Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии генов, вовлеченных в модификацию жирных кислот, на экспериментальных моделях

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии генов, вовлеченных в модификацию жирных кислот, на экспериментальных моделях"

На правах рукописи

Шимшилашвили Христина Романовна

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В МОДИФИКАЦИЮ ЖИРНЫХ КИСЛОТ, НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ

Специальность 03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2010

004603483

004603488

Работа выполнена в группе геномики растений Отдела геномики Учреждения Российской академии наук Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, доцент Ирина Васильевна Голденкова-Павлова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент

Ольга Александровна Огаркова

доктор биологических наук, Елена Викторовна Дейнеко

Ведущая организация:

Кафедра генетики биологического

факультета

Московского

государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «ОЪ» илоИ«5 2010 г. в Yi-OQ часов на заседании диссертационного совета Д 002.214.01 при Учреждении Российской академии наук Институте общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Губкина, д. 3. E-mail: iogen@vigg.ru Факс: (499) 132-89-62

Автореферат разослан "-2.Ф " _2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Т.А. Синелыцикова

1. Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Абиотические стрессы, такие как засуха, засоление, экстремальные температуры - первопричина уменьшения урожая (Воуег, 1982; Bray et al., 2000). Воздействие стрессовых факторов приводит к серии морфологических, физиологических, биохимических и молекулярных изменений, которые негативно сказываются на росте и продуктивности растений. Для сохранения роста и продуктивности растения должны адаптироваться к стрессовым условиям и включить специфические защитные механизмы. Механизмы молекулярно-генетического контроля толерантности растений к абиотическим стрессам основаны на активации и регуляции специфических генов. Эти гены вовлечены в целый каскад последовательных ответов на стресс, таких как восприятие и передача сигналов, активация транскрипционных факторов, защита мембран и белков, удаление свободных радикалов и токсических компонентов. Большой успех в области исследований стрессовых ответов растений на воздействие стрессовых факторов достигнут с использованием методов молекулярной генетики, которые позволили идентифицировать многие гены, индуцирующиеся во время стрессов. Особое место в этом занимают трансгенные растения, в которых «включаются» защитные механизмы за счет переноса и экспрессии гетерологичных генов, кодирующих функциональные гомологи растительных белков (Kuromori et al., 2009; Piruzian et al., 2006). Трансгенные растения использованы и используются в настоящее время для детального функционального анализа генов стрессового ответа и выяснения физиологической роли их белковых продуктов. Другой основной прорыв в области исследования механизмов стрессового ответа растений последовал в 2000 году после расшифровки генома Arabidopsis thaliana. Эта геномная информация позволила провести мониторинг профиля экспрессии для всех предсказанных генов. Несмотря на значительные успехи, наши познания механизма стрессового ответа на уровне целого растения еще весьма ограничены. Так, идентификация сенсоров и сигнальных путей стрессовых стимулов, понимание молекулярных основ взаимодействия между стрессами различного происхождения, идентификация ключевых факторов, связующих стрессовый ответ и процессы развития, выявление долговременных ответов у растений при множественных стрессовых условиях в природе, остаются первоочередными научными задачами. Решение этих научных задач необходимо для создания полной картины молекулярно-генетических механизмов стрессовых ответов у растений и применения полученных знаний для биотехнологического использования. Таким образом, для решения вышеизложенных задач необходимо создание новых экспериментальных моделей трансгенных растений, экспрессирующих гены, продукты которых могут участвовать в механизмах стрессового ответа растений. В частности, важное значение приобретают исследования по определению физиологической роли генов десатураз - ферментов, отвечающих за образование двойных (С=С) связей в цепях жирных кислот

(ЖК) и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Отметим, что ненасыщенные ЖК являются важными компонентами клеточных мембранных структур, и модификация их уровня имеет значение для текучести мембраны, интеграции в мембранах рецепторов, образования вторичных переносчиков и клеточных сигнальных механизмов, которые необходимы для функционирования клеток как в нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов.

Цель исследования: изучить экспрессию гена desA цианобактерии Synechocystis sp. РСС 6803 в клетках бактерий (E.coli) и растений (Solanum tuberosum) и выяснить, можно ли изменить толерантность растений картофеля к стрессовым факторам за счет манипуляции ненасыщенностью ЖК липидов мембран, используя гены десатураз. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидной последовательности гена des А с целью оценки эффективности его экспрессии в клетках E.coli и Solanum tuberosum.

2. Клонировать нативный и сконструировать гибридный гены des А.

3. Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов des А в бактериальных трансформантах.

4. Сконструировать экспериментальные модели трансгенных растений, экспрессирующие нативный и гибридный гены des А.

5. Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов des А в трансформантах растений.

6. Исследовать композицию жирных кислот, интенсивность процессов перекисного окисления липидов и толерантность трансформантов растений к стрессовым факторам, а также их взаимосвязь с уровнем экспрессии целевого гена des А.

Научная новизна работы. Автором впервые проведено изучение экспрессии нативных и гибридных генов дельта-12-десатуразы в клетках прокариот (£. coli) и эукариот (растения). Впервые продемонстрировано, что значительная достройка в С-концевой области А12-десатуразы (до 25 кДА) не сказывается на каталитической активности десатуразы, но увеличивает количество продуктов реакции этого фермента в клетках штаммов-трансформантов Е. coli. Автор впервые обнаружил, что гетерологичная ацил-липидная десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах растений, стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, что коррелирует с увеличением устойчивости трансформантов к пониженным температурам и фитопатогенам. Автором разработан новый метод мультиплексной ПЦР для анализа трансформантов картофеля, который позволяет за один цикл амплификации определять в геномной ДНК трансгенных растений последовательности нескольких генов.

Апробация результатов работы. Результаты работы были представлены на международных и российских конференциях: Научно-практической

конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях», Москва, 2006; Международной конференции «Генетика в России и мире», Москва, 2006; Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 2007; 3-й Международной конференции «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений», Минск, 2008; IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 2008; Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты», Минск, 2008; Международной школе-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях», Звенигород, 2008, и других.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на )iS. страницах машинописного текста, включая А.О. таблиц и •^f?рисунков. Список цитируемых литературных источников включает .15% наименования.

2. Основное содержание работы

Глава 1. Обзор литературы. В обзоре литературы приведены современные данные о молекулярных механизмах стрессового ответа растений, генетическом контроле толерантности растений к стрессовым факторам, роли мембранных липидов в этих механизмах. Особое внимание уделено генам цианобактерий и растений, кодирующим десатуразы с различной субстратной специфичностью, и их физиологической роли в механизмах стрессового ответа растений.

Глава 2. Материалы и методы исследования. В работе использованы стандартные процедуры молекулярного клонирования, которые выполняли согласно методическому руководству Sambrook et al. (2001). В работе использовали стерильную субкультуру картофеля Solanum tuberosum сорта «Десница», выращенную при температуре 25°С в условиях 16-часового светового дня и освещенности 1000-2000 лк. Агробактериальную трансформацию растений картофеля проводили по методу с использованием микроклубней (Дерябин, Юрьева, 1997). Отбор трансформантов и дальнейшее их поддержание проводили на среде MC в присутствии селективного агента — канамицинсульфата (от 50 до 100 мкг/мл).

Молекулярно-генетический анализ первичных трансформантов картофеля проводили с использованием методов ПЦР, а также количественных и качественных методов определения активности лихеназы.

Композицию жирных кислот в листьях растений определяли методом газо-жидкостной хроматографии (Пчёлкин с соавт., 2006). Продукт перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малоновый диальдегид (МДА) определяли по методу (Жирова с соавт., 1982). Проницаемость мембран растительных клеток оценивали по выходу электролитов из тканей растений (Herburn et al., 1996).

Устойчивость тепличных и асептических растений картофеля к фитофторозу и поранению определяли в соответствии с методиками, разработанными во ВНИИКХ (Шнейдер, Яшина, Ерохина и др., 1980), и адаптированной методикой для оценки асептических растений (Юрьева, Кукушкина, 1992).

Статистическое сопровождение анализа результатов экспериментов проводилось с использованием ПО Microsoft Excel.

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Сравнительный анализ кодонового состава гена desA, кодирующего А12-десатуразу цианобактерий, и модельных организмов

Известно, что эффективность экспрессии гетерологичных генов в клетках-реципиентах зависит от многих факторов и, прежде всего, от нуклеотидного состава экспрессируемого гена. Прежде чем приступить к исследованиям по экспрессии гена десатуразы в клетках модельных организмов, мы проанализировали его нуклеотидную последовательность с использованием Codon Usage Database — http://www.kazusa.or.ip/codon/. Сравнительный анализ встречаемости кодонов у Е. coli, Solanum tuberosum и гена desk, кодирующего Д12-десатуразу цианобактерий, позволил заключить, что нуклеотидная последовательность А12-десатуразы содержит 2,3% редких кодонов относительно Е. coli, и не содержит редких кодонов относительно Solanum tuberosum (данные в автореферате не приводятся). Мы предполагаем, что ген des А, кодирующий Д12-десатуразу, должен эффективно экспрессироваться в Solanum tuberosum, но уровень его экспрессии в бактериях предположительно будет низким.

Далее мы сравнили GC-содержание в последовательности гена desA цианобактерий и генах некоторых видов растений. Нами отмечено, что последовательность целевого гена desA имеет более высокое содержание GC пар (50,81%) по сравнению с генами разных растений, в среднем, на 5%, за исключением Triticum aestivum. С одной стороны, повышенное содержание GC в нуклеотидной последовательности целевого гена может оказать негативное влияние на эффективную экспрессию этого гена в растениях. Известно, что CpG динуклеотиды в норме являются мишенью для метилирования. С другой стороны, известно, что в геномах эукариот имеются протяженные последовательности, обогащенные GC-парами, которые обозначают как CpG-островки. В настоящее время механизм поддержания CpG-островков в неметилированном состоянии непонятен. Полагают, что фактор транскрипции Spl, который взаимодействует как с метилированными, так и с неметилированными сайтами, может играть

ключевую роль в постоянном поддержании генов «домашнего хозяйства» в неметилированном активном состоянии.

Для того, чтобы выяснить, будет ли нуклеотидная последовательность гена desA, имеющая повышенное содержание GC, поддерживаться либо в активном, либо в инактивированном состоянии в геноме растений, необходимо получить и проанализировать трансгенные растения, экспрессирующие эту последовательность.

Таким образом, совокупность полученных данных позволяет предположить, что нуклеотидная последовательность гена desA, кодирующая Д12-десатуразу, не нуждается в модификации для эффективной ее экспрессии в растениях картофеля.

3.2. Клонирование нашивного гена desA, конструирование гибридного гена desA-ИсВМЗ и прокариотических векторов для их экспрессии в клетках E.coli.

Первоначально из базы данных NCBI была получена последовательность нативного гена, кодирующего Д12-десатуразу Synechocystis sp. РСС 6803. В качестве потенциальных векторов экспрессии для изучения экспрессии нативного гена desA цианобактерий в клетках Е. coli выбраны системы экспрессии pQE и рЕТ.

Используя геномную ДНК Synechocystis sp. РСС 6803 в качестве матрицы и специально подобранные праймеры, был получен ПЦР продукт, несущий последовательность гена десатуразы. Корректность клонирования целевого гена desA была подтверждена секвенированием.

Следует отметить, что desA ген кодирует белок, который обладает ферментативной активностью (катализирует введение двойных связей в остатки жирных кислот), которую можно определить лишь за счет изменения уровня ненасыщенных ЖК в модельном организме. Отметим, что эти методы требуют значительных материальных и временных затрат.

В своей работе мы использовали новый подход к изучению экспрессии гена, кодирующего Д12-десатуразу, в модельных организмах -конструирование и перенос гибридных генов, в которых целевой ген имеет транскрипционно-трансляционное слияние с последовательностью репортерного гена, кодирующего лихеназу. Возможность использовать такой подход для изучения экспрессии целевого гена Д12-десатуразы основан на данных структуры белкового продукта. Известно, что активный центр этого фермента, обеспечивающий ферментативную активность десатуразы, локализован в середине последовательности белковой молекулы, которая удалена от N- и С-концевой области фермента.

В качестве источника репортерного гена //сВМЗ Clostridium thermocellum использовали плазмиду pQE-//cBM3 (Комахин и др., 2005).

Для изучения экспрессии нативного гена desA и гибридного гена desA-licRMh в клетках E.coli было сконструировано два типа экспрессионных векторов: pQE30-DA и pET32-DA, содержащие нативный ген, и pQE30-DAL и pET32-DAL, содержащие гибридный ген (рис. 1).

Корректность сборки экспрессионных векторов была подтверждена рестрикционным анализом.

промотор desA Stop

промотор des А йсВМЗ Stop

Рисунок 1. Схема экспрессионных кассет, содержащих нативный и гибридный гены Д12-десатуразы.

