Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий

Хаммадов, Наиль Ильдарович

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий"

На правах рукописи

09460907«

ХАММАДОВ НАИЛЬ ИЛЬДАРОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗЛИЧНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТУБЕРКУЛЁЗА И АТИПИЧНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 СЕН 2010

Казань-2010

004609078

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр токсикологической и радиационный безопасности животных» (г. Казань).

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Фаизов Тагир Хадиевич Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Сафин Марат Абдрахманович; доктор биологических наук, профессор Хисматуллина НаиляАнваровна Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» Российской академии сельскохозяйственных наук

Защита состоится «7Ь>сг/*та&/{л 2010 г. в «/#» часов на заседании диссертационного совета Д-220.012.01 при ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» (420075, г. Казань, Научный городок - 2).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» (г. Казань)

Электронный вариант автореферата и текст объявления о защите размещен на сайте организации: http://www.vnivi.ru

Автореферат разослан «IV» 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук В.И. Степанов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Туберкулез наносит большой экономический ущерб животноводству и поэтому одной из важнейших задач ветеринарной науки и практики является разработка современных способов достоверной диагностики, а на этой основе полное оздоровление животных от туберкулеза (Макаров В.В., 1998; Ярёменко H.A., 2004). Кроме того, туберкулез представляет большую опасность для людей. По данным ВОЗ среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 3 млн случаев (Федоров Л.П., 1997; Dolin P.J., 1994; Drobniewski F.А., 1998; Pozzi G., 1999). В развивающихся странах смертельные случаи, связанные с туберкулезом, составляют около 25% от общего числа летальных исходов.

В системе борьбы с туберкулезом важна точная и своевременная лабораторная диагностика данного заболевания.

Существующие методы диагностики туберкулеза имеют определенные недостатки. Так, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе аллергической внутрикожной туберкулиновой пробы недостаточно эффективна, так как дает ложноположительные результаты. Бактериологический метод хотя и дешевый, но длительный по времени проведения анализа и недостаточно чувствительный, позволяет определять микобактерии туберкулеза в исследуемом материале только при наличии в 1мл диагностического материала не менее 100000 клеток микобактерий. При этом могут высеваться и атипичные микобактерии (Харитонов М.В. 1991; Найманов А.Х., 1990; Leite C.Q., 2003; Мс Corry Т.Р., 2004; Miller I.M., 2002; Pate М., 2004).

Самым чувствительным методом является биологическая проба. Однако данный метод для получения конечного результата требует длительного времени наблюдения за подопытными животными, в среднем до 2-3 месяцев (Сафин М.А. 1990).

Перспективным в этом отношении методом выявления микобактерий является высокоспецифичный и чувствительный метод полимеразной цепной

реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки не только выявлять сам возбудитель, но и идентифицировать его до вида по генетическим маркерам. К настоящему времени описано несколько систем для амплификации различных участков генома Mycobacterium tuberculosis (Фаизов Т.Х., 1995; Boddinghaus В., 1990; Dailloux М., 1996; Pao С.С., 1990; Van den Wijngaert S., 2004).

1.2 Цель и задачи исследований. Целью работы явилась изучение дифференцирующей способности основных методов генотипирования микобактерий и определение степени применения каждого из них.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать оптимальный метод выделения ДНК для различных методов генотипирования возбудителей туберкулёза.

2. Изучить и подобрать наиболее эффективные, специфичные молекулярно-генетические методы, пригодные для дифференциации видов и штаммов возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий.

3. Создать систему интерпретации результатов молекулярного генотипирования микобактерий.

1.3 Научная новизна. Впервые показано, что произвольный праймер N113 позволяет дифференцировать виды возбудителей туберкулёза, а праймер N29 обладает дифференцирующей способностью относительно штаммов этих микобактерий.

Установлено что при гидролизе эндонуклеазами рестрикции AspLe и Hinfl фрагмента IS6110, одновременно с идентификацией микобактерий в пробе, достигается и их межвидовая дифференциация.

Впервые разработана технология дифференциации вакцинного штамма М. bovis BCG от патогенных штаммов М. bovis и М. tuberculosis.

1.4 Практическая ценность работы. Разработанные и испытанные в практических условиях молекулярно-генетические методы: анализ VNTR локусов ДНК, ПДРФ на матрице инсерционного элемента IS6110 и анализ региона RD1 микобактерий могут быть внедрены в практику медицинских и

ветеринарных лабораторий.

Для практического применения предложен алгоритм, в котором имеется возможность генотипирования микобактерий как в выращенных культурах, так и непосредственно в патологическом материале, что существенно сокращает сроки идентификации и дифференциации (1-2 дня) по сравнению с бактериологическими методами и исключает субъективизм в постановке диагноза на туберкулёз.

Результаты проведенных исследований вошли в Методические рекомендации «Применение ПЦР с произвольными праймерами для дифференциации различных видов возбудителей туберкулёза», которые были одобрены НМС и утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».

1.5 Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на двух научно-практических конференциях в Казани (2007, 2009) и Международной конференции в Москве (2009).

1.6 Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе методические рекомендации, 4 работы опубликованы » реферируемых ВАК изданиях.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

- ПЦР с произвольными праймерами как универсальный метод генотипирования;

- Использование VNTR-анализа для идентификации и дифференциации штаммов микобактерий;

- Использование ПЦР-ПДРФ для идентификации микобактерий и проведения межвидовой дифференциации;

- Использование геноспецифичных праймеров для дифференциация Mycobacterium bovis BCG от патогенных микобактерий.

1.8 Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах печатного текста и включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение

результатов исследований, выводы, практические предложения, список используемой литературы и приложения. Список литературы содержит 245 источников (101 отечественных и 144 иностранных). Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 28 рисунками.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы исследований

Работа выполнялась в 2006-2010 годах в лаборатории биохимического и молекулярно-генетического анализа Федерального государственного учреждения «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных».

В работе использовались культуры микобактерий выращенные на питательных средах Левенштейна - Йенсена, полученные из туберкулёзного диспансера г. Казани. Это Mycobacterium bovis BCG, Mycobacterium avium штамм 104, Mycobacterium scrofulaceum штамм 14, ДНК Mycobacterium tuberculosis штамм H37Rv, Mycobacterium bovis штамм AF2122/97 и гетерогенные микроорганизмы (Escherichia coli штамм M17 и Brucella abortus штамм 19).

Первоначально культуры исследовали бактериологическими способами в соответствии с нормативно-технической документацией: «Методы лабораторной диагностики туберкулёза» (2002), далее идентифицировали и дифференцировали их с помощью ПЦР тест систем (НПО «Нарвак», ООО «ИнтерЛабСервис» и «Политуб»).

После идентификации микобактерий проводили их генотипирование, используя методы RAPD-PCR, анализ VNTR локусов и ПЦР-ПДРФ. Дифференциацию Mycobacterium bovis BCG от вирулентных микобактерий производили используя геноспецифичные праймеры на регион RD1.

Для генотипирования с использованием произвольных праймеров использовали 6 различных праймеров. Все использованные праймеры, кроме

одного восьминуклеогидного, состояли из десяти нуклеотидов. В данном методе генотипирования использовали праймеры LNA, N29, N106, N113, ОРАЮ и ОРА17.

При анализе VNTR регионов исследовали M1RÜ и ETR локусы. Для анализа MIRU локусов использовали праймеры для амплификации MIRU26 и ?v4IRU31 по системе MIRU-VNTR. VNTR-ETR регион исследовали по локусу ETR-A (по системе P. Supply и соавторы,, 2006).

После амплификации региона IS6110, полученный ПЦР-продукт подвергали рестрикции с различными эндонуклеазами. Для рестрикции использовали ферменты Alu I, AspLE, Hinfl, FatI, Hae 111 и Rsal с сайтами опознавания по 4 нуклеотида.

Подробно схемы опытов, методы и методики исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Бактериологические исследования.

Посев на питательную среду Левенштейна - Йенсена осуществляли стерильной бактериальной петлёй из пробирок, в которых вырастали колонии микобактерий. ? . - . '

На этой среде исследуемые микобактерии росли в виде R- форм, рост колоний проявлялся на 25 - 50-й день. Посеянные культуры пигмент не образовывали. Далее из выросших культур готовили мазки, окрашивали их и просматривали под микроскопом при увеличении объектива 90* с использованием иммерсионного масла. Одна из картин результатов микроскопии представлена на рисунке 1.

Рис.1. Результат микроскопии мазка, окрашенного по методу Циль-Нильсена.

Микобактерии имеют форму тонкой слегка изогнутой палочки, иногда прямой с несколько округлыми концам«, располагаются группами или по одной.

3.2 Использование ПЦР тест систем для индикации и дифференциации микобактерии.

Полимеразная цепная реакция является молекулярно-генетическим экспресс-методом исследования, основанным на обнаружении в исследуемом материале специфического фрагмента ДНК, характерного только для определенного вида возбудителя.

Результаты электрофореза в 2%-ном агарозном геле после амплификации с праймерами Т4, Т4А (после предварительной амплификации с праймерами Т2 и Т2А) и ТЗ, ТЗА (после предварительной амплификации с праймерами Т1 и TIA) для идентификации ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis с использованием тест-системы НПО «Нарвак» представлены на рисунках 2 и 3, соответственно.

Рис.2. Результат электрофореза после применения тест-системы

НПО «Нарвак» после амплификации с праймерами Т4 и Т4А. Обозначения: трек 1 отрицательный контрольный образец, трек 2 -Escherichia coli, штамм Ml7, трек 3 - Brucella abortus, штамм 82, трек 4 -Mycobacterium scrofulaceum, .трек 5 - Mycobacterium avium, трек 6 -Mycobacterium bovis BCG, трек 7 - Mycobacterium bovis, штамм А.Р2122/97, трек 8 - Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv. трек 9 - изолят № 5980,

трек 10 - изолят № 5545, трек 11 - изолят № 585, трек 12 - изолят № 5035, трек 13 - изолят № 942, трек 14 - изолят № 5969, трек 15 - изолят № 5656, трек 16-изолят № 5980.

'! I . а < £ - « О 10 И В •• .1

шаг®; с:: I ;::; <;«. ««¿; шж

Рис.3. Результат электрофореза с применением тест-системы

НПО «Нарвак» после амплификации с праймерами ТЗ и ТЗА.

