Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение факторов регуляции транскрипции РНК-полимеразой II у дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение факторов регуляции транскрипции РНК-полимеразой II у дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи УДК 577 • 214

СИДОРОВА Юлия Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ ФАКТОРОВ РЕГУЛЯЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ РНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ II У ДРОЖЖЕЙ БАССНАЛОНХСЕЗ СОЮТЗХАЕ

оз. оо. оз - молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук '

Москва 1994

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики РАН (Москва) и в Центре изучения рака (Сиэтл) •

Научный руководитель:

доктор биологических наук В.Г.Никифоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Й.И. Толсторуков доктор биологических наук В.3. Тарантул

Ведущая организация:

Кардиологический Центр

Защита состоится " "¿.¿/¿Р//^" 1994 года в часов на заседании

Специализированного совета Д шт. 01 при Научно-исследовательском

институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (Москва, 1ый Дорожный проезд, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан '¿у,/" ¿£¿^>.1994 г. Ученый секретарь Специализированного совета:

кандидат биологических наук Щербакова В.И.

1ВЕДЕНИЕ.

исгуальность темы. Изучение регуляции транскрипции генов эукариот является |Дной из "горячих точек" современной молекулярной биологии. Особую хтуальность эта проблема приобрела в последние годы в связи с прояснением роли, юторую играет регуляция транскрипции в принятии клетками таких жизненно 1ажных "решений", как выбор между пролиферацией и дифференцировкой. Из ■рех РНК-полимераз, существующих в ядрах эукариот, РНК-полимераза IX ■обслуживает" наибольшее число генов, и именно транскрипция этих генов юдвержена наиболее разнообразной и координированной регуляции в ответ на ¡нешние и внутренние стимулы. Как правило регуляторные области генов, ■ранскрибируемых РНК-полимеразой IX состоят из двух частей. Это 1) ТАТА->лок, на основе которого формируется инициаторнын комплекс, включающий 'НК-полимеразу и общие факторы так называемого основного аппарата ■ранскрипции, 2) протяженные (порядка тысячи нукдеотидных пар и более) 'частки ДНК, насыщенные сайтами связывания белков регуляторов транскрипции. Связываясь с регуляторной областью, эти белки контактируют с основным шпаратом транскрипции, способствуя или препятствуя инициации. Основными тодходами к изучению функционирования регуляторных областейявляются внесение 1 них точечных мутаций, кнсерций и делеций, выделение отдельных элементов и томещение их в контекст гетерологичных промоторов, идентификация и анализ 5елков-регуляторов, связывающихся с этими элементами. Дрожжи-сахаромицеты, обладая удивительно сходной с высшими эукариотами организацией транскрипции 3НК-полимеразой II, представляют собой идеальную модель для изучения ее эегуляции, т.к. позволяют сочетать молекулярно-биологические подходы с зогатейшим арсеналом генетических методов.

Цель и задачи работы. Целью работы являлось изучение механизмов активации транскрипции у дрожжей-сахаромицетов. В работе ставились следующие задачи: 1) изучить влияние регулярных последовательностей поли (йА), поли (с1А-<ЗТ) и поли(ай-<1С), способных принимать альтернативные В-форме ДНКконформации,

на активацию транскрипции гена РН05 in vivo. 2) Изучить в опытах in vitr взаимодействие регуяяторных белков SWI4 и SWX6 друг с другом и с sei элементами регуляторной области гена НО, функционирующего в поздней Gl фаз клеточного цикла.

^аучнал новизна и практическая ценность работу. Показано, что встраивали регулярных последовательностей nonH(cLA-dT), нокеполи(<1А) и поли(dG-dC) внутрь астиваторной области гена РН05 приводит к существенному снижении уровня индукции его экспрессии. Установлено, что этот эффект связан с тем, чп поли (dA-dT) проявляет себя как эффективный ТАТА-блок, подавляющи! инициацию транскрипции на натнвном TATA блоке гена PHOS. Охарактеризован новый модулярный транскрипционный фактор, участвующий i активации транскрипции в Gl фазе клеточного цикла дрожжей, состоящий и: продуктов; генов SWI4 и SWI6. Установлено, что в этом комплексе SWI4 несе-функцию сайт-специфического связывания с ДНК, a SWI6 выполняет регуляторнук функцию. Идентифицировпан домен SHI4, обеспечивающий взаимодействие swi¿ со SWI6. Установлено, что этот домен не содержит известных мотивов, участвующих в белок-белковых взаимодействиях.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения материалов и методов, результатов экспериментов, обсуждения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на страница?

машинописного текста, включая таблиц и рисунков. Библиография включает источников русской и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Использованный в работе штамм дрожжей pho3 pho5 и плазмида с геном РН05 получены из лаборатории К. Г. Скрябина (ИМБРАН, Москва). Остальные дрожжевые штаммы и плазмиды взяты из коллекций ИМГ РАН (Москва) и Л. Бриден (Центр онкологических исследований, Сиэтл, США) .

В работе применялись стандартные методы конструирования рекомбинантных

ЩК, изложенные в Пособий Фрйч, Маяяатнс н Сэмбрук, 1988 . Сайт-яецнфический мутагенез кодирующей последовательности белка swie с помощью >лигонуклеотидов проводили в соответствии с рекомендациями пособия current protocols in Molecular Biology, 1987, Greene Ь Wiley Interscience. Работа с РНК, включая выделение, Northern блоттинг, si-картирование сайтов ишциации мРНК, также основывалась на этом пособии. Электрофорез с разделением топоизоМеров плазмид проводили по Keller, W. 1975, Proc. 4atl.Acad.Sci USA, 72:4876-4880 в агарозе с добавлением хлорохнна в концентрации 18 мкг/мл. Получение белковых экстрактов, содержащих активные белки SWI4 и SWI6 разработано в данной работе. Разделение ДНК-белковых комплексов в геле основано на Andrews t Herskowitz, 1989, Cell 57: 21-29. Иммунопреципитадая SWI4/SWI6 комплексов основана на Blackwood, Е. etal, 1992, Genes Dev 6: 71-80. Разделение белков в денатурирующем геле и Western блоттинг проводили на- основе стандартных ■ методик (Current protocols, и Harlow, Ё. and D. Lane, Antibodies. 1988,. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Получение фосфопептидных карт белков, меченых радиоактивным фосфором in vivo, проводили по руководству Boyle, W. et al, 1991, Meth. Enzynol, 201: 110-152.. Измерение активности кислой фосфатазы РН05 проводили согласно Nakao et al, МСВ 1986, 6:2613-2623.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Глава 1. Изучение роли топологии регуляторной области в активации транскрипции.

