - Киев,1981.-Ч. З.-С. 239.

179. Шевченко Т.Л. 1нформацшни технолог^' в селекцГГ цз^ровых бу- ряк1в / Т.Л. Шевченко, О.П. Папий // Фактори експериментально1 еволюц1Уорганизм1в. - КиУв: Аграрна наука, 2003. - 405 - 409.

180. Шелл Дж. Возникновение концепции гетерозиса / Дж. Шелл // Гибридная кукуруза. - М., 1955. - 28-72.

181. Шендеров А.И. Алгоритмы для быстрого выделения мутантов, раз- личающихся по электрофоретической подвижности ферментов / А.Н. Шен-деров, Е.В. Левитес, Л.И. Корочкин // Генетика. - 1978. - Т. 14, №6. - 999-1004.

182. Шурхал А.В. Уровни генетической дифференциации жестких сосен рода Pinus, подрод Piiius, по данным аллозимной изменчивости // А.В. Шур-хал, А.В. Иодогас, Л.А. Животовский // Генетика. - 1993. - Т. 29, №1. - 77-90.

183. Юсубов A.M. К методике нолучения тетранлоидной сахарной свеклы / A.M. Юсубов, Н.Р. Мосина // Сборник трудов ВНИИСС. - Воронеж.-1969.-Т.З .-С.29-53 .287

184. Baker W.W. Subunit structure and gene control of maize NADP - malate derydrogenase / W.W.Baker, B.Mintz // Biochem. Gen. - 1969. V. 2. - P.351-360.

185. Baranski R . Identification of beetroot genotзфes using rapd markers / R.Baransld, B.V.Ford-Lloyl, B.Mchalik, H.J.Newbury // Induced mutat andMd.Teclm. Crop Improv: Proc.Int.Symp.vunna, 19-23, June, 1995. -P. 570-572.

186. Bassiri A. Barley cultivor identification by use of isozyme electropho- retic potterus / A.Bassiri // Canad.J.Plant Sci. -1976. -V.56, №. l.-P.l.

187. Barzen E. An extended map of the sugar beet genome containing RFLP and RAPD loci / E.Barzen, W.Mechellce, E.Pitter, E.Schulte-Kappert, F.Salamini//Theor. and Appl. genet. -1995. - 90. - P. 189-193.

188. Bhatt G.M. Comparison of various methods of selecting parents for hy- bridization in common bread wheat (Triticum aestivum L.) / G.M. Bhatt // Austna-tion J. of Agricultural Research. -1973. - 24, №4. - P. 457-464.

189. Bodenschutz T.G. An evolution for genetic variation within maize in- bred lines maintained by sibmating and self pollination / T.G. Bodenschutz, W.A.Russel // Euphytica. - 1986. -35, №2. - P. 403 - 412.

190. Boseinark N.O. Neue Richtungen in der Zuchtungen in genetischmono- carper Zuckermbensorten / N.O. Bosemark // Biologia Buraka cukrowege. - War-szawa: PWN. - 1979. - S. 286 - 305.

191. Botstein D. Construction of a genetic map in man using restriction fragment length polymorphisms / D. Botstein, R.L. White, M.N. Skolnick // J.Hum. Genet, 1980. - 32. - P.314-331.

192. Bouchez D. Functional genomics in plants / D. Bouchez, H. Hoefte // PlantPhysiol. - 1998. - 118. - P . 725 - 732.

193. Bretted R.I.S. /R.I.S. Bretted, Dennis E.S., Scowcroft W.R.,.Pecock W.J. // Mol. and Gen.Genet., 1986. - Vol. 202. - P. 235-239.

194. Brockart W.F. Plan Defensins: novel antimicrobiol peptides as compo- nents of the host defense system / W.F.Drockan, F.R.G.Terras, B.P.A.Cammue,R.W.Osbom//Plant Physiol. -1995. - V.108. -P.1353-1358.

195. Brown A.H.D. / Brown A.H.D, Allard // Nature. - 1971. - № 232. - P.570.

196. Brunei D. An alternative rapid method of plant DNA extraction for PCR analysis / D.Brunel // Nucleic Acids Res. -1992, 20. - P. 4676.