Обозначения: трек 1 - отрицательный контрольный образец, трек 2 -Escherichia coli, штамм М17, трек 3 - Brucella abortus, штамм 82, трек 4 -Mycobacterium scrofulaceum, трек 5 - Mycobacterium avium, трек 6 -Mycobacterium bovis BCG, трек 7 - Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97, трек 8 - Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv, трек 9 - изолят № 5980, трек 10 - изолят № 5545, трек 11 - изолят № 585, трек 12 - изолят № 5035, трек

13 - изолят № 942, трек 14 - изолят № 5969, трек 15 - изолят № 5656, трек 16-изолят № 5980.

Применение тест-систем ООО «ИнтерЛабСервис» и «Политуб» дает картину идентичную картине электрофореза, представленного на рисунке 3 после амплификации с праймерами Т4 и Т4А (после предварительной амплификации с праймерами Т2 и Т2А) для идентификации ДНК Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis.

По результатам ПЦР с использованием тест-систем для индикации и дифференциации Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis, было установлено, что образцы № 5980, № 5545, № 585, № 5035, № 942, № 5969 и № 5656 являются Mycobacterium tuberculosis, атипичные микобактерии не идентифицировались, а контрольная ДНК реагировала адекватно.

3.3 Полимеразная цепная реакция с применением различных произвольных праймеров для идентификации и дифференциации микобактерий.

При проведении RAPD PCR применяли праймеры LNA, N29, N106, N113, ОРАЮиОРА17.

ПЦР с произвольными праймерами показала различные результаты: одни из них прекрасно подходили для дифференциации видов микобактерий, другие праймеры с успехом дифференцировали микобактерии по штаммовым различиям, третьи вовсе не были пригодны для генотипирования микобактерий.

Так, праймер N29 показал прекрасный результат дифференциации штаммов микобактерий, что выражалось в разнообразии длин ампликонов. Результаты ПЦР с произвольным праймером N29 представлены на рисунке 4.

Рис.4. Результат электрофореза в 2%-ном агарозном геле после амплификации с произвольным праймером N29.

Обозначения: треки 1 и 18 - маркеры молекулярного веса ДНК, трек 2 -отрицательный контрольный образец, трек 3 - Escherichia coli, штамм Ml7, трек 4 -Brucella abortus, штамм 82, трек 5 - Mycobacterium scrofulaceum, трек 6 -Mycobacterium avium, трек 7 - Mycobacterium bovis BCG, трек 8 - Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97, трек 9 - Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv, трек 10 - изолят № 5980, трек 11 - изолят № 5545, трек 12 -

изолят № 585, трек 13 - изолят № 5035, трек 14 - изолят № 942, трек 15 -изолят № 5969, трек 16 - изолят № 5656, трек 17- изолят № 5980.

Маркеры молекулярного веса ДНК имеют следующий молекулярный вес: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 2500, 3000 пар нуклеотидов.

Молекулярная масса паттернов и их количество представлены в таблице 1.

Таблица!. Характеристика паттернов образовавшихся в результате

ПЦР с праймером N29.

Штамм / изолят Кол-во паттерн ов Молекулярная масса паттернов, п.н.

Escherichia coli, штамм М17 11 120, 130, 180, 210, 290, 310, 340, 380, 440, 550 и 2900

Brucella abortus, штамм 82 2 450 и 910

Mycobacterium scrofulaceum 11 105,125,170,185, 205, 240, 290, 320, 390, 550 и 1090

Mycobacterium avium 8 200,250, 445, 530, 605, 800, 850 и 2700

Mycobacterium bovis BCG 6 280, 385,430, 790, 1550 и 2600

Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97 7 130, 170,190, 240,310, 330 и 650

Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv 6 130,170, 190, 240, 310 и 680

изолят № 5980 12 140,160, 180, 195, 240, 260, 290, 310, 340, 390, 420 и 540

изолят № 5545 12 140,155,180, 200, 220,290, 315, 330,400,420, 540 и 720

изолят № 585 8 225, 240, 295, 320, 395, 440, 515, и 575

изолят № 5035 6 140, 200, 240, 290, 310, 390 и 435

изолят № 942 12 140,155, 180, 200, 220, 290, 315, 330, 400, 420, 540 и 720

изолят № 5969 8 225, 240, 295, 320, 395, 440, 515, и 575

изолят № 5656 8 225, 240,295, 320, 395,440, 515, и 575

изолят № 5980 12 140, 160, 180, 195, 240, 260, 290, 310, 340, 390, 420 и 540

По результатам анализа полиморфизма длин амплифицированных фрагментов можно отметить полное совпадение профилей у изолята №5545 и изолята №942, что указывает на то, что данные изоляты относятся к одному и тому же штамму, также совпадение профилей отмечено у изолятов №585, №5969 и №5656, которые также можно отнести к одному штамму.

Аналогичное совпадение профилей амплифицированных фрагментов ДНК наблюдается на треках 10 и 17, в которые был намеренно внесён один и тот же изолят (они служили контролем воспроизводимости реакции).

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что данный праймер обладает хорошей дискриминирующей способностью и может с успехом применятся в генотипировании микобактерий. В тоже время из данных рис^. видно, что данный праймер может отличать Mycobacterium bovis BCG от атипичных и патогенных микобактерий.

Другим примером генотипирования является амплификация с произвольным праймером N113, результаты представлены на рисунке 5.

Рис.5. Результат электрофореза в 2% агарозном геле после амплификации с произвольным праймером N113.

6 - Mycobacterium avium, трек 7 - Mycobacterium bovis BCG, трек 8 -Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97, трек 9 — Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv, трек 10 - изолят № 5980, трек 11 - изолят № 5545, трек 12 -изолят № 585, трек 13 - изолят № 5035, трек 14 - изолят № 942, трек 15 -изолят № 5969, трек 16 - изолят № 5656, трек 17- изолят № 5980.

Молекулярная масса паттернов и их количество представлены в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика паттернов образовавшихся в результате ПЦР с праймером N113.

Штамм / изолят Кол-во паттерн ов Молекулярная масса паттернов, п.н.

Escherichia coli, штамм М17 1 730

Brucella abortus, штамм 82 7 280, 420, 440, 530, 650, 760 и 880

Mycobacterium scrofulaceum 5 600, 1100, 2000, 3300 и 4250

Mycobacterium avium 7 180, 320, 400, 500, 625, 850 и 950

Mycobacterium bovis BCG 4 230, 370, 405 и 510

Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97 4 130, 240, 390 и 500

Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 5980 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 5545 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 585 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 5035 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 942 8 150, 190, 280, 380,400, 540, 725 и 1400

изолят № 5969 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 5656 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

изолят № 5980 8 150, 190, 280, 380, 400, 540, 725 и 1400

По результатам анализа можно сделать заключение о том, что праймер N113 можно с успехом применять для идентификации Mycobacterium

tuberculosis, так как все исследуемые изоляты (относящиеся к Mycobacterium tuberculosis по результату П1ДР с набором НПО «Нарвак») дали паттерны с той же молекулярной массой, что и контрольный образец Mycobacterium tuberculosis. Следует отметить, что данный праймер обеспечивает дифференциацию Mycobacterium tuberculosis от Mycobacterium bovis, Mycobacterium bovis BCG и атипичных микобактерий. Однако указанный праймер непригоден для между штаммовой дифференциации микобактерий.

При использовании произвольных праймеров, амплифицирующих гипервариабельные участки генома микобактерий, метод обладает большой дискриминирующей способностью.

3.4 Анализ вариабельного количества тамдемных повторов.

Несколько другой результат генотипирования показывает метод VNTR. Данный метод рассчитан на более специфичное генотипирование по анализу определенного локуса ДНК.

В основе метода лежит амплификация участка ДНК, содержащего тандемные повторы. В зависимости от количества тандемных повторов ампликон имеет соответственную молекулярную массу, исходя из этого, можно дифференцировать разные виды и штаммы микроорганизмов. Результат представлен на рисунке 6.

Рис.6. Результат электрофореза в 2%-ном агарозном геле после мультиплексной ПЦР локусов М11Ш 31 и ЕТЯ-А.

Обозначения: треки 1 и 18 - маркеры молекулярной массы ДНК,

трек 2

- отрицательный контрольный образец, трек 3 - Escherichia coli, штамм М17, трек 4 - Brucella abortus, штамм 82, трек 5 - Mycobacterium scrofulaceum, трек б

- Mycobacterium avium, трек 7 - Mycobacterium bovis BCG, трек 8 -Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97, трек 9 - Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv, трек 10 - изолят № 5980, трек 11 - изолят № 5545, трек 12 -изолят № 585, трек 13 - изолят № 5035, трек 14 - изолят № 942, трек 15 -изолят № 5969, трек 16 - изолят № 5656, трек 17- изолят № 5980.

Молекулярная масса паттернов и их количество представлены в таблице 3. Табица 3. Характеристика паттернов образовавшихся в результате ПЦР с

праймерами амплифицирующими локусы MIRU 31 и ETR-A.

Штамм / изолят Кол-во паттернов Молекулярная масса паттернов, п.н.

Escherichia coli, штамм М17 0 -

Brucella abortus, штамм 82 0 -

Mycobacterium scrofulaceum 0 -

Mycobacterium avium 0 -

Mycobacterium bovis BCG 1 600

Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97 0 0

Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv 2 530 и 850

изолят № 5980 2 530 и 850

изолят № 5545 2 515 и 800

изолят № 585 2 515 и 800

изолят № 5035 2 415 и 700

изолят № 942 2 515 и 800

изолят № 5969 2 515 и 800

изолят № 5656 2 515 и 800

изолят № 5980 2 530 и 850

В результате генетического анализа локусов М1Яи 31 и ETR-A получилось два паттерна, каждый из которых характеризует штаммы по данному локусу. Анализируя молекулярную массу паттернов, можно сказать, что изоляты № 5545, № 585, № 942, № 596 и № 5656 являются

близкородственными, либо идентичными штаммами, а изолят №5035 относительно этих штаммов является неродственным. Изолят №5980 также отличается от изолятов №5545, № 585, № 942, № 5969, № 5656 и №5035.

