Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение продукции и свойств энтротоксина холерных вибрионов О-139 серовара

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение продукции и свойств энтротоксина холерных вибрионов О-139 серовара"

РГ6 он

>

<- о

На правах рукописи

МАЗРУХО Алексей Борисович

ИЗУЧЕНИЕ ПРОДУКЦИИ И СВОЙСТВ ЭНТЕРОТОКСИНА ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ 0-139 СЕРОВАРА

03. 00. 07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Саратов - 1997 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском > противочумном институте.

Научный руководитель: Заслуженный деятель науки РФ,

Действительный член Академии естествознания РФ, доктор медицинских наук, профессор КХ М. Ломов

Официальные оппоненты: Член-корреспондент Российской

Академии технологических наук, доктор медицинских наук, профессор А. К Адамов

доктор медицинских наук, профессор В. С. Рыбкин

Ведущая организация - Волгоградский научно-исследовательски

противочумный институт

Защита состоится "_"_199? г. на заседании

диссертационного совета Д0743201 по завдте диссертаций при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071, г.Саратов, Университетская ул., 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "_"_ 1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета доктор биологических наук Г. А. Корнеев

Актуальность проблемы.

Всестороннее исследование холерных вибрионов 0-139 серовара имеет особое значение в связи с эпидемической опасностью, которую они представляют. До недавнего времени считали, что только вибрионы 01 группы способны вызывать эпидемии холеры, тогда как штаммы, не агглютинирующиеся 01-холерной диагностической сывороткой, могут быть причиной лишь спорадических гастроэнтеритов, раневой инфекции, септицемии (Safrin S.J. et al. 1987).

Однако, в ноябре 1992 года на юге Индии (Мадрас) была заре-гестрирована вспышка тяжелого диаррейного заболевания, клинически сходного с холерой, которая достаточно быстро распространилась на ряд других районов этой страны (Калькутта, Мадурай, Веллоре), а таете,Бангладеш и Таиланд (Albert M. J. et al. 1993, Swerdiow P. L. , Ries A. 1993).В одной только Калькутте было выявлено более 15 тысяч случаев заболевания, из которых 230 привели к смерти больных (Sarkar В.L. et al. 1993). К середине января 1993 года вспышка на юге Бангладеш охватила около 10 тысяч человек, среди них было за-регестрировано 500 летальных исходов (Albert M. J. 1993). В феврале 1993 года был зафиксирован заЕоз этой инфекции из Индии в США (Altman L. К. 1993), а в мае того же года - в Россию (Ломов Ю. М. с соавт. 1995). За период 1993-1994 годов о местных случаях данного заболевания сообщили органы здравоохранения Пакистана, Китая, Малайзии, Непала; о завозных - Германия, США, Эстония, Киргизия.

Причиной этих вспышек явился токсигенный, ранее не идентифицированный серовар Y.cholerae 0-139 (Bengal). Данный возбудитель не агглютинировался как моно- и поликлональными холерными сыворотками 01, так и не одной из 137 ранее описанных сывороток не 01 ( Yohnson Y. А. 1994).

Первые предварительные исследования показали, что вибрионы нового серовара содержат гены вирулентности 01 серогруппы, обычно не обнаруживаемые у штаммов не 01 серогрупп, в том числе - ген холерного токсина (Calía К. Е. et al. 1994).

Несмотря на ряд опубликованных в 1993-1996 годах работ,преимущественно зарубежных авторов, посвященных проблемам изучения энтеротоксина V. cholerae 0-139 (Albert M. J. 1993, Islam MS. 1993, Waldor M. K. , Mekalanos J. J. 1994 и др. ), в литературе не отражены вопросы об условиях и факторах, влияющих на токсинопродукцию холерных вибрионов 0-139 серовара in vitro, о токсинопродуцирующей

активности штаммов V. cholerae 0-139, выделенных из различных источников, о существовании среди них гиперпродуцентов энтеротокси-на,о разработке технологии получения препаратов холерогена нового серовара и их очистки. Нет сравнительной характеристики удельной активности токсинов 0-139 и 01 серогрупп при тестировании на биологических и цитологических моделях. Наконец, отсутствие эффективной антитоксической сыворотки затрудняет постановку любых иммунологических тестов по индикации и количественной оценке знте-ротоксина V. cholerae 0-139, а также выявление его иммунологического родства с токсинами вибрионов 01 серогруппы. Необходимостью досконального изучения указанных проблем и обусловлена актуальность данной диссертационной работы.