197. Cardy B.J. Identification of soybean cultivars using isoenzyme electro- phoresis / D.J.Cardy, W.D.Beversdorf// Seed Sci. and Teclmol. - 1984. - 12, № 3.-P.943-954.

198. Chareyre Sandrine. The use of ELISA to guantitite the extent of US globulin mobihsation in untreated and primed sugar beet lots / S.Chare5a'e, Ker-sulec Alain, Job Dominigue, Job Cleaudette // C.r.Acad. Sci.Ser. 3. -1998. - 321,№ 8 . - P . 705-711.289

199. Chase S.S. Teclmigues for isolating monoploid maize plants / S.S. Chase // Ainer. J. Botany. - 1947. V. 34, №10. - P. 582.

200. Chase S.S. Monoploid freguencies in acommerical double hybrid maize in its component single cross hybrids and inbred lines /S.S. Chase // Genetics. -1949.-V. 34 .-P. 328-332.

201. Chawla H.S. // Plant Cell. Tissne and Organ Culture. - 1988, Vol. 12. - P. 299-304.

202. Douches D.S. Electrophoretic characterization of North American po- tato cultivars / D.S Douches, K. Ludlam // Am. Potato J. - 1991. - 45. - P. 220 -229.

203. Dudley J.W. Integrating molecular teclmiques into quantitative genetics and plant breeding. / J.W. Dudley // Quantitative genetics, genomics and plantbreeding: Ed.M.S.Kang. - Wallingford, UK, 2002. - P. 69-83.

204. East E.M. Heterozygosis in evolution and in plant breeding / E.M. East, H.K. Hayes // US Dept. Agri. Burean of Plant Industry. 1912. - Bull., N 243. - P.1-58.

205. East E.M. Heterosis / E.M. East // Genetics. 1936. - V.21, N4. - P. 331- 397.

206. Echt C.S. Genetic segregation of random amplified polymorphic DNA in diploid cultivated alfalfa /C.S. Echt, L.A. Erdalil, T.J. Me Coy // Genome. -1991.-35.-P. 84-87.

207. Edwards K. A simple and rapid method for the preparation of plant ge- nomic DNA for PCR analysis / K. Edwards, С Johnstone, C. Thompson // NucleicAcids Res. - 1991. - 19. - P. 1349.

208. Everett N.P. Plant Sci. - 1985. - Vol. 41. - P. 133-140. 29132O.Fedak G. Allozymes asaids to Canadian barley cultivar identification /G. Fedak // Eupliytica. -1974. - V. 23, N 1. - P. -166.

209. Francz P.F. Plant Cell Reports,1989. - Vol. 8. - P. 67-70.

210. Frova C. Haplodiploid gene expression in maize and its defection / C. Frova, M. Sarigorla, E. Ottaviano, C. Pella // Biochem.Genet. -1983. - 21. - N 9-10.-P. 923-931.

211. Fukuoka S. Use of random amplified polymorphic DNAg (RAPDg) for identification of rise accessions / S. Fuloioka, K. Hasaka O. Kamujima, // Jpn. J.Genet. - 1992. - 67. - P. 243 - 252.

212. Gaspar T.M. Cell and Tissue Culture in Forestry (Ed.J.M.Bonga et al.) / T.M. Gaspar, M. Couman // Dordechi: Martinus Nijlioff, 1987.- P.202-217.

213. Germeier C.U. Yhe international Database of Beta an Expert System for Beta Genetic Resources / C.U. Germeier, L. Frese // Proceedings of the 64* IIRBCongress, June 2001. - Bruges, 2001. - P. 123 - 132.

214. Ghaderi A. Multivariate analysis of genetic diversity for yield and its components in mung bean // Amer. Soc. Hortic. Sci. - 1979. - 104, №6. - P. 728 -731.

215. Goodman М.М. Genetic iden tipication of lines and crosses using isoen- zyme electrophoresis / M.M. Goodman, C.W. Stuber // Pros. 35 th Annu. corr andsorgluun, res conf. -1980. - V. 35. - P. 10-31.

