Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков вируса Западного Нила

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков вируса Западного Нила"

На правах рукописи

Богачек Мария Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА

03.00.06 - «вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово — 2006

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

д.б.н, профессор Локтев Валерий Борисович

Официальные оппоненты

д.м.нч профессор Евстропов Александр Николаевич к.б.н. Гнлева Ирина Павловна

Ведущая организация

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН (Москва)

Защита состоится 1 декабря 2006 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета' при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцове Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан «¿4'»..СЫпЛ^Я-. 2006 г,

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вирус Западного Нила (ЮН), относящийся к семейству Fiavivtridae, является возбудителем" инфекционного заболевания человека -лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Клинические формы течения ЛЗН разнообразны, от бессимптомных форм заболевания до тяжелых менннгоэнцефалитов с высокой летальностью (Campbell G.L. et al, 2002). В настоящее время отсутствуют специфические средства терапии и профилактики ЛЗН. Нерешенной остается проблема специфичности и чувствительности разрабатываемых диагностических систем для выявления данного заболевания.

Глобальное распространение ВЗН на территория Евразия, Африки, Австралии, Северной Америки сочетается с увеличением частоты вспышек ЛЗН с преобладанием тяжелых форм течения заболевания (Petasen L.R. et at, 2001). tía территории России вспышки ЛЗН были описаны в южных регионах европейской части: Астраханской, Волгоградской областей и Краснодарского края (Lvov D.K. et al, 2004), В 2002 году ВЗН был также обнаружен в южных регионах Западной Сибири (Терновой В .А. » др, 2004). Эпидемиологические данные позволяют предполагать дальнейшее расширение ареала и активацию природных очагов ВЗН. Высокая чувствительность широкого спектра млекопитающих, птиц и членистоногих обусловливает распространение ВЗН с высокой скоростью после вторжения ва новые территории. Ярким примером быстрой экспансии ВЗН является его распространение по территории Северной Америки в период с 1999 гола, когда была зафиксирована первая в истории Северпой Америки вспышка ЛЗН в Нью - Йорке, по 2005 год. В настоящее время ареал ВЗН охватывает полностью территорию США, южных провинций Каналы, север Мексики и страны Карибского Бассейна (Dauphin G. et al, 2004). Ежегодно регистрируете* высокая заболеваемость ЛЗН, в 2005 году выявлено 2819 случаев ЛЗН со 105 летальными исходами (http://www.cdc.gov/nci do d/dvbid^westnile).

Таким образом, всемирное распространение ВЗН и рост заболеваемости ЛЗН повышает актуальность задач по созданию специфических средств профилактики, диагностики и лечения данного заболевания. На современном этапе решение проблемы связано с исследованием антигенной структуры флавивирусов и выявлением наиболее иммунологнчески значимых участков структурных белков для последующего применения знаний в облает создания полиэтпопных вакцин в систем диагностики.

Ранее картирование антигенных детерминант вирусов Марбург н Эбола было успешно проведено с использованием технологии создания рекомбинантяых гюлипептидов (Sorokin A.V. el al, 2002; Рудзевич Т.Н. и др, 2003). В данной работе

использовался этот же подкол для картирования антигенных детерминант структурных белков ВЗН. формирующихся из различных фрагментов голипегггидной целя. Принципиальным отличием использованного подхода было наличие данных реитгеиоструктурного анализа белка Е ВКЭ, что позволило, используя структурную схожесть белка Е флавивирусов, сконструировать короткие рехомбинаитные полипептнды с минимальными нарушениями структуры доменов.

Мелью данной работы являлось изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков Е и М ЮН Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

исследование иммунохимических свойств рекомбинантных поли пептидов, имитирующих структуру белков ЕнМ ВЗН;

• создание коллекций гибридом, секретнрующнх моноклональные антитела (МКА) против эпнтопов белков ЕнМ ВЗН;

• картирование белка Е ВЗН при помощи созданных МКА;

- исследование биологической активности полученных МКА посредством реакций нейтрализации (РН) и реакции торможения гемагглютннации (РТГА);

• изучение перекрестной реактивности МКА с другими флавивирусами: вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) и вирусом Японского энцефалита (ВЯЭ);

• поиск схожих по структуре эпигопов белков ргМ, М и белка Е ВЗН.

■ Научная но шпик и практическая ценность работы, В результате проделанной работы впервые исследованы нммунохимические свойства рекомбннантных полипе нтидов, соответствующих нммунологнчесхн значимым участкам поверхностного структурного белка Е Российского штамма 1^1У-У1899-27889-Ьшпап (У^ 27889) ВЗН.

Получены оригинальные коллекции гибридом путем слияния клеток мышиной миеломы N$0 и клеток селезенки мышей линии Ва1Ь/С, иммунизированных полученными рекоыбннантными полип епткд&ми: двенадцать типов МКА распознавали участок 1*180 аминокислотных остатков (а,о.) и семь типов МКА - участок 260-466 а.о. белка Е ВЗН.

Впертые получены МКА, ряспоэнвощие район 86-126 и.о. домена II, где расположен пептид слияния (98-110 а.о.) флавивирусов, который обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембран. Картирование эпитопа для антирецепторных МКА 10Н10 между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН показало пространственную близость пептида слияния и ко-рецепториого района белка Е, взаимодействующего с л амини связывающим белком (ЛСБ) на поверхности клеток. На основании изучения пространственная модель белка Е была впервые выдвинута гипотеза, что Ьс-петля (73-89 а.о.) домена II

взаимодействует с ЯСБ н вместе с cd-петлей (пептид слияния) участвует в ранних фазах проникновения вирионов флавивнрусов в клетку.

