Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение блокирующего действия Тамм-Хорсфалл протеина на колонизацию мочевыводящих путей уропатогенными штаммами E. coli

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение блокирующего действия Тамм-Хорсфалл протеина на колонизацию мочевыводящих путей уропатогенными штаммами E. coli"

На правах рукописи

РУЖАНСКАЯ АННА ВЛАДИСЛАВОВНА

ИЗУЧЕНИЕ БЛОКИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ТАММ-ХОРСФАЛЛ ПРОТЕИНА НА КОЛОНИЗАЦИЮ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ УРОПАТОГЕПНЫМИ ШТАММАМИ Е. COLI

03.00.07 - микробиология

14.00.36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре микробиологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов, г. Москва, Россия и в лаборатории эндотоксикозов и гнойно-септических осложнений Федерального государственного учреждения «Научно-исследовательский институт Трансплантологии и искусственных органов» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию, г. Москва, Россия.

Научные руководители: кандидат медицинских наук

Кравцов Эдуард Георгиевич

кандидат медицинских наук

Габриэлян Нина Инзаровна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Смирнова Ирина Павловна

доктор медицинских наук, профессор

Сускова Виктория Сергеевна

Ведущая организация: Государственный научный центр «Институт иммунологии федерального медико-биологического агентства России»

Защита диссертации состоится

¿6

апреля 2006

г . в 4

час на заседании

диссертационного совета Д 212.203.05 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.

6.

Автореферат разослан <

-2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О. Б. Гигани

~eoJT

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

В настоящее время трансплантация почек вошла в широкую медицинскую практику. Одним из наиболее частых послеоперационных осложнений является развитие восходящей уроинфекции. Escherichia coli в этиологической структуре этой патологии занимает ведущее место, в связи с чем исследование механизмов колонизации этим микробом мочевыделительного тракта является актуальным Одним из физиологических барьеров на пути восходящей уроинфекции является Тамм-Хорсфалл протеин (ТХП).

Этот белок был обнаружен в моче здорового человека в 1950 г. исследователями I. Ташш и F. Horsfall. В норме он выявляется исключительно в почках, но при этом не является непосредственным структурным элементом органа, а активно секретируется эпителиальными клетками восходящего отдела петли Генле, выделяясь с мочой в количестве от 50 до 244 мкг/мл.

Несмотря на значительный исследовательский интерес, физиологическая функция этого белка полностью не расшифрована В 1980 Orskov и соавт. доказали возможность связывания Тамм-Хорсфалл протеином Escherichia coli с фимбриями 1 типа. ТХП обладает способностью взаимодействовать с FimH доменом фимбрий 1 типа кишечной палочки, препятствуя тем самым адгезии Е. coli на уроэпителии.

Основой успешной колонизации слизистой мочевого тракта является соответствие фенотипа адгезина рецепторам, локализованным на клетках-мишенях. В этой связи актуальным является определение фенотипов адгезинов, характерных для уропатогенных вариантов Е. coli, и выявление степени блокирования их ТХП на клетках мишенях.

Рассматривая ТХП как фактор защиты мочевыводящего тракта, важным аспектом данной проблемы является вьиснение возможности иммунного ответа на этот белок и определение роли аутоантител (ААТ) к ТХП при адгезии Е. coli на уроэпителии.

Цепь и задачи работы.

Цель исследования заключалась в определении значения Тамм-Хорсфалл протеина в колонизации мочевыделительного тракта штаммами Е. coli, различающимися по фенотипу адгезинов.

По ходу достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Разработать тест-систему, включающую иммунную сыворотку и антигенный диагностикум к ТХП;

2. Исследовать блокирующую активность Тамм-Хорсфалл протеина на адгезию различных штаммов Е. coli;

3. Исследовать иммунный ответ на ТХП у доноров и реципиентов почечного трансплантата;

4. Изучить влияние ААТ к ТХП на секрецию данного белка. Научная новизна.

Впервые в нашей стране была создана тест-система для определения секреции ТХП в моче и ААТ к нему в сыворотке крови. Это позволило провести мониторинг по данным показателям у реципиентов почечного трансплантата. Впервые аутоантитела к ТХП в сыворотке крови были выявлены у доноров почечного трансплантата.

Изучено блокирующее действие ТХП на разные фенотипы адгезинов Е. coli и таким образом, исследована защитная роль этого белка . при развитии восходящей уроинфекции у лиц с трансплантированной почкой.

Практическая значимость.

Предложен простой в исполнении и эффективный метод количественного определения ТХП в моче, а также детекции уровня ААТ к ТХП в сыворотке крови.

Данные сравнительного анализа адгезивных способностей музейных и клинических штаммов E.coli, а также выведенный индекс блокирования их адгезии Тамм-Хорсфалл протеином, свидетельствуют о роли ТХП как селективного фактора при колонизации эпителия мочевого тракта и развитии

восходящей уроинфекции.

Положения, выносимые на защиту.

1. Создана тест-система для количественного определения ТХП в моче и выявления ААТ к этому белку в сыворотке крови;

2. ТХП является селективным фактором для различных фенотипов адгезинов Е. coli при развитии восходящей уроинфекции;

i 3. Титр ААТ к ТХП в сыворотке крови выявляется не только у

реципиентов, но и доноров почечного трансплантата;

^ 4. ТХП способен связываться с ААТ непосредственно в оргатзме, что

к

сопровождается снижением его секреции.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на семинарах кафедры микробиологии медицинского факультета РУДН (Москва, 2004, 2005 г.г.).

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена на .... страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и результатов экспериментальных исследований, их обсуждения и выводов, а также

библиографического указателя, включающего ..... источников. Работа

иллюстрирована ... .рисунками и ... .таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использовали штаммы ААЕС 191А, KB-RS218, G 938, G 1122, JJB14 (2Н25)-018К1Н7, С5 ("Bort")-018KlH7, 89-1449-018К1Н7, Н16 ("Bort"), J96, CFT073-06K2H1, F3, полученные из коллекции Е. Сокуренко (Seattle, WA, USA) и промышленный штаМм М17 (поддерживается на кафедре микробиологии

РУДН). Исследование адгезивной активности Е coli осуществляли с помощью методов агрегации дрожжей (Saccaromyces cerevisiae), агглютинации эритроцитов барана, морской свинки.

Опытные образцы ТХП были получены путем солевого его осаждения (I. Tamm, F. Horsfall, 1950). Тиражирование сыворотки к ТХП проводили по методу Кравцова Э.Г., Карманова М.И., 1983. Специфичность полученных сывороток оценивали в реакции торможения пассивной гамагглютинации (РТПГА) и реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони с различными образцами ТХП и гетерологичными антигенами. Антигенный диагностикум был получен путем сенсибилизации 2% формалинизированных эритроцитов барана (ЭБ) ТХП по ; стандартной методике (Feeley J.С., Sword С.Р., 1958). ТХП выявляли и оценивали количественно в образцах мочи пациентов, не имевших почечной патологии, с помощью реакции нейтрализации антител (РНАТ).

Антитела к ТХП в сыворотке крови клинически здоровых людей, реципиентов и доноров почечного трансплантата и беременных женщин определяли в реакции пассивной гемагтлютинации (РПГА).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Адгезия Е. coli на клетках-мишенях и роль Тамм-Хорсфалл протеина как протективного фактора.

1.1 Изучение адгезинов музейных штаммов Е. coli в сравнении с клиническими изолятами. Блокирующее действие ТХП на адгезию Е. coli к клеткам мишеням.

Охарактеризованы 12 музейных референс- штаммов Е. coli в реакции агглютинации с эритроцитами барана, морской свинки и дрожжами. Штаммы оценивали по степени блокирования агглютинации ТХП, маннозой и галактозой. Реакция гемагглютинации (РГА) выступала в качестве контроля; торможение реакции осуществляли белком Тамма-Хорсфалла, полученным по описанной в 1950 году авторами методике. Выделенный белок стандартизовали методом Лоури. Для торможения ГА использовали 400 мкг/мл ТХП.