216. Gorduan G. / G. Gorduan // Z.Pflanzuchtung. -1976.-Bd.76. -P.47-55.

217. Gorla M. Gene expression at the gametophytic phass in maize / M.Gorla, C.Frova, E.Ottaviano, C. Soave // Pollen: Biol. and Jmphc. Plant Breed.Proc. Syinp.- lake Garda, June 23-26 1982. - New Yorke e.a. -1983. - P. 323-328.

218. Gower J. Somme distance properties of latent roots and methods used in multivariate analysis / J. Gower // Biometrika. - 1966. - 53, №3/4. - P. 325 - 338.292

219. Gupta Р.К. Molecular mai-kers and their applications in wheat breeding / P.K. Gupta//Plant Breed. -1999. -118. -P. 369-390.

220. Hallden С Minicircle variation in Beta mitochondrial DNA / C. Hall- den, С Lind, T. Bryngelsson // Theor. and Appl. Genet. - 1989. - 77, №3. - P. 337-342.

221. Hansen M.. Error Rates and Polymorphism Frequencies for Three RAPD Protocols / M. Hansen, С Hallden, T. Sail // Plant Molecular Biology Re-porter. -1998, №16. - P. 139-146.

222. Henderson N.S. Intracellular location and genetic control of isozymes of NADF-dependent isocitrate dehydrogenase and malate dehydrogenase /N.S. Hen-derson// Ann. New York Acad. Sci. -1968. -V. 151, N 1. - P. 429-440.

223. Hess D. Uptake of DNA and bacteriophage into pollen and genetic ma- nipulation / D. Hess // Genetic manipulation with plant material. - 1973. - P. 519 -537.

224. Holloway A.J. Options available from start to finish-for obtaining data from DNA microarrays / A.J. HoUoway R.K., Van Laar, R.W. Tothill // J. NatureGenet. Suppl. - 2002, 32. - P . 481-489.

225. Hosaka K. Peroxidase isozyme in various tissues for discrimination of two tuberose Solanum species Jpn. / K. Hosaka, M. Matsubayasi, O. Kamijama //J. Breed. - 1985. - 35. - P. 375 - 382.

226. Hosal<:a K. Random amplified ро1утофЫс DNA markers detected in a segregating hybrids population of Solanum chacocnse x phurla / K. Hosaka, R.E.Hanneman // Jpn. J. Genet. - 1994. - P. 53 - 66.

227. Hu J. Identifrcation of broccoh and cauliflowercultivars with RAPD markers / J. Hu, C.F. Quiros // Plant Cell Rep. - 1991. - 10. - P. 505 - 511.

228. Huff D.R. RAPD variation within and among natural populations of outcrossing buffalograss Buchloe dactyloides (Nutt.) Engelm. / D.R. Huff, R.Peakall, P.E. Smouse // Theor. Allp Genet. 1993. - V. 86. - P. 927-934.293

229. Jassem M. Zabarwienie hipocotylu iaco kryterium identifikacji odmian buraka cukrowego Burak culcrowy I pastew / M. Jassem: Ref. Konf. - Bydgoszcz,20 -22 wrzes, 1995 // Biul. Inst. hod. I aklim. rosl. - 1997. -№202. - С 41 - 47.

230. Jatastara D.S. Genetic divergence in wheat under differentenviromental contions / D.S. Jatastara, R.S. Paroda // Cereal Res. Commun. - 1978. - 6, №3. -P. 307-314.

231. Javomic B. Random amplified ро1утофЫс DNA (RAPD) markers in buckwheat / B.Javomic, В.Кшир // Fagopyrum, 1993. - N 3. - P. 35-39.

232. Javomic B. Use of genetic markers in studies of common buck wheat / B.Javomic, В.Кшпр // Proc. 6th Int. Symp. on Buckwheat. Japan, 1995. -P. 141-147.

233. Jinks J.L. Biometrical genetics of heterosis / J.L.Jinlcs // Monogr. Theor. and Appl. Genet -1983. - 6. -P. 1-46.

234. Jones D.F. Dominance of lirked factors as a means of accounting for heterosis /D.F.Jones // Genetics. -1917. - V. 2, N 7. - P. 466-479.35O.Juce S. / Haploid bei Zucerrube / S. Jilce // Inaugural. Dissert. Univers.- Giepen. - 1973.