Мозаичность взаимодействия МКА с шротши рекомбннатнымн полипептадамя и белком Е вируса клещевого энцефалита позволила выявить не менее шести различных антигенных детерминант в составе доменов I и II гликопротенна Е ЮН. Результат конкурентного ИФА позволяли идентифицировать не менее 7 различных эгаггопов в составе участка 260 — 466 ».о. гликопротсина Е ВЗН. Полученные данные показала, что 260-466 а.о. фрагмент белка Е ВЗН содержит эпигоны, индуцирующие образование внруснейтралнзующнх антител и антител с аятигемагглютикирующей активностью.

Впервые исследованы нммупохимические свойства рекомбинантных полнпептндов с аминокислотной последовательностью, соответствующей белкам М и его предшественнику ргМ. Получены оригинальные МКА, распознающие эпвгопы белка М ВЗН,

Показана возможность индуцирования вируснейтралиэующн* антител белком М ВЗН. Впервые описано наличие эпнтопот со схожей структурой а пределах 260-466 а.о. белка Е и белка М ВЗН.

Полученные данные важны дня разработки волиэпитопных вакцин, не несущих дополнительной антигенной нагрузки. В результате проведенной работы получены видоспецифические антигена н рекомбинантные полипептиды, *оторые могут бить использованы для разработки диагностических систем к терапевтических средств. Дальнейшее исследование ранних этапов взаимодействия ВЗН с клеткой хозяина с помощью созданных МКА поможет найга новые подходы к предотвращению заболевания лихорадкой Западного Нила.

Апрофщия работы и публикации. По материалам диссертации опубликована I статья. Материалы диссертации бцля представлены на 8 конференциях: "6th John Humphrey advanced summet programme in immunology" (Пущине, Россия, 2002); "Прогресс в фундаментальных и прикладных науках дня здороьил человека" (Судак, Украина, 2004); "Chemical and Biological Problems of Proteomics" (Новосибирск, Россия, 2004); "Frontiers of cellular microbiology and cell biology" (Сан Фелиу, Испания, 2004); "Current trends in comparative immunology" (Caurr - Питсрбург, Россия, 2005); "Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке" (Томск, Россия, 2006), "Interface of cell biology and cellular microbiology. Macromolecular complexes in microbial pathogenesis, membrane trafficking and cell signalling" (Сан Фелиу,

. Истин», 2006); "Проблемы нифехцнощюй патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока н Крайнего Севера" (Новосибирск, Россия, 2006).

Вклад , »втора, Данные получены лично автором и в соавторстве с к.б.н. Протопоповой Е.В., к.б.н. Терновым В.А., Ивановой A.B., к.б.н. Качко A.B., к.ф.-м.н. Иванисепко В.А. Рекомбииаитные полипептиды были любезно предоставлены к.б.н. Терновым В.А., Ивановой A.B., к.б.н. Качко A.B. Построение пространственных моделей белков выполнено к.ф.-м.н. Иванисенко ВА. Создание коллекций МКА, нммунохпмичсскые и вирусологические исследовали* сделаны лично автором н в соавторстве с к.б.н. Протопоповой Е В,

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, включал 21 рисунок н 12 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (123 наименования).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

При совмещении с помощью программы СЕ (Shindyalov 1. N. et al, 1998) пространственных структур глнкопротеинов Е вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) (PDB Id JsvbX вируса Дснге -2 (PDB Id loke) и ВЗН (РОВ Id ls6n) было выявлено значительное пространственное сходство данных структур (Рис.1.). На основании выявленного сходства, а также гомологии первичных структур белков К флавивирусов (Rey F. et а!, 1995Х данные по пространственной структуре белка Е ВКЭ использовались для конструирования реко.чбинантных поли пептидов белка Б ВЗН.

РнсЛ Совмещение пространственных структур белка Е вирусов Западного Ким, клещевого энцефалита к Денге. С шпло-серим цветом показана структура белка Е ВКЭ (PDB ID ISVB), серым цветом - структура белка Е вируса Денге (PDB ID 10КБ), iTMHihtcpuM — структура белка Е ВЗН. Аминокислотные остатки N и С-концевого участка структуры белка Е ВЗН показаны с использованием шари совой модели.

Выбранные фрагменты N - концевой части белка Е с 1 по 86 аминокислотный остаток (а_о.), 53-126 а.о., 1-180 а.о. (E|.iao, E|.u> несли основные функциональные

районы I и II доменов белка Б флавианрусов, участвующие во взаимодействии с ламииинсвязывающим белком (ЛСБ) н обеспечивающие слияние вирусной и клеточной мембран. Также для моделирования антигенной структуры был выбран полипептид, содержащий 260 - 466 а.о. белка Е (Ено-деХ включавший в себя (1) фрагмент домена II, вызывающий образование протекгавных антител, а также практически (2) весь домен Ш, содержащий классический рене игорный район и (3) известные ранее конформашониые эпитопы индуцирующие образование вируснейтр алиэукяцих антител (Pytela R. el al, 1937; Cira J J.H. et al, 2005; .Beasley D.W.C. et al, 2002; Volt D.E. et a], 2004; Ranimov I.A. et al, 2005; Lee E. et al, 2000). Рекоибинантиые лолипешнаы Ej.ijo, E53.l№, £i-m. Егб<мм были любезно предоставлены D.A. Терновым, А.В. Качко, АВ. Ивановой (ГНЦ В Б "Веггор").Рекоыбинантпые ноляпептнды были экспресснрованы с использованием К Colt и очищены при помощи мсталл-хеяатной хроматографии. Элекгрофорегический анализ полипептидов выявил высокую степень очистки рекомбинаитых полипептидов (Рис.2,3).