Анализируя величину тандемных повторов в локусах MIRU 31 по системе P. Supply и соавт. (2006) и ETR-A по системе VNTR-ETR можно сказать, что данные праймеры комплементарны Mycobacterium tuberculosis и наличие паттернов свидетельствует о принадлежности изолятов к данному виду. Для более достоверной информации о штаммовой принадлежности необходимо анализировать изоляты по нескольким локусам.

3.5 Применение геноспецифичных праймеров для идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса и дифференциации Mycobacterium bovis BCG.

Результаты применения праймеров для амплификации региона RDI представлены на рисунке 7.

Рис.7. Результат электрофореза в 2%-ном агарозном геле после амплификации с праймерами ETI, ЕТ2 и ЕТЗ.

Обозначения: треки 1 и 18 - маркеры молекулярного веса ДНК, трек 2

- отрицательный контрольный образец, трек 3 - Escherichia coli, штамм Ml 7, трек 4 - Brucella abortus, штамм 82, трек 5 - Mycobacterium scrofulaceum, трек 6

- Mycobacterium avium, трек 7 - Mycobacterium bovis BCG, трек 8 -Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97, трек 9 - Mycobacterium tuberculosis,

штамм H37Rv, трек 10 - изолят № 5980, трек 11 - изолят № 5545, трек 12 -изолят № 585, трек 13 —' изолят № 5035, трек {4 - изолят № 942, трек 15 -изолят № 5969, трек 16 - иЗолят № 5656, трек 17- изолят № 5980.

В. этих опытах Escherichia coli, Brucella abortus, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium avium паттернов не образовали. В то же время, на м.атрице контрольных образцов Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis,,а также изолятов №5980, №5545№, № 585, № 942, №5035, № 5969 и № 5656 синтезировались олигонуклеотиды с молекулярной массой 150. п.н. На ДНК Mycobacterium bovis BCG образовался паттерн с молекулярной Массой 200 п.н..

Таким "образом, анализируя полученный результат можно сделать вывод о том, что данные праймеры являются высокоспецифичными (не амплифицирует фрагмент ДНК матрицы атипичных микобактерий и гетерологичных микроорганизмов, а амплификация ДНК матрицы патогенных микобактерий дает паттерн молекулярной массой 150 п.н.). Так же эти праймеры показали достаточно высокую дифференциацию Mycobacterium bovis BCG от патогенных микобактерий.

3.6 Применение ПЦР-ПДРФ для дифференциации видов микобактерий.

Сущность данного метода заключается в предварительной амплификации фрагмента с молекулярной массой 439 пар нуклеотидов, который затем (локус IS6110) подвергается обработке эндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) и в результате анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов становится возможной дифференциация видов микобактерий. Положительный результат предварительная амплификации специфичного для микобактерий этого фрагмента ДНК указывает на то, что все рестрикционные фрагменты принадлежат микобактериям.

Результаты применения фермента AspLE представлены на рисунке 8.

Данный фермент имеет сайт опознавания 5'-GCG|C-3'. Рестрикция происходит между G и С на участке ДНК, где встречается

последовательность GCGC.

Рис.8. Результат электрофореза в 2,5%-ном агарозном геле после рестрикции ферментом АэрЬе.

Обозначения: треки I и 15 - маркеры молекулярного веса ДНК, трек 2 -Mycobacterium scrofulaceum, трек 3 - Mycobacterium avium, трек 4 -Mycobacterium bovis BCG, трек 5 - Mycobacterium bovis, штамм AF2! 22/97, трек 6 - Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv, трек 7 - изолят N« 5980, трек 8 - изолят № 5545, трек 9 - изолят № 585, трек 10 - изолят № 5035, трек 11 - изолят № 942, трек 12 - изолят № 5969, трек 13 - изолят № 5656 и трек 14-изолят №5980.

Молекулярная масса паттернов и их количество представлены в таблице 4.

Результаты электрофорезов показали, что рестрикция ферментом AspLe амплифицированного фрагмента IS6110 не выявил внутривидового полиморфизма микобактерий. Однако здесь выявились межвидовые различия Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium avium, Mycobacterium bovis и Mycobacterium tuberculosis. Все изоляты Mycobacterium tuberculosis дали характерную картину электрофореза, аналогичную контрольному образцу

Mycobacterium tuberculosis, а контрольный образец Mycobacterium bovis показал картину электрофореза аналогичную вакцинному штамму Mycobacterium bovis BCG. Mycobacterium scrophulatium и Mycobacterium avium показали полиморфизм длин рестрикционных фрагментов не схожий ни с одним из исследуемых образцов, следовательно, эти результаты показали высокую межвидовую дифференциацию этих микроорганизмов. Таблица 4. Характеристика паттернов образовавшихся после

рестрикции ферментом AspLe.

Штамм / изолят Кол-во паттернов Молекулярная масса паттернов, п.н.

Mycobacterium scrofulaceum 7 48,63,84,109,242,281 и 439

Mycobacterium avium 7 43,61,82, 113,242,385 и 439

Mycobacterium bovis BCG 3 178,269 и 439

Mycobacterium bovis, штамм AF2122/97 3 178,269 и 439

Mycobacterium tuberculosis, штамм H37Rv 9 43,56,79,151,172,248,267,375 и 439

изолят № 5980 9 43, 56, 79, 151, 172,248,267,375 и 439

изолят № 5545 9 43,56, 79, 151, 172,248,267,375 и 439

изолят № 585 9 43, 56,79,151, 172,248,267,375 и 439

изолят № 5035 9 43,56, 79, 151, 172,248,267,3 75 и 439

изолят № 942 9 43, 56, 79, 151, 172,248, 267, 375 и 439

изолят № 5969 9 43,56, 79,151, 172,248,267, 375 и 439

изолят № 5656 9 43,56, 79, 151, 172,248,267,375 и 439

изолят № 5980 9 43,56,79, 151,172,248,267, 375 и 439

Таким образом, можно заключить, что произвольные праймеры вполне могут быть использованы для дифференциации видов и штаммов микобактерий. Они не требуют знания нуклеотидной последовательности амплифицируемого региона, что дает возможность генотипирования не только микобактерий, но и любых микроорганизмов. Данный метод прост в исполнении и обладает высокой дискриминирующей способностью. Однако

в связи с универсальностью произвольных праймеров и их способности инициировать синтез ампликонов на любых матрицах ДНК метод требует выделения чистых изолятов исследуемых микроорганизмов.

Метод VNTR позволяет генотипировать микобактерии на основании анализа конкретных локусов ДНК, амплифицируя локусы ДНК имеющиеся только у патогенных микобактерии. VNTR-анализ, идентифицируя патогенные микобактерии, дифференцирует и их штаммы.

Амплификация локуса RD1 в геноме Mycobacterium bovis позволяет дифференцировать Mycobacterium bovis BCG от патогенных микобактерии. В результате ПЦР с ДНК Mycobacterium bovis BCG синтезировался ампликон молекулярной массой 200 п.н., в то время как у всех патогенных штаммов микобактерий амплифицированный фрагмент имел молекулярную массу 150 п.н., а геномы атипичных микобактерий и гетерологичных микроорганизмов не имели комплементарные участки в ДНК с данными праймерами.

ПЦР-ПДРФ - высокоспецифичный метод, позволяющий с высокой достоверностью генотипировать микроорганизмы, на основе анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов гипервариабельных локусов. В нашем случае после проведения ПЦР во всех образцах синтезировались фрагменты молекулярной массой 439 п.н. Синтез данного фрагмента свидетельствует о присутствии в пробах микобактерий. В результате рестрикции ампликона и разнообразия молекулярных масс олигонуклеотидов, которая устанавливается электрофорезом, появляется возможность генотипирования по видовым признакам.

4 ВЫВОДЫ

1. При выделении ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции нуклеиновые кислоты сохраняют наибольшую целостность, что способствует повышению эффективности использования произвольных праймеров для генотипирования микобактерий.

2. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов, образовавшийся в

результате электрофореза с ПЦР-продуктами праймеров N29 и N113, позволяет проводить межштаммовую и межвидовую дифференциацию микобактерий.

3. Установлено, что гидролиз локуса ДНК IS6110 рестриктазами Alul, AspLE, Hinfl и Fatl дает возможность межвидовой дифференциации микобактерий, то есть выявляют генетические различия М. bovis, М. tuberculosis и атипичных микобактерий.

4. Информация о количественной вариабильности тандемных повторов в цепочке ДНК является специфичным и достоверным генетическим инструментом для межштаммовой дифференциации микобактерий.

5. При идентификации в исследуемом материале Mycobacterium bovis BCG и

дифференциации её от патогенных микобактерий наиболее эффективным является применение геноспецифичных праймеров для амплификации региона RD1.

5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При поступлении в лабораторию исследуемого материала рекомендуем применять следующий алгоритм генотипироваиия микобактерий:

- пробы необходимо исследовать в ПЦР для идентифицирования М. tuberculosis complex. Отсутствие амплификации будет свидетельствовать об отсутствии в пробе микобактерий, либо о присутствии атипичных микобактерий. Наличие специфичного ампликона является подтверждением присутствия в пробе М. tuberculosis, М. bovis, М. africanum либо М. mycroti.

- далее необходимо установить присутствие в пробе вирулентных микобактерий, с помощью амплификации региона RD1. Наличие ампликона мол массой 150 п.н. будет свидетельствовать о присутствии в пробе вирулентных микобактерий, а ампликон мол массой 200 п.н. укажет на присутствие в пробе М. bovis BCG.

- анализируя чистые культуры необходимо дифференцировать виды и штаммы микобактерий. Для дифференциации видов микобактерий использовать произвольный праймер N113 и метод ПЦР-ПДРФ. Для дифференциации штаммов микобактерий использовать ПЦР с произвольным праймером N29, анализ VNTR локусов и амплификацию локуса RDI для дифференциации М. bovis BCG от патогенных микобактерий.

2. При паспортизации коллекции штаммов микобактерий, наиболее эффективным методом их дифференциации и определения контаминации является применение произвольных праймеров. Предложенные нами произвольные праймеры можно использовать как для межвидовой, так и для межштаммовой дифференциации микобактерий. Они также подходят для дифференциации многих других микроорганизмов. Использовать произвольные праймеры рекомендуем согласно методическим рекомендациям: «Применение ПЦР с произвольными праймерами для дифференциации различных видов возбудителей туберкулёза», которые одобрены НМС и утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 2008 год.