В регуляции транскрипции генов дрожжей участвуют комплексы белков, располагающихся на относительно протяженных участхах ДНК, называемых uas (upstreae activating sequence), и контактирующих друг с другом н с обшим аппаратом транскрипции на ТАТА-блоке. Тем самым, согласно общепринятому представлению, регулятерный'район гена имеет определенную пространственную

укладку (ДНК образует "петли"). Три фактора могут влиять на эту укладку: а] белок-белковые взаимодействия, б) ДНК-нуклеосомные взаимодействия и в) топология ДНК, например, наличие сверхспирализации. Мы предприняли попытк: оценить роль топологических свойств ДНК в активации транскрипции генов дрожжей на примере гена индуиибельной кислой фосфатазы - PHOS. UAS гена РН05 несена себе 4 фазированные, т.е. занимающие определенные участки ДНК, нуклеосомы и, как правило, неактивен. Индукция транскрипции гена PHOí происходит при истощении неорганического фосфата в среде и сопровождается существенным изменением топологии üAS - потерей всех четырех нуклеосом. Поскольку на каждой нуклеосоме фиксирован примерно один сверхвиток ДНК, потеря четырех нуклеосом означает высвобождение трех-четырех сверхвитков. Неизвестно однако, -что происходит с ними далее, и в какой форме они существуют. Мы задались вопросом, нельзя ли использовать регулярные последовательности ДНК в качестве зонда для анализа топологии UAS и ее роли в транскрипции. Этот подход был с успехом применен для оценки роли сверхспирализации ДНК в клетках прокариот. Он основал на том, что в сверхспирализованной ДНК регулярные последовательности обладают выраженными структурными особенностями. Длинные поли(йА) блоки, поли(<1А-<1Т) и поли (dG—dC) последовательности в ДНК с физиологическими значениями сверхспиральной плотности принимают альтернативные В-форме информации и при этом "поглощают* сверхвитки.

vas PHOS содержит два (-зео и -250 нп от ATG ко дона) сайта связывания белка-активатора PHQ4, а также сайт связывания бели РНОг (-286) , необходимого для активации наряду с РН04 (Рис. la). Делеционный анализ свидетельствует, что сайт -360 вносит наибольший вклад в уровень индукции промотора. Мы исследовали экспрессию гена РН05 в составе челночной плазмиды,' под контролем 5' регуляторной области в 540 н.п. начиная от старт-кодона. Этот участок содержит все детерминанты (см. выше), необходимые не только для регулируемой экспрессии гена, но и для нуклеосомных перестроек. В неиндуцибельных условиях локус -360 в UAS РНО открыт, а локусы -286 и -250

la

-540

-273 -100 +1

lb

pRTl pRTAT42 PUP

pho5

*

trp3—

.+ - + "

^¿im.'^.Siäi,,

.-.„-imV и

Рисунок l. А) Схема промотора PH05. Фазированные нуклеосомы представлены в виде эллипсов. 4 незакрашенных эллипса - нуклеосомы, удаляемые при индукции транскрипции. Заштрихованные прямоугольники - сайты связывания PII04, черный круг - сайт связывания РН02. -юо - положение ТАТА-блока. +1 - положение atg кодона. В положение -273 были встроены регулярные последовательности. В) Northern блот-гибридизация тотальной дрожжевой РНК, выделенной из штаммов, трансформированных плазмидой с нативным промотором - pRTl, плазмидой со вставкой (dA-dT)21 в положении -273 промотора - pRTAT42 и плазмидой со вставкой (dA-dT) 21 в положении -54 0 промотора - pUP. Стрелками отмечены РН05 и trpi транскрипты. Р( + и - соответствуют условиям высокой и низкой концентрации неорганического фосфата в среде.

покрыты нухлеосомой. Мы поместили в положение -273 OAS гена РНО регулярные последовательности (dG-dC)ю, (dA)98, (dA-dT)il, (dA-dT)21 С помощью измерения активности фоефатазы РН05 и определения уровня РНО мРНК методом блот-гибридизащш мы показали, что ни одна » последовательностей не стимулировала транскрипцию PHOS в отсутствие индукции В условиях активации транскрипции лить вставки (dA-dT) 21 и (da-dT)i влияли на uas, снижая уровень индукции промотора (Рис. 16, см например pRTi prtat42) Таким образом можно было думать, что поли(£1А-ат) каким-i образом влияют на нндуцибельность UAS. Мы заинтересовались, зависит л негативное влияние поли ( dA-dT) от положения этого блока в промоторе. Поэтов мы поместили (dA-dT)2i вставку в положение -540 промотора РН05, т.е. с S стороны UAS. Уровень индукции такого промотора оказался нормальным ( Рис .16 pup). Таким образом, для того, чтобы оказывать негативное. влияние i промотор, поли (dA-dT) должна находиться внутри uas.

1.2 аийность плазмид, несущих поли (dA-dT) в UAS РН05 не меняет по сравнению с контролем.

Плазмида, с которой экспрессируется ген PHOS, сконструирована наосно репликона так называемого двухмикронного кольца - эндогенной плазмщ дрожжей. Этот репликон, как правило, поддерживает число копий плазмиды ¡ уровне 50-100. В зависимости от условий уровень репликации плазмиды i соответственно, число копий может меняться. Мы сравнили копийность плазм; с поли (dA-dT) и без поли (dA-dT). Оказалось, что встраивание поли(ОА-Л блоков в состав плазмиды не влияет на ее копийность. Таким образом, негативн влияние поли (dA-dT) на продукцию РН05 мРНК отражает абсолютное изменен эффективности транскрипции и не опосредовано снижением числа копий плазми. с геном РНО5.