Рнс.2. Электрофореграмма рекомбинангных полипептндов Ei-ito. E5j.11«, Ei-w, А.

Электрофореграмма. полипептида Ем» (12% гюлиакриламкдкый гель).

1 - рекомбннанткый полипе птмд Ецю. М - маркер молекулярной массы белков.

м

А

а

Электрофореграмма полипетидов Ед-иб, Eus (15% ПААГ).

1 - рекомбинамный полнпепгнд Ejj.jií.

* 2 • рекомбннастиый полипегтгнд

• М - мархер молекулярной массы белков.

¿ м «Д.

Рис.3. Эяектрофоретичесний вкализ рекомбинаттюго полипеятида Е2ыиш ВЗН.

1-2- рекомбинанткыйпоянпегггид

3 - мвргер молекулярной мессы белков, кДа.

м-«,0-М

и ч

»,0 «

0.0

инв Ш» ЮТО* 1ЯИ0ИОДММ'ПИЮйИПЯ -

Рнс.4. Изучение взаимодействия пояипегттнда Е|.|ю ВЗН с мышиныын ПКА метолом ИФА.

1. мышняые ПКА к Емм ВЗН,

2. мышиные ГТКА против ВЗН,

3. отрицательный контроль с нормальной мышиной СЫ короткой.

По оси абсцисс - разведенке сывороток. По оси ордииат- оптически плоти ость. ^

Методом ИФА было установлено взаимодействие поли клопальны* мышиных анпггел (ПКА) против очищенных вирноиов ВЗН с полипептцдом Еыы {Рнс.4), Мышиные ПКА против полипептида Выю также взаимодействовали с белком Б ВЗН в ИФА с титром 1:8100 и иммуноблотикге.

Данные ИФА

свидетельствуют. что

полипептад Нщмм реагарует с мышиными ПКА к ЮН и кроличьими ПКА к ВКЭ.

Мышиные ПКА проти«

Ejsojis также распознавали глнкопротеин Е ВЗН в нммуноблотннге.

Полученные данные позволили сделать вывод, что антигегег.и структуры Еы*о и Емм« и эпитопов участка с 1 по 180 а_о. н с 260 по 466 а.о. патнвного глвкопротенна Е ЮН схожи. Таким образом, полипептнды Ej.1M и Емм« имитируют антигенные структуры соответствующих участков белка Е, и их мож>ю использовать дня получения МКА с целью дальнейшего исследования рекомбинатных полипе пгнао».

Было проведено 4 слияния клеток мышиной миеломы NS0 с клетками селезенок мышей линии ВАШ/С, иммунизированных очищенным полипептидом * Еымь Было получено 12 гибридом, стабильно сегрегирующих мыщнные МКА против фрагмента El. )н. Эта гибридомы не давали расщепления по секреции МКА при клонировании. Основные свойства полученной коллекции гибридом представлены в таблице 1. По результатам типнрования восемь видов МКА (2С6, 3D8, 7В4, 2С5, 60S, 4F], ЗС7, 409) были отнесены к IgOl подклассу, два типа МКА(2В9,2НЗ)-к IgG2a, МКА 808 - к IgG3 и МКА 2Н5 • к IgM. Подученные МКА взаимодействовали в ИФА с рекомбннаигным полипептидом Еыю в диапазоне разведений от 1:8100 до 1:17714700 и были также способны взаимодействовать с вирусным гликопротеином Е. Специфичность взаимодействия МКА с полноразмерным гликопротеином Е ВЗН была дополнительно подтверждена в имнуноблотинге. Эти результаты свидетельствуют о сохранности антигенной структуры 1 и 11 доменов тикопротеина Е ВЗН рекомбннаигным фрагментом Ем».

Данные исследования взаимодействия МКА с рекомбинантными полипептидами Е|44, Е}}.|24, El.цо представлены в Таблице 2. Четыре типа МКА (2Н5, 2В9, ЗС7, ЮН 10) взаимодействовали с поли пептидом Еьм, а с полипептшюм Eti-nt реагировали десять типов МКА (2В9, ЗС7, 10Н10, 7В4, 2С5. 2С6, 3D8, 4F1, 4G9, 605). С этими двумя рекомбииактнымн полипегггидами взаимодействовали только МКА 2В9 и ЗС7, а также антирецепторвые группоспецифические МКА ЮН 10 против ВКЭ. Вое исследованные МКА были способны взаимодействовать с большим рекомбннаигным полипептидом Е|.

1М.

Эпигоны доменя I. Поскольку МКА 2Н5 реагировали с полнпептидрм Е|_м и не реагировали с Езз-иб, то можно предположить, что МКА 2Н5 узнаьтг эпитоп в пределах 153 в.0. домена I белка Е ВЗН. В то же время, МКА 8G8 и 2НЗ взаимодействовали с рекомбиншшымн полипептидаыи Еш и Es3.124 и узнавали эпнтопы только самого большого полипешида E|.uo. По всей вероятности, эпихопы для этих МКА расположены в пределах домена 1 (137-180 а.о.) или домена II (126-136 а.о.) гликопротсина В ВЗН.