3.3. Молекулярно-генетический и биохимический анализ бактериальных трансформантов, несущих плазмиды с нашивным (desА) и гибридным (desA-licBM3) генами

Полученными экспрессионными векторами pQE30-DA и pQE30-DAL, а также pET32-DA и pET32-DAL была проведена трансформация бактериальных штаммов XL-1 Blue и BL21, соответственно. Первоначально бактериальные трансформанты были проанализированы методом чашечного теста (рис. 2). Как видно из представленных результатов, активность лихеназы - просветленные пятна вокруг колоний - выявлена только у бактериальных трансформантов, несущих плазмиды, содержащие последовательность гибридного гена desA-licBM3, и не выявлена у бактериальных трансформантов, несущих экспрессионный вектор, содержащий нативный ген desA. Отметим, что активность лихеназы, как составной части гибридного белка DesA-LicBM3, выявленная с использованием метода чашечного теста, позволила легко отобрать трансформанты бактерий, экспрессирующие соответствующий гибридный ген.

Рисунок 2. Чашечный тест на активность лихеназы штаммов-трансформантов, содержащих рекомбинантные плазмиды pQE30-DA и pET32-DA (несущие нативный ген des A), pQE30-DAL и pET32-DAL (слияние desA-licBM3).

Для доказательства того, что в бактериальных трансформантах эффективно синтезируется полноразмерный гибридный белок DesA-LicBM3, бактериальные белковые экстракты полученных штаммов были проанализированы методом энзимограмм (рис. 3).

225 М

»QE30-DAL ртг-DM.

к+ к-

Рисунок 3. Энзимограмма белковых экстрактов, полученных из бактериальных трансформантов.

PQE30-DAL и pET32-DAL (слияние desA-/г'сВМЗ);

К — pQE30-DA (несущий нативный ген desA);

K+-pQE30- /гсВМЗ; М - маркер молекулярных масс.

150 100

75

бЗкДа

50

35

25кДа

25 кДа

Использование такого подхода позволило выявить полосу активности лихеназы как составной части белкового продукта гена desA-/г'сВМЗ с молекулярной массой около 63 кДа, соответствующей теоретически рассчитанной для гибридного белка (рис. 3). Эти данные свидетельствуют о том, что в клетках Е. coli происходит образование полноразмерного белкового продукта гибридного гена.

Мы оценили уровень экспрессии гибридного гена desA-licBM3 в клетках прокариот на основании данных количественного определения уровня активности лихеназы, входящей в состав гибридных белков. Такой подход позволяет оценить не только эффективность транскрипции, но и эффективность трансляции мРНК гетерологичного гена. Было показано, что уровень экспрессии гибридного гена desA-licBM3 в системах экспрессии pQE и рЕТ варьирует от 2,77% до 3,67% (без индукции) и от 3,67% до 13,36% (с индукцией), соответственно. При этом более высокий уровень экспрессии гибридного гена выявлен у штаммов-трансформантов, содержащих рекомбинантную плазмиду pET32-DAL, по сравнению со штаммами-трансформантами, содержащими рекомбинантную плазмиду PQE30-DAL.

Для того, чтобы определить, сохраняют ли десатуразы в составе гибридных белков свою способность катализировать образование двойных связей в молекулах жирных кислот, определили композицию жирных кислот у бактериальных трансформантов. Показано, что только в клетках бактериальных трансформантов Е. coli, экспрессирующих как нативный, так и гибридный гены А12-десатуразы, обнаружены продукты реакции каталитической активности фермента - диеновые ЖК (18:2). В клетках бактериальных трансформантов, экспрессирующих только репортерный ген лихеназы, не выявлены диеновые ЖК (использован в качестве контроля). Это связано с тем, что в геноме Е. coli присутствует только ген, кодирующий Д9-десатуразу, которая катализирует введение первой двойной связи, что приводит к образованию монодиеновых ЖК (18:1). Следует также отметить, что в клетках Е. coli дикого типа не выявлено

активности, свойственной А12-десатуразе, в связи с чем, у них не детектируются диеновые ЖК.

Необходимо подчеркнуть, что относительное содержание диеновых ЖАК у бактериальных трансформантов, экспрессирующих гибридный ген desА-/г'сВМЗ, коррелирует с уровнем экспрессии этого гена, определенным по активности лихеназы (как составной части этого белка). У штамма-трансформанта, содержащего плазмиду pET32-DAL (относительный уровень активности лихеназы - 13,36%), содержание диеновых ЖК (18:2) составило 1,9%, тогда как у штамма-трансформанта pQE30-DAL (относительный уровень активности лихеназы - 3,67%) этот показатель равен 0,5%. Следует также отметить отличия в относительном содержании диеновых ЖК у штаммов-трансформантов, содержащих рекомбинантную плазмиду с нативным des А геном и гибридным desA-licBMS геном. У штаммов-трансформантов, содержащих плазмиды pQE30-DAL или рЕТ32-DAL, относительное содержание ЖК (18:2) составило 0,5% и 1,9%, соответственно, тогда как у штаммов-трансформантов pQE30-DA или pET32-DA этот показатель равен 0,2% и 0,3%. Более высокое относительное содержание ЖК (18:2) в клетках штаммов-трансформантов, содержащих плазмиды pQE30-DAL и pET32-DAL, по сравнению с таковыми, содержащими плазмиды pQE30-DA и pET32-DA, может быть связано с большей стабильностью белкового продукта гибридного гена, чем белкового продукта нативного гена. Схожие результаты получены другими исследователями (O'Quin et al., 2009).

Полученные результаты убедительно продемонстрировали, что значительная достройка в С-концевой области А12-десатуразы (молекулярная масса лихеназы - 25 кДА) не сказывается на ее каталитической активности, но увеличивает количество продуктов реакции этого фермента в клетках штаммов-трансформантов Е. coli.

Таким образом, на основании полученных результатов по сохранению свойств десатуразы цианобактерий в составе гибридного белка, для переноса в растения может быть использован гибридный ген, в котором последовательность гена desA имеет транскрипционно-трансляционное слияние с последовательностью репортерного гена лихеназы.

3.4. Получение первичных трансформантов растений картофеля и их молекулярно-генетический анализ

Первоначально были сконструированы растительные экспрессионные векторы pBISNl-IN-£feA-//cBM3 и pBISNl-IN-desA, в которых гибридный и нативный гены desA-йсШАЪ находились под контролем сильного конститутивного промотора 35S РНК CaMV (рис. 4) В качестве репортерного гена использовали /г'сВМЗ, а селективного гена -nptll.

Pnos nptll polyA p35S desA polyA

Рисунок 4. Схема растительных экспрессионных векторов

Pnos nptll polyA p35S ¿ÊlA LicBM3 polyA

*4IH>Î==ÎX===C>H

Полученные векторы были перенесены в Agrobacterium tumefaciens штамм AGLO, которым были трансформированы растения картофеля сорта «Десница». В результате проведенных работ по трансформации, регенерации и селекции растений было отобрано:

—11 независимых первичных трансформантов растений, полученных с использованием вектора pBISN 1 -IN-fifosA с целевым геном des А. Эта линия трансформантов растений обозначена нами как «35S-DA», а независимые трансформанты растений этой линии обозначались, соответственно, 35S-DA-1, 35S-DA-2, 35S-DA-3 и т.д.

—36 независимых первичных трансформантов растений, полученных с использованием вектора pBISNl-IN-ûfesA-//cBM3 с гибридным геном desA-ИсВМЗ. Эта линия трансформантов растений обозначена нами как «35S-DAL», а независимые трансформанты растений этой линии обозначались, соответственно 35S-DAL-1, 35S-DAL-2, 35S-DAL-3 и т.д.

— 9 независимых первичных трансформантов растений, полученных с использованием вектора pBISN l-IN-//cBM3 с репортерным геном /г'сВМЗ. Эта линия трансформантов растений обозначена нами как «35S-L», а независимые трансформанты растений этой линии обозначались соответственно 35S-L-1, 35S-L-2, 35S-L-3 и т.д.

Геномная ДНК первичных трансформантов картофеля, отобранных на селективной среде, проанализирована методом мультиплексной ПЦР, разработанным нами (рис. 5).

M Â 1 23456789К

Рисунок 5. Результаты мультиплексной ПЦР геномной ДНК трансформантов картофеля, на примере линии 358-ПАЬ (цифрами обозначены независимые трансформанты). desA — целевой ген, ПсВ — репортерный ген, асйп — ген домашнего хозяйства, Т-поб — регуляторный элемент селективного гена, у/гО — ген вирулентности хромосомы AgroЪacterium Ште/аЫет, М - маркер молекулярного веса, А - растительный экспрессионный вектор, К - контрольное растение.

Проведенный анализ позволил выявить присутствие всех последовательностей из области Т-ДНК, при условии отсутствия агробактериальной контаминации, у 6 из 11 первичных трансформантов растений линии 35S-DA и у 24 из 36 -линии 35S-DAL.

Следующий этап работы был направлен на отбор растений, в которых происходит синтез белкового продукта целевого гена. Для этого были использованы методы чашечного теста и энзимограмм. Как видно из результатов, представленных на рис. 6, активность лихеназы -просветленные пятна вокруг лунок — присутствует в белковых экстрактах, полученных из листовой ткани первичных трансформантов растений линий 35S-DAL (экспрессия гибридного гена desA-ИсВМЗ) и 35S-L (экспрессия только репортерного гена — //сВМЗ). Отметим, что активность лихеназы, как составной части гибридного белка DesA-LicBM3, выявленная с использованием метода чашечного теста, позволила отобрать растения, экспрессирующие этот гибридный ген. Следует отметить, что активность лихеназы выявлена не у всех первичных трансформантов, которые первоначально были проанализированы методом мультиплексной ПЦР.

Рисунок 6. Тест на активность лихеназы в экстрактах клеток листьев трансформантов растений разных линий.

К+ — положительный контроль (экстракт из бактериальных трансформантов pET32-DAL), Линии трансформантов — 35S-DA (нативный ген des А), 35-DAL (гибридный ген desA-licRMi) и 35S-L (репортерный ген /г'еВМЗ).

Для доказательства того, что в трансформантах картофеля эффективно синтезируется полноразмерный гибридный белок DesA-LicBM3 белковые экстракты из трансформантов растений линии 35S-DAL были проанализированы методом энзимограмм (рис. 7).

DA

35S-DAL

25кДа

Рисунок 7. Энзимограмма белковых лизатов, полученных из клеток трансформантов картофеля линии 358-ОАЬ. 1 - 7 - пробы белковых лизатов независимых растительных трансформантов; К - положительный контроль (экстракт из бактериальных трансформантов рЕТ32-БАЬ).

Как видно из представленных результатов, в транс формантах растений линии 358-БАЬ происходит образование белкового продукта гибридного гена — ОеяА-ЬюВМЗ с молекулярной массой около 63 кДА, что соответствует теоретически рассчитанной молекулярной массе для этого гибридного белка. При этом, так же как и в случае бактериальных трансформантов, не выявлены дополнительные полосы активности лихеназы, как составной части гибридного белка. Эти данные свидетельствуют об отсутствии протеолиза гибридного белка и его высокой стабильности в клетках растений.

Далее мы оценили уровень экспрессии гибридного гена ёезА-НсВМЗ в клетках трансгенных растений картофеля линии 358-БАЬ на основании данных полуколичественного определения уровня активности лихеназы, входящей в состав гибридных белков (рис. 8).

На основании проведенного молекулярно-генетического анализа, для дальнейших исследований были выбраны два независимых трансформанта растений картофеля с высоким уровнем экспрессии гибридного гена с1езА-ПсВМЗ (линии 358-13АЬ-2 и 358-ЭАЬ-3) и один трансформант растений картофеля, несущих нативный ген с1е$А (линия 358-ОА), у которого методом ОТ-ПЦР выявлен высокий уровень экспрессии целевого гена (данные в автореферате не приводятся).

# # # # # # # <ф> #####

Рисунок 8. Активность лихеназы у картофеля линии 355-БАЬ.

независимых трансгенных растении

Для изучения эффекта экспрессии гена Д12-десатуразы цианобактерий на абсолютное содержание отдельных видов жирных кислот мембранных липидов был проведен их анализ в листьях контрольных и трансгенных растений линий 358-ОАЬ-2, 358(ЮАЬ-3 и 358-БА. Результаты анализа показали, что экспрессия гена Д12-десатуразы существенно изменяет качественный и количественный состав и соотношение ЖК в липидах трансформантов растений картофеля. Показано, что основные ЖК мембранных липидов — а-линоленовая (18:3), линолевая (18:2) и пальмитиновая (16:0) (данные в автореферате не

приводятся). При этом, суммарное содержание главных полиненасыщенных ЖК - 18:2 и 18:3 - в трансгенных растениях картофеля всех исследованных линий оказалось достоверно выше по сравнению с таковым у контрольных растений (рис. 9).

Увеличенное количество линолевой ЖК (18:2) является результатом эффективной экспрессии гена des А, продукт которого - Д12-десатураза -катализирует превращение 18:1 ЖК в 18:2. Следует подчеркнуть, что для эффективной работы десатураз требуется достаточное количество соответствующего субстрата, т.е. десатурация - субстрат-зависимый процесс (Los, Murata, 1998; Лось, 2005). Так, для образования моноеновой 18:1 или диеновой 18:2 ЖК требуются в качестве субстратов ненасыщенная 18:0 или моноеновая 18:1 ЖК, соответственно.