1.3 Влияние поли(dA-dT) на UAS РН05 не связано с переходом в крест и изменением плотности сверхспирализации.

Препараты плазмид, выделенных из дрожжей, так же как и препараты плазмидной ДНК из E.coli, представляют собой смесь топоизомеров с разным числом зацеплений ДНК. Пределы, в которых варьирует число зацеплений, обычно постоянны для данной плазмиды в данных условиях роста клеток, но могут различаться у разных плазмид. Например, если бы (dA-dT) 21 на плазмяде с геном РН05 принимали альтернативную информацию - крест, распределение топоизомеров этой плазмиды могло бы отличаться от распределения топоизомеров плазмиды без поли (dA-dT). Именно это происходит с плазмвдами, несущими пост (dA-dT) в слетках В.coll. Мы анализировали распределение топоизомеров плазмид с (dA-dT)21 и без (dA-dT)2l, выделенных m дрожжей, растущих в условиях индукции или репрессии гена РН05. В качестве контроля мы наносили на тот же гель плазмиду с (dA-dT) 21, выделенную из Е. coll. В первую очередь обратил на себя внимание тот факт, что плазмиднад ДНК, в зависимости оттого, .вдделена она из дрожжей или из E.coli, облвдает разным уровнем сверхсгшралнзации. Так, плазмиды, поддерживаемые в дрожжах, тлели гораздо меньшую плотность сверхспирализации (Рис. 2а, ср. треки 1-4 и 5). Кроме того, распределение топоизомеров плазмид с тршсхршщяотто активным или неактивным РН05 оставалось одинаковым и не зависело от присутствия поли(dA-dT) (Рис. 2а, треки 1-4 и «приведенные данные). Таким образом, состояние плазмид в дрожжах свидетельствует о том, что переход поли (dA-dT) в крест маловероятен. Тем не менее, поскольку переход поли (dA-dT) в хрест in vivo в принципе может и не сопровождаться сдвигом в распределении топоизомеров, мы воспользовались независимым подходом для выяснения роли этого перехода в негатн8номвлиянииполн(аА-ат) на транскрипцию. Для этого совершенный (dA-dT) 11 блок, встроенный в UAS, был заменен на дефектный, в котором две замены ■гамина на аденин сбивают регулярное чередование аденннов и тнминов. Эти замены очень незначительно меняют общий характер последовательности из 22

2а

pRTl pRTAT42

12 3 4

2b

pRTl pD«l pDelXT pGaJ. pGalAX

GAL - + + - + +

Pi + - + - •1- + - + + -

pbo5 ► trpi—

m

Рисунок 2. Л) Разделение топоизомеров плазмид pRTl и pRTAT42, выделенных из дрожжей, растущих в среде с низкой концентрацией фосфата (1-4) или из Е. coli (5). Препараты ДНК разделяли в агарозном геле с добавлением хлорохина в концентрации 18 мкг/мл. В этих условиях ДНК становится положительно сверхспирализо ванной, таким образом самые быстромигрируюгцие топоизомеры соответствуютсамой релаксированной ДНК в исходном препарате. После разделения ДНК переносили на фильтр и плазмиды детектировали с помощью блот-гибридизации с радиоактивным зондом. В) Northern блот-гибридизация дрожжевой РНК, выделенной из штаммов, трансформированных плазмидой pRTl, плазмидой с делецией участка UAS РНО от -540 до -273 - pDel, плазмидой с делецией UAS РНО и вставкой (dA-dT)2l - pDelAT, плазмидой со вставкой UAS gal вместо участка uas рно от г540 до -273 - pGal, и плазмидой с uas Gal и (dA-dT)21 - pGalAT. GAL + и - условия соответствуют присутствию и отсутствию галактозы в среде. Остальные обозначения сак на Рис. 1б.

нуклеотндных пар, но делают практически невозможным переход этой последовательности в греет. Мы показали, что мутированный поли(<1А-<1Т) блох оказывал такое же влияние na uxs PHOS, как а совершенный. Тсккы образом, негативное влияние nonH(dA-dT) на OAS РНС5 осуществляется без перевода этой последовательности в крест.

1.4 Анализ производных промотора РН05 согласуется с тем, что nonü(dA-dT) влияют на общий аппарат транскрипции.

Чтобы проверить, является ли влияние nojm(dA-dT) специфичным по отношению к UAS PHOS, юш оно распространяется a hí другие OAS, мы заменили фрагмент ДНК от -540 до -273, содержащий сайты связывания белков РН02 и РН04 на ÜAS дрожжевого гена gali. uas gal йхтивярустся, если в ергдз нет. глюкозы, но есть галактоза. Механизм его активация отличен от механизма работы UAS РНО. Сконструированный нами гибридный промотор с vas GAL и фрагментом vas РНО оказался под смешаным контролем - он активировался как в отсутствие фосфата, так и при добавлении галактозы в среду (Рис. 2б, pGAL). Мы далее встроили в положение -273 блок (dA-<M)2l. ГнСрндаый промотор с поян(dA-dT) вставкой (Рис. 26, pGALAT) во всех комбинациях условий среды практически не индуцировался. Таким образом, можно было думать, что mwia(dA-dT) блоки способны влиять на индукцию транскрипции разными и as . С другой стороны, столь же вероятно, что поли (dA-dT) действуют не на активацию транскрипции с помощью UAS, а на общий аппарат транскрипции - на компоненты шшцнаторного комплекса.

Чтобы проверить последнее предположение, мы сконструировали вариант промотора РН05, в котором фрагмент от -540 до -273 был делегировал (Рис. 26, pDel). Эта делеция (см. выше) удаляет практически весь uas PHOS за исключением сайта связывания трансактиватора РН04 в положении -250. Тем не менее оказалось, что такой промотор регулирует транскрипцию почти так же эффективно, как и интахтный промотор. Если затем в положение -273 в

промоторе с делецией встроить поли(dA-dT) блок, то промотор становится неиндуцибелышм, несмотря на то, что в этом случае поли(dA-dT) помещены в 5' положение от оставшегося интактным сайта связывания FH04 (Рис. 26, pDelAT).