Эяитопы домена II. Взаимодействие МКА ЮН 10, 2В9 и ЗС7 с двумя рекомбнпантными полнпептвдаыи Ej^ и Ejj.i» показывает наличие э пи топов для этих

Таблица 1. Панель моноклональных антител против рекомбинантнаго фрагмента Еьш ВЗН.

МКА Титр МКА в ИФА (обратные величины) Результаты иммувоблотчнгя Класс Ig

Ei-iao ВЗН ВКЭ Еым ВЗН

2В9 15000000 656100 * + + lgG2a

2С6 15000000 900 - + + JgGl

3D8 5400000 8100 - + + IgOl

7В4 ■5000000 2700 - + + IgGl

2115 15000000 6Í6100 - + + IgM

2CS 15000000 1100 - + + IgOl

2НЗ 218700 2IS700 - + + lgG2a

8G8 5400000 218700 - + + lgG3

6GÍ 15000001 218700 24300 + + IgOl

4F1 218700 900 - + + IgGl

ЗС7 8100 2700 - + + IgGl

4G9 17714700 200000 - + + IgOl

ЮН 10 5904900 24300 + + lgG2b

МКА в пределах 53-В6 а.о. домена II гликопротенна Е ВЗН. Из этой группы выделяются группоспецифические MICA 101)10 к ВКЭ, которые способны узнавать эшггап общий для ВЗН н ВКЭ, и тем самым отличающийся от эпетопоа дл* МКА 2В9 и ЗС7, которые специфичны для ВЗН. Можно также предположить {на основании представленных в таблице 2 данных), что МКА 6G5, 4G9. 7В4, 2С5, 2С6, 3DS н 4F1 взаимодействуют с эпитопами, расположенными в пределах 86*126 а.о. домена II пиосопротеина Е ВЗН. Из этой группы антител удается выделить только МКА 6GJ, взаимодействующие в ИФА с ВКЭ с титром 1/24300 (таблица 1), указывая на наличие общего для ВЗН и ВКЭ эпитопа между 86 и 126 а.о..

Гипотетическая модель расположения антигенных детерминант, узнаваемых MICA к доменам I и II гликопротеииа Е ВЗН представлена на рисунке 5 (А, Б).

Таблица 2. Взаимодействие МКА с рекомбинантнымн фрагментами E|j(, Ejj-im, Е(. ito ВЗН в ИФА.

МКА E|.s6 Esww Е ми) ЭпнгопМКА .

211S +++ - +++ Эпитоп 1-а

2В9 +++ •и- +++ Эпитои 11-а

ЗС7 ■М+ ++ +++ Эпитоп 11-а

¡шж +++ +++ Эпитоп Н-Ь

7В4 +++ +++ Эпитоп 11-е

2С5 +++ +++ Эпитоп 11-е

2С6 +++ +++ Эпитоп 11-е

3D8 +++ +++ Эпитоп 11-е

4F1 +++ +++ Эпитоп 11-е

4G9 ■Н-+ +++ Эпитоп 11-е

+++ +++ Эпитоп 11-d

8G8 - +++ Эпитои I-b

2НЗ - +++ Эпигон I-b

Примечание: MICA использовали в разведении 1:1000

«+» - оптическая плотность >0,4 но < 1;'«++» - >] но <2; «+++» - > 2

*- МКА 10HI0 против ВКЭ.

¡^Щ^рЩ МКА перекрестно реагирующие с ВКЭ в ИФА

Особенностью изучаемого района являете» взаимодействие с ним антирецепторных МКА 10Н10. Конкуренция эти* МКА с ЛСБ при взаимодействии с тликопротеином Е ВКЭ указывает, что именно этот района белка Е является рекегггорным или ко-рецепторкым районом флавнвнрусов (Protopopova E.V. et al, 1999). Ранее район связывания МКА 10Н10 был картирован методом фагового дисплея для ВКЭ н он включал 73-74,76-77,103, 105,107 н 112 а.о. домена.II (Локтев А.В. н др., 2002,). В случае ВЗН район связывания антнрецепторных антител достаточно однозначно картируется между 53 и S6 ао. домена И. По всей вероятности, 103,105, 107 и 112 ао. не участвуют в

Ei-мо

до«**** В

Ej»i»

Рис. 5. Гипотетическая модель расположения turra генных детерминант, узвавасммх МКА * домеиаы I и П гаикопрогенна Б ВЗН. Метель строган* участков глкктротенна Е, моделируем их рекомбннвнтнымн полипе птндаин E,.ilh Е|ль Еуцц. Для создания ыоделн били нсполиованы данные ж» трехмерной структуре белка Б ВКЭ н ВЗН, депонированные ■ Protein Data Bank (PDBID ltvbwPOB Id ls6n),

формировании эпитопа для МКА 10HI0 для ВЗН. МКА 10Н10 имеют трупооспецифическую активность и способны реагировать с различными представителями флавнвнрусов, такими как вирус Японского энцефалита, ВКЭ и ВЗН (Протопопова Е.В. и др., 1996; Челкнко Н.В. и др.. 1997; Белавнн ПА. и др., 1997). Это дало основание предположить, что рецеттгорный район для JICE достаточно консервативен н также сиза» с S3 и 86 а.0. домена II белка Е вируса Японского энцефалит«, ВКЭ if ВЗН. Этот же район узнают еще два МКА 2В9 н ЗС7, но.они не способны взаимодействовать с ВКЭ, что показывает наличие между 53-86 а.о. глнкопротенна Е не менее двух эпигонов для МКА. В этом районе имеются две поверхностные петли, коротка« ab • петля (61-64 а.о.) и более протяженная be - петля (7389 ».о.). На рисунке 9А видно, что - пстттид слияния (cd-петдя) флавивирусов пространственно расположен непосредственно рядом с Ье- петлей. Вышесказанное позволяет высказать гипотезу, тто именно be - петля домена II является рецепторныы районом, взаимодействукнЦим с ЛСБ, а пространственная близость этого района с пептидом слияния указывает на возможность согласованного взаимодействия зтнх районов в процессе проникновения вирионов в клетку.