Цель работы.

Исследование продукции, факторов, влияющих на нее, биологических и иммунологических свойств энтеротоксина холерных вибрионов 0-139 серовара.

Задачи исследования.

1) Изучить гоксинопродущрующую активность in vitro штаммов V. cholerae 0-139 различного происхождения и выявить среди них потенциальные гиперпродуценты холерного токсина.

2) Изучить влияние серии пассажей через кишечник кроликов-сосунков на токсинопродукцию штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара in vitro.

3) Исследовать влияние различных условий культивирования на токсинопродукцию штаммов V. cholerae 0-139 in vitro .

4) Сравнить токсинопродукцию Гем+ и Гем- субкультур штаммов V. cholerae 0-139 .

5) Получить препараты неочищенного и очищенного токсина V. cholerae 0-139 и исследовать их биологические свойства и удельную активность на моделях лабораторных животных и в культуре клеток в сравнении с токсинами классического и эльтор вибрионов.

6) Получить сыворотку к токсину нового серовара "Bengal", исследовать ее активность.

7) Установить, имеет ли место иммунологическое родство между токсинами холерных вибрионов 0-139-ой и 01-ой серогрупп.

Научная новизна.

1) Впервые проведено исследование токсинопродуцирующей активности in vitro штаммов нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139, имеющих различные источники и места выделения.

2) Найдены потенциальные гиперпродуценты холерного токсина среди штаммов V. cholerae 0-139.

3) Установлено положительное влияние серии пассажей через кишечник кроликов-сосунков на токсинопродукцию ряда штаммов V. cholerae 0-139 in vitro.

4) Подобрана оптимальная питательная среда, добавки к ней, температурный решм и уровень аэрации, способствующие повышению продукции холерного токсина вибрионами 0-139 серовара.

5) Показано, что отрицательные по гемолитической активности субкультуры штаммов V. cholerae 0-139, полученные на агаре Мартена рН 7,6 с 2% эритроцитов барана, обладают более высокой токси-нопродукцией in vitro, чем гемолизположительные.

6) Впервые получены препараты очищенного и неочищенного знтеро-токсина V. cholerae 0-139.

7) Установлена термолабильность знтеротоксина вибрионов серовара "Bengal".

8) Установлено, что энтерогоксин V. cholerae 0-139 серовара идентичен по биологическому действию токсинам классического и эль-тор вибрионов, однако обладает более высокой удельной активностью во всех общепринятых тестах.

8) Впервые метод сорбционной хроматографии с галактозой, ранее применявшийся, преимущественно, для получения очищенного термолабильного токсина Е. col i, был успешно использован с целью очистки холерного токсина как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп.

9) Получены антисыворотки к очищенному и неочищенному токсинам Y. cholerae 0-139, обладающие высокой гомо- и гетерологичной токсиннейтрализующей активностью.

10) Установлено, что токсины холерных вибрионов 0-139 и 01 серогрупп иммунологически идентичны.

Практическая значимость.

1) В качестве потенциальных токсинопродуцентов предложены 2 штамма холерных вибрионов 0-139 серовара - Р16065 и М045.

2) Обоснован и предложен метод селекции отрицательных по гемоли-

- б -

тической активности субкультур штаммов V.cholerae 0-139 для поиска гиперпродуценгов энтеротоксина.

3) Рекомендовано осуществлять серию последовательных пассажей штаммов V. cholerae 0-139 через кишечник кроликов-сосунков с целью предварительной подготовки культур к получению из них препаратов холерогена.

4) В качестве среды культивирования холерных вибрионов 0-139 се-ровара для получения из них энтеротоксина рекомендована среда AKI.

5) Разработаны предложения по оптимизации температурного режима, уровня аэрации, использованию возможных добавок к питательным средам для повышения токсинопродукции штаммов V. cholerae 0-139.

6) Разработана методика получения препаратов токсина-сырца из штаммов V. cholerae 0-139.

?) Показана эффективность метода сорбционной хроматографии с использованием D-галакгозы в качестве агента, связывающего молекулы токсина, для очистки препаратов холерогена как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп.

8) Получена эффективная антисыворотка к очищенному токсину V. cholerae 0-139, обладающая высокой нейтрализующей активностью в отношении препаратов холерогена как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп и, при этом, не содержащая антител к соматическому О-антигену, что исключает неспецифические взаимодействия при постановке серологических реакций.