в Исходный сорт ■ 35S-DAL 2

□ 35S-DAL3

□ 35S-DA

м кг/мо ль сырой массы

Д9,12-18:2

Д9,12,15-18:3 Суммарное содержание ненасыщенных ЖК

Рисунок 9. Анализ содержания 16:3, 18:2, 18:3 и общего количества ненасыщенных ЖК в разных линиях трансформантов картофеля.

Исходя их этого факта, увеличение уровня линоленовой ЖК (18:3) может быть обусловлено увеличением уровня линолевой ЖК (18:2) как субстрата для дальнейшей десатурации. Образование ЖК (18:3), вероятно, катализируется растительными десатуразами. Увеличенный уровень ненасыщенной 18:0 и моноеновой 18:1 жирных кислот у трансгенных растений по сравнению с контрольными растениями также может быть обусловлен эффективной экспрессией гена desA. А именно, экспрессия этого гена приводит к увеличению количества 18:2 ЖК, а это, в свою очередь, требует больше субстрата — 18:1, и, как следствие, приводит к увеличению экспрессии генов собственных растительных ферментов, превращающих 18:0 в 18:1, а также опосредующих синтез 18:0. В свою очередь, сама линолевая ЖК (18:2) тоже является субстратом для образования 18:3 ЖК. Это приводит к увеличению количества ПНЖК, а также к росту индекса ненасыщенности (ИН) ЖК в тканях растений-трансформантов (данные в автореферате не приводятся). Следует подчеркнуть, что полученные результаты позволили нам выявить корреляцию между уровнем экспрессии гибридного гена desA-licBMЗ (рис. 8) и изменениями количественного состава ЖК в мембранных

липидах у независимых трансформантов растений 35S-DAL-2 и 35S-DAL-3 (рис. 9). А именно, более высокий уровень экспрессии гибридного гена desA-ИсВМЗ приводит к более значимым изменениям качественного и количественного состава ЖК мембранных липидов у этого трансформанта картофеля. Кроме этого, полученные данные свидетельствуют о том, что ген desA, имеющий повышенное содержание GC, эффективно экспрессируется в растениях.

Таким образом, на основании совокупности полученных результатов показано, что экспрессия гена Д12-ацил-липидной десатуразы стимулирует биосинтез мембранных липидов и существенно изменяет качественный и количественный состав ЖК в липидах трансформантов картофеля в условиях оптимальных температур.

3.5. Сравнительное изучение показателей холодовой устойчивости у контрольных и трансгенных растений

Для того, чтобы выяснить взаимосвязь между изменением в уровне ненасыщенных жирных кислот мембранных липидов трансформантов картофеля, вызванных экспрессией гетерологичных генов, и их устойчивостью к низким температурам был проведен их физиолого-биохимический анализ. Для этих целей мы использовали стандартные методы определения степени холодостойкости растений.

Первоначально мы определили интенсивность перекисного окисления липидов в листьях за счет определения продукта этого процесса -малонового диальдегида (МДА) у контрольных растений и трансформантов до охлаждения и после краткосрочной холодовой экспозиции (рис. 10). Как видно из представленных данных, в результате холодовой экспозиции содержание МДА в тканях контрольных растений возрастает, тогда как у трансформантов этот показатель достоверно не изменяется. Следует отметить, что во всех линиях исследуемых трансформантов картофеля даже до охлаждения уровень МДА был почти в 1,5 раза ниже, чем у контрольных растений.

Рисунок 10.

Уровень МДА у контрольных растений и в линиях трансформантов растений картофеля в норме и после охлаждения.

ю-

ИИ

Ококтрогь 135S-QM.2

□ 35S-OU3

□ 35S-EA

т

гри22°С после ЗОлю гри -7°С гослеЗСМинпри-7°Си

60ыИ(при22,С

Определение интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) выявило повышенную устойчивость всех линий трансформантов к охлаждению по сравнению с контролем. В то же время усиление накопления продуктов ПОЛ в тканях контрольных растений картофеля при снижении температуры среды свидетельствовало о серьезных повреждениях их мембранных структур в отличие от трансформантов.

Известно, что понижение температуры, увеличивая проницаемость клеточных мембран, главным образом, плазмалеммы, вызывает интенсивный выход ионов во время охлаждения из клеток в клеточные стенки и апопласт. Мы определили электропроводность водных экстрактов из тканей листьев контрольных и трансгенных растений до краткосрочной холодовой экспозиции при минус 7°С и после нее (рис. 11). Как видно из представленных на рис. 11 данных, как при +22°С, так и после 30-минутной инкубации при минус 7°С этот показатель в листьях контрольных растений ниже, чем у трансгенных линий.

Рисунок 11.

Индекс повреждения листьев у контрольных растений и в линиях трансформантов растений картофеля в норме и после охлаждения.

Вероятно, холодовое воздействие увеличивает проницаемость мембран всех вариантов. Причем, наибольшая степень повреждения наблюдалась у контрольных растений. По изменению индекса повреждения можно судить о нарушениях барьерных свойств плазмалеммы.

В связи с этим, совокупность полученных результатов можно интерпретировать, как значительное снижение барьерных функций плазмалеммы при охлаждении у тканей контрольных растений, что соответствует высокой степени холодового повреждения и свидетельствует о пониженной холодостойкости этих растений. В то же время, трансформированные растения имеют достоверно более низкие значения индекса повреждения по сравнению с контролем, что позволяет охарактеризовать их как более устойчивые к пониженной температуре. Следует подчеркнуть, что полученные результаты позволили нам выявить положительную корреляцию между уровнем экспрессии гибридного гена с/а?А-//сВМЗ (рис. 8) и изученными показателями холодостойкости растений (рис. 10 и 11).

Таким образом, в настоящей работе показано, что низкая температура оказывает разное влияние на линии трансформантов картофеля, различающиеся по уровню экспрессии гена Д12-десатуразы, и контрольные растения. Полученные данные подтверждают предположение о важной роли ненасыщенных ЖК в снижении температуры фазового перехода липидов в механизмах устойчивости растений к низкой температуре.

3.6. Сравнительное изучение длительного холодового воздействия на толерантность контрольных и трансгенных растений

Для изучения, как контрольные и трансгенные растения различаются по холодовой устойчивости при длительном воздействии этого стрессового фактора, а также оценки влияния такого воздействия на продуктивность растений были проведены следующие эксперименты in vitro. Контрольные и трансгенные растения (по 20 растений каждой линии) одного возраста инкубировали при 8°С, освещенности 2 ООО люкс и 75% влажности в течение 4 месяцев. Далее оценивали такие показатели, как число микроклубней, количество погибших растений, а также растений с признаками пожелтения листьев (рис. 12).

Рисунок 12.

Результаты длительной холодовой обработки контрольных и

трансгенных растений.

Как видно из представленных данных, количество контрольных растений, не выживших либо имеющих признаки пожелтения листьев после длительной холодовой обработки, достоверно выше, чем эти показатели у всех линий трансформантов растений. Важно отметить, что скорость восстановления трансгенных растений с признаками пожелтения листьев после переноса и роста растений в нормальные температурные условия была выше, чем у контрольных растений (данные в автореферате не приводятся). При этом, количество здоровых растений (зеленые растения) у контрольных растений было в 6 раз меньше, чем у трансформантов картофеля. Нами также установлено, что трансгенные растения образовывали микроклубни быстрее, чем контрольные растения, и их количество у трансгенных линий было в 5 раз выше по сравнению с контрольными растениями картофеля. Кроме этого, нами выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии гена Лея А и

100 90

I общее колличество клубней в 20ти растениях

I погибшие растения

(%)

1 желтые растений

(%)

I зеленые растения

(%>

исследованными показателями холодоустойчивости - трансформанты 358-ОАЬ-З с более высоким уровнем экспрессии характеризуются большей толерантностью к холодовому стрессу (рис. 8 и 12).

3.7. Сравнительное изучение устойчивости к фитофторозу контрольных и трансгенных растений

Следует отметить, что мембраны представляют собой совокупность интегрированных подсистем, состоящих из липидов со специфическим набором жирных кислот и многих белковых комплексов. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в трансформантах растений изменены физические свойства мембраны. Это позволило сделать нам следующее предположение.

Изменение физических свойств мембран в трансформантах растений (за счет увеличения ненасыщенных ЖК) может модулировать количество, конформацию и/или активность интегрированных в мембранные липиды белковых комплексов, большинство из которых являются либо рецепторами, либо сенсорами, участвующими в передаче сигналов при стрессах, в том числе и при атаке фитопатогенов, поранении и действии фитогормонов. На основании этого мы предположили, что трансгенные растений, экспрессирующие нативный и гибридный гены Д12-десатуразы, будут более устойчивы к фитопатогенам и поранению.

Для подтверждения этого предположения была проведена инокуляция листьев растений картофеля суспензией зооспор гриба РИу^рЫИога ш/е$1ат. В качестве стандартов использовали растения сорта: Никулинский — устойчивый сорт, Десница - среднеустойчивый и Жуковский ранний — восприимчивый сорт. Как видно из представленных данных, у трансформантов картофеля по сравнению с растениями исходного сорта и сортов-стандартов отмечается задержка в появлении симптомов поражения (рис. 13).

Рисунок 13. Сравнительная устойчивость контрольных растений и трансформантов к фитофторозу в условиях in vitro.

Следует отметить, что при заражении листьев тепличных растений, а также в экспериментах по поранению получены схожие результаты (данные в автореферате не приводятся)

Таким образом, показано, что созданные трансгенные растения являются адекватными моделями для изучения молекулярных механизмов устойчивости к абиотическим и биотическим стрессам. В настоящее время можно только предположить, что изменение физических свойств мембран в трансформантах растений может модулировать количество, конформацию/активность белков-сенсоров и рецепторов, участвующих в передаче сигналов при действии стрессовых факторов, и, как следствие, приводить к активации генов стрессового ответа растений (рис. 14).

Рисунок 14.

Гипотетическая схема физиологической роли гена desA в молекулярных механизмах стрессового ответа растений. К и Тр - растительная клетка контрольного и трансгенного растений, соответственно; desA и DesA -гетерологичный ген

десатуразы и его белковый продукт;

gl и g2 - гены растения; Р1 и Р2 - их белковые продукты;

Rl, SI, Т1 - рецептор(ы), сенсор(ы), транспортер(ы); P-dl-P-d2 — двудоменный мембранный белок; МАРК - MAP киназа(ы).

Пояснение к рисунку 14. Экспрессия целевого гена desA приводит к изменению композиции жирных кислот мембранных липидов в растительной клетке трансгенных растений (Тр). В результате, изменяется физическое состояние мембраны. Изменение физического состояния мембраны (увеличенная текучесть) может вызвать изменения конформации/активности рецепторов (R1), сенсоров (S1), транспортеров (Т1) и мембранных белков (P-dl-P-d2). Такие изменения, в свою очередь, могут приводить к активации каскада MAP киназ, которые запускают экспрессию генов транскрипционных факторов (gl). Транскрипционные факторы (Р1) могут активировать экспрессию генов стрессового ответа (g2) с образованием соответствующих белковых продуктов (Р2). Таким образом, может включаться каскад молекулярных механизмов стрессового ответа у растений.

Выводы

1 Анализ последовательности гена desA показал, что последовательность целевого гена имеет более высокое содержание GC - пар (50,81%) по сравнению с генами двудольных растений; сравнительный анализ конового состава целевого гена позволил заключить, что для эффективной экспрессии в растениях последовательность целевого гена в модификации не нуждается.

2. Показано, что нативный и гибридный гены Д12-десатуразы с высоким содержанием GC - пар эффективно экспрессируются в клетках прокариот (Е. coli) и эукариот (картофель). При этом как лихеназа, так и десатуразы сохраняют свои основные свойства: лихеназа - активность и термостабильность, десатуразы -способность вводить двойные связи в соответствующие положения жирных кислот.

3. Впервые показано, что гетерологичная ацил-липидная Д12-десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах картофеля, стимулирует биосинтез мембранных лшгадов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, в частности 18:2 и 18:3.

4. Показатели перекисного окисления липидов и значения индекса повреждения у трансформантов картофеля как в нормальных условиях жизнедеятельности, так и при кратковременном холодовом воздействии значительно ниже, чем у контрольных растений.

5. Показано, что экспрессия бактериального гена des А в трансгенных растениях увеличивает их толерантность к длительному воздействию пониженных положительных температур.

6. Показано, что трансформанты растений, экспрессирующих нативный и гибридный desA, проявляют устойчивость к грибным фитопатогенам и поранению.

7. Выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии гена des А в трансгенных растениях и исследованными показателями: композицией жирных кислот мембранных липидов; уровнем перекисного окисления липидов; значением индекса повреждения; уровнем толерантности к холодовому стрессу, поранению и фитопатогенам.

8. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что изменение физических свойств мембран в трансформантах растений (за счет более высокого содержания ненасыщенных жирных кислот) может модулировать конформацию и/или активность интегрированных в мембранные липиды белковых комплексов, участвующих в передаче сигналов при действии стрессовых факторов.

Публикации по материалам работы:

Статьи

1. Р. Маали, Х.Р. Шимшилашвили. В.П. Пчёлкин, В.Д. Цыдендамбаев, A.M. Носов, Д.А. Лось, И.В. Голденкова-Павлова. Сравнительное изучение экспрессии нативного и гибридного гена ацил-липидной Д9-десатуразы в бактерии Escherichia coli. /Генетика. 2007. Т.43, №2. с. 176-182.