235. Jung. Electrophoretic investigalions on nematode resistant sugar beets / Jimg, Wehling, Zoplien // Plant Breed.(8 riicher Z. Pflanzenzucht). - 1986. - 97, N1.-P. 39-45.

236. Karini T.A. Studies on esterease isoenzyme pattom in anthers and seeds of male sterile wheats / T.M.Karim, S.L.Mehta, M.P.Singh // Z.Pflanzenziicht,1984, 93, N 4.-R 309-319.294

237. Каф А. DNA markers: А global overview / А. Karp: Eds. G. Caetano- Anolles, P.M. Gresshoff. // DNA markers: Protocols, applications and overviews. -N.Y., 1997.-P. 1-13.

238. Karp A. The new genetic era: Will it help us in managing genetic diver- sity? / A. Karp // Managing genetic diversity (Eds. J.M.M.Engls e.a.). - Rome,2002.-P. 43-56.

239. Katiyar R.P. Genetic divergence for morphological and guality determi- nans of yield in chickpea / R.P. Katiyar // Indian J. Agric. Sci. - 1978. - 48, №8. -P. 451-454.

240. Kawaguchi Kentaro. Tensai kenkyu kaiho / Kawaguchi Kentaro, Hako- yama Susmnu, Katagi Ikuo // Proc. Jap. Soc. sugar Beet Teclmology. - 1993. -№34.-P. 94-101.

241. Kay L.E. / L.E.Kay, D.V.Basile // Plant Physiol. -1987. - 84. -P.99-105.

242. Keller W. Inheritance of some major color types in beets / W. Keller // J. Agric. Sci. Res. - 1936. - V.52. - P.27 - 38.

243. Kimura M. Some models of neutral evolution, and the schifting balance process / M. Kimura // Theoret. Pop. Theory. - 1990. - V. 37, №1. - P. 150 - 158.

244. Koller B. Identification of apple cultivars using RAPD markers / B. KoUer, A. Lehmann, J.M. McDennott // Theor. Appl. Genet. - 1993. - 85. - P. 901-904.

245. Kubo Т. Alterations in organization and transcription of the mitochon- drial genome of cytoplasmic male sterile sugar beet (Beta vulgaris L.) / T. Kubo, S.Nisliizaw^a, T. Mikami // Mol. Gen. Genet. - 1999. - 262. - P. 283-290.

246. Lee S.J. Characterization of loci containing microsatellite seguences among Canadian wheat cultivars / S.J. Lee, G.A. Peimer, K.M. Devos // Genome. -1995.-38.-P. 1037-1040.

247. Levites E.V. Analysis of the activity and isozyme patterns of alcohol dehydrogenase in a poliploid series of maize/ E.V. Levites, T.I . Novojilova //Maize Genet. Coop. News Letter. - 1977. - V. 51.- P. 25-27.

248. Loarche Y. A comparative analysis of the genetic relationship between rue cultivars using RFLP and RAPD markers / Y. Loarche, R. Gallego, E. Ferrer //Euphytica. - 1996. - 88. -P. 107 -116.

249. Lorenz M. Cloning and sequencig of RAPD fragments amplified from mitochondrial DNA of male-sterile and male-fertile cytoplasm of sugar beet (Betavulgaris L.) /M. Lorenz, A. Weilie, T.Bemer // Theor. Appl. Genet. - 1997. - 94. -P. 273-278.

250. Lutz J. Tissue Culture in Forestry and Agriculture / J. Lutz, J. Wong et.al. // Ed.R.Henke et.al- New York: Plenum Press, 1985. - P. 105-116.

251. MaaP H.I. Infaspecific differentation of garhc (Allium sativum L.) by isozyme and RAPD markers / H.I. Maap, M. Klaas // Theor. Appl. Genet. - 1995. -89.-P. 89-97.

252. Mac Farlane J.S. Variety Development / J.S. Mac Farlane // Advances in sugar beet production: Principlesand Practics. The Jowa State University Press. -Jowa, 1971.-P. 402-435.