Таким образом, nortH(dA-dT) в положении -273 промотора интерферируют с транскрипцией гена PHOS независимо от характера прилегающих последовательностей. Этот результат можно объяснить наиболее просто, если предположить, что поли (dA-dT) последовательность нарушает нормальную инициацию транскриптов гена РН05. Так например, поли (dA-dT) могли бы оттитровывать ТАТА-связываюгций белок, что предотвращало бы формирование инициаторного комплекса на нативном ТАТА-блоке. Чтобы проверить эту возможность, мы перешли к анализу инициации транскрипции гена РН05.

1.5 Поли (dA-dT) в промоторе РН05 нарушает правильную инициацию мРНК.

Мы провели S1-картирование стартов транскрипции мРНК гена PHOS. В гене с нативным промотором в условиях репрессии фосфатом инициация транскриптов не детектировалась. В условиях индукции мРНК инициировалась в положении -50 от ATG кодона, что соответствовало ранее опубликованным данным (Рис. 3, pRTi). Если в положение -273 промотора был помещен поли (dA-dT) блок, промотор сохранял индуцибельный характер активности, но мРНК при индукции инициировалась в области -250 -260 нп от АТГ. т.е. примерно за 30 нп от поли (dA-dT). Тот же эффект наблюдался, если в промотор была вставлена дефектная поли (dA-dT) последовательность (Рис. з, pRTAT42 и pRTATm). Промотор с делецией от -540 до -273 давал начало множественным конститутивным, случайно инициированным мРНК. Однако, в дополнение к этому в условиях индукции наблюдалась и правильная инициация мРНК (Рис. з pDeL и неприведенные данные). Встраивание поли (dA-dT) в такой промотор полностью подавляло как случайную инициацию, так и правильную, и приводило к конститутивной инициации транскриптов в области-250 -2 60 (Рис. з, pDelAT) .

Рисунок 3. si-картирование стартов РН05 мРНК из штаммов дрожжей, трансформированных плазмидами pRTl, pRTAT42, pDel, pDelAT, pRTATn. pRTATo соответствует плазмиде с дефектным поли(<1А-с1Т) блоком, встроенным в положение -273 UAS РНО (см раздел 1.3). С - мРНК, выделенная нз исходного, «трансформированного штамма pho3 pho5 -50 и -260 соответствуют положениям в промоторе, в которых инициируются нативные и поли (dA-dT)-зависимые мРНК, соответственно. Остальные обозначения как ранее.

3

и

а

CN

«? g

% g H 2

EH Ej © 0

tü Q о

а Qk ft Qt

+ - + - - + "

U

-260

-50

к -hin ml №» «Л|

Тагам образом, карткрованзе стартов транскрипции позволило сделать следующие выводы. Во-первых, поли(dA-dT) скорее всего действует как чрезвычайно мощный, доминирующий ТАТА-блок. В пользу этого говорит тот факт, что появление поли (dA-dT) а промоторе элиминирует все старты транскрипции, кроме поди (dA-dT)-зависимых. Во-вторых, поли (dA-dT) последовательность способна к консппутнвнойинициации транскрипции, однако, эта функция подавляется OAS РНО в неиндуцнбедьных условиях. Мы предполагаем, что в неиндущгбельньп условии VAS РНО работает как активный репрессор транскрипции, возможно, благодаря своей нуклеосомной структуре. Этим же ; вероятно объясняется в то, почему поли (dA-dT) не влияет на UAS РНО из положения —540. Нарушение структуры DAS РНО, например при делеции -540273, снимает репрессию и приводит к появлению неконтролируемой транскрипции. Наконец, следует отметить, что поли (dA-dT) в позиции -273 приводит к аномальной инициации тр&нскршггов в области сайта связывания белка РН04 (250). Скорее всего, это препятствует связыванию РН04 и тем самым нарушает функцию OAS.

Глава 2. Изучение факторов Gl/s специфической транскрипции дрожжей.

. Ген НО, кодирующий вндонуклеазуперсключеяия типа спаривания дрожжей-сахаромицетов является одним из наиболее изученных представителей группы генов, чья транскрипция зависит от стадии клеточного цикла. Ген НО не экспрессируется большую часть клеточного цикла гаплоидных клеток в резко активируется во время перехода клеток из Gl в S фазу в ходе так называемого Старта, т.е. момента, после которого в клетке необратимо запускаются репликация хромосом и последующий митоз. В последнее время выяснилось, что аналогичным профилем экспрессии обладают многие гены дрожжей н среди них гены Gl циклинов, чрезвычайно важных белков, являющихся регуляторными субьединицамя главной

кнназы клеточного цикла - CDC28. Стало складываться представление, что транскрипшм всех этих генов управляется единым механизмом. Транскрипция гена НО контролируется исключительно длинной (для дрожжей), в 1400 нп, регуляторяой областью. urs2 ( от upstream repressing sequence), ближний к TATÀ-блоку, занимает более 1000 нп и насчитывает и копий так называемого SCB элемента (cacgaaaa). SCB элемент отвечает за активацию транскрипции гена НО в поздней G1 фазе на Старте. Промоторы G1 циклинов также содержат SCB элементы. Генетический анализ показал, что для функционирования SCB элементов необходимо одновременное присутствие продуктов генов swi 4 и swi б. Кроме того, было показано, что конститутивная гиперэкспрессия гена swi 4 в клетке приводит к дерегуляции промотора НО и сверхпродукцин гена. Это позволяло думать, что SWIÂ является непосредственным активатором транскрипции. Вместе с тем, к моменту начала данной работы существовали считанные биохимические данные о роли белков SWI4 и SWX6 в транскрипции. Так, было показано, что экстракты кз дрожжевых клеток содержат S св-связывающий ф&ггор и что swi 4 входит в его состав. Таким образом, мы поставили задачей продолжить биохимическую характеризацюо белков 5WI4 в SWI6 в нх роля в G1 -спецнфичнон экспрессии SCB элементов гена НО. .

2.2 Связывание белков SWI4 в SWI6 с SCB элементами URS2 НО in vitro.