Следующим этапом работы было изучение антигенной структуры С - концевого фрагмента белка В ВЗН.

Было проведено 2 слияния клеток мышиной миеломы N50 с клетками селезенок мышей линии ВАЬВ/С, иммунизированных очищенным полипеотидом В

результате было получено семь гибридом, стабильно секретирующих МКА против Егео-4м. В таблице 3 представлены данные, характеризующие иммунохнмичесхие свойства мышиных МКА против полкпептчда Е^м-м- Оказалось, что МКА высокоэффективно взаимодействовали в ИФА с рекомбииашкым полапет-идом Е160-ш, в диапазоне разведений 1:900—1:218700 не нативным вирусным белком Е ВЗН с титрами 1: 729001:218700. Согласно результатам иымуяоСлотинга шесть типов МКА против Егю-*ы> распознавали иммобилизованный на нитроцеллюлозе белок Е ВЗН, кроме МКА ЗА6. Эти результаты подтвердили соответствие антигенной структуры рекомбинантвого полипе[ггида Ег«мм и полноразмерного белка Е ВЗН.

Таблица 3. Панель моноклональных антител против реконбаиантного фрагмента Едо-меВЗН.

МКА Титр МКА в ИФА Результаты ^ иммунобяотинга* Класс Ig Титр МКА вРН Титр МКА в РТГА

Езммш ВЗН ВКЭ вяэ Е2ЙМ66 ВЗН

5А4 900 72900 - - + IgGl - -

ЗВ9 218700 218700 - - + + Ig0 2b 320 80

4С10 218700 218700 72900 - + + tgM 640 -

8D9 218700 218700 72900 - + ígM - -

808 24300 72900 • 8100 + + lgG3 -

ЗАб 218700 218700 - 900 + - IgG 1 • -

6Н4 1800000 218700 - 2700 + + IgO 1 • -

Примечание. * (+) — означает наличие взаимодействия антигена и антител, выпаленное при помощи иммуноблоттинга.

Дальнейшее изучение биологической активности полученных МКА показало, что МКА ЗВ9 и 4С10 способны блокировать проникновение ВЗН в клетки VERO с титрами 1:320 и 1:640 соответственно. Вируснейтрализующая активность МКА ЗВ9 н 4С10 показывала, что рекомбннакгный поливептид сохранил эпнтопы, способные нядушровать появление вируснейтрализующнх антител. Причем MICA ЭВ9 были еще способны ингибировать гемагглютнняцню эритроцитов.

Рис. 6. Котирование мштоооэ участка 260 - 466 а. о. белка Е ВЗН. Подавление связывания меченых бнотнном МКА SA4 с рекомбннангным полнлегггкдон ВхАМ«*.

По оси ординат - оптическая плотность.

По оси абсцисс - антитела, С которыми проводилась инкубация Ени»

1 - МКА ЗА6.2 - МКА 6Н4,3 - МКА ÍG8,4 ~ МКА 8D9. 5 - нет предварительной инкубации, 6-нолнкдональные мышиные ангнтела против ВЗН, 7 - МКА 5А4,1-МКА4С10,9 - МКАЗВ9.

картина результатов конкурентного анализа на примере меченых бнотнном МКА 5А4 приведена на рисунке 6.

Данные перекрестной реактивности показали, что все полученные MICA можно разделить на три группы (Рис. Ту В I группу МКА входят МКА 8D9 и 4С10, обеспечивающие перекрестную реактивность с ВКЭ. Конкурентный ИФА показал, что эти два антитела не конкурируют между собой (таблица 4) и, следовательно, узнают разные эпитопы гликопротснна Е. Антигенная детерминанта, узнаваемая МКА 4CI0, способна обеспечить синтез внруснейтрализующих МКА.

Группу II включает МКА IG8, ЗА6 и ЙН4, обладающие перекрестной реактивностью с ВЯЭ (таблица Э), которые также оказались не способны конкурировать между собой, что позволило заключить - они узнают различные антигенные детерминанты.

Группа Ш включает МКА JA4 и ЗВ9, распознающие впдосаецифические эпитопы, причем МКА ЗВ9 обладали вируснсйтрализующей активностью. При помощи конкурентного ИФА между данными МКА была выявлена частичная конкуренция с максимальным эффектом: МКА ЗВ9 снижали эффективность связывания меченых МКА ЗА4 с рскомбннакгаым полипеттгидеш Е ш-щ на 58%. (Рис. б). Таким образом, эпитопы, распознаваемые МКА 5А4 н ЭВ9, частично перекрываются и расположены достаточно близко между собой.

По результатам проведенного конкурентного ИФА было выявлено отсутствие конкуренции между МКА, аа исключением МКА 5А4 и ЗВ9 (Таблица 4). Типичная

Таблица 4. Картирование антигенных сайтов рекомбкнанпюго полнпептцда Eito-M* методом конкурентного ИФА.