6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хаммадов, Н.И. Идентификация возбудителя некробактериоза Fusobacterium necroforum в патматериале от крс методом ПЦР / Н.И. Хаммадов, К.В. Усольцев II Материалы научно-практической конференция молодых учёных и специалистов «Актуальные проблемы ветеринарии» 29 июня 2007 г. - Казань, 2007. - С. 135-137.

2. Хаммадов, Н.И. Генотипирование ДНК возбудителей инфекционных заболеваний животных с использованием произвольных праймеров / Н.И. Хаммадов // Достижения молодых учёных в производство: Научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов, посвященная 100 летаю со дня рождения профессора Х.Х. Абдуллина. - Казань, 2008. С.176-177.

3. Хаммадов, Н.И. Применение ПЦР с произвольными праймерами для

дифференциации различных видов возбудителей туберкулёза / A.B. Иванов, Т.Х. Фаизов, Р.Х. Юсупов, Н.М. Александрова, К.В. Усольцев, Н.И. Хаммадов // Методические указания, - Казань 2008,20с.

4. Хаммадов, Н.И. Анализ VNTR локусов (variable number of tandem repeats) в генотипировании микобактерий / Н.И. Хаммадов // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана «Современные тенденции развития ветеринарной медицины и инновационные технологии в ветеринарии и животноводстве», Казань 2009, С.136-140.

5. Хаммадов, Н.И. Результаты комплексных исследований крупного рогатого скота в благополучных по туберкулезу хозяйствах / Ф.Р. Латыпов, М.А. Сафин, С.Т. Закиров, Н.И. Хаммадов, Т.Х. Фаизов, Д.Г. Латыпов. // Ветеринарный врач, Казань. 2009, -№5 С.23-25.

6. Хаммадов, Н.И. Генотипирование микобактерий с использованием ПЦР с произвольными праймерами / Н.И. Хаммадов // Труды Кубанского государственного аграрного университета, Кубань 2009. - Т.6. -№1, С.114-116.

7. Хаммадов, Н.И. Дифференциация штаммов микобактерий с помощью метода RAPD / A.B. Иванов, Н.И. Хаммадов, К.В. Усольцев, А.Н. Чернов, Т.Х. Фаизов // Материалы пятого международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва 2009, С.317.

8. Хаммадов, Н.И. Генотипирование ДНК возбудителей инфекционных заболеваний животных с использованием произвольных праймеров / Н.И. Хаммадов // Ветеринарный врач, Казань. 2009, -№6 С.33-35.

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 1/16, оф.207

Тел: 272-74-59,541-76-41,541-76-51. Лицензия ПД №7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным . жеррипюрш!ыны.чущмйлеыием МПТР РФ, Подписано епечать^7.07.2010 г.Печл. Заказ МК-69П7. Ткраж 100 зю.-Формат-60х&41/16. ■ - -£умага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Хаммадов, Наиль Ильдарович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Основные свойства возбудителя туберкулёза.

1.2. Иммунитет при туберкулезе.

1.3. Методы диагностики туберкулёза.

1.4. Молекулярно - генетические методы исследований при идентификации и дифференциации возбудителя туберкулёза.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.,.

2.1. Материалы и методы исследований.

2.1.1. Материалы исследований.•.

2.1.2. Методы исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Бактериологические исследования.

3.2. Использование ПЦР тест-систем для индикации и дифференциации микобактерий.

3.3. Полимеразная цепная реакция с применением различных произвольных праймеров для идентификации и дифференциации микобактерий.

3.4. Анализ вариабельного количества тамдемных повторов при идентификации и дифференциации микобактерий.

3.5. Применение геноспецифичных праймеров для идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса и дифференциации Mycobacterium bovis BCG.

3.6. Применение ПЦР-ПДРФ для дифференциации видов микобактерий.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий"

Актуальность темы. Туберкулез наносит большой экономический ущерб животноводству и поэтому одной из важнейших задач ветеринарной науки и практики является разработка современных способов достоверной диагностики, а на этой основе полное оздоровление животных от туберкулеза (Макаров В.В., 1998; Ярёменко H.A., 2004). Кроме того, туберкулез представляет большую опасность для людей. По данным ВОЗ среднегодовая смертность, обусловленная туберкулезом, составляет около 3 млн случаев (Федоров Л.П., 1997; Dolin P.J., 1994; Drobniewski F.А., 1998; Pozzi G., 1999). В развивающихся странах смертельные случаи, связанные с туберкулезом, составляют около 25% от общего числа летальных исходов.

В системе борьбы с туберкулезом важна точная и своевременная лабораторная диагностика данного заболевания.

Существующие методы диагностики туберкулеза имеют определенные недостатки. Так, прижизненная диагностика туберкулеза крупного рогатого скота на основе аллергической вну.трикожной туберкулиновой пробы недостаточно эффективна, так как дает ложноположительные результаты. Бактериологический метод хотя и дешевый, но длительный по времени проведения анализа и недостаточно чувствительный, позволяет определять микобактерии туберкулеза в исследуемом материале только при наличии в 1мл диагностического материала не менее 100000 клеток микобактерий. При этом могут высеваться и атипичные микобактерии (Харитонов М.В. 1991; Найманов А.Х., 1990; Leite C.Q., 2003; Мс Corry Т.Р., 2004; Miller I.M., 2002; Pate М., 2004).

Перспективным в этом отношении методом выявления микобактерий является высокоспецифичный и чувствительный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий в короткие сроки не только выявлять сам возбудитель, но и идентифицировать его до вида по генетическим маркерам. К настоящему времени описано несколько систем для амплификации различных участков генома Mycobacterium tuberculosis (Фаизов Т.Х., 1995; Boddinghaus В., 1990; Dailloux ML, 1996; Pao C.C., 1990; Van den Wijngaert S., 2004).

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучение дифференцирующей способности основных методов генотипирования микобактерий и определение степени применения каждого из них.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

3. Создать систему интерпретации результатов молекулярного генотипирования микобактерий.

Научная новизна. Впервые показано, что произвольный праймер N113 позволяет дифференцировать виды возбудителей туберкулёза, а праймер N29 обладает дифференцирующей способностью относительно штаммов этих микобактерий.

Практическая ценность работы. Разработанные и испытанные в практических условиях молекулярно-генетические методы: анализ VNTR локусов ДНК, ПДРФ на матрице инсерционного элемента IS6110 и анализ региона RD1 микобактерий могут быть-внедрены в практику медицинских и ветеринарных лабораторий. •

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на двух научно-практических конференциях в Казани (2007, 2009) и Международной конференции в Москве (2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе методические рекомендации, 4 работы опубликованны в реферируемых ВАК изданиях.

Основные положения, выносимые на защиту:

- ПЦР с произвольными праймерами как универсальный метод генотипирования;

- Использование VNTR-анализа для идентификации и дифференциации штаммов микобактерий;

- Использование ПЦР-ПДРФ для идентификации микобактерий и проведения межвидовой дифференциации;

- Использование геноспецифичных праймеров для дифференциации Mycobacterium bovis BCG от патогенных микобактерий.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах печатного текста и включает разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список используемой литературы и приложения. Список литературы содержит 245 источников (101 отечественных и 144 иностранных). Диссертация иллюстрирована 17 таблицами и 28 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Хаммадов, Наиль Ильдарович

5. ВЫВОДЫ

2. Полиморфизм длин амплифицированных фрагментов, образовавшийся в результате электрофореза с ПЦР-продуктами праймеров N29 и N113, позволяет проводить межштаммовую и межвидовую дифференциацию микобактерий.

3. Установлено, что гидролиз локуса ДНК 1S6110 рестриктазами Alul, AspLE, Hinfl и FatI дает возможность межвидовой дифференциации микобактерий, то есть выявляют генетические различия М. bovis, М. tuberculosis и атипичных микобактерий.

5. При идентификации в исследуемом материале Mycobacterium bovis BCG и дифференциации её от патогенных микобактерий наиболее эффективным является применение геноспецифичных праймеров для амплификации региона RD1.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При поступлении в лабораторию исследуемого материала рекомендуем применять следующий алгоритм генотипирования микобактерий:

- далее необходимо установить ' присутствие в пробе вирулентных микобактерий, с помощью амплификации региона RDI. Наличие ампликона, мол. массой 150 п.н. будет свидетельствовать о присутствии в пробе вирулентных микобактерий, а ампликон мол. массой 200 п.н. укажет на присутствие в пробе М. bovis BCG.

- анализируя чистые культуры необходимо дифференцировать виды и ' « штаммы микобактерий. Для дифференциации видов микобактерий' использовать произвольный праймер N113 и метод ПЦР-ПДРФ. Для дифференциации штаммов микобактерий использовать ПЦР с произвольным праймером N29, анализ VNTR локусов и амплификацию локуса RDI для дифференциации М. bovis BCG от патогенных микобактерий.

2. При паспортизации коллекции штаммов микобактерий, наиболее эффективным методом их дифференциации и определения контаминаций является применение произвольных праймеров. Предложенные нами произвольные праймеры можно использовать как для межвидовой, так и для межштаммовой дифференциации микобактерий. Они также подходят для дифференциации многих других микроорганизмов. Использовать произвольные праймеры рекомендуем согласно методическим рекомендациям по «Применению ПЦР с произвольными праймерами для дифференциации различных видов возбудителей туберкулёза», которые одобрены НМС и утверждены директором ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 2008 год.

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Хаммадов, Наиль Ильдарович, Казань

1. Авербах М.М. Иммуногенетика инфекционных заболеваний / М.М. Авербах, A.M. Мороз, Б.В. Никоненко М.: Медицина, 1985.

2. Авербах М.М. Иммунология и иммунопатология туберкулеза / М.М. Авербах М.: Медицина, 1976. - 312с.

3. Авербах М.М. Циркулирующие иммунные комплексы и микобактериальные антигены в крови больных туберкулезом легких/ М.М. Авербах, Р.Ю. Романова, А.Б. Инсанов // ЖМЭИ. 1984. -№12.-С.91-94.

4. Аликаева А.Н. Метод выделения чистых культур возбудителя паратуберкулеза / А.Н. Аликаева // Ветеринария. 1957, -№5. С.79-81.