Положения, выносимые на защиту.

1) Штаммы нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139 обладают способностью продуцировать термолабильный энтероток-син, идентичный по биологическому действию токсинам холерных вибрионов 01-ой серогруппы, но превосходящий их по удельной активности.

2) Токсины холерных вибрионов 0-139 и 01 сероЕаров иммунологичес-ки идентичны.

3) Использование для культивирования штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара среды AKI, бульона Мартена рН 7,6 с предварительно добавленным к нему антибиотиком линкомицином в дозе 1 мг/мл, а также, серия последовательных пассажей через кишечник

кроликов-сосунков способствуют повышению токсинопродукции этих штаммов in vitro.

4) Гем- субкультуры штаммов V. cholerae 0-139, полученные на агаре Мартена рН 7,6 с 21 эритроцитов барана, обладают более высокой токсинопродуцирующей активностью, чем Гем-f- варианты.

5) Сыворотка, полученная к токсину V. cholerae 0-139, характеризуется высокой нейтрализующей активностью в отношении гомологичного и гетерологичных препаратов холерогена, и, следовательно, может быть использована для изучения токсинов как 0-139-ой, так и 01-ой серогрупп холерных вибрионов.

Апробация работы.

Основное содержание диссертации отражено в 4 опубликованных работах.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на научных конференциях Ростовского-на-Дону государственного научно-исследовательского противочумного института, а также на конкурсе молодых ученых РЛЧИ (1995).

Структура диссертации.

Монография изложена на 171 странице, состоит иа введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, содержит 14 таблиц и 15 рисунков. Библиография представлена 102 отечественными и 137 зарубежными источниками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы.

В данном разделе диссертации содержится описание 24 использованных в работе штаммов V. cholerae 0-139, имеющих различные места и источники выделения, а также, 2 штаммов 01 серогруппы: V. cholerae 569В и V. eltor 1310, взятых для исследования в качестве контрольных гиперпродуцентов холерного энтеротоксина. Приведены питательные среды и условия культивирования микроорганизмов, приборы, оборудование, препараты и химические реактивы, которые были применены в настоящей работе.

Фильтраты бульонных культур и препараты энтеротоксина получали путем культивирования штаммов холерных вибрионов 0-139-ой и 01-ой серогрупп на бульоне Мартена рН 7,6 и среде AKI по методу

Iwanaga M. (1985).

Очистку полученных токсинов осуществляли методом сорбционной хроматографии с использованием D-галактозы в качестве агента, связывающего молекулы холерогена, предложенным Clements J. D. и Finkelstein R. A. (1979) в модификации Мартыненко Л. Д. (1990).

Тестирование фильтратов и препаратов энтеротоксинов проводили на общепринятых биологических и цитологических моделях: лапках белых мышей (Дурихин К. В., Попова А. Е. 1974), коже (Craig J. Р. 1966) и изолированных кишечных петлях (De S.N. , Chatterje D.N. 1953) взрослых кроликов, кишечнике кроликов-сосунков (Datta N. ,Habbu U 1955) и путем титрования в культуре клеток CHQ (Сальникова 0.И. 1988).

Определение содержания белка в препаратах энтеротоксинов осуществляли по методу Lovjry 0. Н. (1951).

Для получения Гем-ь и Гем- субкультур использовали выращивание штаммов V. choleare 0-139 на агаре Мартена pH 7,6 с 2% эритроцитов барана.

Изучение влияния различных условий культивирования на токси-нопродукцию холерных вибрионов 0-139 серовара включало подбор оптимальной питательной среды, температурного режима, уровня аэрации и выявление эффективности внесения некоторых добавок к средам, в частности, антибиотиков, поЕерхностно-активных веществ, 2,5% этилового спирта.

Антитоксические сыворотки получали методом двукратной, с интервалом в 30 дней, подкожной иммунизации кроликов по схеме Лобанова В. В; (1994) и исследовали их активность в реакции нейтрализации и иммуноферментном анализе.

Результаты исследования и их обсуждение.