Для осуществления нашей задачи мы отработали метод получения экстрактов дрожжей, в которых SWI4 и SWI6 сохранялись в активном виде. Белковые экстракты яэ клеток дрожжей инкубировали с радиоактивно меченым фрагментом регуляторной области гена НО, содержащим 4 scb элемента. ДНК-белковые комплексы затем разделяли в акриламидном геле (Рис. 4а). Был зарегистрирован комплекс (4/6 на рис. 4а), формирующийся на ses элементах в экстрактах из клеток дикого типа и отсутствующий в экстр актах из svi4" или ewie" мутантов (Рис. 4а, треки 4, 7 и 8). Чтобы продемонстрировать специфичность данного комплекса, мы добавляли в реакционную смесь избыток немеченной ДНК, содержащей ннтагтный scb элемент или же scb с двумя точечными заменами.

к 5 9 OS ♦ ♦ ♦ + ♦

Ъ 3

§ Í *

3 s i § „

115?! 5 Ш i

i

i > < 5

t

I *

10 11 12 13 1«

Рвсуио* A> • В) Лшшtejua», шшмшаас!сSC® мементши метолом pupwtxu ДНК-бедеотх комплекс»» » дкркхдыядноы геле. Экстрдгты бйяко» ■) рщых отшмо» дрожжей ннкубкроили с ццметано меченым фрагментом ДНК, содерждщкм 4 SCB »лемента a кшоаш us 4% ддриминдкм* гаи. А) Трет i - t: экстр игт шз кяегос «кког» ттл. Треп 7 я »: •ссгрысш п «vt4* к «W«" ¿леток. Трека »но - 1«: »«rrptrrw ta »vi«' меток со e*ri4 под ковтролем гстеролопгелого ML промотор*. Трех • : «VI4 не мспрессяртетсд. Трек* 10 - SVZ4 саерхпредгцяруттсх. * VI, +tAA, «ДМ ахттеетспгхгг добшеякю » решшокую смес» орежккунаоб сьоорспся кжа кффжвво очяшвсшш двтттел прога 9VI4 ш mi«, coorat сиена?. -»сходы, ♦ слстм аттеегстеуют добдкдевы? . юо-крдтяого моддршого is^wtxí веыечеыого . овговтмеотадд. седержинего пггитяы* яяя мутероманый 8CS мвмеш, соот»етст»еяж>. 4/6 отмечигт подоженяе комплекс«, содерждщего svx< я swifc. Прямоугвльвш ■ ввфра 4 отмечиот нозшшю кдеыекбод, шоншкиших » pesyevm* саергородусига SHI4.

в} лвкдхз камшкссод, формяруемш ki scb »лемеити Гкорочеяяым од« (5Wl4-t>. Тки )■$-*: мстрдгг шз «wi4' штдыы*. саерхпрохупкруюшего 5vz4~t иод юнтгровеы axL ■ вромотор*, тред 3: истригг wj штдмш, схерхлродуцнруютего sm4-t. с. ь в i соответствует%о6*лпьнж»о i реакционную смесь 0,5 * i ки «доикно очищенных итпм протот swu. Осткльные обоиачеши ш нд рис. 44.

C) M*«t*rn блот-псвридгмша с депгтелдми протнд SWI4. 'Трек 2: юшунопрештитдт, полученный дипгтадмк против sw 14 m

жстрдкт» клеток дикого пси, смрхлродушруюши SVX4 под контролем CAL промотор«. Tpti 3: нммунопреикпктдт дкпстелдмя лротш» 8*14 и мстрдктд «vi«' клеток, сверхпродуцируюииа SWI4-t под контроле« gal промотор*. Цифры слей соответствуют мдркердм молекуддриого мед, » килоддльтондх.

D) блог-гнбридимияд с дктнтелдми протк» SWI6. Тред экгпшгг ну клеток, сверхпродуцируюшюг swií. Трех 2: мсстрдгг ю »wl6' меток. Трвкк Э я is »хстрдгт я» клеток дм кого ткпд, сверхлродуикрующнх swx« к Я) смрхпродгикр/юших 8WI4-t, соотмтспенно. Треки 4, яммуяопрелнпктсты игпггеддмн орот«* snn* «j wrpmo» тех же клеток. Трек 7: кммунопреихпкпт дкгнтелдии аропи WZ4 « метр «хтд i 4' клеток, iq стиечдгт ооложенме кммуиогяобуяян! коториК яеслеюфкчйО яродииется ид 6доп. Подожевке белкоаых м«ркеро> мояесулхрного исд отмечено слрды.

. ti

tiff

I 3 i

•1

tÍ х

¡I I

.¡¡.AwbuVi l|l

t ( i i t

100 n

Ы . Мк-мш 10 a i < i « f

%

Лишь интакпшй SCB был способен конкурировать за связывание белков с меченым фрагментом ДНК, что выражалось в уменьшении количества комплекса с меченой ДНК в геле (треки 5 и 6). С помощью антител к белкам SWI4 и SWI6, полученных в лаборатории, мы показали, что данный комплекс содержит и SWI4 и SWI6 (треки 1-3).

Нам удалось реконструировать SCB-специфичный SWI4/SWI6 комплекс, прибавляя очищенный SWI6 белок, продуцированный в Е. coli, к экстракту клеток, не имеющих SWI6 (данные не приведены). В то же время очищенный SWI6 не обладал сайтспецифической ДНК связывающей активностью. А именно, несмотря на то, что наш препарат SWI6 обладал слабой способностью связываться с ДНК, нам не удалось показать, что возникающий комплекс обладает какой-либо избирательностью по отношению х последовательности ДНК. Таким образом, и SWI4 и SWI6 необходимы для формирования SWI4/SWI6 комплекса на ДНК, но функция сайтспецифичесхого узнавания ДНК осуществляется либо SWI4, либо обоими белками в комплексе.

2. з Анализ укороченного SWI4.