5. Аликаева А.П. Об идентификации выделенных от кур атипичных микобактерий А.П. Аликаева, О.В. Якушева // Труды ВИЭВ, 1978. -Т.47. С.48-52.

6. Аникин В. А. Совершенствование лабораторной диагностики туберкулеза / В.А. Аникин, А.Е. Дитятков, С.И. Белобородова, Д.З. Агаев, Г.Н. Кожухаров // Ветеринарная патология. 2004. -№1-2. С.30-32.

7. Байгазанов А.Н. Совершенствование мероприятий при туберкулезе личных подсобных хозяйств/ А.П. Байгазанов. // Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. Новосибирск, 1986. - С.49-51.

8. Беспалова А. http://revolution.allbest.ru/medicine/00025465.html. 2008.

9. Благодарный Я.А. Источники туберкулеза и меры профилактики / Я.А. Благодарный Алма-Ата, 1980. - 145с.

10. Боганец Н.С. Использование озона в бактериологической диагностике туберкулёза/ Н.С. Боганец, Л.Т. Аппельганц //Сибирский вестник с.-х. науки. Новосибирск, 2008. -№7. - С.84-87.

11. Бокун А.О. Патоморфологические изменения при псевдоаллергических реакциях на туберкулин у крупного рогатого скота / А.О. Бокун, Ю.И. Шербоха // Материалы 6 Всесоюзн. конф. по патологической анатомии животных. Тарту, 1977. - Т.2. - С. 105-106.

12. Буряк Е.И. Эффективность разных способов при жизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота / Е.И. Буряк // Ветеринария. 1986. -№>6. С.23-26.

13. Ванеева Л.И. Иммуноферментный метод и его настоящее и будущее / Л.И. Ванеева, Н.В. Цветкова // Иммунология. 1980. -№2. С.13-19.

14. Васильев В.Н. Микобактериозы и микозы легких / В.Н. Васильев // Медицина и физкультура. — София, 1971. 384с.

15. Вишневский Б.И. Применение прибора КЭФ для концентрации микобактерий туберкулеза / Б.И. Вишневский, Т.Ф. Оттем, Л.А. Марченко //Лабораторное дело. 1986. -№5. С.303-306.

16. Глазко В.И. ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих / В.И. Глазко, Е.В. Шульга, Т.Н. Дымань, Г.В. Глазко. // БелаяЦерковь — 2001.

17. Гудкин B.C. Актуальный вопросы взаимодействия микобактерий с макрофагами животных / B.C. Гудкин, В.А. Горбатов, Н.П. Овдиенко и др.. // Современные проблемы профилактики и лечения зоонозных заболеваний и лейкозов Минск, 1982. - С.77-79.

18. Гудкин B.C. Индуцированная биохемилюминесценция макрофагов при взаимодействии с клеточными оболочками микобактерий туберкулеза бычьего вида / B.C. Гудкин, В.А. Горбатов, А.П. Востряков // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. М.: 1986. - С.35-37.

19. Данко Ю.Ю. Характеристика культур микобактерий, выделенных от крупного рогатого скота и объектов внешней среды. Актуальные проблемы ветеринарной медицины / Ю.Ю. Данко// Сборник научных трудов. С-Петербург, 1997. С.31т32.

20. Джупина С.И. О причинах ухудшения эпизоотической ситуации по туберкулёзу / С.И. Джупина // Ветеринария. 2008. -№4. С.21-23.

21. Донченко A.C. Взаимосвязь клеточного и гуморального иммунитета при сенсибилизации различными микобактериями / A.C. Донченко,

22. B.Н. Донченко, М.А. Мандро, В.А. Середин // Ветеринария. 1986. -№6. С.28-30.

23. Дубинина И.П. Использование метода ПЦР в клинико-диагностических лабораториях. / И.П. Дубинина //Лаборатория. 1996. -№4. С.4-6.

24. Желткова Е. VNTR-типирование культур микобактерий туберкулеза из Самарской области / Е. Желткова, М. Радди, Н. Маломанова и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2004. -№1.1. C.35-37.

25. Зыков М.П. Потенциально патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов / М.П. Зыков, Т.Б. Ильина. М.: Медицина, 1978. - 161с.

26. Иванов П.Л. индивидуализация человека и идентификация личности: молекулярная биология в судебной экспертизе / П.Л. Иванов // Вестник российской академии наук. 2003. - Т.73. № 12. - С.1085-1097.

27. Идрисов Г.З. Современные методы диагностики и меры борьбы с туберкулезом животных / Г.З. Идрисов, М.А. Сафин // Казань: Таткнигоиздат, 1992. 168с.

28. Каграманов А.И. Современные вопросы и эпидемиологии и выявления туберкулеза / А.И. Каграманов, Н.М. Макаревич // Алма-Ата. 1977. -С.20-21.

29. Каплин H.H. О роли противотуберкулезных антител к различным химическим субстанциям возбудителя / H.H. Каплин, С.Н. Головачева// Проблемы туберкулеза. 1977. -№5. С.64-66.

30. Кассич Ю.Я. Комлексная диагностика туберкулеза / Ю.Я. Кассич, А.Т. Борзяк // Ветеринария. 1985: -№4. С.28-29.

31. Кисленко В.Н. О выживаемости микобактерий туберкулеза бычьего вида в почве и на пастбище / В.Н. Кисленко // Научные труды Новосибирского СХИ. Новосибирск, 1971. - Т.45. - С.12-17.

32. Кныш C.B. Серологические реакции при экспериментальном туберкулезе телят / C.B. Кныш // Вестник сельскохозяйственнойнауки. 1968.-№1.-С.17-18.

33. Коваленко И.В. Обоснование и разработка выявления и идентификации форм микобактерий методом иммунофлюоресценции / И.В. Коваленко, И.Р. Дорожкова // ЖМЭИ. 1986. -№6. С.35-38.

34. Козулицина Т.И. Состояние и перспектива научных исследований по диагностике и профилактике туберкулеза и бруцеллеза и меры борьбы с этими болезнями с/х животных / Т.И. Козулицина, Т.М. Макоревич, A.M. Кадочкина // Тр. сиб. НИВИ. Омск, 1980. -С.65-68.

35. Кокуричев П.И. Туберкулез / П.И. Кокуричев // Атлас патологической анатомии с/х животных.-Л.: 1973.- С.39-53.

36. Кондратьев В.Г. Бактериологическая диагностика и биопроба при туберкулезе крупного рогатого скота/ В.Г. Кондратьев // Всесоюзн. научн. конф. Омск, 1980.

37. Конопаткин A.A. Эпизоотология и инфекционные болезни с/х животных / A.A. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин и др. -М.: Колос, 1984.-С. 163-172.

38. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов/ Т.В. Коронелли М.: МГУ, 1984. - С.18-68.

39. Кособуцкий Л.А. / фаги микобактерий / Л.А. Кособуцкий // Микробиология. 1971. -№1. С.79-84.

40. Кузьмина H.A. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК / http://www.biotechnolog.ru/ge/ge6l.htm.2006.

41. Курмышев И.А. JI-формы микобакгерий и проблемы патогенеза туберкулёза / ИЛ. Курмышев, М.Г. Бехтер // Ветеринарный врач. 2005. -№4. С.31-34.

42. Лобзин Ю.В. Проблема инфекции в современной медицине / Ю.В. Лобзин, В.В. Волжанин, С.А. Захарченко // Врач. 2004. -№2. С.5-9.

43. Макаров ВБ. Эпизоотология и инфекционные болезни / В.В. Макаров, С.И. Джупина, ДА. Васильев, О.И. Сухарев, А.И. Козин // Учебное пособие, -Ульяновск Москва 1998,60с.

44. Маниатис Т. Векторы, используемые для экспрессии клонированной ДНК в Е. Coli / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук // Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. С.403-405.

45. Мартма О.В. Современное состояние проблемы атипичных микобактерий в ветеринарии / О.В. Мартма // Ветеринария. 1982. -№5. С.22-26.

46. Мартма О.В. О возбудителях в течении бактериоза / О.В. Мартма, К.К. Тяхнас // Туберкулез крупного рогатого скота и меры борьбы с ним. -Новосибирск, 1986. С.96-100.

47. Мникова Л.А. Применение иммуноферментного анализа в диагностике ротовирусной инфекции крупного рогатого скота / Л.А. Мникова, B.C. Авилов, М.М. Гоголев // Бюллетень ВИЭВ. 1985. -Вып.58. - С.26-29.

48. Нарвская О.В, Мокроусов И.В. http://www.pasteur.socspb.ru/news/publication/2002/03/18/events9107.2002.

49. Найманов А.Х. Применения диагностических тестов в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах / А.Х. Найманов, Р.А. Нуратинов, А.С. Дубовой // Ветеринария. 1990. С.31-33.

50. Новиков A. Medinfo. http://www.refmed.ru/health/theliteratiireanotherthebookongenetic s/m/33524/l.72.html. 2008.

51. Новошинов Г.П. Иммуноферментньш метод / Г.П. Новошинов // Методические указания. Казань, 1985. - 27с.

52. Овдиенко Н.П. Туберкулёз как международная и национальная медико-ветеринарная проблема в современных условиях Л Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов, Н.Г., Толстенко и др.. // Ветеринарный врач. 2009. -№2.-С.14-18.

53. Папуниди К.Х. Иммуноферментньш метод для серологическойдиагностики ботулизма / К.Х. Папуниди, Г.Л. Адгамова // Рациональные методы профилактики, диагностики и терапии незаразных болезней животных: сб. науч. тр. ЬСВН Казань, 1993. -С.94-95.

54. Пинчук Л.М. Идентификация микобактерий с применением метода газовой хромотографии жирных кислот / Л.М. Пинчук, А.Л. Лазовская // Вопросы взаимосвязи туберкулеза человека и животного. Алма-Ата, 1981. С. 148-156.

55. Пожалова Р.В. Сравнительная оценка классического и ускоренного методов бактериологической диагностики "туберкулеза крупного рогатого скота и птиц / Р.В. Пожалова, Л.С. Попова, В.В. Кузьмина // Тр. Краснодарского НИВС. 1965. -Т.З. С.70-71.