Изучение гоксинопродуцирующей активности езятых для исследования 24 штаммов V. cholerae 0-139 выявило,что 62,5% из них вызывали формирование достоверного привеса лап белых мышей, а 79% -положительный результат в гесте кожной проницаемости. Причем,между этими критериями токсинопродукции существует прямолинейная положительная связь с достаточно высокой степенью сопряженности, о чем свидетельствует Ееличина найденного коэффицента корреляции г = 0,84. По результатам двух вышеуказанных биологических тестов все использованные в опытах штаммы 0-139 серовара были условно

разделены на 4 группы в зависимости от способности продуцировать холерный токсин в среду культивирования (таб.1). В первую группу, характеризующуюся высоким уровнем токсинопродукции in vi tro, вошли два штамма - Р16065, выделенный в г. Азове (Россия) от человека и М045,выделенный в г.Мадрасе (Индия) из внешней среды. По величине привесов лап белых мышей и титров в кожной пробе они не только превосходили все исследованные штаммы V. cholerae 0-139, но и приближались к контрольным токсинопродуцентам 01 группы: V. cholerae 569В и V. eltor 1310. Таким образом, эти два штамма нового эпидемически значимого серовара "Bengal" могут быть рекомендованы для изучения в качестве потенциальных гиперпродуцентов энтеротоксина.

Следует отметить, что наиболее обширной оказалась вторая группа штаммов V. cholerae 0-139 - со средним уровнем токсинопродукции in vitro. В нее вошли 42% всех взятых в опыт культур, имеющих различные места выделения: 6 штаммов,выделенных на территории Индии, 2 - выделенных в Киргизии, 1 - полученный из института Пастера (Париж) и 1 - выделенный в г.Азове (Россия). Для них было характерно сочетание сравнительно высоких показателей в тесте отекогенного действия на лапки белых мышей (величина приЕесов лап - от 100 до 200 мг) с выраженным эффектом в кожной пробе (титры ФКП - 1/16). Однако,эти штаммы уступали контрольным токсинопродуцентам классического и эльтор вибрионов более существенно, чем штаммы, составившие первую группу.

В культуральных фильтратах 7 из 24 использованных в работе штаммов V. cholerae 0-139 не было обнаружено присутствия холерного токсина в количествах, соответствующих чувствительности примененных для тестирования биологических методов, однако данные штаммы, также как и остальные, содержали ген vet и вызывали типичную хо-лерогенную реакцию при введении их взвесей, содержащих 107 микробных клеток/мл, в кишечник кроликов-сосунков.

В ходе работы было отмечено, что при введении в кожу кролика супернатантов, полученных из свежевыделеяных штаммов V. cholerae 0-139, наряду с типичной реакцией в виде отека и гиперемии,наблюдалось образование на месте инъекции зоны ишемии, а иногда, и небольших участков некроза, в то время, как у длительно хранившихся на питательных средах и пассированных штаммов ишемия либо отсутствовала, либо была незначительной, а некроз вообще не был заре-гестрирован. Вероятно, это связано с тем, что длительное хранение

Таблица 1

Классификация штаммов V. cholerae 0-139 в зависимости от уровня токсинопродукции in vitro.

1 1 | Группа штаммов | i Средний привес | Титр Ш1 i i 1Номера 1

лап белых мышей,| 1штаммов 1

мг | 1

11. Штаммы с высоким | 1 1

| уровнем продукции | более 200 | 1/32 1 Р16065 1

| холерного токсина | 1 1 Ш45 1

I in vitro | 1 i

III. Штаммы со средним | 1 1 1 88 1

| уровнем продукции | 100-200 | 1/4 - 1/16 1 АР2 1

| холерного токсина | 1 1 MD012 1

I in vitro | 1 1 V015 1

1 1 Р07 1

1 1 1306 1

1 1 1311 1

1 Р16063 1

1 SG25 1

1 1 1 MD025 1

I III. Штаммы с низким | 1 1

I уровнем продукции! 75-100 | 1/2 1 Р16064 1

I холерного токсина| 1 1 API 1

I in vitro | 1 1 SG24 1

1 1 Р02 1

1 i 1 Р16131 1

IIV. Югаммы, | 1 1 1 V020 1

I не обладающие | 1 1 МЭ28 1

| регистрируемой | 1 1 55 1

| биологическими | ниже 75 | отр. 1 59 1

| методами | 1 1 62 1

I токсинопродукцией | 1 1 70 1

I in vitro | i i 1 i 1 71 1 i i

штаммов V. cholerae 0-139 на питательных средах, ведущее к определенной перестройке клеточного метаболизма, способствует изменению соотношения синтеза или выделения в среду культивирования дермо-некротического фактора и собственно холерного токсина. В результате, при постановке кожной пробы, доминирующи становится эффект повышения сосудистой проницаемости, вызываемый холерогеном, а не артериоло-капиллярный спазм, связанный с действием ДНФ.