2. Фадеев B.C., Шимшилашвили Х.Р., Гапоненко А.К. Индукционная, регенерационная и баллистическая восприимчивость различных генотипов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L)/ Генетика. 2008. Т.44. №9.

3.И.М. Герасименко, Л.А. Сахно, И.С. Головач, Е.М. Кищенко, Я.Р. Синдаровская, Х.Р. Шимшилашвили. Ю.В. Шелудько, И.В. Голденкова-Павлова. Получение растений, несущих гены ацил-липидныъх десатураз растений Synechocystis sp. РСС 6803/ Информационный Вестник ВОГиС, 2010, Т.14, №1, с. 127-133.

4. _Reza Maali Amin, Natalia O. Yur'eva' Khristina R. Shimshilashvili, Irina V. Goldenkova-Pavlova, Vasiliy P. Pchelkin, Elmira I. Kuznitsova, Vladimir D. Tsydendambaev, Tamara I. Trunova, Dmitry A. Los, Gholamreza Salehi Jouzani, Alexander M. Nosov. Expression of acyl-lipid A12-desaturase gene in prokaryotic and eukaryotic cells and its effect on cold stress tolerance of potato /Journal of Integrative Plant Biology. 2010. Vol. 52. N3. p. 289-297.

Статьи в сборниках

1. Х.Р. Шимшилашвили. Д.В. Сотченков, Р. Маали, И.В. Голденкова-Павлова. Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям /«Факторы экспериментальной эволюции организмов», Научные труды, под ред. акад. М.В. Ройка, Т.З., Киев - ЛОГОС, 2006, Т. 3, с. 653-657.

2. X. Р. Шимшилашвили. Маали Реза, В. П. Пчелкин, В. Д. Цындеданбаев, Д. А. Лось, А. А. Носов, И. В. Голденкова-Павлова. Сравнительное изучение экспрессии нативного и гибридного генов Д12-десатуразы Synechocystis sp. РСС 6803 в клетках про- и эукариот /«Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии». Сборник научных трудов. Под ред. Акад. В.А. Кунах. Киев: Логос, 2007. Т.2. с. 600-605.

3. Фадеев B.C., Шимшилашвили Х.Р.. Сотченков Д.В., Комахин P.A., Бабыкин М.М., Зинченко В.В., Ралдугина Г.Н., Голденкова-Павлова. И.В. Новый подход для экспрессии гетерологичных генов в растениях с целью создания устойчивых и биобезопасных форм растений/ В сборнике научных трудов «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений». Под ред. Акад. В.Н. Решетникова, проф. В.М. Юрина, проф. В.Л. Каллера. Минск. 2008 года. Издательский центр БГУ, 2008. с. 196-199.

4 Х.Р. Шимшилашвили. М.А. Гордукова, В.П. Пчелкин, В.Д. Цындеданбаев, Д.А. Лось, Н.О. Юрьева, A.A. Носов, И.В. Голденкова-Павлова. Экспрессия нативного и гибридного генов Д12-десатуразы Synechocystis sp. РСС 6803 в клетках бактерий и растений приводит к увеличению ненасыщенных жирных кислот и коррелирует с устойчивостью трансформантов к стрессовым факторам /В сборнике научных трудов «Теоретические и прикладные аспекты биохимии и биотехнологии растений». Под ред. Акад. В.Н. Решетникова, проф. В.М. Юрина, проф. В.Л. Каллера. Минск. 2008 года. Издательский центр БГУ, 2008. с. 199-203.

5. И.Н. Бердичевец, М.А. Гордукова, Я.Р. Синдаровская, Х.Р. Шимшилашвили. И.В. Голденкова-Павлова. Разработка метода мультиплексной полимеразной цепной реакции для анализа трансгенных растений/ В Материалах Международной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты \под ред. Проф. Н.П. Максимовой. Минск. Издательский центр БГУ. 2008. с. 44-46.

6. Бердичевец И.Н., Гордукова М.А.. Шимшилашвили Х.Р.. Синдаровская Я.Р., Шелудько Ю.В., Фадеев B.C., Голденкова-Павлова И.В. Дизайн системы праймеров и

условий мультиплексной ПЦР для эффективного отбора и анализа трансгенных растений/ «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Сборник научных трудов. Под ред. Акад. В. А. Кунах. Киев «Логос», 2009. Т. 7. с. 204-208. 7. Шимшилашвили Х.Р., Юрьева И.О., Бердичевец И.Н., Гордукова М.А., Цыдендамбаев В.Д., Носов A.M., Голденкова-Павлова И.В. Создание трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам за счет экспрессии генов десатураз с различной субстратной специфичностью/ «Факторы экспериментальной эволюции организмов». Сборник научных трудов. Под ред. Акад. В.А. Кунах. Киев «Логос», 2009. Т. 7. с. 265-270. Заявка на патент

1. Бердичевец И. Н., Герасименко И.М., Голденкова-Павлова И.В., Синдаровская Я. Р., Шелудько Ю.В., Шимшилашвили X. Р. Способ детекции рекомбинантных генов ацил-липидных десатураз, слитых с термостабильной лихеназой, методом мультиплексной полимеразной цепной реакции. Заявка на патент. 12102, дата подачи 25.11.2009.

Избранные тезисы докладов

2. Шимшилашвили Х.Р.. Сотченков Д.В., Голденкова-Павлова И.В. Экспериментальные модели для создания трансгенных растений, устойчивых к стрессовым воздействиям/ Сборник докладов Научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи - путь к обществу, основанному на знаниях». Москва.: МГСУ, 2006. 125-127.

3. Х.Р. Шимшилашвили. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер при изучении экспрессии гетерологичных генов в модельных организмах/ Статья в сборнике «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2006, с.180-181.

4. Шимшилашвили Х.Р., Сотченков Д.В., Фадеев B.C., Бабыкин М.М., Маали Р., Юрьева Н.О., Пчелкин В.П., Цыдендамбаев В.Д., Верещагин А.Г., Дерябин А.Н., Трунова Т.И., Лось Д.А., Носов A.M., Голденкова-Павлова И.В. Разработка экспериментальных моделей с целью создания устойчивых форм растений/ Материалы Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (VI Съезд Общества физиологов растений России). Сыктывкар, 2007. Ч. 2. с. 275 - 277.

5. B.C. Фадеев. Х.Р. Шимшилашвили. И.Н. Бердичевец, А.О. Вячеславова, С.А. Голенкина, М.А. Гордукова, М.М Бабыкин, В.В. Зинченко, Г.Н Рапдугина., И.В. Голденкова-Павлова. Разработка новых подходов создания трансгенных растений перспективных для фотобиотехнологии/ Материалы IX Международной конференции «Биология клеток растений in vitro и биотехнология», Звенигород, 2008, с. 422-423.

6. Бердичевец И.Н., Гордукова М.А., Шимшилашвили Х.Р.. Синдаровская Я.Р., Голденкова-Павлова И.В. Применение метода мультиплексной полимеразной цепной реакции для анализа трансгенных растений/ Материалы III Международной конференции молодых ученых «Биология: от молекулы до биосферы» \ под ред. Г.Г. Михайлова. Харьков. 2008. с. 176

7. Х.Р. Шимшилашвили. И.Н. Демин. Создание трансгенных растений, устойчивых к стрессовым факторам/ Материалы Международной школы-конференции молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях». Звенигород. 2008. с. 77.

8. М.А. Гордукова, Х.Р. Шимшилашвили. И.Н. Бердичевец. Дизайн системы анализа трансгенных растений методом мультиплексной ПЦР/ Материалы 62-й международной студенческой научной конференции секции «Генетика, селекция и биотехнология». Москва, 2009. С. 16.

9. Бердичевец И.Н.. Шимшилашвили Х.Р.. Синдаровская Я.Р., Шелудько Ю.В. Разработка системы праймеров мультиплесной ПЦР для отбора и анализа трансгенных растений/ Материалы XVI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И.

Андреев. [Электронный ресурс]

10. И.Н. Бердичевец, Х.Р.Шимшилашвили. Я.Р. Синдаровская, Ю.В. Шелудько. Разработка системы праймеров мультиплексной ПЦР дня отбора и анализа трансгенных растений.// Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 2009. с. 533.

Автор выражает искреннюю и глубокую признательность своему научному руководителю — доктору биологических наук Ирине Васильевне Голденковой-Павловой за всемерную поддержку, внимание и бесценную помощь в ходе выполнения научной работы.

Автор признателен сотрудникам УРАН Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН профессору Дмитрию Анатольевичу Лосю; профессору Александру Михайловичу Носову; к.б.н. Владимиру Дылыковичу Цыдендамбаеву; профессору Тамаре Ильиничне Труновой, Илье Демину за помощь в проведении данной работы, а также за неоценимую помощь в обсуждении полученных результатов.

Особая благодарность и искренняя признательность автора - к.б.н., старшему научному сотруднику УРАН Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН Наталье Олеговне Юрьевой, за длительное и плодотворное сотрудничество, помощь при освоении современных методов и в проведении экспериментов, и особенно за понимание и поддержку.

Автор выражает благодарность сотруднику НИИ картофельного хозяйства им. А.Г. Лорха РАСХН к.б.н. Светлане Николаевне Кирсановой за помощь в проведении ряда экспериментов.

Моя искренняя благодарность к.б.н. Юрию Всеволодовичу Шелудько и к.б.н. Ирине Герасименко за совместные исследования.

Благодарю сотрудников группы геномики растений: Виталия Фадеева, Ирину Бердичевец, Алису Вячеславову за поддержку.

Спасибо всей моей семье.

Заказ № 146-а/04/10 Подписано в печать 28.04.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

^г—ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 !. (V)) тт.ф.ги; е-таИ:т/о@с/г.ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шимшилашвили, Христина Романовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Молекулярные механизмы стрессового ответа растений на абиотические факторы среды ■

1.2. Мембраны: структура, роль в толерантности растений

1.3. Биосинтез жирных кислот мембранных липидов в растениях

1.4. Десатуразы - ключевые ферменты модификации мембранных липидов

1.5. Перспективы генетической инженерии растений для выяснения молекулярных механизмов стрессового ответа растений и создания растений, толерантных к абиотическим стрессам

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Методы молекулярного клонирования

2.2. Методы культивирования и трансформации растений картофеля

2.3. Методы получения и анализа бактериальных и растительных белков

2.4. Количественные и качественные методы определения активности репортерного белка лихеназы

2.5. Методы определения жирно-кислотного состава бактериальных и растительных трансформантов

2.6. Методы определения устойчивости растений к стрессовым факторам

2.7. Биоинформационный анализ и статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Сравнительный анализ кодонового состава гена desA, кодирующего Д12-десатуразу цианобактерий и модельных организмов

3.2. Клонирование нативного гена и конструирование прокариотических экспрессионных векторов

3.3. Конструирование гибридного гена desA-НсВМЗ и экспрессионных векторов для его экспрессии

3.4. Молекулярно-генетический и биохимический анализ бактериальных трансформантов, несущих плазмиды с нативным (desA) и гибридным (desA-licBM3) генами

3.5. Конструирование экспрессионных векторов для трансформации растений

3.6. Получение первичных трансформантов растений картофеля и их молекулярно-генетический анализ

3.7. Сравнительное изучение показателей холодовой устойчивости у контрольных и трансгенных растений

3.8. Сравнительное изучение краткосрочного и длительного холодового воздействия на толерантность контрольных и трансгенных растений

3.9. Сравнительное изучение устойчивости к фитофторозу и поранению контрольных и трансгенных растений

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение экспрессии генов, вовлеченных в модификацию жирных кислот, на экспериментальных моделях"

Абиотические стрессы, такие как засуха, засоление, экстремальные температуры - первопричина уменьшения урожая [Воуег, 1982; Bray et al., 2000]. Воздействие стрессовых факторов приводит к серии морфологических, физиологических, биохимических и молекулярных изменений, которые негативно сказываются на росте и продуктивности растений. Ответ на абиотический стресс - важен для неподвижных организмов, таких как растения, поскольку этот тип организмов не способен выжить, если не их способность справиться с изменениями окружающей среды. Для сохранения роста и продуктивности растения должны адаптироваться к стрессовым условиям и включить специфические защитные механизмы. Современные данные свидетельствуют о сложности ответных реакций растений на стрессовые воздействия, в которые вовлечены множество генов и биохимико-молекулярных механизмов. Механизмы молекулярно-генетического контроля толерантности растений к абиотическим стрессам основаны на активации и регуляции специфических генов. Эти гены вовлечены в целый каскад последовательных ответов на стресс, таких как восприятие и передача сигналов, активация транскрипционных факторов, защита мембран и белков, удаление свободных радикалов и токсических компонентов. Большой успех в области исследований стрессовых ответов растений на воздействие стрессовых факторов достигнут с использованием методов молекулярной генетики, которые позволили идентифицировать многие гены, индуцирующиеся во время стрессов. Особое место в этом занимают трансгенные растения, в которых «включаются» защитные механизмы за счет переноса и экспрессии гетерологичных генов, кодирующих функциональные гомологи растительных белков [Kuromori et al., 2009; Piruzian et al., 2006]. Трансгенные растения использованы и используются в настоящее время для детального функционального анализа генов стрессового ответа и выяснения физиологической роли их белковых продуктов. Другой основной прорыв в области исследования механизмов стрессового ответа растений последовал в 2000 году после расшифровки генома Arabidopsis thaliana. Эта геномная информация позволила провести мониторинг профиля экспрессии для всех предсказанных генов.