Ранее в лаборатории был клонирован мутантиый вариант гена SWS 4-, который ходирует белковый продукт, укороченный с С-конца на 279 аминокислот. Этот белок, SWl4-t, сверхлродуцированный в клетках дрожжей с плазмнды под контролем индуцибельного gal промотора, оказался способным комплементнровать swi4' мутацию в геноме, восстанавливая swi' фенотип. В то же время, если в swi4" клетках экспрессироватъ swi4-t на низком уровне, то восстановления SWI* фенотипа не происходит. Таким образом, укороченный SWI4, по всей видимости, является частично дефектным. Мы поставили задачей изучить биохимическую природу этого дефекта. Используя экстракты из штаммов дрожжей, сверхпродуцирующих swi4-t, мы показали, что укороченный белок неспособен формировать SWI4/SWI6 комплекс (Рис. 4б, треки з и 4). В то же-время нам удалось обнаружить новый SCB специфичный комплекс, содержащий swi4-t и не

нуждающийся в (положение комплекса отмечено звездочкой на рис. 46, см треки 5-9). Тем самым, функция сайтспецифичгсхого узнавания ДНК по-видимому полностью принадлежит гнх4. Мы проверили также ДНК связывание варианта БИХ4, укороченного лишь на 149 аминокислот, и получили аналогичный результат, причем образующийся комплекс обладал., соответственно, меньшей подвижностью, чей комплекс с ДНК. Мы далее проанализировали

комплексы, формирующиеся на ДНК в экстрактах с повышенным содержанием полноразмерного ЗИХ4 в отсутствие ЗМ16. Оказалось, что в этих условиях БМХ4 также способен специфично связываться с ДНК (Рис. 4а, треки 9-14). Однако, в этом случае образуется целый набор минорных комплексов с подвижностью гораздо большей, чем подвижность комплекса укороченного с ДНК (положение в

геле отмечено прямоугольником на рис. 4а). Если к экстракту а«1б" клеток с повышенным содержанием полноразмерного 5Н14 перед инкубацией с меченой ДНК прибавить очищенный 5ИХ6, то чрезвычайно эффективно сформируется ЗЫ14/5И16 комплекс, в то время как минорные ЭИ14 комплексы практически не исчезнут (данные не приведены). Это свидетельствует о том, что 5И14/ЗЫ16 комплекс формируется ве на основе зсв-саязанного 5М14, присутствующего в минорных комплексах.

Анализ комплексов, образуемых на ДНК ем14 и его укороченными производными в отсутствие $И1б позволил нам сделать ряд предположений.

Во-первых, на основании подвижности минорных комплексов можно заключить, что они содержат не полноразмерный ЗМ14, а, скорее всего, его 11-концевые протеолитические фрагменты, более короткие, чем Следовательно,

полноразмерный гИ14, в отличие от 5И14, укороченных на 279 или на 149 аминокислот с С-конца, скорее всего не способен связываться с ДНК без £5*16. Во-вторых, из относительных количеств 5М14/5я16, минорных БМХ4 и комплексов с ДНК следует, что ЗИ14/£И16 связывается с ДНК гораздо более эффективно, чем БМ14-Ъ или более короткие Н-концевые фрагменты Б*)14. В то же время SWI4-t более эффективен в ДНК-связывании, чем более короткие . фрагменты ЭТП* в/ила концентрации 5И14^ в экстрактах значительно выше

концентрации SWI4. Последнее может достигаться, если SWi4-t почему-либо стабильнее swx 4.

2. з Анализ ассоциации между SWI4 и SWI6.

Результаты, изложенные выше, можно интерпретировать по-разному. Либо swi4-t не способен физически ассоциировать со SMI6, либо swi4-t/swi6 комплекс образуется, но не связывается с ДНК и тем самым не регистрируется в нашем эксперименте. Чтобы разрешить эту проблему, мы использовали альтернативный подход. Антителами против SWI4 из экстрактов нммунопреципитировали swi4-содержащие комплексы белков, затем разделяли кммунопреципитаты на две аликвоты и методом Western блоттинг-гибридизацин детектировали в них SWI4 или SWI6. Оказалось, что SWI6 ко-иммунопреципитирует с полноразмерным SWI4 (Рис. 4d, трек 4), но не содержится в иммунопреципитатах swi4-t (трек 6). Таким образом, отсутствие С-концевых аминокислот SWI4 предотвращает его ассоциацию со SWX6. В то же время оказалось, что содержание swi4-t в экстрактах по крайней мере на порядок выше содержания SWI4 (Рнс. 4с, треки 1 и 2). Поскольку оба белка экспрессируются в дрожжах с идентичных плазмид, можно предположить, что укороченный SWI4 более стабилен.

2.4 С-концевой домен swi 4 является необходимым и достаточным для ассоциации cswi6.

Чтобы проверить, является ли С-конец SWI4 необходимой и достаточной" детермннантой для связывания со SWI6, мы сконструировали гибридный белок, в котором С-концевые 259 аминокислот SWI4 были присоединены к ДНК-связывающему домену белка GAL4 (GAL4-C259). Экстракты дрожжей, экспрессирующих этот белок, анализировали инкубацией с меченым фрагментом ДНК, содержащим 17 н.п. сайт узнавания GAL4. Оказалось, 4TOGAL4-C259 при наличии SWI6 в экстракте действительно образует на 17 нп сайте комплекс, в который входит SWI6. Таким образом, С-концевые 259 аминокислот swi4

; являются достаточной яэтерминантой для ассоциации со SWI6. Получив этот результат, мы попытались более точно локализовать участок С-конц& swi4, ; ответственный за ассоциацию. Для этого мы разделили С-концевой домен примерно ; надвое, сконструировав два GAL4-SWI4 гибрида, несущие 114 и 145 аминокислот : SWI4. Ни один вз них, однако, не образовывал на 17 нп сайте комплексы с участием SWI6. Можно думать, что избранным нами делением С-концевого домена мыв действительности нарушили участок связывания SKI 6, однако, возможны и ' другие объяснения этого результата. Следует отметить, что £К1б-связывающий : домен SWI4 не содержит известных мотивов белок-белкового узнавания и таким образом представляет собой домен нового типа .

г.5 Роль SWI6 в составе SWI4/SWIб комплекса.

На основании наших результатов (см. разделы 2.1 к 2.2) можно ; заключить, что SWI6 не вносят воад в сайтспецифическое узнавание ДНК. В то же время не исключено, что SWT6 каким-то образом способствует связыванию SWI4 с ДНК. Чтобы оцепить роль S>fI6 в составе SWI4/SWI6 комплекса, мы изучили свойства двух мутантов SWI6.