Были получены данные, свидетельствующие, что серия последовательных пассажей через кишечник кроликов-сосунков с выделением культуры после каждого из них в определенной мере способствует усилению вирулентных свойств и токсинопродукции in vitro штаммов V. cholerae 0-139. Однако, это влияние имеет различную степень выраженности для каждого из штаммов: чем более вирулентна исходная культура, тем значительнее повышение после пассирования токсинопродуцирующей активности. Значимое увеличение продукции холерного экзотоксина in vitro возможно при проведении серии, включающей не менее трех последовательных пассажей, а при низкой холерогенности исходного штамма необходимо увеличить количество пассажей до 5-6.

Изучение влияния различных условий культивирования на токси-нопродукцию штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара in vitro выявило, что наиболее оптимальной средой для получения энтеротоксина V. cholerae 0-139 является среда AKI. Так, средний для взятых в опыт штаммов привес лап белых мышей при использовании среды AKI был на 296 мг больше,чем при использовании бульона Мартена рН 7,6, а в тесте кожной проницаемости средний титр штаммов,выращенных на среде AKI, был в 205 раз выше, чем у культивированных на бульоне Мартена рН 7,6 (таб.2). До настоящего времени, предложенная в 1985 году Iwanaga № et al. среда AKI, использовалась, преимущественно, для получения холерного токсина из вибрионов биовара eltor, в отношении же классического биовара она была недостаточно эффективной. Обнаруженное нами усиление токсинопродуцирующей активности штаммов V. cholerae 0-139 при их культивировании на среде AKI указывает на определенную близость вибрионов нового эпидемически значимого серовара "Bengal" с вибрионами eltor.

Было также показано,что добавление антибиотика линкомицина в дозе 1 мг/мл к бульону Мартена рН 7,6 приводило к повышению токсинопродуцирующей активности всех использованных в работе штаммов V. cholerae 0-139. Таким образом, получение холерного энтеротокси-

Таблица 2

Сравнение токсинопродуцирующей активности штаммов V. сЬо1егае 0-139,выращенных на бульоне Мартена рН 7,6 и среде АК1

1 1 | N штамма | Бульон Мартена рН 7,6 1 Среда AKI |

Средний привес лап б/м.мг Титр ФКП Средний привес лап б/м,мг 1 Титр ФКП |

| 16065 | 230 ш=8,0 1/16 500 ш=12,5 1/2048 |

| АР 2 | 65 ш=2,4 1/4 375 т=9,5 1/32 |

| Ш 45 | 83,5 т=6,0 1/32 405 т=8,8 1/1024 1

| MD0 12 | 155 ш=8,4 1/32 512,5 ш=12,6 1/256 |

1 88 | 1 1 50 т=3,б 1/2 272,5 ш=9,2 1/128 | |

на из штаммов нового эпидемически значимого серовара возможно и путем выращивания на бульоне Мартена рН 7,6, но при этом целесообразно предварительно добавалять к среде линкомицин.

Среди испытанных методов культивирования наиболее высокую токсинопродукцига штаммов V. cholerae 0-139 обеспечивал метод Iwa-nag-a М. (1985), который включает инкубирование в стационарных условиях, близких к анаэробным, в течение первых 4 часов с последующим восемнадцатичасовым шуттелированием при 33-350С. Нами было установлено,что данный метод позволяет применять в качестве среды выращивания вибрионов 0-139 серовара не только AKI, но и бульон Мартена рН 7,6, хотя и с меньшей эффективностью.