Несмотря на значительные успехи, наши познания механизма стрессового ответа на уровне целого растения еще весьма ограничены. Так, идентификация сенсоров и сигнальных путей стрессовых стимулов, понимание молекулярных основ взаимодействия между стрессами различного происхождения, идентификация ключевых факторов, связующих стрессовый ответ и процессы развития, выявление долговременных ответов у растений при множественных стрессовых условиях в природе, остаются первоочередными научными задачами.

Решение этих научных задач необходимо для создания полной картины молекулярно-генетических механизмов стрессовых ответов у растений и применения полученных знаний для биотехнологического использования.

Следует отметить, что в отличие от большинства моногенных характеристик, которые приданы растениям за счет генно-инженерных подходов, таких как устойчивость к гербицидам и пестицидам, генетически сложный комплекс ответа на абиотические стрессы является более сложным для контроля и генно-инженерных подходов. Существующий генноинженерный подход основан на переносе одного или нескольких генов, которые либо вовлечены в сигнальный или регуляторный пути, либо участвуют в биосинтезе функциональных и структурных защитных молекул осмолиты, антиоксиданты, белки стрессового ответа). Современные попытки улучшить толерантность растений к стрессовым абиотическим факторам за счет переноса генов привели к ряду положительных результатов, однако природные механизмы толерантности к абиотическим стрессам и потенциальный побочный эффект делают задачу создания растений толерантных к абиотическим стрессовым факторам достаточно трудной.

Следует подчеркнуть, что засуха, засоление, экстремальные температуры и окислительный стресс во много взаимосвязаны и могут индуцировать схожие изменения в клетках организмов. Вследствие этого, разнообразные стрессовые воздействия часто активируют схожие сигнальные пути

Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000; Knight and Knight, 2001; Zhu, 2001,

2002] и клеточные ответы, такие как продукция белков стрессового ответа, запуск синтеза антиоксидантов и накопление соответствующих защитных соединений [Vierling and Kimpel, 1992; Zhu et al, 1997; Cushman and Bohnert,

2000]. При этом, комбинированные абиотические стрессы вызывают непредвиденные физиологические изменения в клетках растений [Larkindale et al., 2005; Mittler, 2006]. Кроме этого, абиотический стресс взаимосвязан сложным образом и с защитным ответом против патогенов. Молекулярные основы такой взаимосвязи еще не выяснены. Вследствие этого, для решения вышеизложенных задач необходимо создание новых экспериментальных моделей трансгенных растений, экспрессирующих гены, продукты которых могут участвовать в механизмах стрессового ответа растений. В частности, важное значение приобретают исследования по определению физиологической роли генов десатураз - ферментов, отвечающих за образование двойных (С=С) связей в цепях жирных кислот (ЖК) и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран. Отметим, что ненасыщенные ЖК являются важными компонентами клеточных мембранных структур, и модификация их уровня имеет значение для текучести мембраны, интеграции в мембранах рецепторов, образования вторичных переносчиков и клеточных сигнальных механизмов, которые необходимы для функционирования клеток как в нормальных условиях, так и при действии стрессовых факторов.

Цель исследования: изучить экспрессию гена desA цианобактерии

Synechocystis sp. РСС 6803 в клетках бактерий (E.coli) и растений (Solarium tuberosum) и выяснить, можно ли изменить толерантность растений картофеля к стрессовым факторам за счет манипуляции ненасыщенностью

ЖК липидов мембран, используя гены десатураз.

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ нуклеотидной последовательности гена desA с целью оценки эффективности его экспрессии в клетках E.coli и Solatium tuberosum.

2. Клонировать нативный и сконструировать гибридный гены desA.

3. Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов desA в бактериальных трансформантах.

4. Сконструировать экспериментальные модели трансгенных растений, экспрессирующие нативный и гибридный гены desA.

5. Провести сравнительное исследование экспрессии нативного и гибридного генов desA в трансформантах растений.

6. Исследовать композицию жирных кислот, интенсивность процессов перекисного окисления липидов и толерантность трансформантов растений к стрессовым факторам, а также их взаимосвязь с уровнем экспрессии целевого гена desA.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Шимшилашвили, Христина Романовна

Выводы

1 Анализ последовательности гена des А показал, что последовательность целевого гена имеет более высокое содержание GC - пар (50,81%) по сравнению с генами двудольных растений; сравнительный анализ конового состава целевого гена позволил заключить, что для эффективной экспрессии в растениях последовательность целевого гена в модификации не нуждается.

1. Показано, что нативный и гибридный гены Д12-десатуразы с высоким содержанием GC - пар эффективно экспрессируются в клетках прокариот (Е. coli) и эукариот (картофель). При этом как лихеназа, так и десатуразы сохраняют свои основные свойства: лихеназа -активность и термостабильность, десатуразы — способность вводить двойные связи в соответствующие положения жирных кислот.

2. Впервые показано, что гетерологичная ацил-липидная Д12-десатураза эффективно экспрессируется в трансформантах картофеля, стимулирует биосинтез мембранных липидов и повышает уровень ненасыщенных ЖК, в частности 18:2 и 18:3.

3. Показатели перекисного окисления липидов и значения индекса повреждения у трансформантов картофеля как в нормальных условиях жизнедеятельности, так и при кратковременном холодовом воздействии значительно ниже, чем у контрольных растений.

4. Показано, что экспрессия бактериального гена desA в трансгенных растениях увеличивает их толерантность к длительному воздействию пониженных положительных температур.

5. Показано, что трансформанты растений, экспрессирующих нативный и гибридный desA, проявляют устойчивость к грибным фитопатогенам и поранению.

6. Выявлена положительная корреляция между уровнем экспрессии гена desA в трансгенных растениях и исследованными показателями: композицией жирных кислот мембранных липидов; уровнем перекисного окисления липидов; значением индекса повреждения; уровнем толерантности к холодовому стрессу, поранению и фитопатогенам.

7. Полученные результаты подтверждают гипотезу о том, что изменение физических свойств мембран в трансформантах растений (за счет более высокого содержания ненасыщенных жирных кислот) может модулировать конформацию и/или активность интегрированных в мембранные липиды белковых комплексов, участвующих в передаче сигналов при действии стрессовых факторов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шимшилашвили, Христина Романовна, Москва

1. Голденкова И.В. (2002) Репортерные системы: возможности для изучения различных аспектов регуляции экспрессии генов. Успехи современной биологии. № 6. с. 515-526.

2. Климов С.В. (2008) Адаптация растений к стрессам через изменение донорно-акцепторных отношений на разных уровнях структурной организации. Успехи современной биологии. Т. 128. №3 с. 281-299.

3. Комахин Р.А., Абдеева И.А., Салехи Джузани Г.Р., Голденкова И.В., Жученко А.А. (2005) Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер. Генетика. Т. 41. №1. с. 31-40

4. Кузнецов Вл.В., Дмитриева Г.А. (2005) Физиология растений. Учебн. для вузов. М.: Высш. шк с. 736.

5. Лось Д.А. (1997) Десатуразы жирных кислот: Адаптивная экспрессия и пртнципы регуляциию. Физиология растений, №44. с. 528-540.

6. Лось Д.А. (2001) Восприятие сигналов биологическими мембранами: сенсорные белки и экспрессия генов. Соросовский образовательсный журнал №7. с. 14-22.

7. Лось Д.А. (2005) Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений. Вестник Российской Академии Наук №75. с. 338-345.

8. Лось Д.А. (2007) Восприятие стрессовых сигналов биологическими мембранами. Сборн. науч. трудов. «Проблемы регуляции в биологических системах. Биофизические аспекты» под ред. А.Б Рубина. М,: РХД. с.480

9. П.Маниатис Т., Фрич Э.Д. (1984) Молекулярное клонирование. М.: Мир, с, 480.

10. Новикова Г.В., Мошков И.Е., Лось Д.А. (2007) Белковые сенсоры и передатчики холодового и осмотического стрессов у цианобактерий и растений. Молекулярная биология. Т. 41. № 3. с. 478-490.

11. Патрушев Л. И. (2000) Экспрессия генов,- Москва: Наука, с.527

12. М.Пирузян Э.С., Кобец Н.С., Метт В.Л., Серебрийская Т.С., Неумывакин

13. Салехи Джузани Г.Р., Комахин Р.А., Пирузян Э.С. Сравнительный анализ экспрессии нативного и модифицированного генов сгуЗа Bacillus thuringiensis в прокариотических и эукариотических клетках. Генетика. 2005. Т. 41. №2. с. 171-177.

14. Сотченков Д.В., Голденкова И.В., Мирахоли Н., Волкова Л.В. Модификация последовательности гена дефснзина SD2 из подсолнечника и его экспрессия в бактериальных и дрожжевых клетках. Генетика. 2005. Т. 41. № 11. с. 1453-1461.

15. Abe H., Urao Т., Ito T, Seki M., Shinozaki К., Yamaguchi-Shinozaki К.2003) Arabidopsis AtMYC2 (bHLH) and AtMYB2 (MYB) function as transcriptional activators in abscisic acid signaling. Plant Cell. V. 15 p. 63-78.

16. Alamillo J., Almoguera C., Bartels D., Jordano J. (1995) Constitutive expression of small heat shock proteins in vegetative tissues of the resurrection plant Craterostigmaplantagineum. Plant Mol Biol. V. 29. p. 1093-1099.

17. Alia Hayashi H., Sakamoto A., Murata N. (1998a) Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine. Plant J. V. 16. p. 155-161.

18. Alia., Hayashi H., Chen T.H.H., Murata N. (1998b) Transformation with a gene for choline oxidase enhances the cold tolerance of Arabidopsis during germination and early growth. Plant Cell Environ. V. 21. p. 232-239.

19. Almoguera C., Coca M.A., Jordano J. (1993) Tissue-specific expression of sunflower heat shock proteins in response to water stress. Plant J. V. 4. p. 947958.

20. Apse M.P., Aharon G.S., Snedden W.A., Blumwald E. (1999) Salt tolerance conferred by overexpression of a vacuolar Na+/H+antiport in Arabidopsis. Science. V. 285. p. 1256-1258.

21. Artus N.N., Uemura M,, Steponkus P.L., Gilmour S.J., Lin C., Thomashow

22. M.F. (1996) Constitutive expression of the coldregulated Arabidopsis thaliana

23. COR15a gene affects both chloroplast and protoplast freezing tolerance. Proc Natl

24. Acad Sci USA. V. 93. p. 13404-13409.

25. Bartels D. and Sunkar R. (2005) Drought and salt tolerance in plants. Crit. Rev. Plant Sci. V. 24. p. 23-58.

26. Berger S.L. (2007) The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. V. 447. p. 407-412.

27. Blumwald E. (2000) Sodium transport and salt tolerance in plants. Curr Opin Cell Biol. V. 12. p. 431-434.

28. Bohnert H.J., Shen B. (1999) Transformation and compatible solutes. Sci Hort. V.78. p. 237-260.

29. Bohnert H.J., Sheveleva E. (1998) Plant stress adaptations—making metabolism move. Curr Opin Plant Biol. V. 1. p.267-274.

30. Bohnert H.J., Ayoubi P., Borchert C., Bressan R.A., Burnap R.L., Cushman J.C., Cushman M.A., Deyholos M., Fischer R., Galbraith D.W. (2001) A genomics approach towards salt stress tolerance. Plant Physiol Biochem. V. 39. p. 295-311.

31. Bordas M., Montesinos C., Debauza M., Salvador A., Roig L.A., Serrano R., Moreno V. (1997) Transfer of the yeast salt tolerance gene HAL1 to Cucumismelo L. cultivars and in vitro evaluation of salt tolerance. Transgenic Res V.6.p. 41-50.

32. Borsani O. Zhu J. Verslues P.E., Sunkar R. and Zhu J.K. (2005) Endogenous siRNAs derived from a pair of natural cis -antisense transcripts regulate salt tolerance in Arabidopsis . Cell V. 123. p. 1279-1291.

33. Boston R.S., Viitanen Р.У., Vierling E. (1996) Molecular chaperones and protein folding in plants. Plant Mol Biol V.32. p. 191-222.

34. Bouchez O, Huard C, Lorrain S, Roby D, Balague С (2007) Ethylene is one of the key elements for cell death and defense response control in the Arabidopsis lesion mimic mutant vadl. Plant Physiol. V.145. p. 465-477.

35. Bowler C., Van Montagu M., Inze D. (1992) Superoxide dismutases and stress tolerance. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. V.43. p. 83-116.

36. Boyer J.S. (1982) Plant productivity and environment. Science 218:443-448

37. Boyko A. and Kovalchuk I. (2008) Epigenetic control of plant stress response. Environ. Mol. Mutagen. V.49. p. 61-72.

38. Bradford M.M. (1976) A Rapid Sensitive Method for Quantification of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem., 72, 248-254.