253. Maddock S.E. Cereal Tissue and Cell Culture / S.T. Maddock //(Ed.S.W.) Bright et al. Boston, 1985. - P. 175-205.296

254. Magassy L. Recent experimental results on self- incompatibility and self- incompatibility in beet (Beta vulgaris L.) / L. Magassy // Acta agron., Acad.Scieent. Himg. - 1965. - 13, №3/4. - P.241 - 262.

255. Maim V. A new Cytoplasmic male sterile genotype in the sugar beet (Beta vulgaris L.): a molecular analysis / V. Mann, L. Mclntosh, C. Theiirer, J.Hirschberg // Theor. Appl. Genet. - 1988. - 78. - P. 293 - 297.

256. Mandolino G. Restriction fragment length analysis of Mitochondrial DNA and breeding in Beta vulgaris / G. Mandolino, S. Cochi, P. Ranalli // Genet.Agr. - 1988. - V. 42. - P . 169-176.

257. Markert C.L. Multiple forms of enzymes: Tissue, ontogenetic and spe- cies specific patterns / C.L. Markert, F. Moller //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. -1959.-V.45.-P. 753-763.

258. Mita G. Assesment of the degree of genetic Variation in beet based on RFLP analysis and the taxonomy of Beta / G. Mita, M. Dani, P. Casciare, A. Pas-guali, E. Selva, С Minganti, P. Piccardli // Euphytica. - 1991. - V.55. - P. 1-6.

259. Mizue Yuka. Tensai kenkynkaiho / Mizue Yuka, Oohashi Shin - ichi, Ikeda Yoschitomo, Masuda Hirochi // Proc. Jap. Soc. Sugar Beet Technology. -1993.-№34.-P. 34-43.

260. Morikawa T. Isozyme polymorpliism in natural populations of Avena conariensis from the Canary Islands / T. Morikawa, I.M. Leggett // Heredity. -199O.-64,N3.-P. 403-411.297

261. Mullis К.В. Specific enzymatic ampHfication of DNA in vitro; the po- lymerase chain reaction / K.B. MuUis, F.A. Faloona, S.A. Scharf // Cold SpringHarbon Symp. Auant. Biol. - 1986. - 51. - P. 263-273.

262. Mullis K.B. Specific synthesis of DNA in vitrj via a polymerase catal- ized reaction / K.B. Mullis, F.A. Falloana // Methods Ensymol. - 1987. - 255. - P.335-350.

263. Nei M. Genetic distance between populations / M. Nei // Ibid. - 1972. - 106, №949. - P. 283 - 292.

264. Nei M. The tlieory and estimation of genetic distance / M. Nei // Genetic Structure of populations. - Honolulu: Univ. of Hawaii Press, 1973. - P. 45 - 54.

265. Nei M. Analysis of gene diversity in subdivided populations / M. Nei // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1973. - 70, №12. -pt. 1. - P . 3321 - 3323.

266. Nei M. A new measure of genetic distance / M. Nei // Genet. Distance. - N. Y.: Pleniun Press, 1974. - P. 63 - 76.

267. Nei M. Molecular population genetics and evolution / M. Nei. - N. Y.: Amer. Elsevier, 1975. - 238 p.393 .Nei M. The theory of genetic distance and evolution of human races /M.Nei //Jap. J. Num. Genet. -1978. - V.23, N 4. - P. 112-118.

268. Nesselhut T. Properties of glutamate dehydrogenase from Beta vulgaris /T. Nesselliut, G. Hamischfeger // Physiol. Plant. - 1980. - V.50. - P. 1-5.

269. Oliver J.L. A genetic classification of potato cultivars based on al- lozyme pattern / J.L. Oliver, J.M. Martinez - Zapater // Theor. Appl. Genet. -1985.-69.-P.305-311.

270. Olson M. A common languaye for the physical mapping of the hmnan genome / M.A. Olson, L. Hood, C. Cantor // Science. - 1989. - 248. -P. 1434 -1435.

271. Owen F.W. Inheritance of cross - and selfsterility in Beta vulgaris L. /F.W. Owen // J. Agric. Res. - 1942. - V.64, №12. - P. 679 - 698.