Было установлено, что популяция гемолизотрицательных по Грейгу штаммов 0-139 серовара неоднородна по своему составу: при культивировании на агаре Мартена рН 7,6 с 2Z эритроцитов барана она диссоциирует на Гем+ и Геы- варианты, причем в большинстве случаев наблюдается преобладание именно Гем+ колоний. Наш впервые была предпринята попытка сравнительного изучения токсинопро-дуцирующей активности Гем+ и Гем- субкультур штаммов V. cholerae 0-139 путем получения из них бесклеточных культуральных фильтратов для тестирования на общепринятых биологических моделях: лапках белых мышей и в коже кролика. Проведенное исследование показало, что токсинопродукция Гем- вариантов всех взятых в опыт штаммов выше, чем у Гем+ субкультур (таб. 3). Это наводит на мысль о наличии обратной связи между холерогенностьга и гемолитической активностью для нового серовара V. cholerae 0-139. Более высокая токсинопродукция гемолизотрицательных субкультур по сравнению с ге-молитически активными вариантами каждого из исследованных штаммов может быть объяснена как супрессорным влиянием Hly-гена на ген vet, так и взаимодействием на уровне экспрессии этих генов, когда реализация одного из них частично или полностью препятствует реализации другого. Указанная закономерность взаимосвязи холерогена и гемолизина V. cholerae 0-139 открывает возможность использования селекции отрицательных по гемолитической активности субкультур штаммов нового эпидемически значимого серовара в качестве одного из методов поиска потенциальных продуцентов энтеротоксина.

В ходе настоящего исследования впервые удалось получить и лиофилизировать три серии экзотоксина-сырца из референтного штамма V. choloerae 0-139 KD45, которые превосходили по удельной ак-

Таблица 3

Токсинопродуцирующая активность Гем+ и Гем- субкультур, полученных из штаммов V. Cholerae 0-139

1 | N штамма i 1 Гем- Гем+ i

1 |Диапазон j значений ¡привеса |лап б\м, | мг i 1 Среднее | значение] привеса | лап б\м,| мг | Титр ФКП Диапазон значений привеса лап б\м, мг i i | Среднее | | значение! | привеса | | лап б\м, | 1 мг ¡ Титр| ФКП |

| Р 16065 1 189-145 1 i 108,8 | т=1г,2 | 1/16 27,5-56 1 47,3 | | т=6,3 | отр |

[ РО 7 1 [123-180 1 i 156 | пИ.2,2 | 1/16 42,5-72 1 56,3 | 1 ш=7,4 | отр |

| Ш 45 1 1110-207 1 i 167,9 | т=19,9 | 1/32 80-97,5 1 88,6 | 1 ш=4,2 | отр |

| 88 t 1 181-185 1 i 121,5 | т=22,5 | i 1/16 40-102,5 1 64,9 | | т=13,61 i i отр | 1

тивности контрольные препараты из штаммов-токсинопродуцентов V. cholerae 569В и V. eltor 1310 как в 4 основных тестах на биопробных животных,так и при титровании в культуре клеток СНО. Причем, в кожной пробе и на модели лапок белых мышей, удельная активность всех трех- серий токсина-сырца 0-139 серовара была почти в 100 раз,а на моделях кишечника кроликов-сосунков и лигированных кишечных петлях взрослых кроликов - в 10 раз выше, чем у токсинов из' классического и эльтор вибрионов 01 группы. Титрование экзотоксинов-сырцов в культуре клеток СНО выявило, как и постановка проб на лабораторных животных, что по показателю удельной активности препараты V. cholerae 0-139 в 38,09 - 1454,5 раза превосходят неочищенный токсин 7. cholerae 569В, и в 2,31 - 88,2 раза -токсин-сырец V. eltor 1310 в случае 100% изменения клеток в популяции. Для 50% изменений это превосходство было еще более выражено: активность по белку энтеротоксина V. cholerae 0-139 М045 в 150,9 - 5714,2 раза выше, чем у V. cholerae 569В, и в 4,5 - 171,4 раза - чем у V. eltor 1310.

Впервые нами был получен препарат очищенного холерного токсина из штамма V. cholerae 0-139 М045. Для его получения был использован метод сорбционной хроматографии с применением D-галактозы в качестве агента, связывающего молекулы токсина, предложенный Clements J. и Finkelstein R. А. (1979) в модификации Мартынен-ко Л. Д. (1990). Данный метод ранее применялся, преимущественно, для очистки термолабильного энтеротоксина Е. coli. Была также предпринята попытка очистить аналогичным способом препараты токсинов-сырцов из штаммов V. cholerae 569В и V. eltor 1310, оказавшаяся достаточно успешной. В результате, нам удалось получить две серии очищенного препарата холерогена V. cholerae 0-139 Ш45 и по одной серии очищенных токсинов классического и эльтор вибрионов. Полученные очищенные препараты характеризовались более высоким процентным содержанием белка и возросшей удельной активностью в основных биологических гестах по сравнению с неочищенными токсинами из этих штаммов.