11емеченьи> МКА МКА, меченые биотипом

5А4 ЗВ9 4С10 SD9 SGS ЗА6 6П4

5А4 +++ ++ - - - - -

ЗВ9 ++ +++ - - - -

4С10 - - +++ - - -

8D9 - - - +++ - -

8G8 - - - - +++ - -

ЗАб - - - ■ - +++ ' -

6Н4 - - - - - - +++

Нормальная мышиная сыворотка - - - - ■ - ' - -

Примечание. "+++" — подавление связывания (ПС) меченых МКА с Е 260-466 немечеными антителами более чем на 75%; "++" - соответствует области: 75% > ПС > 50% ; "+" • 50% > ПС > 25%, - ПС меиее 25%.

Рис, 7. Картировали«эпнтопое участка260 - 4É6 а.о. белкаЕВЗН. '

I • сайты, распознаваемые группоспецифнческимн МКА 8D9 и 4С10, взаимодействующими с ВКЭ;

II - сайты, распознаваемые группоспецифическнын МКА 808,6114 и ЗА6 взаимодействующими с ВЯЭ;

Ш-сайты, распознаваемые ввдоспецифнческимн МКА 5А4 н ЗВ9,

Функциональной особенностью домена III ВЗН является паличие рецепторной области, блокирование которой предотвращает проникновение вируса в клетку. Два типа созданных МКА (ЭВ9 и 4С10) по результатом реакции нейтрализации предотвращают инфицирование клеток Vero. Дальнейшие исследования механизма внруспейтралиэующего действия данных антител может дать новые аргументы для

подтверждении гипотезы о взаимодействии этих МКА с каноническим RGD — мотивом домена Ш белка Е ВЗН, блокирующим взаимодействие с мембранными белками клетки Недавно было показано, что взаимодействие между ВЗН и aVp3 - интегрнном, являющимся для ВЗН рецептором, не опосредуется RGD - мотивом (Thullier P. et а!, 2001). Таким образом, альтернативная гипотеза механизма нигвбироваиия МКА проникновения ВЗН в клетку состоит в связывании МКА с неядектифнцированным эпигоном, обеспечивающим взаимодействие с aVpj—иитегрином.

Полученные данные о наличии двух эпигонов со схожей структурой в пределах участка 260 - 466 а.о, белка Е ВЗН и ВКЭ важны при разработке полюпитшшых вакцин и терапевтических средств, особенно для регионов Дальнего Востока и Юго-Западной Сибири, где циркулируют оба вируса. МКА ЗВ9 и SA4, не обладающие перекрестной активностью, могут быть использованы лая создания диагностической системы для ВЗН.

Следующим этапом настоявшей работы было исследование антигенной структуры белков М и PtM ВЗН. Необходимость исследования связана с тем, что биологическая значимость белка М ВЗН и его предшественника еще не полностью ясна. Полученные ранее данные о значимости белков М и РгМ родственных ВЗН вирусов в индукции противовирусного иммунитета (Cnrdosa М. J. et al, 2002) свидетельствуют о перспективности выбора данных белков в качестве объекта исследований.

Для исследования иммунохимичесхнх свойств белков М н РгМ был-использованы подход с моделированием их структуры рекомбинантнымн полипептидами, получением коллекции МКА с последующим изучением их биологических свойств.

Рекомбинантные полипептиды- РгМ и Мл-?з - Еыа были экстгресснрованы в системе Е. coli и очищены посредством металл-хслатаой хроматографии.

Методами ИФА я кмыуноблотннгя было установлено взаимодействие мышиных ПКА пропив ВЗН и полипептида РгМ. Это позволило считать, что рекомбинантный полипептид ргМ успешно моделирует антигенную структуру нативного белка РгМ ВЗН, и возможно его использование дня получения коллекции МКА против белка РгМ ВЗН. В результате использования стандартной гибридоыной технологии была получена панель из шести типов МКА, стабильно продуцирующих МКА прошв рекомбинанпюго полипептнза РгМ. Иммунохнмнческие свойства созданных МКА представлены в таблице 5. По результатам цитирования четыре типа МКА (7С6, 4D7, 4Н2, 4Е5) относились к классу антител IgM, МКА2Е11 - к IgOl классу и МКА 7D11 - к lgG2b. Полученные МКА реагировали с рекомбинаитным белком РгМ в ИФА с титрами 1:3200-1:656100.

Титры взаимодействия МКА против РгМ с вирионаыв ВЗН составили 1:50- 1:6400. Специфичность взаимодействия МКА с эпигонами РгМ ВЗИ была дополнительно подтверждена методом имыуноСлотютга. Полученные результаты свидетельствуют о схожести автогенной структуры иэтивного и рекомбинаипюго Белков РгМ ВЗН.

Все шесть типов МКА против РгМ (7С6, 7D11, 4D7, 2Е11, 4Е5, 4Н2) не взаимодействовали с вириоками ВКЭ и ВЯЭ, что показало отсутствие перекрестно реагирующих эпигонов на РгМ и М белках этих вирусов. Таким образом, впервые выявлена высокая специфичность белков РгМ н М ВЗН, что очень важно для разработки высокоспецифн<шых тест—систем.

Для более детального картровакия эпигонов, индуцировавших образование МКА против белка ргМ ВЗИ, был использован созданный рекомбинантиый фрагмент, включающий 1-30 а.о. белка Е ВЗН ц 31-75 а.о. бедка М ВЗН.