39. Bray E.A., Bailey-Serres J., Weretilnyk E. (2000) Responses to abiotic stresses. In: Gruissem W, Buchannan B, Jones R (eds) Biochemistry and molecular biology of plants. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD, pp 1158-1249

40. Brodersen P. and Voinnet O. (2006) The diversity of RNA silencing pathways in plants. Trends Genet. V. 22. p. 268-280.

41. Cartea M.E., Migdal M., Galle A.M., Pelletier G., Guerche P. (1998) Composition of sense and antisense methodologies for modifying the fatty acid composition of Arabidopsis thaliana oilseed Plant Science V. 136. p. 181-194.

42. Ceccardi T.L., Meyer N.C., Close T.J. (1994) Purification of a maize dehydrin. Protein Express Purif. V.5. p. 266-269.

43. Chapman D. (1998) Phospholipase activity during plant growth and development and in response to environmental stress. Trends Plant Sci. V.3. p. 419-426.

44. Chauhan S., Forsthoefel N., RanY., Quigley F., Nelson D.E., Bohnert H.J. (2000) Na+/myo-inositol symporters and Na+/H+-antiport in Mesembryanthemum crystallinum Plant J. V. 24. p. 511-522.

45. Chen T.H.H., Murata N. (2002) Enhancement of tolerance of abiotic stress by metabolic engineering of betaines and other compatible solutes. Curr Opin Plant Biol. V. 5. p. 250-257.

46. Chinnusamy V. and Zhu J.K. (2009) Epigenetic regulation of stress responses in plants. Curr. Opin. Plant Biol. V. 12. p. 133-139.

47. Chinnusamy V., Ohta M., Kanrar S., Lee В., Hong X., Agarwal M. and Zhu J. (2003) ICE1: a regulator of cold-induced transcriptome and freezing tolerance in Arabidopsis . Genes Dev. V. 17. p. 1043-1054.

48. Choi H.I., Hong J.H., Ha J., Kang J.Y., Kim S.Y. (2000) ABFs, a family of ABA-responsive element binding factors. J Biol Chem V. 27. p. 1723-1730.

49. Close T.J. (1996) Dehydrins: emergence of a biochemical role of a family of plant dehydration proteins. Physiol Plant. V. 97. p. 795-803.

50. Close T.J., Kortt A.A., Chandler P.M. (1989) A cDNA-based comparison of dehydration-induced proteins (dehydrins) in barley and corn. Plant Mol Biol. V. 13. p. 95-108.

51. Cushman J.C., Bohnert H.J. (2000) Genomic approaches to plant stress tolerance. Curr Opin Plant Biol. V. 3. p. 117-124.

52. Davison P.A., Hunter C.N., Horton P. (2002) Overexpression of b-carotene hydroxylase enhances stress tolerance in Arabidopsis. Nature. V. 418. p. 203-206.

53. Diamant S., Eliahu N., Rosenthal D., GoloubinoD P. (2001) Chemical chaperones regulate molecular chaperones in vitro and in cells under combined salt and heat stresses. J Biol Chem. V. 276. p. 39586-39591.

54. Doherty C.J., Van Buskirk H.A., Myers S.J. and Thomashow M.F. (2009) Roles for Arabidopsis CAMTA transcription factors in cold-regulated gene expression and freezing tolerance. Plant Cell V. 21. p. 972-984

55. Dong C., Agarwal M., Zhang Y., Xie Q. and Zhu J.K. (2006) The negative regulator of plant cold responses, HOS1, is a RING E3 ligase that mediates the ubiquitination and degradation of ICE 1. Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. p. 103 , 8281-8286.

56. Dunwell J.M. (2000) Transgenic approaches to crop improvement. J Exp Bot. V. 51. p. 487-496

57. Dure III. L. (1993a) Structural motifs in Lea proteins. In: Close TJ, Bray EA (eds) Plant response to cellular dehydration during environmental stress. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD. V. p. 91-103

58. Dure III L. (1993b) A repeating 11-mer amino acid motif and plant desiccation. Plant J. V.3. p. 363-369

59. Ehrnsperger M., Graber S., Gaestel M., Buchner J. (1997) Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J. V. 16. p. 221-229

60. Eschen-Lippold L, Rothe G, Stumpe M, Gobel C, Feussner I, Rosahl S. (2007) Reduction of divinyl ether-containing polyunsaturated fatty acids in transgenic potato plants. Phytochemistry. V. 68(6). p.797-801.

61. Fedoroff N.V. (2002a) RNA-binding proteins in plants: the tip of an iceberg Curr. Opin. Plant Biol. V. 5 , p. 452^59.

62. Flowers T.J. and Colmer T.D. (2004) Salinity tolerance in halophytes. New Phytol. V. 179, p. 945-963.

63. Fowler S., Thomashow M.F. (2002) Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathways are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway. Plant Cell. V. 14. 1675-1690

64. Frank W., Munnik Т., Kerkmann K., Salamini F., Bartels D. (2000) Water deficit triggers phospholipase D activity in the resurrection plant Craterostigma plantagineum. Plant Cell. V. 12. p.l 11-124

65. Fukuda A., Nakamura A., Tanaka Y. (1999) Molecular cloning and expression of the Na+/H+ exchanger gene in Oryza sativa. Biochim Biophys Acta. V. 1446. p. 149-155

66. Garay-Arroyo A., Colmenero-Flores J.M., Garciarrubio A., Covarrubias

67. A.A. (2000) Highly hydrophilic proteins in prokaryotes and eukaryotes are common during conditions of water deficit. J Biol Chem. V. 275. p. 5668-5674

68. Garg A.K., Kim J.K., Owens T.G., Ranwala A.P., Choi Y.D., Kochian L.V., Wu R.J. (2002) Trehalose accumulation in rice plants confers high tolerance levels to diderent abiotic stresses. Proc Natl Acad Sci USA. V. 99. p. 1589815903

69. Gaxiola R.A., Rao R., Sherman A., Grisafi P., Alper S.L., Fink G.R. (1999) The Arabidopsis thaliana proton transporters, AtNhxl and Avpl, can function in cation detoxification in yeast. Proc Natl Acad Sci USA. V. 96. p. 1480-1485

70. Gaxiola R.A., Li J., Undurraga S., Dang L.M., Allen G.J., Alper S.L., Fink G.R. (2001) Drought- and salt-tolerant plants result from overexpression of the AVP1 H+-pump. Proc Natl Acad Sci USA. V. 98. p. 11444-11449

71. Gilmour S.J., Sebolt A.M., Salazar M.P., Everard J.D., Thomashow M.F.2000) Overexpression of the arabidopsis CBF3 transcriptional activator mimics multiple biochemical changes as sociated with cold acclimation. Plant Physiol. V. 124. p. 1854-1865

72. Gisbert C., Rus A.M., Bolarin M.C., Lopez-Coronado J.M., Arrillaga I., Montesinos С., Саго M., Serrano R., Moreno V. (2000) The yeast HAL1 gene improves salt tolerance of transgenic tomato. Plant Physiol. V. 123. p. 393^102

73. Grant M.R. and Jones J.D.G. (2009) Hormone (dis)harmony molds plant health and disease. Science. V. 324. p. 750-752.

74. Guiltinan M.J., Marcotte W.R., Quatrano R.S. (1990) A plant leucine zipper protein that recognizes an abscisic acid response element. Science. V. 250. p. 267271

75. Gupta A.S., Heinen J.L., Holaday A.S., Burke J.J., Allen R.D. (1993a) Increased resistance to oxidative stress in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA. V. 90. p. 1629-1633

76. Gupta A.S., Webb R.P., Holaday A.S., Allen R.D. (1993b) Overexpression of superoxide dismutase protects plants from oxidative stress. Plant Physiol. V. 103. p. 1067-1073

77. Haake V., Cook D., Riechmann J.L., Pineda O., Thomashow M.F., Zhang

78. J.Z. (2002) Transcription factor CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis. Plant Physiol. V. 130. p. 639-648

79. Hamada A., Shono M., Xia Т., Ohta M., Hayashi Y., Tanaka A., Hayakawa T. (2001) Isolation and characterization of a Na+/H+ antiporter gene from the halophyte Atriplex gmelini. Plant Mol Biol. V. 46. p. 35^12

80. Hamilton III E.W., Heckathorn S.A. (2001) Mitochondrial adaptations to NaCl. Complex I is protected by anti-oxidants and small heat shock proteins, whereas complex II is protected by proline and betaine. Plant Physiol. V. 126. p. 12661274

81. Hare P.D., Cress W.A., Van Staden J. (1998) Dissecting the roles of osmolyte accumulation during stress. Plant Cell Environ. V. 21. p. 535-553

82. Harper J., Breton G. and Harmon A. (2004) Decoding Ca 2+ signals through plant protein kinases. Annu. Rev. Plant Biol. V. 55. p. 263-288.

83. Hartl F.U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature. V. 381. p. 571-579

84. Hasegawa P.M., Bressan A.B., Zhu J.K., Bohnert H.J. (2000) Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. V. 51. p. 463—499

85. Haslbeck M., Walke S., Stromer Т., Ehrnsperger M., White H.E., Chen S., Saibil H.R., Buchner J. (1999) Hsp26: a temperature regulated chaperone. EMBO J. V. 18. p. 6744-6751

86. Hayashi H., Mustardy L., Deshnium P., Ida M., Murata N. (1997) Transformation of Arabidopsis thaliana with the codA gene for choline oxidase: accumulation of glycinebetaine and enhanced tolerance to salt and cold stress. Plant J. V. 12. p. 133-142

87. Hendrick J.P., Hartl F.U. (1993) Molecular chaperone functions of heat-shock proteins. Annu Rev Biochem. V. 62. p. 349-384

88. Hirayama T. and Shinozaki K. (2007) Perception and transduction of abscisic acid signals: keys to the function of the versatile plant hormone ABA. Trends Plant Sci. V. 12. p. 343-351.

89. Hong Z., Lakkineni K., Zhang K., Verma D.P.S. (2000) Removal of feedback inhibition ofDl-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protection of plants from osmotic stress. Plant Physiol. V. 122. p. 1129-1136

90. Horwitz J. (1992) a- Crystallin can function as a molecular chaperone. Proc Natl Acad Sci USA. V. 89. p. 10449-10453

91. Houde M., Daniel C., Lachapelle M., Allard F., Laliberte S., Sarhan F. (1995) Immunolocalization of freezing-tolerance-associated proteins in the cytoplasm and nucleoplasm of wheat crown tissue. Plant J. V. 8. p. 583-593

92. Houseley J. and Tollervey D. (2009) The many pathways of RNA degradation. Cell. V. 136. p. 763-776.

93. Hrabak E.M., Chan C.W., Gribskov M. et al. (2003) The Arabidopsis CDPK-SnRK superfamily of protein kinases. Plant Physiol. V. 132. p. 666-680.

94. Huang J., Hirji R., Adam L., Rozwadowski K.L., Hammerlindl J.K., Keller W.A., Selvaraj G. (2000) Genetic engineering of glycinebetaine production toward enhancing stress tolerance in plants: metabolic limitations. Plant Physiol. V122. p. 747-756

95. Ichimura K., Shinozaki K., Tena G. et al. (2002) Mitogen-activated protein kinase cascades in plants: a new nomenclature. Trends Plant Sci. V. 7. p. 301-308.

96. Ingram J., Bartels D. (1996) The molecular basis of dehydration tolerance in plants. Annu Rev Plant Biol. V. 47. p. 377-403

97. Iturriaga G., Schneider K., Salamini F., Bartels D. (1992) Expression of desiccation-related proteins from the resurrection plant in transgenic tobacco. Plant Mol Biol. V. 20. p. 555-558

98. Jaglo-Ottosen K.R., Gilmour S.J., Zarka D.G., Schabenberger O., Thomashow M.F. (1998) Arabidopsis CBF1 overexpression induces COR genes and enhances freezing tolerance. Science. V. 280. p. 104-106

99. Jones-Rhoades M.W., Bartel D.P. and Bartel B. (2006) MicroRNAs and their regulatory roles in plants. Annu. Rev. Plant Biol. V. 57. p. 19-53.

100. Kang J.Y., Choi H.I., Im M.Y., Kim S.Y. (2002) Arabidopsis basic leucine zipper proteins that mediate stress-responsive abscisic acid signaling. Plant Cell. V. 14. p. 343-357

101. Kasuga M., Liu Q., Miura S., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. (1999) Improving plant drought, salt, and freezing tolerance by gene transfer of a single stress-inducible transcription factor. Nature Biotech. V. 17. p. 287-291

102. Kazuoka Т., Oeda K. (1994) Purification and characterization of COR85-oligomeric complex from cold-acclimated spinach. Plant Cell Physiol. V. 35. p. 601-611

103. Khodakovskaya M., McAvoy R., Peters J., Wu H., Li Y. (2006) Enhances cold tolerance in transgenic tobacco expressing a chloroplast co-3 fatty acid desaturase gene under control of a cold-inducible promoter. Planta. V. 223, p. 1090—1100

104. Kim S.G., Park C.M. (2007) Membrane-mediated salt stress signaling in flowering time control Plant Signal Behav, V. 2(6). p. 517-8.