Сравнительное изучение белкового состава очищенного и неочищенного энтеротоксинов V. cholerae 0-139 MD45 методом электрофореза в полиакриламидном геле (12%) с SDS выявило, что исследуемый токсин-сырец разделился на 6 белковых зон с молекулярными массами - 30 кДа, 40 кДа, 45 кДа, 54 кДа, 90 кДа и 95 кДа, а очищенный

препарат энтеротоксина - только на 2 зоны (30 кДа и 54 кДа), что соответствует молекулярным массам субъединиц А и В. Это свидетельствует об эффективности использованного способа очистки холероге-на вибрионов 0-139 серовара.

Однако, необходимо дальнейшее совершенствование этого метода с целью достижения большего выхода очищенного препарата и увеличения процентного содержания в нем белка, что станет возможным, с одной стороны,путем повышения сорбционной емкости колонки и более точного определения требуемого для связывания всех молекул токсина количества галактозы, с другой - путем снижения потерь специфического белка на этапах концентрирования и очистки.

Наибольшая удельная активность, как и при исследовании токсинов-сырцов, была зарегестрирована у обеих серий очищенного препарата V. cholerae 0-139 Ш45 и оказалась, в среднем, в 10 раз выше, чем у очищенных токсинов классического и эльтор вибрионов при постановке основных биологических тестов (таб. 4). Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют, что при полной идентичности патоморфологических изменений в органных и тканевых мишенях экспериментальных животных под действием очищенных токсинов V. cholerae 0-139 и V. cholerae 01, более активным в отношении влияния на биологические модели является препарат из референтного штамма серовара "Bengal".

Подводя итоги проведенной иммунизации, следует отметить, что впервые удалось получить достаточно эффективную антисыворотку к очищенному и неочищенному токсинам из референтного штамма нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139 Ш45 с выраженной токсиннейтрализующей активностью, о чем свидетельствуют высокие (до 1/65610) титры антитоксических антител в реакции нейтрализации. При этом, сыворотка к очищенному токсину данного штамма вообще не содержит агглютининов, что полностью исключает возможные неспецифические взаимодействия при постановке серологических реакций, а сыворотка к токсину-сырцу имеет сравнительно невысокие титры этих антител, что также улучшает ее диагностические возможности. Параллельно полученные аналогичным методом сыворотки к препаратам холерогена традиционных штаммов-токсинопродуцентов 01 группы - V. cholerae 569В и V. eltor 1310 тоже обладали выраженной токсиннейтрализующей активностью и,соответственно, могут быть использованы в сравнительном иммунологическом тестировании.

Таблица 4

Удельная активность очищенных экзотоксинов, полученных из штаммов V. cholerae 0-139 М045, V. cholerae 569В и V.eltor 1310 на основных биологических моделях

1 | Очищенный | токсин Активность по белку (в г белка) 1

Лапки белых мышей 1 1 | Тест кожной | | проницаемости! 1 I 1 Кролики- | сосунки | Взрослые | кролики |

I V. cholerae | 0-139 Ш45 [ (серия 2) 5,6.10-10 1 1 1 1 | 7.10-15 | 1 1 1 I 1,4.10-7 | 2,3.10-5|

| V. cholerae | 0-139 Ш45 | (серия 3) 6,3 .10-10 1 1 1 1 | 1,6.10-14 | 1 1 1 | 1,6.10-7 | 2,6.10-51

I V. cholerae | 569В 5,3.10-9 1 1 1 1 | 5,3.10-13 | I I 1,3.10-6 | 2,7.10-41

| V. el tor I 1310 i 7,4.10-9 I 1 1 1 | 3,7.10-13 | 1 1 1,9.10-6 | I 1,9.10-4| |

Таблица 5

Титры антитоксических сывороток в реакции перекрестной нейтрализации на модели лапок белых мышей.