56. Пономарёв А.Б. Совершенствование лабораторно-диагностической работы в России. / А.Б. Пономарёв // Ветеринария. 1998. -№3. С.З-5.

57. Пташкин В.А. РБТЛ и кожная аллергическая проба при сенстбилизации и экспериментальном туберкулезе крупного рогатого скота / В.А. Пташкин, B.C. Гуткин, В.А. Горбатов и др. // Труды ВИЭВ. 1985. Т.63.-С.21-25.

58. Ротов В.И. Туберкулез с/х животных / В.И. Ротов, П.И. Кокуричев, П.Е. Савченко и др. Киев: Урожай, 1978. - С.240.

59. Сафин М.А. Влияние гормональных препаратов на течение экспериментального туберкулеза / М.А. Сафин, Е.Б. Галкин // Матер, науч. конф. Казанского вет. ин-та. Казань, 1971. - С.251-252.

60. Сафин МЛ. Туберкулёз сельскохозяйственных животных / МЛ. Сафин, М.В. Харитонов // Учебное пособие. Казань, 1990. 53с.

61. Сафин М.А. Туберкулез сельскохозяйственных животных и меры борьбы с ним / М.А. Сафин // Учебное пособие. Казань, 1982. 72с.

62. Смирнов А.М. Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных / А.М. Смирнов // Ветеринарная патология. 2004. -№1-2. -С.10-13.

63. Смирнов Г.Б. Механизмы приобретения и потери генетической информации бактериальными геномами. / Г.Б. Смирнов // Успехи современной биологии. 2008. Т.128. -№1. - С.52-76.

64. Сулимова Г.Е. Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК у сельскохозяйственных видов: методы изучения и перспективы тестирования / Г.Е. Сулимова // Успехи современной генетики. 1993. Вып. 18.-С.18-24.

65. Сурикова О.В. Опыт использования VNTR-типирования Mycobacterium tuberculosis для решения" клинических задач: контроля за качеством лечения и работой лабораторной службы / О.В. Сурикова, Д.В. Войтих, Ю.Н. Курунов, М.Л. Филипенко //

66. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. -№2. -С.21-24.

67. Тузова Р.В. Патогенез туберкулеза птичьего типа у млекопитающих / Р.В. Тузова// Проблемы туберкулеза. 1966. -№1. 21с.

68. Туркебаева К.А. Патологическая анатомия туберкулеза млекопитающих и виды микобактерий / К.А. Туркебаева, Я.А. Благодарный // Алма-Ата: Наука, 1981. 216с.

69. Удина И.Г. Изучение полиморфных маркеров генов PARK2 PACRG в связи с заболеванием туберкулезом легких в двух районах республики Тыва / И.Г. Удина и др. // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. -№7. С.27-29.

70. Урбан В.П. Аллергическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота / В.П. Урбан, М.М. Широбокова, Ю.Ю. Данко и др. // Профилактика и ликвидация заразных болезней с/х животных и птиц.-Л.: 1985. -С.80-85.

71. Урбан В.П. Практикум по эпизоотологии и инфекционным зобалеваниям с ветеринарной санитарией / В.П. Урбан, МА. Сафин, А А. Сидорчук и др.. // М.: Колос, 2004.-215с.

72. Фаизов Т.Х. Полимерозная цепная реакция в инфекционной патологии / Т.Х. Фаизов // Тез. докл. науч. конф. по проблемам ветеринарии и животноводства. Казань. 1995. - С.4-5.

73. Фогель Ф. Генетика человека / Ф. Фогель, А. Мотульски // М.: Мир, 1990. — Т.1-3. 378с.

74. Хазипов Н.З. Туберкулез крупного рогатого скота / Н.З. Хазипов, МА. Сафин, Г.З. Идрисов -М.: Агропромиздат, 1985. 127с.

75. Хамзин А.З. Роль L-форм микобактерий в эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота и прогнозирование эпизоотической ситуации с помощью бактериологического надзора / А.З. Хамзин // Дисс. канд. вет. наук. Казань. 2001. 18с.

76. Харитонов М.В. Разработка системы противотуберкулезных мероприятий в условиях широкого выявления неспецифических реакций на туберкулин. / М.В. Харитонов // Дисс. док. вет. наук. Казань. 1991.

77. Харитонов М.В. Совершенствование методов дифференциации неспецифический туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота/ МБ. Харитонов // Дисс. кандидата вет. наук. Казань. 1983.

78. Хоменко А.Г. Современные представления о строении M.tuberculosis / А.Г. Хоменко, Н.В. Ерохин // ЖМЭИ. 1982. -№12. - С.33-40.

79. Хузин Д.А. Иммуноферментный метод определения антител к возбудителю некробактериоза / Д.А. Хузин, Е.К. Акимов, Н.А. Хисматуллина, В.В. Сабирова // Матер. Международ, конф., посвящ. 125-летию академии. Казань, 1998. -Ч.1.-С.111-112.

80. Ченоусова Л.Н. Генотипирование микобактерий, выделенных от больных туберкулёзом из пенитенциарного учреждения / Л.Н. Черноусова, С.Н. Андреевская, Т.Г. Смирнова, Н.И. Катулина, МЛ. Шудрова // Пробл. туб. 2001. -№7. С.60-62.

81. Чередник Ю.А. Молекулярно-генетическое типирование клинических изолятов Mycobacterium tuberculosis в Украине / Ю.А. Чередник, О.В. Аноприенко, Ю.И. Фещенко // Украинскийпульмонологичний журнал. 2005! -№4. С.66-68.

82. Шагинян И.А. ПЦР-генетическое типирование возбудителей бактериальных инфекций. / И.А. Шагинян, A.JI. Гинцбург // Генетика 1995. 31: 600 -10.

83. Шарифуллин Э.А. Серологическая диагностика туберкулеза крупного рогатого скота и идентификация микобактерий / Э.А. Шарифуллин // Дисс. канд. вет. наук, Алма-Ата. 1981.

84. Шебанов Ф.В. Туберкулез / Ф.В. Шебанов // М.: Медицина, 1981. -368с.

85. Шемякин И.Г. Генетические особенности современных микобактерий туберкулезного комплекса / И.Г. Шемякин, В.Н. Степаншина // Микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2006.-№6.-С. 71-76.

86. Шлыгин И.В. Значение иммунологических реакций при эпизоотическом обследовании свежих и стационарных очагов туберкулеза крупного рогатого скота / И.В. Шлыгин, Э.Д. Лакман // Сборник НИВИ Омск, 1976. -Вып.27. - С.35-41.

87. Шуцкая Е.И. Хемилюминисцентный метод в диагностике туберкулеза / Е.И. Шуцкая, Ю.Г. Земинский, Т.И. Дербикова, В.В. Недточный // Биохемилюминесценция в сельском хозяйстве. М.: 1986. - С.90-92.

88. Adams L.G. In vivo and in vitro diagnosis of Mycobacterium bovis infection // Rev Sei Tech. 2001, Apr. 20(1): 304-24.

89. Addo K.K., Owusu-Darko K., Dan-Dzide M., Yeboah-Manu D.,

90. Ablordey A., Caulley P., Minamikawa M., Bonsu F., Lienhardt C., Akpedonu P., Ofori-Adjei D. Situation analysis of TB microscopy centres in Ghana // Int J Tuberc Lung Dis. 2006, Aug. 10(8): 870-5.

91. Al-Hajoj S.A., Zozio T., Al-Rabiah F., Mohammad V., Al-Nasser M., Sola C., Rastogi N. First insight into the population structure of Mycobacterium tuberculosis in Saudi Arabia // J Clin Microbiol. 2007, Aug. 45(8): 2467-73.

92. Alves B.C., Hossepian de Lima V.F., Moreira-Filho C. Development of Y-chromosome-Specific SCAR Markers Conserved in Taurine, Zebu and Bubaline Cattle // Reprod Domest Anim. 2009, Jul. 7.

93. Ang M., Htoon H.M., Chee S.P. Diagnosis of tuberculous uveitis: clinical application of an interferon-gamma release assay // Ophthalmology. — 2009, Jul. 116(7): 1391-6.

94. Arbeit R.D., Maslow J.N., Mulligan M.E. Polymerase chain reaction-mediated genotyping in microbial epidemiology // Clin. Infect Dis. 1994. 18: 1018-9.

95. Asakura N., Mori N., Nakamura C., Ohtsuka I. Genotyping of the Q locus in wheat by a simple PCR-RFLP method // Genes Genet Syst. 2009, Jun. 84(3): 233-7.

96. Athamna A., Cohen D., Athamna M., Ofek I., Stavri H. Rapid identification of Mycobacterium species by lectin agglutination // J Microbiol Methods. 2006, May. 65(2): 209-15.

97. Barman P., Gadre D. A study of phage based diagnostic technique for tuberculosis // Indian J Tuberc. 2007, Jan. 54(1): 36-40.

98. Bennet J J. Les difficulties d'interpretation lors du depistage de la tuberculose bovine: remedes possible I I Lyon, 1984. P. 1-17.

99. Bhaskar S., Banavaliker J.N., Hanif M. Large-scale validation of a latex agglutination test for diagnosis of tuberculosis // FEMS Immunol Med Microbiol. -2003, Dec. 5; 39(3): 235-9.

100. Bifani P.J., Mathema B., Kurepina N.E., Kreiswirth B.N. Global dissemination of the Mycobacterium tuberculosis W-Beijing family strains // Trends Microbiol. 2002. V.10, - №1. - P. 45-52.

101. Boddinghaus B., Rogall T., Flohr T., Blocker H., Bottger E. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA // J. Clin. Microbiol. 1990. №28. - P. 1751-1759.

102. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.V. // Amer. J." Hum. Genet. 1980.-V.32.-P.314.

103. Brow M., Oldenburg M.C., Lyamichev V. et al. Differentiation of bacterial 16S rRNA genes and untergenic regions and Mycobacterium tuberculosis katG genes by structure-specific endonuclease cleavage. J Clin Microbiol. 1996. 34: 3129-37.

104. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using veiy short arbitrary oligonucleotide primers. // Biotechnology. 1991. 9: 553-7.

105. Cockerill F.R. Genetic Methods for Assessing Antimicrobial Resistance. // Antimicrob Agents Chemother. 1999. №43 - P. 199-212.