272. Owen F.W. Utilization of male - sterility in breeding superior - yielding sugar beets / F.W. Owen // Proc. Amer. Soc. Sugar Beet. Technol. - 1948. - V.5. -P.156-161.

273. Powling A. Species of small DNA molecules found mitochondria from sugar beet normal and male - sterile cytoplasms / A. Powling // Moll. Gen. Genet.- 1981.-V.183.-P. 82-84.299

274. Rasmussen J.O. Characterization of somatic hybrids of potato by us a of RAPD markers and isozyme analysis / J.O. Rasmussen, O.S. Rasmussen // Physiol.plant. - 1995. -93, N 2. - P. 357-364.

275. Raybold A.F. The genetic structure of Beta vulgaris ssp. maritima (sea beet) populations: RFLPs and isozyines show diiferent patterns of gene flow / A.F.Raybold, R.J, Mogg, R.T. Clarke // Heredity. - 1996. -V. 77, part. 3. -. - P. 245 -250.

276. Redtearr M. Instint. rech. bettera viems / M. Redtearr, M.J. Asher // Bmxelles, 1997.-P. 545.

277. Reiter R. PCR - based marker system. / R. Reiter // DNA -based mark- ers in plants: Eds. R.L. Pliillips, I.R. Vasil. Dordrecgt, 2001. - P . 9-29.

278. Ribaut J.M. Marker - assisted selection: new tools and strategies / J.M. Ribaut, D. Hoisington // Trends Plant. Sci.. -1998, 3. - P. 236-239.

279. Roder M.S. Abudance variability and chromosomal location of microsa- tellites of wheat /M.S. Roder, J. Plasclike, S.U. Konig // Mol. Gen. Genet. - 1995.- 2 4 6 . - P . 327-333.

280. Roberts D.R. Plant Cell Rep., 1989. - V.8. - P. 286-288.

281. Rogovsky P.M. // Genome / P.M. Rogovsky, K.W. Sherpherd. - 1992. - V. 35, №4.-P. 621-626.300

282. Roth E. Genetic variation in a inbred plant: Variation in tissue cultures of soybean Glycine max (L.) Menill. / E. Roth Jill, L. Frazier Barbara, R. ApuyaNeston, G. Kaii Hank // Genetics. - 1989. - 121, № 2.- P. 359-368.

283. Sagai-Maroof M.A. / M.A. Sagai-Maroof, K.M. Soliman, R.A. Jorgen- sen, R.W. Allard // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - V.81, № 12. - P. 8014-8018.

284. Santoni S. Rapid control of the cytoplasm of malesterile seed Strocks by means of a dot hybridization assay / S. Santoni, P. Faivre-Rampant, E. Morean, A.Berville // Mol. and Cell. Probes. - 1991. - 5, №1. - P. 1-9.

285. Savitsky V.F. Embriology of mono - and multigenn fixiits in the genus Beta L. / V.F. Savitsky // Proc. Amer. Soc. Sugar Beet. Technol. - 1950. -V.4, №6.-P.161-164.

286. Savitsky V.F. A genetic study of monogenn characters in beets / V.F. Savitsky//Proc. Amer. Soc. Sugar Beet. Teclmol. -1952. -V.7 -P.331 - 338.

287. Savitsky V.F. Genetische Studien und Zuchtungsmetoden bei Zucker- mben / V.F. Savitslcy // Z. Pflanzenzucht. - 1958. - Bd. - S. 1 - 36/

288. Scandahos J.G. Isozymes in development and differentitation / J.G.Scandalios // Ann. Rev. Plant Physiol. -1974. - 25. - P. 225-228.

289. Scandalios J.G. Molecular varieties of isozymes and their role in studies of gene regulation and expression during eukaryote development / J.G. Scandalios// Isozymes: Current topics in biological and medical research. - 1983. - V.9. - P.1-31.