Музейные штаммы кишечного происхождения не агглютинировали эритроциты барана, но давали относительно высокие показатели в реакции агглютинации с дрожжами; с эритроцитами морской свинки наблюдалась средняя степень агглютинации. Уропатогенные музейные штаммы с эритроцитами барана агглютинировали, и показывали относительно низкую степень агглютинации с дрожжами и эритроцитами морской свинки (табл. 1). ТХП интенсивнее блокировал адгезию кишечных штаммов Е. соН на дрожжах и эритроцитах морской свинки по сравнению с уроизолятами. При анализе ингибирования адгезии уропатогенных штаммов на разных клетках-мишенях, более низкая степень блокирования наблюдалась на эритроцитах барана.

Табл. 1 Степень ингибирования адгезии музейных штаммов Е. coli на клетках-мишенях.

Штаммы Эритроциты Saccaromyces cerevisiae

барана МО рекой свинки

к | оп | ман | гал к оп | ман | гал к | оп | ман | гал

Уропатогенные штаммы

KB-RS - - - - 64 2 32 64 64 2 32 32

G 938 - - - - - - - - 32 16 16 32

JJB14 64 8 16 64 64 - - 8 - - - -

J96 8 8 8 8 - - - - - - - -

CFT073 64 - - 16 - - - - 64 8 8 8

F3 - - - - - - - - - - - -

Gl 122 32 4 32 16 - - - - - - - -

Кишечные штаммы

Н16 - - - - 32 - 32 32 - - - -

89-1449 - - - - - - - - 128 - 128 128

М17 - - - - 64 - - - 128 - - 64

ААЕС - - - - 32 - 32 32 128 16 32 128

С5 - - - - - - - - 64 8 4 32

М-17 - - - - - - - - 128 - - 64

к-контроль

оп- опыт; блокирование адгезии ТХП; ман - блокирование адгезии маннозой; гал- блокирование адгезии галактозой.

• прочерками отмечено отсутствие агглютинации

Нами были поставлены аналогичные опыты с 12 клиническими штаммами, б из которых являлись уроизолятами и б - кишечными изолятами (табл. 2)

Табл. 2 Адгезивная активность клинических штаммов Б. coli

Штаммы Эритроциты Saccaromyces cerevisiae

ба рана морской свинки

к оп ман гал к оп ман гал к оп ман гал

Уроизоляты

№ 1 - - - - - - - - 4 - - 4

№2 - - - - 8 2 8 8 4 - - 4

№3 - - - - - - - - 2 - - 2

№4 - - - - - - - - 8 - 8 8

№5 - - - - - - - - 8 4 8 8

№6 - - - - - - - - 8 8 2 8

Кишечные изоляты

№ 1 - - - - 32 - 32 32 128 64 128 128

№2 - - - - 32 4 4 32 64 - 64 64

№3 - - - - - - - - 128 4 128 128

№4 - - - - 32 - - - 128 - 32 64

№5 - - - - 64 16 8 64 256 64 128 128

№6 - - - - 32 - 16 32 64 - 64 64

к - контроль

оп - опыт (блокирование адгезии ТХП) ман - блокирование адгезии маннозой гал - блокирование адгезии галактозой

• прочерками отмечено отсутствие агглютинации

Сравнивая агтлютинационные свойства референс-штаммов Е. coli с клиническими штаммами, последние удалось охарактеризовать по типу пилей. В клиническом материале были обнаружены штаммы, сходные по адгезинам с кишечными или уропатогенными штаммами (табл. 3). 4 клинических штамма (2 уроизолята и 2 кишечных изолята) не удалось идентифицировать с имеющимися в коллекции музейными референс-штаммами.

По взаимодействию с тем или иным рецептором мы определили следующие основные типы адгезинов исследуемых штаммов: маннозный и галактозный, маннозный, галактозный, безрецепторный и неизвестный тип. Основной процент приходится на безрецепторный тип, а самый малый процент составляет тип с галактозозависимым адгезином.

Табл. 3 Идентификация фенотипов адгезинов клинических изолятов Е. coli

Штаммы Эритроциты Saccaromyces cerevisiae

барана морской свинки

к | о | м | г К I О I М I г к | о | м | г

Сравнение клинических штаммов с музейными кишечными референс-штаммами Е. coli

89-1449 - - - - - - - - 128 - 128 128

У4 - - - - - - - - 8 - 8 8

У5 - - - - - - - - 8 4 8 8

КЗ - - - - - - - - 128 4 128 128

ААЕС - - - - 32 - 32 32 128 16 32 128

У2 - - - - 8 2 8 8 4 - - 4

К1 - - - - 32 - 32 32 128 64 64 128

М-17 - - - - 64 - - - 128 - - 64

К4 - - - - 32 - - - 128 - 32 64

Сравнение клинических штаммов с музейньши уропатогенными референс-штаммами E.coli

RS KB - - - 64 2 32 64 64 2 32 32

К5 - - - 64 16 8 64 256 64 128 256

G938 - - - - - - - 32 16 16 32

CS - - - - - - - 64 8 4 32

У1 - - - - - - - 2 - - 2

УЗ - - - - - - - 4 - - 4

У2; У6 К2; Кб Не идентш зицированы

У - уроизолят; К- кишечный изолят, к - контроль,

о - опыт (блокирование адгезии ТХП), м - блокирование адгезии маннозой, г - блокирование адгезии галактозой

• прочерками отмечено отсутствие агглютинации

• Выделенные жирным шрифтом - референс штаммы,

• Обычным шрифтом отмечены клинические изоляты.

Степень блокирования агглютинации уропатогенных и кишечных музейных штаммов Тамм-Хорсфалл протеином была максимальной на модели "эритроциты морской свинки" (табл. 4).

Табл. 4 Способность ТХП блокировать адгезию Е. coli на эритроцитах барана, морской свинки и Saccaromyces cerevisiae.

ЭрИТ1 тоциты S. cerevisiae Эритроциты S. cerevisiae

барана морской свинки барана морской свинки

Музейные штаммы

Уропатогенные штаммы Кишечные штаммы

1ср 1ср Icp Icp Icp Icp

3,0 5,5 3,3 не взаим. 5,3 5,0

Клинические штаммы

Уроизоляты Кишечные изоляты

не взаим 2,0 2,0 не взаим 4,0 4,5

I - индекс блокирования

При постановке реакции агглютинации на дрожжах индекс блокирования был выше у кишечных штаммов. Реакция агглютинации музейных уропатогенных штаммов с эритроцитами барана блокировалась со средним индексом =3,0, причем музейные и клинические кишечные изоляты эритроциты барана не агглютинировали. Клинические - штаммы (кишечные изоляты) по степени блокирования ТХП были сходны с музейными кишечными штаммами. Клинические уроизоляты блокировались ТХП достоверно слабее кишечных изолятов, т.е. защита мочевыводящего тракта ТХП определяется типом адгезина, экспрессированного у кишечной палочки. Из этого следует, что уропатогенные варианты обладают низким сродством с маннозочувствительными клеточными рецепторами, при этом ТХП слабо блокирует их адгезию. В кишечной популяции Е. coli удается выявить отдельные штаммы, сходные по профилю адгезинов с урологическими. Вероятно, именно такие варианты могут быть исходными при переходе кишечной флоры в новую экологическую нишу. Их адгезия плохо блокируются ТХП, что открывает ворота восходящей инфекции. Возможно, что снижение содержания этого белка в моче способствует колонизации уроэпителия Е. coli и, прежде всего, теми вариантами, которые способны обойти блокирующее его действие.

Естественно, что для защиты от вариантов с низким индексом блокирования необходима более высокая концентрация ТХП в моче, чем для вариантов с высоким индексом.

Если принять, что ТХП блокирует адгезию Е. coli на уроэпителии, то можно было предположить, что уровень данного белка в моче снижается благодаря связыванию его антителами, а ААТ к ТХП, связываясь с ним, должны отменять его блокирующий эффект. Было показано, что если в систему Е. coli - ТХП -клетка-мишень ввести иммунную сыворотку к ТХП, то ингибирующее действие этого белка на адгезию к клетке-мишени не проявляется, т.е. связанный ТХП не препятствует адгезии. Вероятность такой ситуации in vivo становится значимой в том случае, если в организме идет продукция ААТ к данному белку. Принимая во внимание, что ТХП является секвестрированным антигеном, в норме, несмотря на отсутствие к нему толерантности, иммунный ответ исключен. В то же время, при патологическом процессе этот антиген становится доступен иммунокомпетентным клеткам и, как следствие этого, в крови могут накапливаться ААТ, которые снижают уровень ТХП в моче. Чтобы подтвердить данное предположение, необходимо было разработать соответствующие иммунореагенты: сыворотки к ТХП узкой специфичности и антигенный диагностикум к нему.

2. Тест - система для определения Тамм-Хорсфалл протеина. 2.1. Получение и тестирование иммунных сывороток в РИД.

На первом этапе мы предприняли попытку тиражировать сыворотку к ТХП, производимую фирмой Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, USA). С этой целью двум кроликам в 4 точки был введен выделенный из мочи ТХП в дозе 100 мкг/кг живого веса в смеси с полным адьювантом Фрейнда. Через две недели животным был введен преципитат, сформированный из референс- сыворотки и очищенного коммерческого ТХП. Через две недели от кроликов была получена сыворотка, с которой снова был сформирован преципитат к ТХП и введен внутривенно тем же продуцентам. С целью повышения специфичности тиражированных сывороток, после третьей иммунизации в схему был введен

этап сорбции сыворотки альбумином. Процедура была повторена ещё четыре раза с интервалом в две недели.

Специфичность полученных сывороток оценивали в реакции иммунодиффузии (РИД) по Оухтерлони с различными образцами ТХП; в качестве контрольного антигена использовали очищенный сывороточный альбумин человека (рис. 1).

Как следует из представленных микрофотографий (см рис.1 (I), антитела к ТХП от обоих продуцентов формировали две полосы преципитации, сливающиеся с аналогичными полосами, сформированными ТХП (центральная лунка) и референс-сывороткой (верхняя и нижняя лунки). Такое расположение полос преципитации свидетельствовало о том, что сравниваемые сыворотки идентичны. Обе они выявляли два компонента в референс-препарате ТХП и в опытных образцах, выделенных из мочи здоровых людей.

Рис. 1 Анализ репродуцированных сывороток к ТХП в РИД

ТХП - Тамм-Хорсфапл протеин 1- сыворотка от первого продуцента РС - референс-сыворотка 2- сыворотка от второго продуцента

Примесный белок оказался не идентичен основному и по подвижности в электрофорезе соответствовал альбумину (рис 1 (II)

Гетерогенность препаратов ТХП достаточно подробно обсуждалась в литературе. Именно это обстоятельство требовало исключить возможность присутствия в сыворотке антител к посторонним белкам. Принимая во внимание то, что из всех белков крови сывороточный альбумин человека (САЧ) наиболее легко проходит гломерулярный барьер, реакция иммунодиффузии была выполнена по схеме, приведенной на рис. 1 (III). Оказалось, что полоса преципитации, расположенная дальше от лунки с иммунной сывороткой, представляла собой результат взаимодействия последней с САЧ. Это позволяет считать, что референс и воспроизведенная сыворотки к ТХП имеют две специфичности: кроме ТХП они определяют примесь САЧ.

Мы полагали целесообразным определить, во сколько раз референс- и репродуцированная сыворотки активны по основному и контаминирующему компоненту. На рис.1 (IV) представлена РИД сыворотки с образцами хроматографически очищенного ТХП в разных концентрациях откуда следует, что основной компонент определяется в концентрации 62,5 мкг/мл от общего белка, в то время как примесь САЧ выявляется только при концентрации 250 мкг/мл, т.е. референс-сыворотка в 4 раза активней к основному компоненту ТХП, чем к САЧ.

После введения в схему иммунизации этапа сорбции альбумином иммунная сыворотка практически не преципитировала САЧ, но была активна в отношении всех образцов ТХП, включая и референс-препарат. После 7 иммунизации дополнительный компонент полностью исчез (рис. 2).

Наибольший титр сывороток приходился на 3 и 4 иммунизацию и составлял 1:2560 и 1:1280 для 1 и 2 продуцентов соответственно, затем снижался. Таким образом, повышение специфичности сопровождалось снижением активности сыворотки.

Рис. 2 Анализ в РИД сыворотки после заключительной иммунизации.

А - альбумин

ТХП- Тамм-Хорсфалл протеин

С- сыворотка продуцента после седьмой иммунизации

2 2. Исследование активности антигенного эритроиитарного диагностикума.

Следующим этапом конструирования тест-системы для детекции ТХП было исследование активности антигенного эритроцитарного диагностикума.

При тестировании системы в РНАТ оказалось, что 1 гемагглютинирующая единица (ГАЕ) полученной нами сыворотки к ТХП может быть нейтрализована как референс-препаратом, так и выделенным нами ТХП в концентрации 7,6 мкг/мл. Образцы сывороток, полученные на этапе тиражирования коммерческой сыворотки (1 забор крови) блокировались ТХП в указанных выше концентрациях. Оказалось, что они могут быть блокированы и САЧ, но в концентрации последнего 1000 мкг/мл. Сыворотки же 7 забора крови, взятые на заключительных этапах тиражирования, САЧ не блокировались даже в концентрации 10000 мкг/мл.

Приведённые данные свидетельствуют о том, что полученная тест-система высокочувствительна, а использованный нами приём сорбции повышает её специфичность.

3. Исследование продукции яутоантител к Тамм-Хорсфалл протеину и влияние их на изменение уровня ТХП в моче.

3.1 Исследование антителопродукиии к Тамм-Хорсфалл протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата.

В реакции прямой гемагппотинации нам удалось выявить наличие антител ТХП в сыворотке крови разных групп пациентов и вывести диагностический титр, ^ которого равен 2,3 В группе клинически здоровых людей процент серопозитивных случаев был достоверно ниже, чем в остальных группах. В группе беременных женщин все сыворотки оказались позитивными Однако уровни ААТ к ТХП в этой группе не превышали диагностически значимого.

Средний ^ титра в контрольной группе составил 1,6 + 0,1 и не отличался от ^ титра у беременных (1,7 + 0,6) В то же время, в группе доноров и реципиентов этот показатель составил 2,9 и 2,7 + 0,2 соответственно. Иными словами, несмотря на то, что ААТ к ТХП при беременности определяются практически в 100% случаев, их титр не превышает значений, определяемых в контрольной группе, в то время как у реципиентов и доноров почечного трансплантата этот показатель был достоверно выше титра, равного 2,3.

С помощью данной системы в РНАТ мы определяли концентрацию ТХП в нативной моче 3 исследуемых групп: средний уровень протеина в утренних образцах мочи клинически здоровых людей составил 574,5 + 86; у реципиентов почки - 506,7 +.94; у беременных женщин 912,0 + 112. Статистически значимое повышение секреции было выявлено только в группе беременных женщин.

При изучении антителопродукции к ТХП, в связи с достоверным различием в титрах между контрольной группой и группой реципиентов почечного трансплантата, последние были объединены по типу трансплантации Максимальный титр ААТ к ТХП наблюдался у реципиентов, перенесших аллотрансплантацию трупной почки (АТТП) сроком менее полугода. В дальнейшем титр у реципиентов после АТТП на протяжении следующих 6 месяцев несколько снижался, но оставался выше диагностического уровня. титра в группе реципиентов после родственной аллотрансплантации (РАТП), перенесенной менее 6 месяцев назад, оказался меньше, чем в аналогичной группе после АТТП, однако это различие было статистически не достоверно.

Приведенные данные позволяют заключить, что вид проведенной операции, в том числе и нефрэктомия, не существенно влияет на уровень титра ААТ к ТХП. При этом судить об их динамике из представленных материалов не представляется возможным. Для решения этого вопроса мы считали целесообразным провести индивидуальный мониторинг по данному показателю у доноров почки (рис. 3).

Сыворотка крови доноров была исследована до нефрэктомии и после. До операции титр ААТ не превышал диагностический; после - резко повышался к 7 дню, сохраняя высокие значения в течение всего месяца с момента хирургического вмешательства. К концу первого месяца титр незначительно снижался, оставаясь, при этом, выше диагностического.

Ввиду относительно непродолжительного пребывания доноров в стационаре, нам удалось проследить динамику титров в течение одного месяца.

Рис 3 Динамика титров АТ в крови доноров до и после нефрэктомии

Более продолжительные исследования были выполнены на группе реципиентов (табл. 5).

Табл. 5 Изменение величины титра ААТ в крови реципиентов почечного трансплантата в зависимости от срока после трансплантации.

Срок после грансплан- гации 7-21 пень п=17 1 -2 мес ti=17 > 3 мес п=17

Серопозитивных [%) 95+5% 77 + 8% 73+7%

Серонегативных (%) 5% 23% 27%

Средний титр, lg 2,7+0,3 2,8+0,2 2,4+_0,1

Наибольшее число серопозитивных случаев (95%) наблюдалось в период с 7 по 21 день после операции. Наибольшие показатели титра ААТ к ТХП выявлялись в первый-второй месяц после трансплантации, затем, начиная с 3-х месяцев, титр достоверно снижался, но оставался выше, чем у клинически здоровых людей, приближаясь, при этом, к диагностическому уровню. Из представленных результатов следует, что оперативное вмешательство стимулирует продукцию ААТ к ТХП, которая имеет определенную динамику с максимальным подъемом к 1-2 месяцу и последующим медленным снижением.

Нами было отмечено, что у лиц с высоким титром ААТ к ТХП уменьшается уровень секреции этого белка с мочой. При проведении корреляционного анализа установлена высокая корреляционная связь между концентрацией ТХП и титрами ААТ к данному белку (г=0,7). В приведенных ранее экспериментальных данных мы отмечали, что связывание ТХП аутоантителами отменяет его блокирующее действие на адгезию Е. coli. Следовательно, снижение уровня этого белка, опосредованное появлением ААТ, снижает защиту мочевыводящего тракта от колонизации Е. coli, т.е. такие пациенты включаются в группу риска развития восходящей уроинфекции. В этой ситуации ТХП в низких концентрациях может выступать в роли селективного фактора, вычленяющего из контаминирующей кишечной популяции варианты Е coli, уклоняющиеся от ингибирующего адгезию действия ТХП.

ВЫВОДЫ:

• 1.В кишечной популяции штаммов Е. coli встречаются варианты, сходные по фенотипу адгезинов с уропатогеиными;

■ 2. Штаммы Е. coli, высевающиеся с мочой, блокируются ТХП слабее, чем кишечные изоляты, что является одним из ключевых моментов в развитии восходящей уроинфекции;

■ 3. Индукция ААТ к ТХП отменяет протективное действие ТХП по отношению к колонизации Е. coli мочевыводящих путей;

■ 4 При операции физиологическая защита ТХП может нарушаться за счет снижения его секреции и открываются ворота уроинфекции;

■ 5. Титр ААТ к ТХП, значительно превышает диагностический и после операции присутствует не только у реципиентов почечного трансплантата, но и у доноров.

Список публикаций по материалам диссертации.

1. A.B. Ружанская, O.E. Миленина, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, Н.И. Габриэлян. Методические подходы к определению Tamm-Horsfall протеина.// «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» - 2005, №9 - с.316-319; 2 А.В Ружанская, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, Н.И. Габриэлян. Исследование антителопродукции к Tamm-Horsfall протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата.// «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» - 2005, №4.

3. AB. Ружанская, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, Н.И. Габриэлян. Изучение продукции аутоантител к Тамм-Хорсфалл протеину "(ТХП) у доноров и реципиентов почечного трансплантата и влияние их на изменение уровня ТХП в моче. // «Вестник трансплантологии и искусственных органов «МОО» Научное общество трансплантологов» - 2006 - №1.

РУЖАНСКАЯ АННА ВЛАДИСЛАВОВНА (РОССИЯ)

«ИЗУЧЕНИЕ БЛОКИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ТАММ-ХОРСФАЛЛ ПРОТЕИНА НА КОЛОНИЗАЦИЮ МОЧЕВЫВОДЯЩИХ ПУТЕЙ УРОПАТОГЕННЫМИ ШТАММАМИ Е. COLb>. В последнее время во всем мире и в нашей стране освоена сложнейшая операция по поводу трансплантации почки Несмотря на разнообразие антимикробной терапии, в послеоперационном периоде в большом проценте случаев происходит развитие восходящей уроинфекции, причем Escherichia coli рассматривается как одна из основных причин заболевания В связи с этим актуальной является проблема поиска агентов, способных ингибировать адгезию данного микроба на клетки уроэпителия Барьером на пути восходящей уроинфекции является Тамм-Хорсфалл протеин (ТХП), одной из возможных физиологических функций которого является блокировка адгезии Е coli на клетки уроэпителия.

Охарактеризованы музейные и клинические штаммы Е coli по способности ТХП блокировать их агглютинацию с разными клетками-мишенями Создана тест-система для количественного определения ТХП в моче и детекции аутоантител (ААТ) на ТХП в сыворотке крови Система испытана на образцах мочи людей, не имевших почечной патологии, у беременных женщин, а также у доноров и реципиентов почечного трансплантата С помощью антигенного диагностикума у этих групп охарактеризована антителопродукция к ТХП

Показано, что в кишечной популяции штаммов Е coli встречаются варианты, сходные по фенотипу адгезинов с уропатогенными, при этом штаммы Е coli, высевающиеся с мочой, блокируются ТХП слабее, чем кишечные изоляты, что является одним из ключевых моментов в развитии восходящей уроинфекции При операции физиологическая защита ТХП может нарушаться и, за счет снижения его экскреции, открываются ворота уроинфекции Причиной этого является связывание ТХП аутоантителами Титр ААТ к ТХП, значительно превышающий диагностический, в сыворотке крови после операции присутствует не только у реципиентов почечного трансплантата, но и у доноров

RUZHANSKAYA ANNA VLADISLAVOVNA (RUSSIA]

INVESTIGATION OF THE CAPACITY OF TAMM-HORSFALL PROTEIN TO INHIBIT E. COLI ADHESION TO URINARY TRACT EPITHELIUM.

Recently all over the world and in Russian Federation also, surgical operation concerning of the kidney transplantation is elaborated Despite of a variety of antimicrobial therapy, for the postoperative period in large percent of cases there is a development of an ascending urinary tract infection Numerous data indicate that the vast majority of such disease is caused by E coli That is why the research of the antigenes, which can inhibit adhesion of given microorganisms to urinary tract epithelium cells is urgent One of the barriers for ascending uropathogenic infection is Tamm-Horsfall protein (THP), one of which physiological functions is blocking of E.coli adhesion to urinary epithelium.

The museum and clinical E coli strains was characterized on the ability of THP to block their agglutination with different target cells The test - system for quantitative definition of THP in the urine and detection of antibodies to THP in blood serum was elaborated The system was tested with the urine samples those human which were not having a kidney pathology, at the pregnant women, and also at the donors and recipients of the kidney transplantate With the help of antigenic diagnosticum, the antibody production to THP was characterized at these groups of patients Our data show, that intestinal representatives of E coli have similar phenotypic variants of adhesins with uropathogenic strains. Thus an adhesion of urinary E coli strains, are inhibited by THP more weakly, than intestinal isolates, that is one of the key moments in ascending urinary infection development After the kidney transplantation surgical procedure the physiological protection of THP can be broken and, the pathway for urinary infection can be opened. The titer of antibodies to THP, considerably exceeding diagnostical one, in blood serum after operation is present not only in the kidney recipients but also at the donors

li - 6 0 9 9

АсубД

г

4

Гарнитура Times. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,0. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ 153. Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ружанская, Анна Владиславовна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Escherichia coli как условно-патогенный микроорганизм 1.1.1. Типы адгезинов Е. coli

1.1.1.1. Маннозочувствительные фимбрии или фимбрии 1 типа Е. coli

1.1.1.2. Маннозоустойчивые фимбрии Е. coli

1.2. Общая характеристика Тамм-Хорсфалл протеина

1.2.1. Структура Тамм-Хорсфалл протеина 17 1.2.1.1 .Аминокислотный состав Тамм-Хорсфалл протеина 19 1.2.1.2. Углеводный состав Тамм-Хорсфалл протеина

1.2.2. Способы идентификации и выделения Тамм-Хорсфалл протеина

1.3. Роль Тамм-Хорсфалл протеина в развитии восходящей уроинфекции

1.3.1. Взаимодействие Е. coli, несущих Р-фимбрии с Тамм-Хорсфалл протеином

1.3.2. Взаимодействие Е. coli, несущих фимбрии 1 типа с Тамм-Хорсфалл протеином

1.3.3. Взаимодействие Е. coli, несущих S-фимбрии с Тамм-Хорсфалл протеином

1.3.4. Взаимодействие Е. coli, несущих адгезин 075Х с Тамм-Хорсфалл протеином

1.4. Биологическая роль ТХП 28 1.4.1. Исследование Тамм-Хорсфалл протеина на мышиных моделях

1.5. Патологическое значение Тамм-Хорсфалл протеина 30 1.5.1. Количественное содержание Тамм-Хорсфалл протеина в норме и при патологии

1.5.1.1. Экскреция Тамм-Хорсфалл протеина при трансплантации почки

1.5.2 Антителопродукция к Тамм-Хорсфалл протеину

1.5.2.1. Возрастная зависимость антителообразования к Тамм-Хорсфалл протеину

1.5.2.2. Антителопродукция к Тамм-Хорсфалл протеину при патологиях 35 1.5.3. Феномен Тамм-Хорсфалл протеина при трансплантации почки

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Штаммы микроорганизмов

2.1.2. Клинический материал

2.1.3. Среды, антибиотики и реактивы, используемые в работе

2.1.3.1. Среды

2.1.3.2. Антибиотики

2.1.3.3. Реактивы

2.1.3.4. Экспериментальные животные

2.1.3.5. Оборудование

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение Тамм-Хорсфалл протеина

2.2.2. Получение иммунных сывороток

2.2.3.Получение антигенного эритроцитарного диагностикума

2.2.4. Исследование бактериальной адгезии

2.2.4.1. Исследование адгезии Е. coli в реакции агглютинации дрожжей

2.2.4.2. Реакция нейтрализации агглютинации дрожжей

2.2.4.3. а,б Реакция торможения агглютинации дрожжей

2.2.4.4. Исследование агглютинации эритроцитов барана

2.2.4.5. реакция нейтрализации эритроцитов барана

2.2.4.6. Реакция торможения агглютинации эритроцитов барана

2.2.4.7. исследование агглютинации эритроцитов морской свинки

2.2.4.8. Реакция нейтрализации эритроцитов морской свинки

2.2.4.9. Реакция торможения агглютинации эритроцитов морской свинки

2.2.5. Методы постановки серологических и иммунохимических реакций

2.2.5.1. Реакция агглютинации с иммунной сывороткой

2.2.5.2. Реакция торможения Тамм-Хорсфалл протеина агглютинации иммунной сыворотки

2.2.5.3. Определение концентрации ТХП в образцах мочи по реакции нейтрализации антител

2.2.5.4. Реакция нейтрализации антител нативной мочой

2.2.5.5. Реакция преципитации в геле

2.2.5.6. Иммуноэлектофорез

2.2.6. Математическая и статистическая обработка данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Адгезия Е. coli на эпителиальные клетки мочевыводящего тракта и роль ТХП как протективного фактора

3.1.1. Изучение адгезинов музейных штаммов Е. coli в сравнении с клиническими изолятами. Блокирующее действие

ТХП на адгезию Е. coli к клеткам-мишеням

3.2. Тест-система для определения Тамм-Хорсфалл протеина

3.2.1. Тестирование иммунной сыворотки в РИД

3.2.2. Исследование активности сывороток

3.2.3. Исследование активности антигенного эритроцитарного диагностикума

3.3. Исследование продукции аутоантител к Тамм-Хорсфалл протеину и влияние их на изменение уровня ТХП в моче

3.3.1. Исследование антителопродукции к Тамм-Хорсфалл протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение блокирующего действия Тамм-Хорсфалл протеина на колонизацию мочевыводящих путей уропатогенными штаммами E. coli"

В настоящее время трансплантация почек вошла в широкую медицинскую практику. Одним из наиболее частых послеоперационных осложнений является развитие восходящей уроинфекции. Escherichia coli в этиологической структуре этой патологии занимает ведущее место, в связи с чем исследование механизмов колонизации этим микробом мочевыделительного тракта является актуальным. Одним из физиологических барьеров на пути восходящей уроинфекции является Тамм-Хорсфалл протеин (ТХП).

Этот белок был обнаружен в моче здорового человека в 1950 г. исследователями I. Tamm и F. Horsfall (102). В норме он выявляется исключительно в почках, но при этом не является непосредственным структурным элементом органа, а активно секретируется эпителиальными клетками восходящего отдела петли Генле, выделяясь с мочой в количестве от 50 до 244 мкг/мл (5).

Несмотря на значительный исследовательский интерес, физиологическая функция этого белка полностью не расшифрована. В 1980 Orskov и соавт. доказали возможность связывания Тамм-Хорсфалл протеина с фимбриями 1 типа Escherichia coli (83). ТХП обладает способностью взаимодействовать с FimH доменом фимбрий 1 типа кишечной палочки, препятствуя тем самым адгезии Е. coli на уроэпителии.

Основой успешной колонизации слизистой мочевого тракта является соответствие фенотипа адгезина рецепторам, локализованным на клетках-мишенях. В этой связи актуальным является определение фенотипов адгезинов, характерных для уропатогенных вариантов Е. coli, и выявление степени блокирования их ТХП на клетках мишенях.

Рассматривая ТХП как фактор защиты мочевыводящего тракта, важным аспектом данной проблемы является выяснение возможности иммунного ответа на этот белок и определение роли аутоантител (ААТ) к ТХП при адгезии Е. coli на уроэпителии.

Цель и задачи работы.

Цель исследования заключалась в определении значения Тамм-Хорсфалл протеина в колонизации мочевыделительного тракта штаммами Е. coli, различающимися по фенотипу адгезинов.

По ходу достижения поставленной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Разработать тест-систему, включающую иммунную сыворотку и антигенный диагностикум к ТХП;

2. Исследовать блокирующую активность Тамм-Хорсфалл протеина на адгезию различных штаммов Е. coli;

3. Исследовать иммунный ответ на ТХП у доноров и реципиентов почечного трансплантата;

4. Изучить влияние ААТ к ТХП на секрецию данного белка.

Научная иовизна.

Впервые в нашей стране была создана тест-система для определения секреции ТХП в моче и ААТ к нему в сыворотке крови. Это позволило провести мониторинг данных показателей у реципиентов почечного трансплантата. Впервые аутоантитела к ТХП в сыворотке крови были выявлены у доноров почечного трансплантата.

Изучено блокирующее действие ТХП на разные фенотипы адгезинов Е. coli и таким образом, исследована защитная роль этого белка при развитии восходящей уроинфекции у лиц с трансплантированной почкой.

Практическая значимость

Предложен простой в исполнении и эффективный метод количественного определения ТХП в моче, а также детекции уровня ААТ к ТХП в сыворотке крови.

Данные сравнительного анализа адгезивных способностей музейных и клинических штаммов E.coli, а также выведенный индекс блокирования их адгезии Тамм-Хорсфалл протеином, свидетельствуют о роли ТХП как селективного фактора при колонизации эпителия мочевого тракта и развитии восходящей уроинфекции.

Положения, выносимые на защиту

1. Создана тест-система для количественного определения ТХП в моче и выявления ААТ к этому белку в сыворотке крови;

2. ТХП является селективным фактором для различных фенотипов адгезинов Е. coli при развитии восходящей уроинфекции;

3. Титр ААТ к ТХП в сыворотке крови выявляется не только у реципиентов, но и доноров почечного трансплантата;

4. ТХП способен связываться с ААТ непосредственно в организме, что сопровождается снижением его секреции.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Ружанская, Анна Владиславовна

ВЫВОДЫ:

1.В кишечной популяции штаммов Е. coli встречаются варианты, сходные по фенотипу адгезинов с уропатогенными;

2. Штаммы Е. coli, высевающиеся с мочой, блокируются ТХП слабее, чем кишечные изоляты, что является одним из ключевых моментов в развитии восходящей уроинфекции;

3. Индукция А AT к ТХП отменяет протективное действие ТХП по отношению к колонизации Е. coli мочевыводящих путей;

4. При операции физиологическая защита ТХП может нарушаться за счет снижения его секреции и открываются ворота уроинфекции;

5. Титр А AT к ТХП, значительно превышает диагностический и после операции присутствует не только у реципиентов почечного трансплантата, но и у доноров.