Изучение взаимодействия полученных МКА С Mj|.и - Е[.м показало, что все шесть типов МКА распознавали эпитопы палипепгида Мл-я — Ei.jo в ИФА с титрами 1 ;800 — 1:656100. Результаты представлены в таблице 5. Для уточнения расположения эпитопов,

распознаваемых созданными МКА, был проведен ИФА с использованием поли пептида

>

Ei.ih. Отсутствие взаимодействия МКА с данным рекомбииантпым фрагментом свидетельствовало о том, что участок 1-30 а.о. белка Ев составе Мэ|.7з—Ei-эо не вовлечен во взаимодействие с МКА. Пять типов МКА (7С6, 7D11, 2Е11, 4112, 4Е5) взаимодействовали с мономерной формой полнпептнда Мм.» 7 Ei.« в нммуноблотинге, и МКА 4D7 — с олигомерной формой данного фрагмента Таким образом, удалось уточнить' расположение эпигонов, вызвавших образование МКА, в пределах нммунодомииантаого участка 31-75 s.o. белка М ВЗН. Полученные нами данные подтверждаются результатами Falconar (Falconar A K., 1999): участок 40-49 а.о. белка М родственного вируса Дейте вызывал образование протективных МКА.

Для исследования наличия схожих по структуре участков > пределах белков М и домена III ВЗН был использован полипептнд Ещм». При, помощи ИФА было установлено, что пять типов МКА против белка РгМ ВЗН распознают эпитопы рекомбинаитиого фрагмент* Ешм» с Титрами 1:24300-1:656100.

Для подтверждения данных о наличии общих по антигенной структуре эпитопов я пределах белков РгМ, участка 31-75 а.о. белка М н участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН было изучено взаимодействие созданных ранее семи типов МКА против Цздш с рекомбинантнымн фрагментами PiM н М методом ИФА (таблица 6). Было выявлено

Таблица S, Иммужкшмические свойства моноклональных антител против рехомбинаятвого полипептида РгМ.

МКА Титр МКА (обратные величины) Trap PH Класс Ig ЭПНТОЦ

ИМ Мл.« -Ei-30 Е мм Вшш взн вкэ вяэ

7D11 8100 800 - 24300 3200 - 320 IgGîb i

2Е11 3200 800 - • 50 - IgGl n

4D7 218700 218700 ■ 218700 200 - IgM ni

4Н2 656100 656100 - 656100 6400 - IgM IV

4Е5 24300 1600 - 24300 200 IgM IV

7С6 656100 24300 - 24300 100 • IgM IV

взаимодействие МКА 8Ю и 4С10 с данными гюлнпсптндамн. Полученные результаты подтвердили наличие сходных антигенных детерминант участка 31-75 а.о. и участка 260466 а.о. белка Е ВЗН.

Таблица 6. Взаимодействие моноклональных антител против рехомбинантного полилеигада Ешм& с белками М и РгМ ВЗН.

Тип МКА Титр МКА (обратные величины)

Егмм«« РгМ Mn.7í—.El.JO

ЗА4 900 - •

ЗВ9 218700 -

4С10 218700 8100 ' 2700

8D9 218700 24300 900

808 24300 - -

ЗА6 218700 - -

6Н4 1800000 - -

При помощи реакции нейтрализации была вывалена вируснейтралнзующая активность МКА 7D11 с титром 1:320. Все полученные МКА против белка РгМ ВЗН были неактивны в РТГА, что косвенно подтверждает роль белка Е как главного ремагппепинина флавквирусов. Таким образом, впервые показано наличие как минимум одного эпитопа в пределах белков РгМ и М ВЗН индуцирующего синтез вируснейтраяизующих антител. Причем этот элитоп оказался нымунологически схожим с эпигоном белка Е. расположенном на фрагменте Емо-«« ВЗН.

Анализ взаимодействия полученных МКА с рекомбннаитныын фрагментами

М 3i.jj - Е ио. РгМ и 1-180, 260-466 а.о. белка Е ВЗН позволяет обнаружить различные эпитопы в структуре белков М и РгМ В311. Взаимодействие всех июли полученных МКА с фрагментом М белка позволяет локализовать эпигоны в пределах участка 31 — 75 а.о. белка М ВЗН, причем MICA 4D7 распознавали эпигон только олигомерной формы полипштеда. Три типа МКА (7С6, 4Н2, 4Е5) взаимодействовали с э пито пом схожим по строению с антигенной детерминантов в пределах 260-466 а.о. белка Е, в отличие от MICA 2Е11, распознающих эпитоп с уникальной структурой. Таким образом, не менее четырех типов эпитопов было идентифицировано в пределах 31 - 75 а.о. белка Е ВЗН.

Далее с использованием программы СЕ было " проведено сравнение пространственных структур белков М к Е вирусов Денге и ВЗН. В результате были обнаружены схожие по пространственной структуре фрагменты полнлептнлной цепи в между 440 - 492 а.о. белка Е и 16-68 а.о. бейка М вируса Денге (Рис. 8А). При сравнении аналогичных фрагментов белков М и Е ВЗН было также обнаружено значительное сходство их пространственной структуры (Рис. 8В). Это прежде всего три района с альфаспиральной конформаиней имеющихся яа каждом полнпеггтнде и разделенных небольшими участками из 5-6 аминокислотных остатков. По два альфаспнральных района расположенных между 40 -67 а.о. белка М н 452 -492 белка Е ВЗН связаны с траясмембраннымн доменами этих белков н погружены в лкпцдную мембрану вирусной частицы. Только относительно небольшой фрагмент белка М с 16 по 40 а.о. н фрагмент белка Е с 440 по 456 а.о. расположены снаружи вирусной мембраны, частично представлены в воде альфаспнралн и могут быть доступны. для взаимодействия с антителами в составе ннгактной вирусной частицы.