290. Schen Yulong. Genetic relationships within and DNA seguencing - technigues / Yu. Schen, V. Ford - Lloyd Briaan, H. Newbury John // Heredity. -1998.-80, №5.-P. 624-632.301

291. Schondelmaier J. Integration of APLP markers in to a linkage map of sugar beet (Beta vuigaris L.) / J. Schondehnaier, G. Steinrucken, C. Jung // PlantBreed. - 1996. - 115. - P . 231-237.

292. Schondehnaier J. Genetic and chromosomal location of the 5Sr DNA locus in sugar beet (Beta vulgaris L.) / J. Schondelmaier, T. Schmidt, C. Jung //Genome. - 1997. - V. 40, №2. - P . 171 - 175.

293. Schulze A. Variability of an Austzo-Hungarian land race of barley to distinguish perennial ryegrass cultivars when sown in mixtures / A. Schulze, A.Steiner, P. Ruckenbauer // J. Agric. Sci. -1985. -104. - P. 1-9.

294. Schuti-e R. //Arch. Zuchtungsforsch. - 1988. -Bd. 18. - P.3-11.

295. Schwartz D. Genetic studies on mutant enzymes in maize synthesis of hybrid enzymes by heterozygotes / D. Schwartz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1960. - V. 46, № 9. - P. 1210-1215.

296. Schwartz D. The genetic control of alcogol dehydrogenase in maize gene duplication and repression / D. Schwartz // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1966.-V.56.-P. 1431-1436.

297. Schwartz D. Alcohol dehydrogenase in maize: genetic basis for multiple isozymes / D. Schwartz // Science. -1969. - V. 164. - P. 585-586.

298. Sedhnayer K. Rekurente selektion zur resiproke from binlinations fa- higkeit / K. Sedhnayer // Zuchter. -1957. ^27, № 2. - P.65-69.

299. Shah M.M. Comparisons of RPLP and PCR-based markers to detect ро1утофЫ8т between wheat cultivars / M.M. Shall, Y. Yen, K.S. Gill //Euphytica. - 2000, 114. -P. - 135-142.

300. Shenderov A.N. A rapid method of seeking freguency of alleles control- ling multimeric enzymes in plant population / A.N. Shenderov, S.I. Maletzky, E.V.1.evites // Maize Genet. CNL. - 1976. - V.50. -P. 54-55.

301. Shows T.B. Mitochondrial malate dehydrogenase and malic enzyme: mendelian inherited electrophoretic varians in the mouse / T.B. Shows, V.M.Chapman, F.H. Ruddle // Biochem. Genet. - 1970. - V.4, № 6. - P.707-716.

302. Shull G.H. The genotypes of maize / G.H. ShuU // Amer. Naturahst. - 1911.-V. 45,№2.-P. 234-252.

303. Steiger E. Isoenzyme der Phosphorylase in Beta vulgaris L. und ver- waiiter Arten / E. Steiger, W.O. Abel // Angew. Bot. - 1975. - Bd.49, № 3-4. -P.169-178.

304. Stein D.B. Isolation and comparison of bucleic acids from land plants: nuclear and organellar genes /D.B. Stein // Methods in Enzymology. - N.Y., 1993,224.-R 153-167.

305. Stim S. /. Stini, H.J. Jacobson // Plant Cell Rep. -1987. -V.6. - P.50-54. 30345O.Suiart D.A. Tissue Culture in For. and Agr. / D.A. Suiart, R.R. Ed,Henlce et al. // PlenumPubl. Соф., 1985. - P. 59-73.

306. Stuart D.A. / D.A. Stuart et al. // J.Plant Physiol. - 1988. - V.132. - P.134-139.

307. Stuber C.W. Synergy of empirical breeding, marker-assisted selection, and genomiesto increase crop yield otential / C.W. Stuber, M. Polacco, L.M. Sen-ior//Crop Sci. -1999, 39.-P.1571-1583.

308. Stuber C.W. / C.W. Stuber, R.H. Moll // Crop Sci. -1972.- Ш 12.-P. 337.

309. Swiecicki Wojciech K. Application of electrophoretic metliods of isozymes separation to genetical characterization of pea (Pisum sativum l.p. lat)cultivars / W.K. Swiecicld, B. Wolko // Genet, pol. -1987. -28. - P.89-99.