106. Cousins D.V., Florisson N. A review of tests available for use in the diagnosis of tuberculosis in non-bovine species // Rev Sci Tech. 2005, Dec. 24(3): 1039-59.

107. Dolin P.J., Raviglione M.C., Kochi A. Global tuberculosis incidence and mortality during 1990-2000 // Bull. Wld Hit Org. 1994. V.72. - P. 213220.

108. Dragon A.D., Spadoro J.P., Madej R. Quality Control of Polymerase Chain Reaction. // Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington, 1993. P. 160.

109. Drobniewski F.A., Wilson S.M. The rapid diagnosis of isoniazid and rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis a molecular story // J Med Microbiol. 1998. - V.47. - P. 189-196.

110. Dube R., Rook G.A., Steele J., Brealey R., Dwek R., Rademacher T., Lennard-Jones J. Agalactosyl IgG in inflammatory bowel disease:correlation with C-reactive protein // Gut. 1990, Apr. 31(4): 431-4.

111. Dym O., Albeck S., Peleg Y., Schwarz A., Shakked Z., Burstein Y., Zimhony O. Structure-function analysis of the acyl carrier protein synthase (AcpS) from Mycobacterium tuberculosis // J Mol Biol. 2009, Sep. 2.

112. Ellertsen L.K., Storla D.G., Diep L.M., Brokstad K.A., Wiker H.G., Hetland G. Allergic sensitisation in tuberculosis patients at the time of diagnosis and following chemotherapy // BMC Infect Dis. — 2009, Jun. 26; 9: 100.

113. Engvall E., Jonsson K., Perlman P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), quantitative assay of immunoglobulin G // Immunochem. 1971. -V.8.-P. 871-874.

114. Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M., Stich R.W. Amplification-fragment length polymorphism in Brucella strains by use of polymerase chain reaction with arbitrary primers // J. Bacteriology. 1992, - V.174, -№23. -P. 7778-7783.

115. Finegold I. Nontuberculous mycobacterial infection in the differential diagnosis of chronic cough // Allergy Asthma Proc. — 2008, May-Jun. 29(3): 343-4.

116. Francis L., Seiler R.I., Frost A.I. The efficiency and dose bovine purified protein derivative tuberculin // J. Australian veter. 1978. №54. - P. 4547.

117. Fredericks D.N., Relman D.A. Application of Polymerase Chain Reaction to the Diagnosis of Infectious Diseases. // Clin Infect Dis. 1999. №.29. P. 457-488.

118. Frothingham R., Meeker-O' Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats // Microbiology. 1998. V.144. №5. - P. 11891196.

119. Gilmour N.J.R., Augus K.N. The specificity and sensitivity of the fluorescent antibody test in cattle experimentally infected with M. avium and M.jonnei. // Res. In veter. Sc. 1976. V.20. - №1. - P. 69.

120. Grange J.M. The humoral immune response in tuberculosis : its nature, biological role and diagnostic usefulness // Advances in Tuberculosis ; Research. 1984. №21. - P. 1-78.

121. Griender K., Wendt K., Fuchs H.W., Boretius J. Atipische Mycobacterion als Erreger enzootisch verlaufender Mastitigen // Mh. Veter .Med. 1984. -V.39 №21. - P. 721.

122. Grossmann T.N., Seitz O. Nucleic acid templated reactions: consequences of probe reactivity and readout strategy for amplified signaling and sequence selectivity // Chemistry. 2009, Jul. 6; 15(27): 6723-30.

123. Gubkina M.F., Gazizova I.K., Ovsiankina E.S., Ershova N.G. Tuberculin sensitivity in children and adolescents with tuberculosis // Probl Tuberk Bolezn Legk. 2007, (6): 53-6.

124. Guimaraes H. Recent Patents on DNA Sequences and Diagnostic Methods for the Identification and Strain Differentiation of Mycobacterium tuberculosis // Recent Pat DNA Gene Seq. 2009, Nov.

125. Haefliger E. Tuberculosis: a perspective on its development from an epidemic to an endemic disease—reminiscences of a contemporary witness//Praxis. 2006, Oct. 11; 95(41): 1577-81.

126. Hejazi A., Keane C.T., Falkiner F.R. The use of RAPD-PCR as a typing method for Serratia marcescens // J. Med. Microbiol. 1997. V.46. - P. 913-919.

127. Honscha G., Von Groll A., Valen9a M., Ramos D.F., Sanchotene K., Scaini C.J., Ribeiro M.O., da Silva P.E. The laboratory as a tool to qualify tuberculosis diagnosis // Int J Tuberc Lung Dis. 2008, Feb. 12(2): 21820.

128. Hosen H. Moulds in allergy // J. Auth. a Res. 1977. №15. P. 151-156.

129. Hugo M., Turell L., Manta B., Botti FI., Monteiro G., Netto LE., Alvarez B., Radi R., Trujillo M. Thiol and sulfenic acid oxidation of AhpE, the one-cysteine peroxiredoxin from Mycobacterium tuberculosis: kinetics,

130. Hujer A.M., Page M.G., Helfand M.S., Yeiser В., Bonomo R.A. Development of a sensitive and specific enzyme-linked immunosorbent assay for detecting and quantifying CMY-2 and SHV beta-lactamases // J Clin Microbiol. 2002, Jun. 40(6): 1947-57.

131. Ikonomopoulos J., Fragkiadaki E., Liandris E., Sotirakoglou K., Xylouri E., Gazouli M. Estimation of the spread of pathogenic mycobacteria in organic broiler farms by the polymerase chain reaction // Vet Microbiol. -2009, Jan. 13; 133(3): 278-82.

132. Ishikawa J., Fujita K., Kanno Т., Maekawa M. Lactate dehydrogenase (LD) extra isoenzyme electrophoretic band between LD1 and LD2 caused by a complex with alphal-lipoprotein. A case report // Clin Chem Lab Med. 2004, Jan, 42(1): 102-4.

133. Johnson J.R., Owens K., Gajewski A., Clabots С. Колонизация E. coli членов семьи и домашних животных как фактор риска инфекций мочевыводящих путей // J Infect Dis. 2008, Jan. 15; 197(2): 218-24

134. Kamerbeek J., Schouls A., Kolk M. et al. Simultaneous detection and strain differentiation of M.tuberculosis for diagnosis and epidemiology // J. Clin. Microbiol. 1997. V.35. - P. 907-914.

135. Kansal A.P., Chopra V., Singh H., Singh U. Tubercular hepatic abscess a rare presentation // Indian J Tuberc. 2008, Oct. 55(4): 217-20.

136. Kemp H.A., Morgan M.R.A. Studies on the^ determental effects of bivalent binding in a microtitration plate ELISA and possible remidies //

137. J. Immun. Meth. 1986. V.94. - №1-2. - P. 65-72.

138. Kremer K., van Soolingen D., Frothingham R. et al. Comparison of methods based on different molecular epidemiological markers for typing ofi

139. Mycobacterium tuberculosis complex strains: interlaboratory study of dis- * criminatory power and reproducibility // J. Clin. Microbiol. 1999. V.37. - № 8.-P. 2607-2618. "

140. Lari N., Rindi L, Bonanni D, Tortoli E, Garzelli C. Molecular analysis of clinical isolates of Mycobacterium bovis recovered from humans in Italy // J Clin Microbiol. 2006, Nov. 44(11): 4218-21.

141. Le Fleche P., Fabre M., Denoeud F., Koeck J.L., Vergnaud G. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacteriumtuberculosis complex based on tandem repeat typing // BMC Microbiol. 2002. V.2. - №11. - P. 37-48.

142. Leflon-Guibout V., Pons J-L., Heym B., Nicolas-Chanoine M-N. Typing of Clostridium perfringens strains by use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) system in comparison with zymotyping // Anaerobe. 1997, 3: 245-50.

143. Leite C.Q., Anno J.S., Leite S.R., Roxo E., Morlock Q.P., Cooksey R.S. Isolation and identification of mycobacteria from livestock specimens and milk obtained in Brazil // Mem. Just. Oswold Cruz. 2003. №98(3). - P. 319-323.

144. Lentonen O.P., Viljanen M.K. Antigen attachment in ELISA // J. of immunol. Meth. 1980. №34. - P. 61-70.

145. Leung A.K.C., Robson W.L.M Childhood cervical lymphadenopathy. // J Pediatr Health Care. 2004. 18(1): 3-7.

146. Lukusa T., Fryns J.P. Human chromosome fragility // Biochim Biophys Acta. 2008, Jan. 1779(1): 3-16.

147. Maiorova A.A., Stepanshina V.N., Shemiakin I.G., Korobova O.V. Study of collections of Mycobacterium non-tuberculosis by a restriction test of the amplified fragment spacer sequence 16S-23S of ribosomal DNA //

148. Probl Tuberk Bolezn Legk. 2004, (11): 34-7.

149. Mc Corry T.P., Mc Cormick CM., Hughes M.C., Pollack J.M., Neill S.D. Mycobacterium nonchromogenicum in nasal mucus from cattle in a herd infected with bovine tuberculosis // Vet. Microbiol. 2004. №99(3-3). - P. 281-285.

150. Mehta S.R., MacGruder C., Looney D., Johns S., Smith D.M. Differences in tuberculin reactivity as determined in a ^veterans administration employee health screening program // Clin Vaccine Immunol. 2009, Apr. 16(4): 541-3.

151. Meyer T.J., Ribi E., Azuma J. Biologically active components from mycobacterial cell walls: suppression and regresibr of strain 2 quinea pig hepatoma // J. Natl. Conser Instr. 1974. V.52. - P. 103-111.

152. Miller I.M., Ienny A.L., Paycur I.B. Polymerase chain reaction defection of Mycobacterium tuberculosis complex and Mycobacterium avium organisms in formalin fixed from culture - negative ruminants // Vet. Microbiol. 2002. - №87(1). - P. 15-23.

153. Mitre H. Die differenzierung van bakyerienspezies mit hilfe electrophoretischer verfahren // Fortschr. Veter. -Med. 1978. №28. - P. 237-251.

154. Mosca A., Russo F., Miragliotta L., Iodice M.A., Miragliotta G. Utility of gas chromatography for rapid identification of mycobacterial species frequently encountered in clinical laboratory // J Microbiol Methods. — 2007, Feb. 68(2): 392-5.