В аминокислотной последовательности swie привлекают внимание два мотива. Один из них - уч&стос, способный складываться в альфа спираль с расположением лейциновых остатков на одной стороне спирали. Известно, что подобные структуры. способны димеризоваться с образованием так называемой лейциновой молнии. Другой из них представляет собой достаточно вырожденный повтор из 33 аминокислот с несколькими вполне консервативными остатками в центральной части. Этот мотив встречается у самых разных белков, например, у активатора иммуноглобулиновых генов NFitB, у регулятора эмбриогенеза дрозофилы белка Hotch, у мембранного белка анкирина, и, соответственно, описан под разными названиями - анкириновый повтор, БИб-яовтор, TPLH-повтор (последнее основано на четырех наиболее консервативных аминокислотных остатках в повторе, и мы будем придерживаться этого названия). В ряде случаев показано, что TPLH-повтор участвует в белок-белковом взаимодействии.

Мы начали изучение свойств 5И1б, мутированного по описанным выше аминокислотным мотивам. В белке энхб-Л мы заменили по 3 консервативные аминокислоты в двух ГРШ-повторах экгб на алашшы. Белок БИГб-ьг был ранее сконструирован в лаборатории, и имеет деяещпо всей лейцкновой молнии. Оба мутанта были экспресснрованы в вч1б' штамме, мутантные белки продуцировались на том же уровне, что и дикий тип. В то же время оказалось, что я 5ИХ6-А и г\Пб-ьг нефункциональны, т.е. не способны активировать транскрипцию НО. В экспериментах по коиммунопреципитации было продемонстрировано, что и 51« б-А и 51/1 б-ьг прештнтируют вместе со ЯМ! 4, т.е. ассоциация между мутантными ЭИ16 и не нарушена. Однако, анализ ДНК связывания показал, что

51*14/8Н15-А комплекс связывается с 5СВ элементами значительно хуже, чем нормальный комплекс, а 5Н14/5Н1б-Ь2 не связывается с ДНК

вообще. Таким образом и в том и в другом случае причиной нефункциональкости , мутанткых можно считать нарушение взаимодействия с ДНК.

Эти данные свидетельствуют о том, что 5К14/5И16 комплекс может существовать в клетке в свободном виде, вне связи с ДНК. Более того, несмотря на то, что этяхб сам по себе не является сайтспецифичным ДНК связывающим белком, он способен влиять на эффективность узнавания ДНК своим партнером гИ14. Таким образом 8Я14/£М16 комплекс представляется нам модулярным транскрипционным фактором, состоящим как минимум из двух субъеднннц - ДНК связывающей и регуляторной.

2.6 Активность 5И14/ЗИ1б комплекса в клеточном цикле.

йсв элементы транскрипционно активны только в поздней фазе клеточного цикла в момент реактивация юшазы сос28, ответственной за прохождение Старта клеточного цикла. Механизмы этой цихлоспецифичнойтранскрипции до сих пор не установлены. Тем не менее, господствующая точка зрения, основанная на целом ряде косвенных данных, связывает ахтивацию эсв элементов с активацией комплекса СОС28 и циклинов. В таком случае связь эта должна осуществляться через 5»14 и/или БШб, т.к. именно эти факторы взаимодействуют с зев

элементами и отвечают за их активность. Мы предприняли попытку идентифицировать цихлоспецифичную функцию swi 4/sw 16 комплекса. С этой целью мы приготовляли экстракты из культур клеток, синхронно проходящих клеточный цикл. Синхронизаци. клеток производили с помощью альфа фактора -феромона спаривания дрожжей. Добавление этого феромона в культуру вызывает временный арест клеток в фазе, непосредственно предшествующей Старту. Последующая отмывка феромона приводит к тому, что в течение зо минут все клетки культуры одновременно проходят Старт и далее за 80 минут завершают полный клеточный цикл. Синхронность культуры обычно сохраняется в течение двух-трех циклов. Аликвоты синхронно делящейся культуры клеток отбирали через каждые 10 минут на протяжение одного клеточного цикла. Далее из аликвот приготовляли экстракты, в которых анализировали ассоциацию между SWI4 и SWI6 и взаимодействие этого комплекса с SCB элементами. Оказалось, что комплекс SW14 и SWI6, равно как и его SCB-связывающая активность детектируются на всех стадиях клеточного цикла, несмотря на то,, что swi4/swi 6-зависимая транскрипционная активность присутствует только в поздней G1 фазе клеточного цикла. Из этого результата следует, что механизм, отвечающий за циклоспецифичную транскрипционную активность SWI4/SWI6 комплекса должен действовать на уровне регуляции его активационного потенциала. Например, SWI4 и/или SWI6 могли бы фосфорилироваться перед Стартом клеточного цикла, что приводило бы к активации комплекса, в остальное же время клеточного цикла комплекс мог бы быть неактивен.

2.8 Изучение фосфорилнрования swi6 in vivo.

Изложенные выше соображения привели нас к изучению фосфорилнрования swi4/swi6 комплекса in vivo. Аминокислотная последовательность обоих белков содержит несколько потенциальных сайтов фосфорилнрования киназой cdc28. В случае swi6 эти сайты (4 сайта) встречаются только в N-концевой области белка, где они тесно сближены, что, возможно, указывает на их функциональную важность. Мы инкубировали культуры дрожжей с радиоактивным ортофосфатом,