105. Kishor K.P.B., Hong Z., Miao G.H., Ни C.A.A., Verma D.P.S. (1995) Overexpression of Dl-pyrroline-5-carboxylate synthetase increase proline production and confers osmotolerance in transgenic plants. Plant Physiol. V. 108. p.1387-1394

106. Knight H., Knight M.R. (2001) Abiotic stress signalling pathways: specificity and cross-talk. Trends Plant Sci. V. 6. p. 262-267

107. Konstantinova Т., Parvanova D., Atanassov A., Djilianov D. (2002) Freezing tolerant tobacco, transformed to accumulate osmoprotectants. Plant Sci. V. 163.p.157-164

108. Krasowska A,, Dziadkowiec D., Polinceusz A., Plonsla A., Lukaszewicz

109. M. (2007). Cloning of Flax Oil Fatty Acid Desaturase and Its Expression in Yeast. J. Am. Oil Chem. Soc. V. 84. p. 809-816

110. Kreps J.A., Wu Y., Chang H.S., Zhu Т., Wang X., Harper J.F. (2002) Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress. Plant Physiol. V. 130. p. 2129-2141

111. Kuhn J.M. and Schroeder J.I. (2003) Impacts of altered KNA metabolism on abscisic acid signaling. Curr. Opin. Plant Biol. V. 6. p. 463-469.

112. Kunkel B.N., Brooks D.M. (2002) Cross talk between signaling pathways in pathogen defense. Curr Opin Plant Biol. V. 5. p. 325-331

113. Kuromori Т., Takahashi S., Kondou Y., Shinozaki K. and Matsui M. (2009) Phenome analysis in plant species using loss-of-function and gain-offunction mutants. Plant Cell Physiol. V. 50. p. 1215-1231.

114. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, V. 227. p. 680-685

115. Larkindale J., Hall J.D., Knight M.R. and Vierling E. (2005) Heat stress phenotypes of Arabidopsis mutants implicate multiple signaling pathways in the acquisition of thermotolerance. Plant Physiol. V. 138. p. 882-897.

116. Lee G.J., Roseman A.M., Saibil H.R., Vierling E. (1997) A small heat shock protein stably binds heat-denatured model s bstrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBO J. V. 3. p. 659-671

117. Lee J.H., Hubel A., Scho F. (1995) Derepression of the activity of genetically engineered heat shock factor causes constitutive synthesis of heat shock proteins and increased thermotolerance in transgenic Arabidopsis. Plant J. V. 8. p. 603-612

118. Lee K., Piao H., Kim H., Choi S.M., Jiang F., Hartung W., Hwang I., Kwak J.M., Lee I.J. and Hwang I. (2006) Activation of glucosidase via stres induced polymerization rapidly increases active pools of abscisic acid. Cell. V. 126. p. 1109-1120.

119. Leung J., Giraudat J. (1998) Abscisic acid signal transduction. Annu Rev Plant Biol. V. 49. p. 199-222

120. Lisch, D. (2009) Epigenetic regulation of transposable elements in plants. Annu. Rev. Plant Biol. V. 60. p. 43-66.

121. Lilius G., Holmberg N., Bulow L. (1996) Enhanced NaCl stress tolerance in transgenic tobacco expressing bacterial choline dehydrogenase. BioTechnology. V. 14.p. 177-180

122. Lister R., Gregory B.D. and Ecker J.R. (2009) Next is now: new technologies for sequencing of genomes, transcriptomes, and beyond. Curr. Opin. Plant Biol. V. 12. p. 107-118.

123. Ludwig A.A., Romeis T. and Jones J.D.G. (2004) CDPK-mediated signaling pathways: specificity and cross-talk. J. Exp. Bot. V. 55. p. 181-188.

124. Lyons J.M. (1973) Chilling injury in plants. Annu. Rev. Plant.Physiol. V. V. 24. p. 445-466

125. Ma Y., Szostkiewicz I., Korte A., Moes D,, Yang Y., Christmann A. and

126. Grill E. (2009) Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. V. 324. p. 1064-1068.

127. Mahajan S., Pandey G.K. and Tuteja N. (2008) Calciumand salt-stress signaling in plants: shedding light on SOS pathway. Arch. Biochem. Biophys. V. 471. p. 146-158.

128. Maleck K., Dietrich R.A. (1999) Defense on multiple fronts: how do plants cope with diverse enemies? // Trends in plant science. V. 4. p. 215-219.

129. Malik M.K., Slovin J.P., Hwang C.H., Zimmerman J.L. (1999) Modified expression of a carrot small heat shock protein gene, Hspl7.7, results in increased or decreased thermotolerance. Plant J. V. 20. p. 89-99

130. Mannerlof M., Tenning P. (1997) Screening of transgenic plants by multiplex PCR// Plant Mol. Biol. Rep. V. 15. p. 38^15.

131. Marini I., Moschini R., Corso A.D., Mura U. (2000) Complete protection bya-crystallin of lens sorbitol dehydrogenase undergoing thermal stress. J Biol Chem. V. 275. p. 32559-32565

132. Matsuda O, Sakamoto H, Hashimoto T, Iba К (2005) A temperaturesensitive mechanism that regulates post-translational stability of a plastidialw-3 fatty acid desaturase (FAD8) in Arabidopsis leaf tissues. J Biol Chem. V. 280. p. 3597-3604.

133. Matsui A., Ishida J., Morosawa T. et al. (2008) Arabidopsis transcriptome analysis under drought, cold, high-salinity and ABA treatment conditions using a tiling array. Plant Cell Physiol. V. 49. p. 1135-1149.

134. Matzke M., Kanno Т., Huettel В., Daxinger L. and Matzke A.J. (2007) Targets of RNA-directed DNA methylation. Curr. Opin. Plant Biol. V. 10. p. 512519.

135. Maurel C. (1997) Aquaporins and water permeability of plant membranes. Annu Rev Plant Biol. V. 48. p. 399^129

136. McCue K.F., Hanson A.D. (1990) Drought and salt tolerance: toward understanding and application. Trends Biotechnol. V. 8. p. 358-362

137. McKersie B.D., Bowley S.R., Harjanto E., Leprince O. (1996) Water deficit tolerance and field performance of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase. Plant Physiol. V. 111. p. 1177- 1181

138. McKersie B.D., Bowley S.R., Jones K.S. (1999) Winter survival of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutase. Plant Physiol. V. 119. p. 839-848

139. McNeil S.D., Nuccio M.L., Hanson A.D. (1999) Betaines and related osmoprotectants: targets for metabolic engineering of stress resistance. Plant Physiol. V. 120. p. 945-949

140. Mentzen W.I., Peng J., Ransom N., Nikolau B.J., Wurtele E.S. (2008). Articulation of three core metabolic processes in Arabidopsis: fatty acid biosynthesis, leucine catabolism and starch metabolism. BMC Plant Biol. V. 11. p. 8-76

141. Meza T. J., Enerly E., Boru В., Larsen F., Mandal A., Aalen R. B. and Jakobsen K. S. (2002) A human CpG island randomly inserted into a plant genome is protected from methylation// Transgenic Res. V. 11(2). p. 133-42.

142. Mittler R. (2002) Oxidative stress, antioxidants and stress tolerance. Trends Plant Sci. V. 7. p. 405-^110

143. Mittler R. (2006) Abiotic stress, the field environment and stress combination. Trends Plant Sci. V. 11. p. 15-19.

144. Miura K., Jin J.B. and Hasegawa P.M. (2007) Sumoylation, a post-translational regulatory process in plants. Curr. Opin. Plant Biol. V. 10 p. 495502.

145. Moran J.F., Becana M., Iturbe-Ormaetxe I., Frechilla S., Klucas R.V., Aparicio-Tejo P. (1994) Drought induces oxidative stress in pea plants. Planta. V. 194. p. 346-352

146. Morimoto R.I. (1998) Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Genes Dev. V. 12. p. 3788-3796

147. Mundy J., Chua N.H. (1988) Abscisic acid and water stress induce the expression of a novel rice gene. EMBO J. V. 7. p. 2279-2286

148. Mundy J., Yamaguchi-Shinozaki K., Chua, N.H. (1990) Nuclear proteins bind conserved elements in the abscisic acid-responsive promoter of a rice rab gene .Proc. Natl Acad Sci USA. V. 87. p. 406^110

149. Munnik Т., Ligterink W., Meskiene I., Calderini O., Beyerly J., Musgrave A., Hirt H. (1999) Distinct osmo-sensing protein kinase pathways are involved in signaling moderate and severe hyper-osmotic stress. Plant J. V. 20. p. 381-388

150. Nakagami H., Pitzschke A. and Hirt H. (2005) Emerging MAP kinase pathways in plant stress signaling. Trends Plant Sci. V. 10. p. 339-346.

151. Nakagawa Y., Katagiri Т., Shinozaki K. et al. (2007) Arabidopsis plasma membrane protein crucial for Ca 2+ influx and touch sensing in roots. Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. 104. p. 3639-3644.

152. Ndong C., Danyluk J., Wilson K.E., Pocock Т., Huner N.P.A., Sarhan F. (2002) Cold-regulated cereal chloroplast late embryogenesis abundant-like proteins. Molecular characterization and functional analyses. Plant Physiol. V. 129. p. 1368-1381

153. Noctor G., Foyer C. (1998) Ascorbate and glutathione: keeping Active oxygen under control. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. V. 49. p. 249-279

154. Nover L., Bharti K., Doring P., Mishra S.K., Ganguli A., Scharf K.D. (2001) Arabidopsis and the heat stress transcription factor world: How many heat stress transcription factors do we need? Cell Stress Chaperones. V. 6. p. 177-189

155. Nuccio M.L., Russell B.L., Nolte K.D., Rathinasabapathi В., Gage D.A., Hanson A.D. (1998) The endogenous choline supply limits glycine betainesynthesis in transgenic tobacco expressing choline monooxygenase. Plant J. V. 16. p. 487-498

156. Oberschall A., DeakM,Torok K., Sass L., Vass L, Kovacs I., Feher A., Dudits D., Horvath G.V. (2000) A novel aldose/aldehyde reductase protects transgenic plants against lipid peroxidation under chemical and drought stresses. Plant J. V. 24. p. 437-446

157. O'Quin J. В., R. T. Mullen, J. M. Dyer. (2009) Addition of an N-terminal epitope tag significantly increases the activity of plant fatty acid desaturases expressed in yeast cells. Appl. Microbiol. Biotechnology.

158. Orlikowska T. (1999) Regeneration of adventitious shoots in process of genetic transformation // In: Altman A, Ziv M, Izhar S (eds). Plant biotechnology and in vitro biology in the 21st century. Kluwer, Dordrecht. - P. 185-188.

159. Overmyer K, Brosche M, Kangasj"arvi J (2003) Reactive oxygen species and hormonal control of cell death. Trends Plant Sci. V. 8. p. 335-342.

160. Park S., Fung P., Nishimura N. et al. (2009) Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science . V. 324. p. 1068-1071.

161. Pieterse C.M.J., Leon-Reyes A., Van der Ent S. and Van Wees S.C.M. (2009) Networking by small-molecule hormones in plant immunity. Nat. Chem. Biol. V. 5. p. 308-316.

162. Pinja Jaspers and Jaakko Kangasj"arvi (2010) Reactivc oxygen species in abiotic stress signaling Physiologia Plantarum. V. 138. p. 405-413.

163. Piruzian E.S., Goldenkova-Pavlova I.V., Abdeev R.M., Komakhin R.A., Brouskin S.A., Abdeeva I.A. (2006) Transgenic plants expressing bacterial genesas a model system for plant functional genomics. Current Genomics. V. 7. p. 3342.

164. Pitcher L.H., Zilinskas B.A. (1996) Overexpression of copper/zinc superoxide dismutase in the cytosol of transgenic tobacco confers partial resistance to ozone-induced foliar necrosis. Plant Physiol. V. 110. p. 583-588

165. Price A.M., Atherton N.M., Hendry G.A.F. (1989) Plants under drought-stress generate activated oxygen. Free Rad Res Commun. V. 8. p. 61-66

166. Qin F., Sakuma Y., Tran L.P. et al. (2008) Arabidopsis DREB2A-interacting proteins function as RING E3 ligases and negatively regulate plant drought stress-responsive gene expression. Plant Cell. V. 20. p. 1693-1707.