155. Mukai T., Miyamoto Y., Yamazaki T., Makino M. Identification of Mycobacterium species by comparative analysis of the dnaA gene // FEMS Microbiol Lett. 2006, Jan. 254(2): 232-9.

156. Newton C.R., Graham A. PCR. // Bios Scientific Publishers. Oxford, 1996. P. 18-9.

157. Ngo T.T., Bovaird J.H., Lenhoff H.M. Separation free amperometric enzyme immunoassay // Appl. Biochem. Biotechel. 1985. -iy.i l>. - P. 6370.

158. Norazah A., Rasinah W.Z., Zaili Z., Aminuddin A., Ramelah M.fAnalysis of PCR-RAPD DNA and antibiotic susceptibility profiles of antrum and corpus isolates of Helicobacter pylori from Malaysian patients // Malays J Pathol. -2009, Jun. 31(1): 29-34.

159. Nuratinov R.A., Efendiev I.V. Causes of para-allergy to tuberculin // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 2001, Jan.-Feb. (1): 50-3.

160. Olive D.M., P.Bean. Principles and application-of me-thods for DNA-based typing of microbial organisms. // J.Clin. Microbiol. 1999. 37: 1661-9.

161. Ozawa H., Tamauchi H., Ito M., Terashima M., Inoue M., Hozumi K., Habu S., Watanabe N. Immune responses to Nippostrongylus brasiliensis and tuberculin protein in GATA-3-transgenic mice // Immunol Lett.2005, Jul. 15; 99(2): 228-35.

162. Pamidimarri D.V., Mastan S.G., Rahman H., Reddy M.P. Molecular characterization and genetic diversity analysis of Jatropha curcas L. in India using RAPD and AFLP analysis // Mol Biol Rep. 2009, Aug. 18.

163. Pang J-P., Chen L-C., Chen L-F.O., Chen S-C.G. DNA polymorphisms generated by arbitrarily primed PCR in rice // Biosci. Biotech. Biochem. -1992, 56(8): 1357-8.

164. Pao C.C., Yen T.S.B., You I.B., Maa I.S., Fiss E.H., Chang C.H. Detection and identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA amplification // J. Clin. Microbiol. 1990. №28. - P. 1877-1880.

165. Paran J., Michelmore R.W. Development of Reliable PCR Based Markers Linked to Downy Mildew Resistance Genes in Lettuce // Theor. Appl. Genet. 1993. V.85. - P. 985-993.

166. Pate M., Zdove J., Pirs T., Krt B., Ocepe K.M. Isolation and characterization of Mycobacterium avium and Rhodococcus equi from granulomatous lesions of swine lymph nodes in Slovenia // Acta Vet. Hung. 2004. №52(2). - P. 143-150.

167. Paweska J.T., Smith S.J., Wright-I.M., Williams R., Cohen A.S., Van

168. Persing D.H., Cimino G.D. Amplification Product Inactivation Methods. // Diagnostic Molecular Microbiology. Washington, 1993. P. 21-105.

169. Phillips A.P., Martin K.L., Horton W.H. The choise of methods for immunoglobulin IgG purification: yield and purity of antibody activity // J. Immun. Meth. 1984. V.74, - №2. - P. 385-393.

170. Pilgrim D. CeRep25B forms chromosome-specific minisatellite arrays in Caenorhabditis elegans // Genome Res. 1998, Nov. 8(11): 1192-201.

171. Pozzi G., Meloni M., Iona E. et al. Orefici, rpoB mutations in multidrug resistant strains of Mycobacterium tuberculosis isolated in Italy <// J. clin. Microbiol. 1999.-V.37.-P. 1197-1199.

172. Ralph D., McClelland M. Arbitrary Primed PCR Methods for Studying Bacterial Diseases. // Molecular Bacteriology. Totowa, 1998. P. 83-102.

173. Ramirez J., Mason C., Ali J., Lopez F.A. Mycobacterium avium complex pulmonary disease: management options in HIV-negative patients // J La State Med Soc. -2008, Sep.-Oct. 160(5): 248-54.

174. Redmond W.B., Botes J.H., Engel H.W. Methods for bacteriophage typing of mycobacterium // Meth. Microbiol. London, 1979. №13. - P. 345-375.

175. Ridley A.M. Genomic Fingerprinting by Application of rep-PCR. // Molecular Bacteriology. Totowa, 1998. P. 17-103.

176. Saini V., Raghuvanshi S., Talwar G.P., Ahmed N., Khurana J.P., Hasnain S.E., Tyagi A.K. Polyphasic taxonomic analysis establishes Mycobacterium indicus pranii as a distinct species // PLoS One. 2009, Jul. 16; 4(7): e6263.

177. Savelkoul P.H., Aarts H.J., De Haas J., Dijkshoorn L., Duim B., Otsen M., et al. Amplified-Fragment Length Polymorphism Analysis. // J'.'Clin. Microbiol. 1999. 37: 3083-91.

178. Schaefer W.B. Serologic identification and classification of the-atypical mycobacteria by their agglutination // Amer. Rew. Resp. Dis. 1965. -№92.-P. 85-93.

179. Schuurs A.H., Van Weemen B.K. Enzyme immunoassay // Clin. Chem. Acta. 1977.-V.81.-P. 1-40.

180. Shen X., Deriemer K., Yuan Z., Shen M., Xia Z., Gui X., Wang L., Mei J. Deaths among tuberculosis cases in Shanghai, China: who is at risk? // BMC Infect Dis. 2009, Jun. 17; 9: 95.

181. Snyder M. P., Kimbrell D., Hunkapiller M. A transposable elementt hat splits the promoter region inactivates a Drosophila cuticle protein gene // Proc. Natl. Acad. Sci. 1982. V.79. - P. 7430-7434.

182. Sreevatsan S., Bookout J.B., Ringris F.M., et al. Algorithmic approach to high-throughput molecular screening for alpha interferon-resistant genotypes in hepatitis C patients // J Clin Microbiol. 1998. 36: 1895-901.

183. Srikantam A., Moorthy K., Gokhale S. Bacteriological techniques compliment the clinical and cytological diagnosis of tuberculosis in human immuno deficiency virus infected persons // Indian J Med Microbiol. 2006, Jul. 24(3): 225-7.

184. Sundaram M., Adhikary S.D., John G.T., Kekre N.S. Tuberculosis in renal transplant recipients // Indian J Urol. 2008, Jul. 24(3): 396-400.

185. Taylar F.G.R., Patel D., Baerne E. Comparison of sensitive of ELISA and radioimmunoassay for detection of class specific antibody in mour serum // J. Immun. Meth. 1983. V.65. - №1-2. - P. 65-73.

186. Thoen CO., Malstrom C, Mills K. Use of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting mycobacterial antigens in tissues of M. bovis infected cattle // Am. J. Vet. Res. 1981. V.42, - № 10. - P. 1814 -1815.

187. Tiwari R.P., Garg S.K., Bharmal R.N., Kartikeyan S., Bisen P.S. Rapid liposomal agglutination card test for the detection of antigens in patients with active tuberculosis // Int J Tuberc Lung Dis. 2007, Oct. 11(10): 1143-51.

188. Troesch A., Nguyen H., Miyada C.G., et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing with high-density DNA probe arrays // J Clin Microbiol. 1999. 37: 242-5.

189. Van Embden J.D. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: recommendations for a standardized methodology / van Embden J. D, Cave M. D, Crawford J. T et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. -V.31. №2. - P. 406-409.

190. Van Ree R., Chapman M.D., Ferreira F., et. al. The CREATE project: development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification // Allergy. 2008, Mar. 63(3): 310-26.

191. Vankayalapati R., Klucar P., Wizel B., Weis S.E., Samten B., Safi H., Shams H., Barnes P.F. NK cells regulate CD8+ T cell effector function in response to an intracellular pathogen // J Immunol. 2004, Jan. 1; 172(1):

192. Vassart G., Georges M., Monsieur R., Brogas H., Lequarre A.S., Christophe D. A sequence in M13 phage detects hypervariable minisatellites in human and animal DNA // Science. 1987. V.235. №.4789. - P. 683-684.

193. Vougiouklakis T., Mitselou A., Batistatou A., Boumba V., Charalabopoulos K. First case of fatal pulmonary peliosis without any other organ involvement in a young testosterone abusing male //Forensic Sci Int. 2009, Apr. 15; 186(1-3): el3-6.

194. White T.J. Amplification Product Detection Methods. // Diagnostic Molecular Microbiology. Principles and Applications. Washington, 1993. -P. 138-48.

195. Williams G.T., Williams W.J. Granulomatous inflammation a review // J. Clin. Patch. 1983. V.36. - P. 723-733.

196. Yin T.M., Zhang X.Y., Gunter L.E., Li S.X., Wullschleger S.D., Huang M.R., Tuskan G.A. Microsatellite primer resource for Populus developed from the mapped sequence scaffolds of the Nisqually-1 genome // New Phytol. 2009, Jan. 181(2): 498-503.

197. Yu F., Du P., Lei X., Zhang S. Investigation of voltammetric enzyme-linked immunoassay system based on N-heterocyclic substrate of 2,3-diaminopyridine // Talanta. 2009, Jun. 15; 78(4-5): 1395-400.

198. Zabeau M., Vos P. Selective restriction fragment amplificanion: a general method for DNA fingerprinting // European Patent Application 924026297 (Publication number:053458 At).

199. Zamarioli L.A., Coelho A.G., Pereira C.M., Ferrazoli L., Bammann R:H. Laboratory identification of mycobacteria in respiratory samples from HIV-positive patients suspected of tuberculosis // Rev Soc Bras Med Trop. 2009, May-Jun. 42(3): 290-7.

200. Zota V., Angelis S.M., Fraire A.E., McNamee C., Kielbasa S., Libraty D.H. Lessons from Mycobacterium avium complex-associated pneumonitis: a case report // J Med Case Reports. 2008, May. 13; 2: 152.

Информация о работе

Хаммадов, Наиль Ильдарович
кандидата биологических наук
Казань, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Изучение эффективности различных молекулярно-генетических методов идентификации и дифференциации возбудителей туберкулёза и атипичных микобактерий - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы