Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНАЭРОБОВ (CL. CHAUVOEI, CL. SEPTICUM И CL. PERFRINGENS) И ИХ ТОКСИНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОКТКАНЕЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНАЭРОБОВ (CL. CHAUVOEI, CL. SEPTICUM И CL. PERFRINGENS) И ИХ ТОКСИНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОКТКАНЕЙ"

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК им. В. И. ЛЕНИНА

-Я- Ш5)

На правах рукописи Аспирант САИДОВ Уктам Саидовач

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНАЭРОБОВ (СЦ СНАиУОЕ1, СЬ. вЕРпсим И СЦ РЕНР1^СЕ^) и ИХ ТОКСИНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОКТКАНЕЙ

(03.00.07 — «Микробиология»)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

всесоюзный ордена ленина институт экспериментальной ветеринарии

всесоюзной ордена ленина академии сельскохозяйственных наук.««. в. и. ленина

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ АНАЭРОБОВ (СЬ. СНАЦУОЕ!, СЬ/БЕРПСим И СЬ. РЕНРЯ1ШЕКЗ> И ИХ ТОКСИНОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С КУЛЬТУРАМИ КЛЕТОК ТКАНЕЙ

На правах рукописи

Аспирант САИДОВ Уктам Саидович

(03.00.07 — «Микробиология»)

Авторефера? диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щеатра^«-." ...

я-даг

т »*——

Идиоте» ; хСйКЬХва.

Работа "ьыполнека й лаборатории микробиологии Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (Директор—доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ,-профессор Я. Р. Коваленко).

Матёр'иалы Диссертации изложены па 153 стр. машинописного текста, иллюстрированы 22 таблицами, 7 рисунками. Список использованной литературы включает 307 работ, в том числе 160 иностранных источников. ■ ■ ■ ■

Научные руководители:

Заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветерин-арных наук;-професса]г;'М.-Д. Т1олыКовский;

доктор, ветеринарных наук М. А. Сидоров.

"Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор С. Я. Залкинд;

кандидат ветеринарных паук Л, В. Кириллов.

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного Знамени ветеринарная академия им, К. И, Скрябина.

Автореферат разослан « Эг» а&^геисС-1974 г.

Защита диссертации состоится « » ¿-С^ОЖ^сС- 1974 г в 14 часов на заседании Учёного'совёта Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (Москва, 109472, ВИЭВ).. ■ .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь Совета, кандидат биологических наук

В. В. КАЛУГИН

Эффективность специфической профилактики токсиконн-фекций, обусловленных анаэробами, в значительной мере зависит от своевременной диагностики, выявления и определения возбудителя болезни, а также от активности используемых биологических препаратов.

В настоящее время для идентификации возбудителей анаэробов . применяются бактериологические и серологические методы исследования. " -----

Как известно, для определения видовой и типовой принадлежности возбудителей анаэробных инфекций наиболее часто используется реакция нейтрализации токсинов типоспеци-фическими антитоксическими сыворотками на чувствительных лабораторных животных {Oakley и Warrack, 1953; Б. Д. Бы-ченко, 1961 и др.).

Иммуногенность биопрепаратов (антигенов), применяемых против анаэробов, в большинстве случаев зависит от степени токсигенности штамма, из которого готовится вакцина. При длительном хранении, а также при частых пересевах культур анаэробов на искусственных питательных средах они нередко утрачивают токсигенность к одновременно иммуногенность.

С целью сохранения или усиления этих свойств штаммов гшаэробов используются методы пассирования их через чувствительных животных (Н. Я. Денисова, М, Д. Петренко, 1955 и др.).

Для идентификации н сохранении высокой токсичности анаэробов при помощи существующих методов требуется большое количество лабораторных животных и затраты значительного времени.

Значительное число исследований было проведено в направлении изучения возможности идентификации возбудителей газовых отеков при помощи серологических реакций (РА и РП) (Б. Г. Базилевский и В. А. Мельник, 1937; ТА. П. Белов н В. Е. Ласкан, 1940; Г. А. Козловский, 1954 и другие). Однако антигенное родство и наличие большого числа серологических групп'у возбудителей газовых отеков лишает возможности применения этих реакций для идентификации указанных возбудителей.

В сообщениях Е. М. Земскова (1963), С. А, Шамраевой (1965), Е. П, Земляницкой с соавт, (1971) и др. авторов отражены данные экспериментальных работ о способности токсинов возбудителей газовых отеков оказывать цитогоксическое действие на клетки различных видов культур тканей.

В связи с этим представляют значительный интерес исследования, направленные на изыскание возможности идентификации возбудителей газовых отеков с помощью реакции нейтрализации токсинов типоспецифнческими антитоксическими сызоротками в культуре ткани.

В настоящей работе представлены материалы экспериментальных исследований по изучению условий взаимодействия некоторых анаэробов (С1. СЬа\гтое1, С1. эерНсит, С1. регГгш-депв) с культурами клеток тканей, изучению биологических свойств указанных анаэробов, пассированных па культуре ткани, изучению цитотоксического действия их нативных токсинов (культуральная жидкость) на культуры различных видов тканевых клеток, а также изучению возможности идентификации анаэробов с помощью реакции нейтрализации токсинов типо-специфическими антитоксическими сыворотками в культуре клеток.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследования

Для исследования были использованы производственные и музейные штаммы анаэробов С]. СЬаиуое! (1?-15), С1. Берисит (штаммы 1098, 6-1, «Октябрь», 3940, 652), С1. регЫпдепз типа А (штаммы 28, 215, «ПК») тина В (штаммы ЬЁ)-1, ЬО-4), типа С (штамм 219), типа О (штамм 213),типа Е (штамм 415), типа И (штаммы 399 и 400),

У всех указанных исходных и пассированных на культуре клеток (ПТ) штаммов анаэробов изучали морфологические, тинкториалЬные, биохимические и культуральные свойства, а также вирулентность и токспгенность.

Для изучения культуральных свойств были использованы следующие среды: среда Китт-Тароццн (МППБ), триптнче-ский перевар говядины и кровяной агар с 2% глюкозы. Изучение ферментативных свойств проводили путем посева культур на среды с углеводами и многоатомными спиртами.

Вирулентные и токсигенпые свойства исследовали на чувствительных лабораторных животных (белые мыши, морские свинки).

Для изучения взаимодействия культуры клеток с микробными телами анаэробов использовали отмытые путем центрифугирования клетки микробов,

Для изучения,антигенных и иммуногенных свойств пассированных на культуре клеток Штаммов анаэробов, были использованы сыворотки крови кроликов иммунизированных антигенами из пассированных анаэробов. Эти свойства изучали с помощью реакции агглютинации и реакции нейтрализации токсинов указанных анаэробов.

Иатишше токсины возбудителей газовых отеков получали центрифугированием бульонных культур анаэробов, выращенных па питательных средах: Кнтт-Тароцци, бульоне Хоттинге-ра с добавлением глюкозы и сыворотки, триптическом пере* варе говядины, бульоне Мартена и грибной казеиновой гидро-лизатной среде с добавлением глюкозы. Сроки инкубирования культур после посева на питательные среды- составляли для С1. СИаиуое1 24—36 часов, для С1. верНсиш и С1. регЫнйепэ типов А и И—18 часов, для С1. регГпг^епэ типов В, С н Е — 7 часов и для типа О— 18—48 часов.

С целью восстановления токсигенности некоторые штаммы анаэробов многократно пассировали через организм морских свинок и голубей.

Для получения гипериммунных сывороток использовали кроликов весом 2—2,5 кг. Антигенами для гипериммунизации служили инактивированные формалином и живые культуры указанных анаэробов. Иммунизацию проводили возрастающими дозами антигенов, приготовленных из культур С]. СЬаиуое! и С1. БерИсит но следующей схеме:

1. Первый цикл иммунизации проводили инактивнрованны-ми антигенами анаэробов двухкратным внутривенным введением их в дозах 0,5 и 1,0 мл.

2. Второй цикл иммунизации проводили по истечении 17 дней после последней инъекции первого цикла иммунизации 24-часовой культурой С1. СЬаиуое! в дозах 0,3, 0,6 и 1,0 мл и 18-часовой культурой С1. эерИсит в дозах 0,1, 0,2 и 0,4 мл. Интервалы между инъекциями 5 дней.

Иммунизацию против С1. регШг^епэ типа В проводили по несколько видоизменной схеме,

1. Первый цикл иммунизации проводили инактивированиы-ми антигенами трехкратным внутривенным введением его в дозах 0,4, 0,6 и 0,8 мл.

2. Второй цикл иммунизации проводили по истечении 15 дней после последней инъекции первого цикла иммунизации 7-часовой культурой подкожным введением в дозах 0,0001, 0,0005, 0,001 мл. Интервалы между инъекциями — 5 дней:

Кровопускание у кроликов производили через 14 дней после последней инъекции антигена. Выделенную сыворотку отсасывали в отдельные стерильные флаконы и хранили в холодильнике при температуре +4°.

Реакцию агглютинации проводили лробирочным методом. Антигеном для реакции служили отмытые и убитые 0,3% формалином микробные тела, которые разводили физиологическим раствором по оптическому стандарту до концентрации 2 млрд. микробных тел в 1 мл.

Реакцию нейтрализации токсинов проводили по усовершенствованной методике Б. Д, Быченко (1961). Для реакции были использованы нативные токсины, предварительно оттитрованные на культуре клеток и белых мышах.

Культуры клеток тканей

В экспериментах нами были использованы пять видов пер-вично-трипсииизнрованиых клеток: почки новорожденных крольчат (ПК), почки молодых телят (ПТ), почки эмбрионов коров (ПЭК),текстикулы бычков (ТБ) и куриныеэмбрионы9— 11-дневного возраста (культура фибробластов куриных эмбрионов) и два вида перевиваемых линий клеток версннпзирован-ная почка эмбриона свиней (СПЭВ) и почка овцы (ПО).

Для заражения культуры клеток отмытыми микробными клетками анаэробов использовали пробирки с ыонослоями клеток различных тканей. Посте удаления культуральнон среды в пробирку вносили отмытые микробные клетки анаэробов, суспензированные в 0,5%-ном растворе гидролизата лакталь-бумина с добавлением различных компонентов.

С целью заражения культур клеток нативными токсинами анаэробов, из пробирок с монослоями клеток, отобранных для опытов, удаляли культуральную среду и вносили в них разведенные в различной степени в 0,5%-ном растворе гидролизата лактальбумина с добавлением антибиотржов нативные токсины. рН среды после разведения в ней токсинов доводили до 7,4—7,6.

Зараженные культуры клеток выдерживали в термостате при температуре 37°. Через определенные промежутки времени клеточный монослой просматривали под малым увеличением микроскопа (10 X 9).

Для изучения морфологии клеток суспензии клеток тканей высевали в пробирки или пеннциллиновые флаконы с покровными стеклами. Препараты окрашивали краской Романовско-го-Гимза и гематоксилин-эозином.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Изучение взаимодействия возбудителей газовых отеков с культурами клеток тканей

В целях изучения взаимодег^ствия возбудителей газовых отеков с культурами клеток были использованы отмытые клетки из суточных культур патогенных штаммов анаэробов

CI. ChaUvoei, CI. septicum й tl. perfringens типа 6 (Lft-l) и культуры клеток ПО, ПТ, ПЭК, ТБ и куриные фибробласты.

В качестве поддерживающей среды для культуры клеток был использован 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбуми-ha. При заражении культур клеток по указанной методике нами не было отмечено цитопатического. или цитотоксического эффекта и роста анаэробов в поддерживающей среде для культуры клеток.

При исследовании морфологии препаратов культур клеток в окрашенном виде под увеличением микроскопа 7 X 40 и 7 х 90, не наблюдали внутриклеточного размножения анаэробов.

В следующих опытах в качестве поддерживающей среды для клеток тканей применяли 0,5%-ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса с добавлением 1-цистеина, аскорбиновой кислоты, глюкозы и сыворотки крови крупного рогатого скота в различных соотношениях.

Проведенными опытами установлено, что наиболее благоприятной средой для роста анаэробов при взаимодействии с культурами клеток оказался 0,5%-ный раствор гндролнзата лактальбумина с добавлением 2 мг% 1-цистеина, 0,2 мг% аскорбиновой кислоты, 4% глюкозы и 15% сыворотки крови крупного рогатого скота. Было установлено, что добавление этих компонентов в указанной выше дозировке способствует поддержанию и размножению клеток названных культур тканей.

Перед началом опытов пассирования в культуре клеток ПТ была определена минимальная летальная доза исходных культур анаэробов. С этой целью были заражены лабораторные животные. При этом установлено, что минимальная летальная доза суточной культуры CI. Chauvoei для морских свинок составляла 0,4 мл (активность культуры 2,5 Dim в 1 мл). Минимальная летальная доза нативного токсина CI. septicum 18-часовой культуры для белых мышей составляла 0,0124 мл (активность токсина 80 Dim в 1 мл), нативного токсина CI. perfringens типа В — 0,0005 мл (2000 Dim в 1 мл).

Для проведения первого пассажа из отобранных для опыта пробирок с культурой клеток ПТ сливали культуральпую среду и вносили по 4 мл 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина с добавлением 2 мг% 1-цистеина, 0,2 мл% аскорбиновой кислоты, 4% глюкозы и 15% сыворотки крупного рогатого скота (La<i) и из расчета от 100 тыс. до Г млн. отмытых клеток названных анаэробов в 1 мл суспензии.

Одновременно для контроля пассирование анаэробов проводили в среде 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина с вышеуказанными добавлениями дополнительных ком-

попситов {La<), а также S среде Китт-Тароцци (МППБ). Дальнейшие пассажи анаэробов проводили непрерывно без предварительных отмываний. По мере получения роста и после каждого пассажа производили засевы в среду Китт-Тароцци. У полученных культур исследовали морфологические н тинкто-рналыше свойства.

а) Изучение некоторых свойств CI. Chauvoei пассированных на культуре клеток ПТ

При взаимодействии с культурой клеток почки телят морфология микробов, форма колоний, а также биохимические свойства CI. Chauvoei существенно не изменились.

Рост CI, Chauvoei при посеве в среду Китт-Тароцци из пассированных на культуре клеток ПТ и в 0,5%-iiom растворе гидролизата лактальбумнна с добавлением некоторых компонентов, начинался через 9 часов после посева и сопровождался сильным помутнением среды и интенсивным газообразованием. Омечено также удлинение фазы логарифмического деления, что обеспечило накопление большого количества бактериальных клеток.

Вирулентность CI. Chauvoei, пассированных в культуре клеток ПТ, понизилась. В то же время антигены, приготовленные из этих культур, обладали высокими нммуногеннымн свойствами.

В опытах реакции нейтрализации культур CI. Chauvoei групповыми иммунными сыворотками кроликов в дозе 0,25 мл из пассажа на культуре клеток ПТ полностью нейтрализовала 2 Dim культуры, обеспечивая выживание всех 11 зараженных животных. Несколько меньшей нейтрализующей способностью обладали сыворотки крови кроликов, вакцинированных ана-культурой из пассированного штамма CI. Chauvoei на La4 и МППБ. Сыворотки этих групп в дозе 0,25 мл обеспечили выживание 9 из 10 морских свинок.

Также наиболее высокую устойчивость к прямому заражению проявили морские свинки, вакцинированные антигенами из пассажей на культуре клеток ПТ. Из 12 зараженных мор-^ ских свинок этой группы пала одна от 2 Dim культуры на пятые сутки после заражения. Меньшей устойчивостью к прямому заражению обладали морские свинки, иммунизированные другими антигенами. Так, из 12 морских свинок, иммунизированных антигенами из пассажей на La4 пали 2 на четвертые сутки после заражения 4 Dim культуры. Из 12 зараженных морских свинок, иммунизированных антигенами из пассажей в МППБ, пали 3 на четвертые сутки после заражения.

Понижение степени вирулентности CI. Chauvoei прн проведении пассажей не влияло на их агглютиногенность.

ё) Изучение свойств CI. septlcutrl пассированной на культуре клеток ПТ

Изменения в морфологии клеток CI. septicum в отдельных пассажах на культуре клеток ПТ были непостоянными и часто приобретали ^вою исходную морфологию.

Культурные свойства. На среде Кнтт-Тароцци культуры CI. septicum, предварительно пассированные на культуре кле* ток ПТ и на среде La4, давали бурный рост с интенсивным помутнением среды и газообразованием. Начало интенсивного роста этих культур наблюдалось через 8 часов.

На кровяном агаре CI. septicum после 15 пассажа па культуре клеток ПТ, La4 и МППБ отмечался рост круглых колоний и в виде вуали. Кроме того, в посевах из культур, пассированных на культуре клеток ПТ и La4, встречались колонии с корневидными отростками.

Культуры из 30-го пассажа па кровяном агаре формировали колонии, свойственные исходным штаммам CI. septicum в виде корневидных отростков л в большинстве ползучие колоний (образование кружева и арабесок).

Изменения в биохимических и антигенных свойствах у пассированных культур CI. septicum не было отмечено.

Культуры CI. septicum 15-го пассажа на культуре клеток ПТ и на среде La4 снизили токсигенность в 20 раз по сравнению с токсигепностью исходной культуры. Культуры CI. septicum 15-го пассажа в среде Китт-Тароцци снизили токсигенность в 2,5 раза.

При изучении нммуиогешшх свойств CI. septicum установили, что в дозе 0,4 мл сыворотка, полученная иммунизацией кроликов формол антигена ми из пассированной культуры на клетках ПТ, обеспечивала выживание 5 белых мышей из 10 против 2,5 Dim токсина, в среде La4 — 6 белых мышей из 10, н в среде МППБ — 8 из 10 белых мышей. В дозе 0,2 мл иммунные сыворотки всех групп против 2,5 Dim токсина не обеспечивали выживания белых мышей.

Одновременно изучали превентивные свойства иммунных сывороток. С этой целью были взяты дозы 0,2 и 0,4 мл иммунных сывороток и привиты по 6 белых мышей.

Через сутки после введения иммунных сывороток все белые мыши были заражены 2,5 минимальными летальными дозами ?i эти в кого токсина из 18-часовой исходной культуры CI. septicum.

В результате опытов нами было установлено, что сыворотки крови группы кроликов, иммунизированных вакцинами из пассированной культуры на ПТ, в дозе 0,4 мл, предохраняли от гибели трех белых мышей из шести; из второй группы — че-

тырёх из шести; третьей групы всех белых мышей.

— та же доза предохраняла

в) Изучение свойств С1. регМг^епБ типа В, пассированной на культуре клеток ПТ

С1. perfringens типа Б при взаимодействии с культурой клеток ПТ изменяли свою морфологию, сопровождающуюся разбуханием клеток, образованием нитей и цепочек. Также изменялась п форма колоний на кровяном агаре в сторону образования шероховатых (Я) форм колоний.

Среда из 0,5%-ного раствора гидролизата лактальбумина с добавлением Ь — цистеина, аскорбиновой кислоты, глюкозы и сыворотки крови в указанных выше количественных соотношениях является благоприятной для токсинообразования С1. регГппдепэ типа В.

Проведение многократных пассажей на культуре клеток ПТ не стимулировало повышения токсигенности культуры С1. регГгтйепз типа В.

Полученные данные показывают, что С1. регГпп^епэ типа В при проведении 50 пассажей на культуре клеток ПТ и в МППБ одинаково понизили токсигенность в 20 раз. Сравнительно лучше сохранилась токсигенность при пассировании в среде Ьа4. Степень токсигенности культур в'этой среде после проведения 15 пассажей не снизилась. После 30 пассажей токсигенность культур снизилась в два раза и после 50 пассажей— в четыре раза по сравнению с исходными культурами.

Иммунные свойства сывороток проверяли реакцией нейтрализации токсина и изучением превентивных свойств.

Для опытов реакции нейтрализации нативных токеннов С1. регГг^епэ типа В иммунные сыворотки кроликов брали в дозах ОД, 0,3 и 0,5 мл против 5 01ш нативного токсина.

В результате проведенных опытов установлено, что иммунные сыворотки кроликов всех групп, полученные против С1. рег/пп£еп5 типа В, обладали нейтрализующей активностью. Так, полученная иммунизацией антигенами из пассированных на культуре клеток сыворотка в дозе 0,3 мл против 5 01т токсина обеспечила выживание половины белых мышей, а в дозе 0,5 мл — выживание всех мышей. Наибольшей активностью обладала иммунная сыворотка из пассажей в среде Ьа4 в дозе 0,3 мл. Она обеспечила выживание всех белых мышей; иммунная сыворотка из пассажей в среде МППБ в дозе 0,3 мл обеспечила выживание трех белых мышей из четырех.

л ее

При изучении предохранительных свойств сыворотки испытывали в дозах 0,1, 0,3 и 0,5 мл. На каждую дозу сыворотки в опыт брали по 4 белые мыши и на второй день после введения 10

сывороток их заражали 2 Dim иативных токсинбй CI. perfringens типа В (LD-1).

Результаты проведенных опытов показали, что иммунные сыворотки крови кроликов, полученные иммунизацией формо-лантигенами из пассированных на культуре клеток ПТ культур CI. perfringens типа В в дозе 0,3 мл, предохраннлп двух белых мышеи из четырех; сыворотка из пассированных культур в среде La4 предохранила в той же дозе трех из четырех; сыворотка нз пассированных культур в МППБ — одну из четырех белых мышей. Иммунные сыворотки в дозе 0,5 мл предохранили всех белых мышей во всех группах.

Понижение степени токснгеиности CI. perfirngens типа В при проведении пассажей не влияло па их агглютипогеиность.

Полученные нами результаты лишний раз подтверждают положение о зависимости напряженности иммунитета от степени токсигенности культуры, используемой для изготовления анавакцины.

Изучение цитоксического действия иативных токсинов возбудителей газовых отеков на культуры клеток

В целях изучения цитотоксического действия токсинов анаэробов представляет интерес выяснить условия токсинообразо-ваиия возбудителей газовых отеков, изучить чувствительность к токсинам возбудителей газовых отеков культур клеток и происходящих в них при этом морфологических изменений проводить титрацию токсинов и антитоксинов в культурах чувствительных клеток н на белых мышах, а также изучить возможность серологической идентификации нативных токсинов на культурах клеток.

Изучение условий токсинообразования CI. Chauvoei CI. septicum и CI. perfirngens

а) Токсинообразование CI. Chauvoei, С целью выяснения токсинообразования CI. Chauvoei in vitro и in vivo нами были проведены два опыта.

В первом опыте культуры CI. Chauvoei полученные на разных средах, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 минут и надосадочными культуральнымн жидкостями заражали культуры клеток ПЭК, ПК и куриные фибробласты.

Во втором опыте летальными дозам» суточной культуры CI. Chauvoei R-15 выращенной в среде Китт-Тароцци. были заражены морские свинки. Пораженные мышцы павших морских свинок были суспензированы физиологическим раствором, затем полученная суспензия профильтрована через стерили-

зующий фильтр Зейтца и стерильным фильтратом заражалй культуры клеток ПЭК и ПК.

Результаты морфологических исследований культур клеток показали, что в культуральных жидкостях С1. СЬаи\тое1, выращенных в различных средах, а также в фильтратах суспензий, приготовленных из пораженных мышц морских свинок токсические факторы, оказывающие цитотоксическое действие, отсутствуют.

б) Токсннообразование С1. верНсиш и С1. регГгт^епз. С этой целью провели сравнительное изучение токсинообразо-вання С1. зерКсит и С1. регГг^епз типа В, в средах из трип-тнческого перевара говядины (с кусочками говяжьей мышцы и мела на дне емкости с добавлением 0,5% глюкозы) и Китт-Тароцци. , .

При сравнительном анализе токсинообразования С1. sept^cLlm 1098 и С1. регП"^епз типа В (1Л>-1) было отмечено более высокое токсннообразование в среде триптического перевара говядины с содержанием аминного азота 280 мг%, пептона 2% с добавлением глюкозы 0,5%. Полученный на этой среде токсин содержал 100 и 4000 Ь05о в 1 мл нативного токсина, соответственно против 34 и 500 ЬО50 в среде Китт-Тароцци.

Опыты по изучению цитотоксического действия нативных токсинов возбудителей газовых отеков на культуру лервично>трипсинизировгнных клеток ПЭК

Опытами установлено, что нативные токсины С1. зерйсит и С1. регМл^епэ типов В, С, Е и И оказывали цитотоксическое действие на культуры клеток ПЭК, а нативные токсины С1. регГпп^епэ типов А и Д цитотоксического действия не оказывали.

Цитотоксическое действие нативных токсинов С1. регГш^еш типов В, С, Е и Р. проявлялось не сразу, а отмечалось лишь через 4—8 часов после заражения и сопровождалось дегенеративными изменениями клеток. Полное разрушение клеточного монослоя завершалось в течение суток после заражения.

В целях изучения цитотоксического действия токсинов С1. регЕг^епэ типа Д на культуры клеток ПЭК использовали активированные трипсином и неактивированные нативные токсины из 18—48-часовых культур, выращенные на среде триптического перевара говядины с добавлением 0,5% глюкозы.

Результаты опытов показали, что использованные нами культуры клеток ПЭК оказались нечувствительными к натив-ному токсину С1. регГг^епэ типа Д при летальной смертельной дозе его для белых мышей от 0,1 до 0,02 мл.

При исследовании морфологии культур, зараженных клеток токсинами С1. б ер и сит по истечении 30 минут наблюдали вакуолизацию цитоплазмы веретенообразных и фибробласто-подобных групп клеток. У отдельных клеток отмечали разрушение цитоплазмы, ядра пикнотизировались.

В последующие часы указанные процессы деструкции клеток углублялись, протоплазма большинства клеток теряла отростки, вследствие чего они округлялись. Клетки с некротическими явлениями сползали со стекла, в результате чего разрушался образовавшийся монослой клеток.

По истечении суток после заражения на поверхности стекла наблюдали только редкие группы полигональных, дегенери-рованных округлых клеток, со сморщенным ядром и протоплазмой.

При исследовании окрашенных клеток, зараженных токсинами С1. регГппёепз типа В, изменения в морфологии наблюдали через 3 часа контакта с токсином. Они характеризовались разрывами межклеточных связей и округлением веретенообразных и крупных фибробластоподобных клеток, Наблюдали также длинные клеточные тяжи в виде нитей, с вытянутыми ядрами. Они интенсивно окрашивались гематоксилином. Эти клетки, по-видимому, находились в стадии разрыва межклеточных связей, дальнейшего округления и сморщивания.

Большинство округлившихся клеток, не подвергаясь дальнейшему глубокому дегенеративному изменению, сползали со стекла и поэтому по истечении 6 часов контакта с токсином на поверхности стекла оставались лишь отдельные островки здоровых и дегецерировапных полигональных клеток. В дальнейшем и эти клетки подвергались описанным выше глубоким изменениям.

Характер морфологических изменений, происходящих в клетках под действием токсина С1. регЫпёепэ типов С и Р, был идентичен изменениям, вызываемым действием токсина С1. регЖг^епэ типа В.

Дегенеративные изменения в культуре клеток почки эмбриона коров под воздействием токсина С1. регГппеепэ типа Е несколько отличались от описанных выше изменений. В данном случае почти одновременно дегенерировались все виды клеток. Через 1—3 часа после контакта с токсином произошло округление клеток, в результате чего наблюдали полное разрушение монослоя. При этом не отмечали полной дегенерации самих клеток, а наблюдали лишь отдельные клетки, у которых сморщивалось ядро и протоплазма.

По истечении 6—12 часов после контакта наблюдали дегенерацию всех клеток, сопровождавшуюся сжатием цитоплазмы и перемещением ядра в эксцентричное положение.

Опыты по изучений цнтотйксичёского действия нативны* токсинов возбудителей газовых отеков на культуре фибробластов куриных эмбрионов

Проведенными опытами . было установлено, что культуры фибробластов куриных эмбрионов высоко чувствительны к действию нативных токсинов С1. регГНпдепз типов В н С, цито-токсическое действие которых проявлялось от дозы 0,0008 мл. Токсин С1. регМпёепБ типа Л вызывал цитотоксический эффект при внесении в культуру клеток в дозе 0,04 мл. Цитотоксический эффект под воздействием нативных токсинов этих возбудителей проявился в течение 12 часов после заражения. К нативным токсинам С1. регЕп^епэ типов Е и Р культуры фибробластов куриных эмбрионов оказались нечувствительными. Токсины С1. БерНсигл разрушали мопослой клеток в дозе 0,02 мл.

При исследовании зараженных клеток под малым увеличением микроскопа было отмечено, что цитотоксическое действие токсина С1, зерИсиш начинается с разрушения межклеточных связей, округлением и последующим сморщиванием клеток. В дальнейшем на стенках пробирок образуется множество мелких очажков, состоящих из отдельных некротизированных клеток.

В культуре зараженных клеток токсинами С1. регЫгщепэ типов А, В и С цитотоксическое действие проявлялось в ясно-выраженном разрушении значительного количества клеток пласта. В начальной стадии происходило округление и обособление клеток вследствие первичного разрушения межклеточных связей. Округлившиеся клетки в последующем либо отслаивались от стенок пробирок, либо накапливались в очагах, образуя бесформенные клеточные конгломераты.

Опыты по изучению цитотокснческого действия нативных токсинов возбудителей газовых отеков на культуры клеток ПО и СПЭВ

В результате проведенных опытов установили, что перевиваемая линия клеток ПО оказалась чувствительной к действию нативных токсинов С1. эерисит и С1. реНппдепэ типов В и С, а нативные токсины С!, регЕалдепв типов А и О не оказывали цитотокснческого действия на культуры клеток перевиваемых линий ПО.

Культура перевиваемых линий клеток СПЭВ оказалась нечувствительной к действию натнвных токсинов С1. регЫпдепэ типов В, :С и О, даже при внесении в нее 20 и больше минимальных смертельных для белых мышей доз токсина.

Одновременно установлена сравнительно высокая чувствительность этих культур клеток к действию пативных токсинов С1. регГпг^епБ типов Е и Р.

Весьма заметное цнтотоксическое действие натишшх ток-•син-ав С1, верИснт и С1. регЫпеепБ типов Е и Р проявлялось ■по истечении 6 часов после заражения, а полное поражение клеток клеточного монослоя происходило по истечении 12 часов.

Через 1 час после заражения токсинами С1. реНг^епэ типа Е в культуре клеток СПЭВ была отмечен® разрыв межклеточных связей, округление и сморщивание «леток.

Просмотром препаратов под большим (10X90) увеличением микроскопа наблюдали вакуолизацию -цитоплазмы клеток н единичные клетки, у которых ядра пнкнотизировались. Имеющиеся л моносдое многоядерные и гига н тек не клерки, несмотря на разрыв межклеточных связей, не подвергались глубокому дегенеративному изменению, наблюдавшемуся в более '.мелких и округлых клетках. Лишь по истечении трех часов после контакта наблюдалась вакуолизация цитоплазмы этих «лето«.

Через 3—6 часов после контакта с токсинами указанные процессы дегенерации углублялись, т. е. увеличивалось количество клеток с ■пи.кнотизирюванными ядрами. Отмечалось эксцентрическое расположение шшютизированных ядер у от дельных клеток.

Титрация нативных токсинов возбудителей газовых отеков »л культурах чувствительных клеток и белых мышах

Для этой цели мы в опытах использовали четыре вида первично- т р и п с и н из иров а.ч н ы х и два вида перевиваемых линии культур клеток. Для заражения клеток и животных использовали различные разведения токсинов.

Для каждого разведения нативных токсинов брали по четыре пробирки с культурами клеток н 4 белые мыши ¡весом 20—22 г.

Проведенными ис-следовалнями установили, что минимальная летальная доза пативного токсина С1. вер^сит, вызывающая гибель клеток и животных, 'составляла для культуры клеток ПК — 0,02 мл, для культуры клеток ПЭК п куриных фибр об ласт об 0,036 мл, для культуры клегок ПО и СПЭВ—0,2 мл н для белых мышей — 0,24 мл.

-Минимальная летальная доза пативного токсина С1. рег-fгingens типа А составляла для культур куриных фибробла-сто.в 0,04 ,мл и для белых мышей—0,1 мл.

Минимальная летальная доза нативного токсина С1. рег-friпgens типа В составляла для -культур клеток ПК 0,01 мл,

для культур клеток ПЭК 0,0022 мл, для культур клеток ПТ 0,004 'мл, для культу|р фиброластов куриных эмбрионов

0.00053 мл, для культур клеток ПО 0,0016 мл и для белых мышей — 0,01 ил.

Летальная доза дативного токсина С1. регГппдепэ типа С составляла для культур клеток ПЭК 0,01 мл, для культур клеток куриных фийрйбластав — 0,0011 мл, для ПО 0,008 мл и для белых *мышей — 0,01 .мл.

: Опыты, проведенные по изучению чувствительности культур клеток и лабораторных животных к нативным токсинам С1. регГНп^епз типа Е, показали, что летальная доза токсина составляла для культур клеток ПЭК 0,008 мл, для культур клеток перевиваемых линий ОПЭВ 0,04 мл и для белых мышей— 0,1мл.

Нативные тоисины штаммов С1. регГпгщепз т ил а И оказывали цитотаксическое действие на культуры клеток ПЭК и СПЗВ в дозе 0,1 мл, тогда как в опытах заражения белых мышей не было отмечено летального исхода от дозы 0,5 мл нативного токсина.

Опыты по серологической идентификации нативных токсинов возбудителей газовых отеков на культурах клеток тканей и

белых мышах

В экспериментах были использованы нативные токсины возбудителей газовых отеков (С1. зерисит, 01. регГпп^епз типов А, В, С, Е). Токсин 01. регГпп^епэ типа Д не представилось возможным ггспользовать в виду того, что он не оказывал цитотокси.чеокото эффекта на культуры клеток тканей.

Серологическая идентификация, основанная па реакции нейтрализации нативных токсинов,-была проведена на первич-ио-тринсннизированных культурах клеток ПЭК, куриных фибропластах и перевиваемой линии культур клеток СПЗВ, а также на белых мышах.

Результаты проведенных опытов показали большую специфичность цнтотоксического и летального действия нативных токсинов, которое было устранено <в реакции нейтрализации гомологичными антитоксическими сыворотками.

" При титрации специфических антитоксических сывороток на белых мышах было установлено, что нативная антитоксическая сыворютка против 01. верШит содержит 1,6 АЕ, аухая антитоксическая сыворотка против 01. регГпп^епз типа А— 10 АЕ, типа В—20 АЕ, типа С —50 АЕ, типа Е— 10 АЕ. При штрации этих же сывороток на культурах клеток установили, что нативная антитоксическая сыворотка против 01. БерМсит содержит 1,6 АЕ, сухая антитоксическая сыворотка против

01. регГппдепа типа А ,— 25 АЕ, нативная типа В — 10 АЕ,

сухая — 100 АЕ, против типа С — 250 АЕ, против типа Е — 100 АЕ в 1 мл.

Большая нейтрализующая способность гнпериммунных сывороток в опытах на культуре клеток объясняется высокой чувствительностью культур клеток в реакции токсин + антитоксин, а также специфичностью цитотоксическаго действия токсинов названных анаэробов на культуре клеток.

При определении титрскв антитоксических сывороток на белых мышах не всегда устанавливались идентичные результаты полученные на культуре клеток, что можно объяснить индивидуальной чувствительностью подопытных животных.

Большой интерес представляли проведешые «амл опыты перекрестной реакции нейтрализации анаэробных тсяшшов на зтик же объектах.

■В опытах учитывали предельные разведения антитоксических сывороток, способных нейтрализовать определенные дозы-гомологичных нативных токсинов.

В результате проведенных опытов установлено, что натив-ные токсины С1. регМг^епз типов А и Е, использованные в опытах на культурах клеток и на белых мышах, нейтрализовались только гомологичными акт к токси ч ескимт сыворотками. Антитоксичаские сыворотки этих тигтов не устраняли ци-тотоксического и летального действия нативных токе плов других титшв С1. рег/пп^епБ.

. В реакциях »нейтрализации на культурах «легок была отмечена перекрестная нейтрализация нативных токсинов типов В и С. При проведении опытов на белых мышах было установлено, что антштоксическая сыворотка против О. регГппеепэ типа В нейтрализовала гомологичный, а также натигоиый токсины С1. peгfringeпs типа С. Антитоксическая сыворотка против С1. рег1ппдепз типа С нейтрализовала только гомологичный нативный токсин.

Реакция перекрестной нейтрализации латнвных токсинов возбудителей газовых отеков па культурах клеток позволила идентифицировать натшвный токсин С1, регГпп£епй типа А от типов В, С и Е, типа В от типов А (Н Е, типа Е —-от типов А, В и С. Вопрос идентификации нативных токсинов С1. регГпп-£еп$ типов В и С в реакциях перекрестной нейтрализации «а культурах клеток остается окончательно не решенным. Учитывая избирательность действия е — токсина на клетки нервной системы, выявление чувствительных .культур нервных клеток дадут возможность идентифицировать указанные типы на этих биологических объектах,

Изложенные 1выше ¡результаты позволяют полагать, что цитотоксическое действие токсинов С1. регГппдепэ типов В и С

обусловлено летально-некротическим р — токсииом, который, продуцируется этими анаэробами.

Гибель белых мышей .в опытах перекрестной реакции нейтрализации токсина С1, регГпп^епз типа В с гмпериммун-ными сыворотками против С1. регГг^епз типа С объясняется отсутствием в этой сыворотке антител против летального е — токсина,

выводы

г 1. Установлено, что искусственная питательная среда из 0,5% раствора гидролиз а та лактальбумина с добавлением ростовых веществ {1 — цистеина, аскорбиновой кс (слоты, глюкозы и сыворотки крови) оказывает благоприятное влияние на (рост и размножение клеток тканевых культур и патогенных анаэробе®.

2. При заражении культур тканевых «леток патогенным« анаэроба'ми наблюдаются дегенеративные изменения клеток, обусловленные токсическими продуктами, продуцируемыми анаэробами ,в процессе их размножения.

3. Выращивание С1. СЬаиуое! на ,культуре клеток не вызывало изменений -в морфологии, биохимических, антигенных и иммуногенных свойств анаэроба, «о при этом его .вирулентность снижалась. При дыращивании на культуре ¡клеток С1, верНсиш и С1. регГг^епэ токсигенность л им-муногенпость этих анаэробов снижается с сохранением исходных агглютл-ногенных свойств.

4. Фильтраты выращенных культур С1. СЬаиуое!, а также фильтраты из суспензии пораженных мышц -морских свинок, погибших после заражения С1. СЬаиУое] ле оказывали цито-тоисического действия на ¡культуры клеток. Это указывает на отсутствие леталыьо-некротического фактора в -профильтрованных продуктах ■метаболизма С1. СЬаиуое!.

5. Токсин С1. эер1кит оказывает резковыраженное цито-токсическое действие на культуры клеток всех использованных тканей (ПЭК, ПК, культуры фибробластов куриных эмбрионов и др.).

6. Токсины С1. рег[гщ0еп& типов А, В, С, Е и Р обладают избирательным цитотоксическим действием на культуры клеток различных тканей. Так, токсин типов А, В и С (вызывает дегенеративные изменения в клетках культур фибробластов. куриных эмбрионов, а типов Е и И — в клетках ПЭК и СПЗВ,

" Токсин С1. реНгИ^епБ типа Д, вызывающий гибель лабораторных животных, не оказывал цитотоксн ческ о го действия на в'се испытанные культуры клеток.

■7. Цитотойсическое действие токсинов анаэробов сопровождалось нарушением межклеточных связей, округлением и 18

сморщиванием клеток, а также пикнозом ядер, что приводило к гибели клеток.

8. Высшая чувствительность культур тканевых клеток к токсинам возбудителей анаэробных инфекций позволяет определить минимальные количества токсинов анаэробов, не оказывающие летального действия на мелких лабораторных животных (белых мышей).

9. С помощью реакции нейтрализации токсинов возбудителе й т а т о г ш н ых анаэробов антитоксическими сыворотками на культуре клеток представляется возможность проводить идентификацию указанных анаэробов.

10. Результаты проведенных нами исследований ш изучению взаимодействия патогенных анаэробов и дх токсинов с культурами клеток тканей, а также опытов титрации токсинов и антитоксинов позволяют использовать их в ¡практике для диагностики и индикации токснко и н ф екци й, вызываемых анаэробами.

СПИСОК

опубликованных работ по теме диссертации

1. Взаимодействие патогенных анаэробов с культурами «леток некоторых шаней. «Профилактика и меры борьбы с болезнями овец». Тезисы докл. на научном совещании. Махачкала, 12—14 .шоня 1973 г., ВАСХНИЛ.

2. Цитотокснческое действие некоторых патогенных анаэробов ма культуру клеток. Бюллетень ВИЭВ, в. XVI, Москва, 1973 т.

Ответственный за выпуск — доктор вет. наук М. А. Сидоров.

Йодп. в печать 22/111 — 1974 г. Зак. 211—2ÖÖ

Типография ХОЗУ Минпромстроя СССР