Список публикаций по материалам диссертации.

A.B. Ружанская, O.E. Миленина, Э.Г. Кравцов, М.В. Далии, Н.И. Габриэлян. Методические подходы к определению Tamm-Horsfall протеина.// «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» -2005, №9-с.316-319;

A.B. Ружанская, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, Н.И. Габриэлян. Исследование антителопродукции к Tamm-Horsfall протеину у доноров и реципиентов почечного трансплантата.// «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» - 2005, №4. A.B. Ружанская, Э.Г. Кравцов, М.В. Далин, Н.И. Габриэлян. Изучение продукции аутоантител к Тамм-Хорсфалл протеину (ТХП) у доноров и реципиентов почечного трансплантата и влияние их на изменение уровня ТХП в моче. // «Вестник трансплантологии и искусственных органов «МОО» Научное общество трансплантологов» - 2006 - №1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ современной литературы показал, что исследования Тамм-Хорсфалл протеина (ТХП) имеет много аспектов. Одним из них является изучение защитной функции этого белка от восходящей инфекции мочевыделителыюго тракта (5, 86, 90, 110). Защитная роль этого белка была убедительно доказана в прямых опытах, которые продемонстрировали высокую чувствительность к восходящей уроинфекции линий мышей, дефектных по гену, контролирующему продукцию ТХП (29). Известно, что ТХП может связываться с маннозочувствительными сайтами адгезинов I типа Е. coli. Именно это обстоятельство позволяет считать, что данный белок блокирует адгезию кишечной палочки на уроэпителии и не позволяет кишечной флоре распространяться в новую для нее экологическую нишу. Однако при исследовании особенностей фенотипов адгезинов Е. coli, многие авторы приходят к заключению, что уропатогенные варианты этих микробов по фенотипу существенно отличаются от Е. coli, для которых кишечник является естественной средой обитания. Проведенные нами исследования показали, что характерным для кишечных изолятов является экспрессия адгезинов 1 типа, в то время как у изолятов, полученных из мочи, этот тип адгезина не является доминирующим. По данным Тринчиной Е. даже в том случае, если уропатоенные штаммы экспрессируют адгезин 1 типа, то он отличается по FimH фенотипу от кишечных штаммов. Структура FimH уропатогенных вариантов обеспечивает более прочное прикрепление микробов к эпителию, что позволяет им противодействовать потоку мочи. Сравнительное изучение референс-штаммов урологического и кишечного происхождения с клиническими изолятами позволило заключить, что в кишечной популяции Е. coli существуют варианты, по фенотипу адгезинов сходные с уропатогенными штаммами, но именно они при контаминации кишечной флорой мочевыделителыюго тракта могут занять новую экологическую нишу. Одним из факторов селекции в данном случае является ТХП, который, связываясь с адгезином, препятствует фиксации Е. coli на уроэпителии, и только варианты, способные уклоняться от такого действия ТХП могут удерживаться в мочевыводящем тракте.

Приведенный анализ блокирующего действия ТХП показал, что Е. coli кишечного происхождения характеризуются высоким уровнем блокирования маннозочувствительной адгезии на клетках-мишенях. Индекс блокирования урологических штаммов гораздо ниже, а в ряде случаев адгезия таких штаммов вообще не может быть отменена ТХП. Показано, что ингибирование не эффективно в отношении маннозочувствительной адгезии Е. coli. Эффект связывания маннозочувствительных адгезинов 1 типа ТХП, возможно, определяется структурой FimH области пилина. В настоящее время стало известно, что мутации в FimH кластере определяют связывание пилей с клеточным рецептором по моновалентному или поливалентному типу. В связи с этим, блокирующий эффект ТХП очевидно определяется конфигурацией маннозозависимого сайта FimH (7). Таким образом ТХП, выполняя защитную функцию, в низких концентрациях выступает в роли селективного фактора, вычленяя из контаминирующей кишечной популяции Е. coli варианты, уклоняющиеся от действия ТХП. Условием селекции уропатогенных вариантов является снижение концентрации этого белка в моче ниже физиологической нормы. Нами было показано, что такая ситуация возникает в том случае, когда ТХП связывается антителами. По данным литературы, срыв иммунологической толерантности к ТХП как аутоантигену возможен при некоторых патологиях (пиелонефрит, пузырно-мочеточниковый рефлюкс и прочее) (5). Было показано, что аутоантитела к этому белку появляются и при трансплантации почки. В наших исследованиях эти данные подтвердились. Установлено, что у лиц перенесших такую операцию на протяжении месяца титр антител достинает максимальных значений и сохраняется на высоком уровне более полугода. Поскольку индукция аутоантител наблюдается не только у реципиентов почки, но и у доноров мы считали, что причиной срыва иммунологической толерантности может быть любое оперативное вмешательство на этом органе. Нами была установлена высокая отрицательная корреляционная связь между титром аутоантител и уровнем ТХП в моче. Это позволяет заключить, что лица, перенесшие оперативное вмешательство становятся менее защищенными от восходящей уроинфекции.

В настоящей работе был рассмотрен только один из аспектов роли ТХП в почечной патологии, однако мы считали, что методические решения, предложенные в ней, окажутся полезными и при исследовании других сторон этой проблемы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ружанская, Анна Владиславовна, Москва

1. Бэм Э. Иммунодиффузия. Иммунологические методы. Под. Ред. Г. Фримеля, перевод с нем., 1987, М. Медицина, с. 73-89;

2. Галь Э., Медьеши Г., Верецкей JI. Электрофорез в разделениибиологических молекул. Пер. с англ. М., Мир, 1982, с. 236-246;

3. Гликопротеины. Под ред. Готтшалк А., Москва, Изд. Мир.

4. Далин М.В., Фиш Н.Г. Адгезины микроорганизмов. Под ред. Агаркова В.И. Москва, 1985, Итоги науки и техники.

5. Дранник Г.Н., Майданник В.Г. Белок Тамма-Хорсфала. Патогенетическая роль и клиническое значение при урологических и нефрологических заболеваниях. Урология и нефрология, 1990, №5, с. 69-74;

6. Кравцов Э.Г., Карманов М.И.; Авт. свид. № 1018643 от 22.01.83;

7. Тринчина Е.В. Автореферат; Москва, 2003;

8. Чеснокова B.JI. Автореферат; Москва, 1998;

9. Akiyama A., Stein P., Houshiar A., Parsons L. Urothelial cytoprotective activity of Tamm-Horsfall protein isolated from the urine of healthy subjects and patients with interstitial cystitis. Int. j. of urology, 2000, 7, 176-183;

10. Allen F. TisherC.C. Morphology of the ascending thick limb of Henle Kidney Int, 1976, 9, 8-22;

11. Andriole V.T. The role of Tamm-Horsfall protein in the pathogenesis of reflux nephropathy and chronic pyelonephritis. J. Biol. Med. 1985 v. 58. P. 91100

12. Bates JM, Raffi HM, Prasadan К et al. Tamm-Horsfall protein knockout mice are more prone to urinary tract infection: rapid communication. Kidney Int 2004; 65:791-797

13. Quantitative immunoassay. Urol Res 1: 50-59, 1973;

14. Bleyer A.J., Hart T.C., Shihabi Z., Robins V., Hoyer J. Muttations in the uromodulin gene decrease urinary excretion of Tamm-Horsfall protein. Kidney Int., 2004, v 66,974-977;

15. Brinton C.C. The structure, function, synthesis and genetic control of bacterial pili and a molecular model for DNA and RNA transport in gram negative bacteria. Trans N Y Acad sci, 1965, 27,1003-1054;

16. Burg M.B. Green N.Function of Henle's loop. Am J of Physiology, 1973, 3

17. Carvalho M. Role of Tamm-Horsfall protein and uromodulin in calcium oxalate crystallization. Braz. J Med Res, 2002, 35(10), 1165-1172;

18. Cavallone D., Malagolini N., Serafini-Cessi F. Binding of human neutrophils to cell-surface anchored Tamm-Horsfall glycoprotein in tubulointerstitial nephritis. Kidney Int., 1999, 55(5), 1787-1789;

19. Chick S., Harber MJ., MacKenzie R., Asscher AW. Modified method for studying bacterial adhesion to isolated uroepithelial cells and uromucoid. Inf.and Immun., 1981, oct., 256-261.