1 I Сыворотки к токсинам 1 Очищенные токсины i

|V. cholerae | М045 1 1 0-139| V.cholerae| | 569В | 1 I V. eltor j 1310 |

I V. cholerae 0-139 Ш45 | очищенному | 1/65610 I 1 i 1/65610 | 1 1 1 f 1/21870 |

I V. cholerae 0-139 Ш45 | сырцу | 1/21870 1 1 | 1/21870 | 1 1 I I 1/7290 |

I V. cholerae 569В I очищенному | 1/7290 1 1 | 1/7290 | 1 1 1 I 1/2430 |

| V. cholerae 569В I сырцу | 1/7290 1 1 | 1/21870 | 1 1 I | 1/2430 |

I V. eltor 1310 | очищенному I | 1/21870 1 1 1 | 1/21870 i 1 1 • « 1/65610 | i

Проведенное изучение активности,полученных к токсинам V. cholerae 0-139 MD45, V. cholerae 569В и V. eltor 1310, сывороток в реакциях прямой, перекрестной нейтрализации и ИФА (таб.5) показало, что все они обладают не только выраженной гомологичной, но и гете-рологичной токсиннейтрализующей активностью, что свидетельствует об антигенной идентичности токсинов 0-139 и 01 сероваров.

Наиболее активной оказ'алась сыворотка к очищенному токсину штамма V. cholerae 0-139 Ю45, вызывавшая нейтрализацию отекоген-ного действия на лапки белых мышей гомологичного токсина в разведении 1/65610, а гетерологичных - в разведениях 1/21870 - 1/65610 и блокировавшая развитие феномена сосудистой проницаемости в коже кроликов при еще более высоком разведении - до 1/131220 для гомологичного токсина. Таким образом, высокая гомологичная и гетеро-логичная токсиннейтрализующая активность в сочетании с отсутствием агглютинирующих антител, которые могут быть причиной неспецифических взаимодействий, открывает широкие перспективы применения этой сыворотки в микробиологических и иммуннологических исследованиях.

ВЫВОДЫ

1) Штаммы нового эпидемически значимого серовара "Bengal" обладают способностью продуцировать in vitro термолабильный энтеро-токсин, идентичный по биологическому действию токсинам классического и эльтор вибрионов, но превосходящий их по удельной активности.

2) В качестве потенциальных продуцентов холерного токсина могут быть предложены два штамма V. cholerae 0-139: PI6065 и МЭ45.

3) Серия последовательных пассажей через кишечник кроликов-сосунков способствует повышению холерогенной активности и токсино-продукции in vitro V. cholerae 0-139.

4) Установлено, что культивирование штаммов V. cholerae 0-139 на среде AKI и в бульоне Мартена рН 7,6 при добавлении к нему линкомицина способствует усилению их токсинопродуцирующей активности.

5) Отрицательные по гемолитической активности субкультуры штаммов холерных вибрионов 0-139 серовара обладают более высокой токсинопродуцирующей активностью, чем гемолизположительные вари-

анты.

6) Антисыворотка,полученная к очищенному токсину V. choleras 0-139 характеризуется высокой гомо- и гетерологичной токсиннейтрали-зующей активностью и не содержит антител к соматическому О-ан-тигену.

7) Высокие титры сывороток к токсинам холерных вибрионов 01-ой и и 0-139-ой серогрупп в реакциях перекрестной нейтрализации свидетельствуют об антигенной идентичности этих токсинов.

Список работ, опубликованных ло теме диссертации.

1. Мазрухо А. Б. , Ломов Ю. М. ,Подосинникова Л. С. .Лобанов В. В., Колпикова Л. Д. Влияние различных условий культивирования на продукцию холерного экзотоксина in vitro вибрионами 0-139 серовара // Современные достижения биотехнологии. Материалы Всероссийской конференции. Тезисы докладов, июль 1995 г. .Ставрополь, 1996.- С. 325326.

2. Мазрухо А. Б. , Ломов Ю. М. , Подосинникова JL С., Лобанов Е В. , Колпикова Л. Д. К вопросу о поиске штаммов - потенциальных токси-нопродуцентов нового эпидемически значимого серовара V. cholerae 0-139 // Современные достижения биотехнологии. Материалы Всероссийской конференции. Тезисы докладов, июль 1996 г. , Ставрополь, 1996.- С. 326-327.

3. Мазрухо А. Б. , Лобанов R В. Изучение возможности использования среды AKI в качестве одного из факторов, повышающих продукцию холерного экзотоксина штаммами V. cholerae 0-139 in vitro // Деп. в ВИНИТИ 05. 02.97.-N 314-В97 - 8с.

4. Мазрухо А. Б. , Карагозова А. В. Сравнительное изучение ток-синопродуцирующей активности Гем+ и Гем- субкультур V. cholerae 0-139 // Деп. в ВИНИТИ 12.03.97.- № 770-JB97 - Пс.