167. Riechmann J.L., Heard J., Martin G., Reuber L., Jiang C., Keddie J., Adam L., Pineda O., Ratclifle O.J., Samaha R.R. (2000) Arabidopsis transcription factors: genome-wide comparative analysis among eukaryotes. Science. V. 290. p. 2105-2110

168. Roxas V.P., Smith R.K. Jr., Allen E.R., Allen R.D. (1997) Overexpression of glutathione S-transferase/glutathione peroxidase enhances the growth of transgenic tobacco seedlings during stress. Nature Biotech. V. 15. p. 988-991

169. Russell B.L., Rathinasabapathi В., Hanson A.D. (1998) Osmotic stress induces expression of choline monooxygenase in sugar beet and amaranth. Plant Physiol. V. 116. p. 859-865

170. Sabehat A., Lurie S., Weiss D. (1998) Expression of small heat-shock proteins at low temperatures. Plant Physiol. V. 117. p. 651-658

171. Sakamoto A., Murata N. (2001) The use of bacterial choline oxidase, a glycinebetaine-synthesizing enzyme, to create stress resistant transgenic plants. Plant Physiol. V. 125. p. 180-188

172. Sakamoto A., Murata N. (2002) The role of glycine betaine in the protection of plants from stress: clues from transgenic plants. Plant Cell Environ. V. 25. p. 163-171

173. Sakamoto A., Alia, Murata N. (1998) Metabolic engineering of rice leading to biosynthesis of glycinebetaine and tolerance to salt and cold. Plant Mol Biol. V. 38. p. 1011-1019

174. Sakamoto A., Valverde R., Alia, Chen T.H.H., Murata N. (2000) Transformation of Arabidopsis with the codA gene for choline oxidase enhances freezing tolerance of plants. Plant J. V. 22. p. 449- 453

175. Sambrook J., Russel D.W. (2001) Molecular cloning: A laboratory manual.-Cold spring harbor laboratory.3rd edition. 999 p.

176. Scho F., Prandl R., Reindl A. (1998) Regulation of the heat-shock response. Plant Physiol. V. 117. p. 1135-1141

177. Seo P. J., Kim M.J., Park J.Y., Kim S.Y., Jeon J., Lee Y.H., Kim J. and. Park C.M (2010) Cold activation of a plasma membrane-tethered NAC transcription factor induces a pathogen resistance response in Arabidopsis The Plant Journal. V. 61. p. 661-671)

178. Serrano R., Rodriguez-Navarro A. (2001) Ion homeostasis during salt stress in plants. Curr Opin Cell Biol. V. 13. p. 399-404

179. Serrano R., Mulet J.M., Rios G., Marquez J.A., de Larrinoa I.F., Leube M.P., Mendizabal I., Pascual-Ahuir A., Proft M., Ros R., Montesinos C. (1999) A glimpse of the mechanisms of ion homeostasis during salt stress. J Exp Bot. V. 50. p. 1023-1036

180. Sheveleva E., Chmara W., Bohnert H.J., Jensen R.G. (1997) Increased salt and drought tolerance by D-ononitol production in transgenic Nicotiana tabacum L. PlantPhysiol. V. 115. p. 1211-1219

181. Shi H., Ishitani M., Kim C., Zhu J.K. (2000) The Arabidopsis thaliana salt tolerance gene SOS1 encodes a putative Na+/H+ antiporter. Proc Natl Acad Sci USA. V. 97. p. 6896-6901

182. Shi H., Lee B.H., Wu S.J. and Zhu J.K. (2003) Overexpression of a plasma membrane Na+/H+ antiporter gene improves salt tolerance in Arabidopsis thaliana. Nature Biotech. V. 21. p. 81-85

183. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (1997) Gene expression and signal transduction in water-stress response. Plant Physiol. V. 115. p. 327-334

184. Shinozaki K., Yamaguchi-Shinozaki K. (2000) Molecular responses to dehydration and low temperature: dierences and cross-talk between two stress signalling pathways. Curr Opin Plant Biol. V. 3. p. 217-223

185. Shinozaki K. and Yamaguchi-Shinozaki K. (2007) Gene networks involved in drought stress response and tolerance. J. Exp. Bot. V. 58. p. 221-227.

186. Siomi H. and Siomi C. (2009) On the road to reading the RNA-interference code. Nature. V. 457. p. 396-404.

187. Skriver K., Mundy J. (1990) Gene expression in response to abscisic acid and osmotic stress. Plant Cell. V. 2. p. 503-512

188. Smirnoff N. (1998) Plant resistance to environmental stress. Curr Opin Biotech. V. 9. p. 214-219

189. Smykal P., Masm J., Hrdy I., Konopasek I., Zarsky V. (2000) Chaperone activity of tobacco HSP18, a small heat-shock protein, is inhibited by ATP. Plant J. V. 23. p. 703-713

190. Steponkus P.L., Uemura M,, Joseph R.A., Gilmour S.J., Thomashow M.F. (1998) Mode of action of the COR15a gene on the freezing tolerance of Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA. V. 95. p. 14570-14575

191. Sugino M., Hibino Т., Tanaka Y., Nii N., Takabe T. (1999) Overexpression of DnaK from a halotolerant cyanobacterium Aphanothece halophytice acquires resistance to salt stress in transgenic tobacco plants. Plant Sci. V. p. 146:81-88

192. Sun W., Bernard C., van de Cotte В., Van Montagu M., Verbruggen N.2001) At-HSP17.6A, encoding a small heat-shock protein in Arabidopsis, can enhance osmotolerance upon overexpression. Plant J. V. 27. p. 407^415

193. Sunkar R. and Zhu J.K. (2004) Novel and stress-regulated microRNAs and other small RNA from Arabidopsis. Plant Cell. V. 16. p. 2001-2019.

194. Sze H., Lia X., Palmgrenb M.G. (1999) Energization of plant cell membranes by H-pumping ATPases: regulation and biosynthesis. Plant Cell. V. 11. p. 677-690

195. Takashi Hirayama and Kazuo Shinozaki (2010) Research on plant abiotic stress responses in the post-genome era: past, present and future The Plant Journal. V. 61. p. 1041-1052.

196. Tarczynski M.C., Jensen R.G., Bohnert H.J. (1993) Stress protection of transgenic tobacco by production of the osmolyte mannitol. Science, V. 259. p. 508-510

197. Teige M., Scheikl E., Eulgem Т., Do czi R., Ichimura K., Shinozaki K., Dangl J.L. and Hirt H. (2004) The MKK2 pathway mediates cold and salt stress signaling in Arabidopsis . Mol. Cell. V. 15. p. 141-152.

198. Thomashow M.F. (1998) Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance. Plant Physiol. V. p. 118:1-7

199. Thomashow M.F. (1999) Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms. Annu Rev Plant Bio. V. 150. p. 571-599

200. Thomashow M.F., Gilmour S.J., Stockinger E.J., Jaglo-Ottosen K.R., Zarka D.G. (2001) Role of the Arabidopsis CBF transcriptional activators in cold acclimation. Physiol Plant. V. 112. p. 171-175

201. Torres M. A. (2010)-R0s in biotic interactions. Physiologia Plantarum. V. 138. p. 414-429.

202. Torok Z., Goloubinoff P., Horvath I., Tsvetkova N.M., Glatz A., Balogh

203. Tyerman S.D., Bohnert H.J., Maurel C., Steudle E., Smith J.A.C. (1999) Plant aquaporins: their molecular biology, biophysics and significance for plant water relations. J Exp Bot. V. 50. p. 1055- 1071

204. Umezawa Т., Kobayashi M., Koshiba Т., Kamiya Y. and Shinozaki K.2006a) CYP707A3, a major ABA 8 ф -hydroxylase involved in dehydration and rehydration response in Arabidopsis thaliana. Plant J. V. 46. p. 171-182.

205. Umezawa Т., Fujita M., Fujita Y., Yamaguchi-Shinozaki K. and Shinozaki K. (2006b) Engineering drought tolerance in plants: discovering and tailoring genes to unlock the future. Curr. Opin. Biotechnol. V. 17. p. 113-122.

206. Yega S.E., de Rio A.H., Bamberg J.B., Palta J.P. (2004) Evidence for the Up-regulation of Stearoyl-ACP (A9) Desaturase Gene Expression during Cold Acclimation American J of Potato Res. V.81. p. 125-135.

207. Veinger L., Diamant S., Buchner J., Goloubinoff P. (1998) The smallheat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stressdenatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. J Biol Chem. Y. 273. p. 11032-11037

208. Vierling E. (1991) The roles of heat-shock proteins in plants. Annu Rev Plant Biol. V. 42. p. 579-620

209. Vierling E., Kimpel J.A. (1992) Plant responses to environmental stress. Curr Opin Biotech. V. 3. p. 164-170

210. Vega S.E., de Rio A.H., Bamberg J.B., Palta J.P. (2004) Evidence for the Up-regulation of Stearoyl-ACP (A9) Desaturase Gene Expression during Cold Acclimation American J of Potato Res. V.81.p. 125-135

211. Wang W.X., Vinocur В., Shoseyov O., Altman A. (2001a) Biotechnology of plant osmotic stress tolerance: physiological and molecular considerations. Acta Hort. V. p. 560:285-292

212. Waters E.R., Lee G.J., Vierling E. (1996) Evolution, structure and function of the small heat shock proteins in plants. J Exp Bot. V. p. 47:325-338

213. Wohlbach D.J., Quirino B.F. and Sussman M.R. (2008) Analysis of the Arabidopsis histidine kinase ATHK1 reveals a connection between vegetative osmotic stress sensing and seed maturation. Plant Cell, V. 20. p. 1101-1117.

214. Wood T.M., Bhat K.M. (1988) Methods for measuring cellulose activities. Meth Enzymol., V. 160. p. 87-112.

215. Xu C., Fan J., Cornish A.J., Benning C. (2008) Lipid trafficking between the endoplasmic reticulum and the plastid in Arabidopsis requires the extraplastidic TGD4 protein. Plant Cell. V. 20(8). p. 2190-204).

216. Xu P., Wang J., (1992) Fincher GB. Evolution and differential expression of the 1,3-beta-gluccan endohydrolase-encoding gene family in barley, Hordeum vidgare. Gene. V.120. p. 157-165.

217. Yamada K., Lim J., Dale J.M. et al. (2003) Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome. Science. V. 302. p. 842-846.

218. Yamanouchi U., Yano M., Lin H., Ashikari M., Yamada K. (2002) A rice spotted leaf gene, Spl7, encodes a heat stress transcription factor protein. Proc Natl Acad Sci USA. V. 99. p. 7530-7535

219. Yang M, Xu Y.Oleate accumulation, induced by silencing of microsomal omega-6 desaturase, declines with leaf expansion in transgenic tobacco.

220. Yara A, Yaeno T, Montillet JL, Hasegawa M, Seo S, Kusumi K, Iba K. (2008) Enhancement of disease resistance to Magnaporthe grisea in rice by accumulation of hydroxy linoleic acid. Biochem Biophys Res Commun. V. 30. p. 370(2):344-7).

221. Zeller G., Henz S.R., Widmer C.K., Sachsenberg Т., Ra tsch G., Weigel D. and Laubinger S. (2009) Stress-induced changes in the Arabidopsis thaliana transcriptome analyzed using whole-genome tiling arrays. Plant J. V. 58. p. 10681082.

222. Zhang H.X., Blumwald E. (2001) Transgenic salt-toleranl tomato plants accumulate salt in foliage but not in fruit. Nature Biotech. V. 19. p. 765-768

223. Zhu J.K. (2001a) Plant salt tolerance. Trends Plant Sci. V. 6. p. 66-71

224. Zhu J.K. (2001b) Cell signaling under salt, water and cold stresses. Curr Opin Plant Biol V.4.p.401^106

225. Zhu J.K. (2002) Salt and drought stress signal transduction in plants. Annu Rev Plant Biol V. 53. p. 247-73

226. Zhu J.K., Hasegawa P.M., Bressan R.A. (1997) Molecular aspects of osmotic stress in plants. Crit Rev Plant Sci. V. 16. p.253-277

227. Zhu S., Yu X., Wang X. et al. (2007) Two calcium-dependent protein kinases, CPK4 and CPK11, regulate abscisic acid signal transduction in Arabidopsis . Plant Cell. V. 19 p. 3019-3036.

228. Zhu J., Jeong J.C., Zhu Y. et al. (2008) Involvement of Arabidopsis HOS15 in histone deacetylation and cold tolerance. Proc. Natl Acad. Sci. USA. V. 105. p. 4945-4950

229. Zimmermann S., Sentenac H. (1999) Plant ion channels: from molecular structures to physiological functions. Curr Opin Plant Biol. V. 2. p. 477-482-t

230. Публикации по материалам работы:1. Статьи

231. Фадеев B.C., Шимшилашвили Х.Р., Гапоненко А.К. Индукционная, регенерационная и баллистическая восприимчивость различных генотипов мягкой пшеницы (Triticum aestivum L)/ Генетика. 2008. Т.44. №9.

232. Бердичевец И.Н., Гордукова М.А., Шимшилашвили Х.Р., Синдаровская Я.Р.,

233. Шимшилашвили Х.Р., Юрьева Н.О., Бердичевец И.Н., Гордукова М.А.,

234. Х.Р. Шимшилашвили. Термостабильная лихеназа как трансляционный репортер при изучении экспрессии гетерологичных генов в модельных организмах/ Статья в сборнике «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2006, с. 180-181.

235. М.А. Гордукова, Х.Р. Шимшилашвили, И.Н. Бердичевец. Дизайн системы анализа трансгенных растений методом мультиплексной ПЦР/ Материалы 62-й международной студенческой научной конференции секции «Генетика, селекция и биотехнология». Москва, 2009. С. 16.

236. И.Н. Бердичевец, Х.Р.Шимшилашвили, Я.Р. Синдаровская, Ю.В. Шелудько. Разработка системы праймеров мультиплексной ПЦР для отбора и анализа трансгенных растений.// Материалы V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва, 2009. с. 533.

237. А, Частота встречаемости кодонов гена desA цнанобактрий в геноме E.coli1. Codontable:1. Sscherichia coli100т