20. Cohen A.H., Border W.A., Rajfer J., Dumke A. Identification and morphologic pattern of injury. Lab. Invest., 1984,50, 5,519

21. Dahan K, Devuyst O, Smaers M et al. A cluster of mutations in the UMOD gene causes familial juvenile hyperuricemic nephropathy with abnormal expression of uromodulin. J Am Soc Nephrol 2003; 14: 2883-2893

22. Dahan K, Fuchshuber A, Adamis S et al. Familial juvenile hyperuricemic nephropathy and autosomal dominant medullary cystic kidney disease type 2: two facets of the same disease? J Am Soc Nephrol 2001; 12: 2348-2357

23. DavvneyA. McLean C. Cattell W.R. The development of a radioimmunoassay for Tamm-Horsfall glycoprotein in serum. Biochem. J. 1980, v. 185, p. 679-687

24. Dawney A. Thornley C. Thornley C. Cattell W.R. An improved radioimmunoassay for urinary Tamm-Horsfall glycoprotein.n Biochem. J. 1982, v.206, p. 461;

25. Devuyst O., Dahan K., Pirson Y. Tamm-Horsfall protein or uromodulin: new ideas about an old molecule. Nephrology Dialysis Transplantation 2005 20(7): 1290-1294

26. Duguid J.P., Old D.C. Introduction: A historical perspective. In: Fimbriae:Adhesion, Genetics, biogenesis, and Vaccines (P. Klemm Ed.), 1994, CRC Press boca Raton, FL, 1-7;

27. Dulawa J, Jann K, Thomsen M. Tamm-Horsfall protein interferes with Bacterial adherence to human kidney cells. Eur. J of clin. Invest., 1988, 18, 8791

28. Dulawa J, Rambausek M., Jann K., Notohamiprodjo M., Ritz E. Abnormal radiofurosemide binding by Tamm-Horsfall glycoprotein of diabetic patients. Diabetologia, 1985, v. 28, 827-830;

29. Fasth A., Bjure J., Hellstrom M., Jacobsson B., Jodal U. Autoantibodies to Tamm-Horsfall glycoprotein in children with renal damage associated with urinary tract infections. Acta Paediatr Scand, 1980, 69, 709-715;

30. Fasth A., Hanson L.A., Jodal U., Peterson M.D. Autoantibodies to

31. Tamm-Horsfall glycoprotein associated with urinary tract infections in girls. The J of Pediatrics, 1979, v 95, 1, 54-60;

32. Fasth A., Jodal U. Progr. Allergy, 1983, 33, 247-258

33. Firon NOfek I., Sharon N. Carbohydrate-binding sites of the mannose-speeific fimbrial lectins of enterobacteria. Infect Immun, 1984, v 43, 1088-1090;

34. Fletcher A.P. Neuberger A. Tamm-Horsfall urinary glycoprotein. The chemical composition. Biochem J, 1970, 120, 417-420

35. Fletcher A.P. Neuberger A. Tamm-Horsfall urinary glycoprotein. The subunit structure. Biochem J, 1970, 120, 420-425

36. Fowler JE, Mariano M., Lau JLT Interaction of Tamm-Horsfall protein with transitional cells and transitional epithelium. The J of Urology, 138, aug, 446

37. Geerlings SE., Meiland R., Emiel C. et al. Adherence of Type 1-fimbriated Escherichia coli to uroepithelial cells. Diab. Care, 2002, 25, 1405-1409.

38. Gokhale JA., Glenton PA., Khan SR. Characterization of Tamm-Horsfall urinary glycoprotein in a rat nephrolithiasis model. Thhe J of Urology, 2001, 166, 1492-1497.

39. Goodall A.A. Marshall R.D. Problems relating to the storage and treatment of urine samples before radioimmunoassay for Tamm-Horsfall glycoprotein. Biochem. Soc. Trans. 1978, v.6, p. 1043

40. Grant A.M.S. Neuberger A. The development of radioimmunoassay for the measurment of urinary Tamm-Horsfall glycoprotein in the presence of sodium dodecyl sulfate. Clin. Sci. 973, v. 44, p. 163-179

41. Grant AM, Baker LRI, Neuberger A. Urinary Tamm-Horsfall glycoprotein in certain kidney diseases and its content in renal and bladder calculi. Clin Sci 44:377-384, 1973

42. Hartmann L. Bringuier A. Delain E. Ultrastructure-immunoreactivity interference in the radioimmunoassay of the Tamm-Horsfall urinary mucoprotein. J. Immunol. Methods, 1982, v. 54, p. 343-353

43. Hanson LA et al. Immunological aspects of pyelonephritis; Contrib Nephrol,1979,16,16-21

44. Hanson LA Fasth A Jodal U Auto-antibodies to Tamm-Horsfall protein, a tool for diagnosing the level of urinary infections Lancet 1: 226-228, 1976

45. Hodson C.J., Maling T.M., McManamon P.J. Brit. J. Radiol., 1975, 13, 1-26

46. Houwink A.L., Iterson W. Electron microscopical observations on bacterial cytology. A study on flagellation. Biochim Biophys. Acta, 1950, v 5, 10-44;

47. Hoyer JR, Seiler M.W. Influence of renal transplantation in rats on glomerular and tubular immune complexes. Am. J. of kidney dis., v 7, 1, 1986, 69-75

48. Hoyer JR Seiler MW Pathophysiology of Tamm-Horsfall protein. Kidney Int, 16, 1979, 279-289

49. Kaden J., Groth J., May G., Liedvogel B. Urinary Tamm-Horsfall protein asa marker of renal transplant function. Urol. Res., 1994, 22(3), 131-136;

50. Keutel H.J., King J.S., Boyce W.H. Further studies of uromucoid in normal and stone urine. Urologia Int., 1964,17, 324-341;

51. Keutel H J. Localisation of uromucoid in human kidneys and In sections of human kidney stone with fluorescent antibody technique. J. Histochem. Cytochem. 1965, v 13, p 155

52. Kjellsson B. Soderstorm T. An ELISA-method for quantification of Tamm

53. Horsfall protein using monoclonal antibodies.

54. Kurijama I.J., Kobayashi K., Fukuoka S. Lab. Invest., 1990, 5, 54

55. Lewis R.A. Schwartz R.H. Schenk E.A. Tamm-Horsfall mucoprotein. Ontogenic development. Lab. Invest., 1972, v 26, p. 728

56. Lose G., SrensenK., Frandsen B., Nathan E. Excretion of urinary Tamm-Horsfall glycoprotein in girls with recurrent urinary tract infection. Urol. Res. 1987, v. 15, p. 249

57. Lynn K.L., Shenkin A., Marshall R.D. Factors affecting excretion of human urinary Tamm-Horsfall glycoprotein. Clin. Sci. 1982, v. 62, p. 21-26

58. Lynn K.L., Marshall R.D. excretion of Tamm-Horsfall glycoprotein in renal disease. 1984, Clin. Neprology, v 22, 5, 253-257;

59. Leeker A., Kreft B., Sandmann J., Bates J., Wasenauer G., Muller H. et al. Tamm-Horsfall protein inhibits binding of S- and P-fimbriated E. coli to human renal tubular epithelium cells. Exp. Nephrol., 1997, 5, 38-46

60. Lowry O.H. et al. J. Biol. Chem., 1951, 193,265

61. Malagolini N., Cavallone D., Serafini-Cessi F. Intracellular transport, cell-surface exposure and release of recombinant Tamm-Horsfall protein. Kidney Int., 1997, 52(5), 1340-1350;