310. TaylorD.C. /D.C. Taylor /Planta. -1990. - V.181. -P. 18-26.

311. Terraus F.R.G. Small Cysteinerich Antifimgal Protlins from Radisk:Thei Rolt in Host Defense / F.R.G. Terraus, K. Eggepmont, W.F. Brekart //Plant Cell. -1995. - V. 7. - P. 573-588.

312. Told S. / S. Told, T. Kameya, T. Abe // Theor. and Appl. Genet. - 1990. -V.-80.-P. 588-592.

313. Topfer R. / R. Topfer, J. Gronenbom, J. Schell // Plant Cell Report. - 1989.-V. l . - P . 133-136.

314. Towsend CO. Single germ beet seed / CO. Towsend // Heredity. - 1915.-V.6.-P. 351-354.

315. Uphoff H. A genetic map of sugar beet (Beta vuigaris L.) / H. Uphoff, G. Wricke // Plant Breed. - 1995. - 111. - P. 355 - 357.304

316. Wagner Н. Are Beta prociunbens Chr. sm. and Beta Mog. differentspe- cies / H. Wagner, E.M. Gimbel, G. WricUe // Plant. Breed. - 1989. - V. 102, №1.- P . 17-21.

317. Wann S.R. et al. // IPC Teclm. Paper Science. -1988, V.2. - P. 1-10.

318. Welsh J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary premers / J. Welsh, M. McClelland // Nucl. Acids Res. -1990. - V. 18. - P. 1713-1718.

319. Westplial Lore. Genetiche Marker in der Zuchtung / L.Westphal //TASPO- Gartenbanmag. -1995. - 4, № 1. - P. 12.

320. Wijbrandi J. // Plant Sci. -1990. - V. 70. - P. 197-208.

321. Wright S. Systems of mating / S. Wright // Genetics. - 1921. - V. 63. -P. 111-129.

322. Wilde J. Genetic fingeфrinting of Theobroma clones using randomly amplified polymorphic DNA markers / J. Wilde, Wauge, Powelle // Theor. Appl.Genet. - 1992. - 83. - P. 871 - 877.

323. Wilkie S.E. Random amplified polymorpliic DNA (RAPD) markers for genetic analysis in Allium / S.E. Wilkie, P. Issac, R.J. Slater // Theor. Appl. Genet.-1993.-86.-P. 497-504.

324. WU L. / L. Wu, Y.T. King // Bot. Bull. Acad. Sinica. - 1979. - V. 19. - P. 171-178.

325. Van Geyt J. et al / G. Van // Theor and Appl. Genet. - 1988. - V. 76. - P. 577-586.

326. Vos P. AFLP analysis / P. Vos, H. Kuiper // DNA markers: Protocols, applications and overviews (Eds.G.Caetano - AnoUes. P.M. Gresshoff). - N.Y. -1997.-P.115-131.

327. Yang G.P. Comparative analysis of microsatellite DNA polymorphism in landraces and cultivars of rice / G.P. Yang, M.A. Maroof, C.G. Xu // Moll. Gen.Genet. - 1994. - 254. - P. 187 - 194.

328. Yang X. Identification and classification of celery cultivars with RAPD markers / X. Yang, C. Quiros // Theor. Appl. Genet -1993. -V.86. - P.205-212.305

329. Young N.D. A cantiously optimistic vision for marker - assisted breed- ing/N.D. Young//Mol. Breed. -1999, №5. -P.505-510.

330. Young N.D. Marker-assisted selection for soybean cyst nematode resis- tance / N.D. Young, J. Mudge // Plant resistance to parasitic nematodes (Eds. J.L.Starr e.a. - Wallingford, UK, 2002. - P. -414-252.

331. Yu K. Rapid estimation of genetic relatedness among heterogeneous populations of alfalfa by random amplification of bulked genomic DNA samples /K. Yu, K.P. Pauls // Theor. Appl. Genet. -1993. -V. 86. - P. 788-794.

332. Xu Y. Use of RAPD markers to screen somatic hybrids between So- lanum tuberosum and S.brevidens / Y. Xu, M.S. Clark, E. Pehu // Plant Cell Rep. -1993.-12.-P. 107-109.