приготовляли из них экстракты и иммунопреципитировали SWI4 и SWI6. Оба белка эффективно фосфорилировались. Мы далее сосредоточились на SWI6 и показали с помощью анализа фосфоаминокислог, что SWI6 фосфорилирован in vivo по сериновым и в меньшей степени треониновым остаткам. Фосфоршгарованный SWI6 однако, присутствует в клетках на всех стадиях клеточного цикла, а также в состоянии ареста альфа фактором в G1 фазе и в условиях инактивации CDC28 в штаммах с температурочувствительными аллелями этого гена. Таким образом, если у SWI6 существуют регулируемые сайты фосфорилирования киназой CDC23, то их вклад в содержание фосфатов на белке, возможно, "маскируется " присутствием конститутивных сайтов фосфорилирования. В связи с этим мы обратились к анализу состояния индивидуальных сайтов фосфорилирования SW16, изолированного из клеток на разных стадиях клеточного цикла, Для этого мы иммунопреципитировали SWI6 из клеток, меченых радиоактивным ортофосфатом и получали фосфопептидные карты SWI6. Оказалось, что SWI6 действительно фосфорилирован по нескольким сайтам, большинство из которых является конститутивными. Тем не менее, по крайней мере два разных фосфопептнда отсутствуют на карте SWI6, изолированного из клеток, арестованных альфа фактором в G1 фазе (Рис. 5 а и б, дифференциально фосфорилированные пептиды отмечены стрелками). Если "позволить" таким клеткам пройти Старт, фосфорилирование этих пептидов восстанавливается. Эти же пептиды, являющиеся преобладающими у SWI6 из несинхронной популяции клеток, фосфорилированы гораздо менее эффективно, когда клетки "застревают" перед Стартом в результате инактивации CDC28. Таким образом, мы обнаружили в составе SWI6 пептиды, не фосфорилирующиеся в G1 фазе перед Стартом и быстро фосфорилирующиеся после или во время его прохождения.

Мы провели серию переваров дифференциально фосфорилированных пептидов специфическими протеазами, что позволило сделать предсказания об их аминокислотной последовательности, а также установили, что оба пептида фосфорилированы по серину. Далее мы получили фосфопептидные карты мутантных SWI6 с заменами серинов в наиболее вероятных сайтах фосфорилирования на

в

а в

liISi : А ; ■ ' ■ ' . ' Vi

< sé «г _ ъ * + +

tíí

Рисунок 5. Карты триптичесих'фосфопептидов SWI6, меченого ортофосфатом in vivo. Петиды SWI6 были нанесены на хроматографическую пластину в точках/ отмеченных знаками + и разделялись электрофоретически б горизонтальном направлении и хроматографически в вертикальном направлении. A) SWI6, изолированный из экстракта делящихся клеток. В) SWI6, изолированный нз экстракта клеток, арестованных альфа фактором в поздней G1 фазе перед Стартом клеточного цикла. Стрелками отмечены дифференциально фосфорилирующиеся пептиды.

нефосфорилируемые аминокислоты- Мы показали, что дифференциально фосфорилированные пептиды представляют один и тот же сайт, где фосфо р илиро ван серии 160 в составе одного их четырех консенсусов для CDC28 киназы. Таким образом, данная еиназа или киназы со схожей специфичностью дифференциально фосфорилируют swi6 in vivo. В настоящее время мы, однако, не знаем роли, которую играет это фосфорилирование. Оно могло бы быть частью процесса активации SHI6 в момент Старта, и тем самым должно преобладать лишь в клетках, проходящих Старт. С другой стороны, оно может участвовать в инактивации SWI6 после Старта и, таким образом, присутствовать во все время клеточного цикла кроме Gl фазы. Для решения этого вопроса необходимы исследования статуса фосфорилирования SWI6 во время прохождения синхронных клеточных циклов.

ВЫВОДЫ.

1. Встраивание регулярных последовательностей поли(dA-dT), но не поли(<1А) или noflH(dG-dC) внутрь регуляторной области гена PHOS снижает эффективность его экспрессии. Эффект не связан со способностью поли (dA-dT) переходить в альтернативную информацию. Результаты s1 картирования свидетельствуют, что поли (dA-dT) вызывает смещение стартов транскрипции из положения -50 от ATG в положение -260-250. Тем самым noflH(dA-dT) выполняет функцию ТАТА-блока, использование которого оказывается предпочтительнее, чем использование нативного ТАТА-блока.

2. В белковых экстрактах клеток дрожжей присутствует комплекс белков SWI4 и SWI6, связывающийся с SCB элементами регуляторной области гена НО. Связывание SWI4 с SWI6 обеспечивается С-концевыми 259 аминокислотами SWI4 . В комплексе SWI4 отвечает за специфичное связывание с ДНК, а SWI6 является регуляторной субъедйницей.

3. swi4/swi6 комплекс и его взаимодействие с scb элементами обнаруживается на протяжение всего клеточного цикла, несмотря на то, что in

vivo swi4 / swx6-зависимая транскротционная активность scb элементов проявляется только в поздней G1 фазе митотического цикла.

4. swi4 и swie фосфоршшруются in vivo. smi6 фосфорилирован по нескольким сериновым и треониновым остаткам на протяжение всего клеточного цикла. Однако, в составе swi6 есть по крайней мере один сайт, который фосфорилируется дифференциально. Это S160 в составе аминокислотной последовательности, соответствующей консенсусу для киназы cdc2 8. Фосфорилирование по этому серину отсутствует у swx6 в клетках, пребывающих в g1 фазе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Сидорова, Ю.М., Е.Н. Кистанова, Б.К. Чернов, М.А. Эльдаров, К.Г. Скрябин, В.Г. Никифоров, С.М. Миркин (1990). Встраивание (dA-dT)n блоков в регуляторную область гена РН05 нарушает его экспрессию. Молекулярная биология, т. 24, стр. 163-172

2. Sidorova, J. Mikesell, G. and Breeden, L. (1992). The mechanism of START-dependent transcription in S. cerevisiae. Abstract, The Cell Cycle , Cold Spring Harbor Meeting.

3. Sidorova, J. and Breeden, L. (1993). Analysis of the SWI4/SWI6 protein complex, which directs Gl/S-specific transcription in Saccharomyces cerevisiae. Mol. Cell. Biol. 13: 1069-1077.

4. J. Sidorova, G. Mikesell and t. Breeden. (1993). The role of SWI6 in START-specific transcription in S. cerevisiae. Yeast Genetics and Molecular Biology Meeting, Madison, Wisconsin.

Технический редактор О.П. Громова

Подписано в печать 27.04.94. Формат 60x84/16 Уч.-изд. л. 1,2. Тираж 100. Заказ 78

Отпечатано ■ РИД «Курчатовский институт» ' 12318-2; Москва, -пл.-АмадемихвКурчатова