62. Marier R., Fong E., Jansen M., Hodson C.J., Richards F. Antibody to Tamm-Horsfall protein in patients with urinary tract obstruction and vesicoureteral reflux. The J. of infect. Dis., 1978, v 138, 6, 781-790;

63. Marr AMS Neuberger A. Ratcliffe W.A.Rabbit Tamm-Horsfall urinary glycoprotein: Chemical composition and subunit structure. Biochem J 122: 623-631,1971

64. Maxfield M. Molecular forms of human urinary mucoprotein present under physiological conditions. Biochem. Biophys. Acta, 1961, v. 49, p. 548

65. Maxfield M., Stefanye D. The amino acid composition of normal human urinary mucoprotein. 1962, The J. of biological chemistry, v 237, 8, 1962;

66. Mazzuchi N. Pecarovich R. Ross N. Rodriquez J. Sanguinetti C.M. Tamm-Horsfall urinary glycoprotein. Quantitation by radial immunodiffusion: normal patterns. J. Lab. Clin. Med. 1974, v. 84 p. 774-776

67. McQueen E.G. Engel G.B. Factors determining the aggregation of urinary mucoprotein. J. Clin. Path., 1966, v. 19, p. 392-396

68. McQueen EG The nature of urinary casts. J.Clin.Path, 1962, 15, 367

69. McKenzie JK., McQueen EG. Immunofluorescent localization of Tamm-Horsfall protein in human kidney. J.Clin.Path., 1969, 22, 334-339;

70. Mo L, Zhu XH, Huang HY, Shapiro E, Hasty DL, Wu XR. Ablation of the Tamm-Horsfall protein gene increases susceptibility of mice to bladder colonization by type 1-fimbriated Escherichia coli. Am J Physiol Renal Physiol 2004; 286: F795-F802

71. Mobley HLT., Chippendale GR., Tenney JH., Hull RA„ Warren JW. Expression of Type 1 Fimbriae may be required for persistence of Escherichia coli in the catheterized urinary tract. J of Clin.Microbiol., 1987, v 25, № 12, dec., 2253-2257

72. Muchmore AV, Decker JM. Uromodulin: a unique 85-kilodalton immunosuppressive glycoprotein isolated from urine of pregnant women. Science 1985; 229: 479^81

73. Ochman H., Selander R. Standart reference strains of E. coli from natural populations. J. of bacteriology, feb., 1984, 690-693;

74. Olczak T., Olczak M., Kubicz A., Dulawa J., Kokot F. Composition of the sugar moiety of Tamm-Horsfall protein in patients with urinary diseases. Int. J. clin.lab.res., 1999, 29, 68-74;

75. Olliez-Hartmann M., Pouget-Abadie C., Boullie J., Hartmann L. Variation of urinary Tamm-Horsfall protein in human during the first thirty years of life. Nephron, 1984, v. 38, p. 163

76. Orskov L., Ferencz A., Orskov F. Lancet, 1980, 1, 887

77. Parkinen J. Finne J. Isolation and structural characterization of five major sialyloligosaccharides and a sialylglycopeptide from normal human urine. Eur. J. Biochem. 1983, v. 136(8), p. 355-361

78. Parkkinen J., Virkola R., Korhonen T. Identification of factors in human urine that inhhibit the binding of E. coli adhesins. Inf and Imm., 1988, oct. 26232630

79. Patel R., McKenzie J.K., McQueen E.G. Tamm-Horsfall urinary mucoprotein and tubular obstruction by casts in acute renal failure. Lancet, 1964, v.l, p. 457-461

80. Pennica D., KohrW.S., Kuang W.S. et al. Identification of human uromodulin as the Tamm-Horsfall urinary glycoprotein. Science, 1987, v. 236, p. 83-88

81. Rambausek M., Rahm H-J., Jann K., Notohamiprodjo M., Ritz E. Abnornal glycolisation of Tamm-Horsfall protein (THP) in diabetes. Kidney Int., 1984, v. 25, 1,237

82. Rampoldi L, Caridi G, Santon D et al. Allelism of MCKD, FJHN and GCKD caused by impairment of uromodulin export dynamics. Hum Mol Genet 2003; 12: 3369-3384

83. Reinhart H., Obedenau N. Excretion of Tamm-Horsfall protein in women with reccurent urinary tract infection. The J of urology, 144, nov, 1185.

84. Reinhart H., Obedenau N., Walz D A new ELISA method for the rapid quantitation of Tamm-Horsfall protein in urine. AJCP, aug., 1989

85. Romero M., Zanaro N., Gonzalez L. et al. Tamm-Horsfall proteinexrcretion to predict the onset of renal insufficiency. Clin.Biochem., 2002, 35, 65-68;

86. Schenk E.A., Schwartz R.H., Lewis R.A. Tamm-Horsfall mucoprotein. Localization in the kidney. Lab. Investigation, 1971, v 25, 1, 92;

87. Schwartz RH, Berdon WE, Wagner J, Becker J, Baker DH Tamm-Horsfallurinary mucoprotein precipitation by Urographie contrast agents: in vitrostudies. Am J Roentgenol 108:698-701, 1970

88. Schwartz RH, J.D. Van Ess, Allyn G. May, Eric A. Schenk Tamm-Horsfall glycoproteinutia and renal allograft rejection. Transplantation, 1973, v 16, 2, 83

89. Shachner M., Peggy MM., Mayrer AR Interaction of Tamm-Horsfall

90. Protein with bacterial extracts. Kidney Int., 1987, 31, 77-84

91. Serafini-Cessi F., Malagolini N., Cavallone D. Tamm-Horsfall glycoprotein:biology and clinical relevance. Am. J. kidney dis., 2003, 42(4), 658-676;

92. Serafini-Cessi F. Malagolini N., Hoops T.C., Rindler M.J. Biosynthesis and oligosaccharide processing of human Tamm-Horsfall glycoprotein permanently expressed in HeLa cells. Biochem Biophys. Res. Commun., 1993, 194(2), 784-790;

93. Stapleton A., Moseley S., stamm W.E. Urovirulence determinants in E. coli isolates causing first-episode and recurrent cystitis in women. The J. of infect. Dis., 1991, 163,773-779;

94. Stevenson F.K. The viscosity of Tamm-Horsfall mucoprotein. Biochim Biophys. Acta, 1968, 160, 296-298;

95. Stevenson FK, KentPW Subunits of Tamm-Horsfall glycoprotein.Biochhem J, 116: 791-796, 1970

96. Tamm I., Horsfall J. Charakterization and separation of an inhibitor of viral hemagglutination present in urine. Proc. Soc.Exp.Biol.Med., 1950, 74, 108- 114.

97. Tamm I., Horsfall J. A mucoprotein derived from human urine which reacts with influenza, mumps, Newcastle disease viruses. J.Exp.Med.,1952, 95,71-97.

98. Thornley C., Dawnay A., Cattel W. Human Tamm-Horsfall glycoptotein: urinary and plasma levels in normal subjects and patients with renal disease determined by a fully validated radioimmunoassay. Clin/ science, 1985, v/ 68, 529-535;

99. Torffvit O., Kamper A.L., Strandgaard S. Scand. J. urol. Nephrol., 1997,dec., 31(6), 555-559;

100. Van der Anwera, P. Denis R. Acta clin. Belg., 1985, 40,3, 179-193

101. Weichhart T., Zlabinger G.J., Saemann M. The multiple functions of Tamm- Horsfall protein in human health and disease: A mystery clears up. Wien Klin Wochenschr., 2005, 117\9., 316-322;

102. Work J., Andriole V.T. Yale J. Biol. Med., 1980,53,3, 133-148

103. Zimmerhackl L.B., Rotasy K., Wiegele G., Rasenack A. et al. Tamm-Horsfall protein as a marker of tubular maturation. Pediatr. Nephrol., 1996, aug., 10(4), 448-452;

104. Zimmerhackl L.B. Evalution of nephrotoxicity with renal antigens in children: role of Tamm-Horsfall protein. Eur. J. Clin. Pharmacol., 1993, 44, 39-42;