Рис. 8А. Изображение пространственной структуры комплекса белков Е и М вируса Денге (РСВ ГО 1р18). Светло-серым показана структура белка М, позиции е 14 по 68 ао Темно-серым показана структура белка Е, позиции 1 - 492 а.0 фрагмент 43! - 492 а о. белка Е, имеющий структурное сходство с белком М показа» черным цветом.

окопом ембранныб участок белка Е (438 -449 а.о.)

Рис. 8В. Структурное выравнивание схожих участков белков Е н М. Светло-серым показан фрагмент структуры белка М, позиции с 14 ао. по 6! ао. Темно-серый показан фрагмент структуры белка Е, позиции 438 - 492 а.о. Дли консерватлиных, а таске сходных по фнзнко-химическим свойствам остатков в белках Е, M и РгМ приведены названия н номера позиций. Нумера щи остатков приведена для B3R

Полученные шесть типов МКА распознавали эпитеты на фрагментах 31-75 до. белка M B31I н 260 - <466 а.о. белка Е ВЗН. Нейтрализующая активность МКА 7РП свидетельствует об их взаимодействии с единственным участком аминокислотой последовательности, расположенном вне траясмембранных сегментов: 31 — 41 до. белка M ВЗН и 438 - 449 а.о. белка Е ВЗН. Соответственно, возможно предположить локализацию эпктопов, распознаваемых биологически неактивными МКА, на участках 42 -75 а.о. белка M и 450- 466 а,о. белкаЕВЗН.

Исходя из вышесказанного, при создании вакцип нового поколения следует учесть полученные данные о наличии иммукодомннантиых участков в пределах S3 — 86 а.о., 260466 а.о. белка Е ВЗН и 31-75 а.о. белка M ВЗН. Перспективным представляется использование созданных высокоспецнфнчных МКА против белков M и Е ВЗН при разработке новых диагностических систем.

выводы.

1. Показано, что рекомбинантлые полипегггацы Ei.jjo, Еле, iís> Ei«¡mk, ргМ, Мэь75 -E|.3s выитируют антигенную структуру соответствующих белков ВЗН.

2. Созданы коллекции: из двенадцати типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов учалка 1-180 а.о. белка Е ВЗН; из «ми типов гибридом, сите пирующих МКА против эпитопов участка 260-466 и.о. белка Е ВЗН; из шести типов гибридом, синтезирующих видоспецифические МКА против участка 31-75 а.о. белка M ВЗН.

3. С помощью панели МКА изучена антигенная структура бедка Е ВЗН:

- Не менее 6 эпитопов обнаружено на N - концевом фрагменте 1-180 а_о. белка Е ВЗН. Локализован группоспецифическнй эпигон 11-Ъ для антирецепторных МКА 10Н10, распознающих сайт связывания белка Е ВЗН с предполагаемым клеточным рецептором • ЛСБ, между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН.

- Методом КИФА было выявлено 7 эпитопов на С - концевом фрагменте 260-466 а.о, белка Е ВЗН. Группоспецифичсский зпнтоп 1 - 4С10 и вндоспецнфнческнй эгитоп III -ЗВ9 вызывают образование вирус — нейтрализующих и тормозящих гемагглютинацию антител,

4. Исследование перекрестной реактивности МКА выявило:

- 4 видоспецифических эпитопа ( 1-а, 1-Ь, И-а» Н-с) и 2 групп оспецифических (11-b, 11-d) на N —концевом фрагменте I-I8Q а.о. белка Е ВЗН,

- 2 видоспецифических эпигона (ИГ - 5А4, III - ЗВ9) и 5 группоспецнфических (I - 8D9,1 -4С10, II - 8G8, II - ЗА6, II - 6Н4) на С - концевом фрагменте 260-466 а о. белка Е ВЗН.

5. Не менее четыре* видоспецифических эпитопа было обнаружено в структуре С -концевой часто 31 - 75 а.о. белка М. Эпитоп I, распознаваемый МКА 7DÍ1, связан с нейтрализацией инфекционности ВЗН.

6. Установлено наличие двух схожих эпитопов (I - 4С10; I - SD9) в пределах 260-466 ао. белка Е ВЗН и 3 эпитопов (1, III, IV) участка 31 - 75 а.о. белка M ВЗН.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко A.B., Иванова A.B. Иванисенко ВА., Локтев В.Б. Иммунохимнческие свойства рекомбннантных полипе гггааов, моделирующих домены I н II белка В вируса Западного НилаУ/ Молекулярная биологи», №5. с. 813 -822,2005.

2. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко A.B., Иванова A.B., Ивапнсенко В. А., Шваяов A.If, Локтев В.Б, Иммунохимнческие свойства белка ргМ и С - концевого фрагмента белка М вируса Западного НилаУ/ "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", с. 187, Новосибирск 2006.

3. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко A.B., Иванова A.B. Иванисенко В. А., Локтев В.Б. Нммунохнмическне свойства рскомбинантоых полипептндов, моделирующих домены I и II белка В вируса Западного Нила. // Современная ситуация н перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке. Всероссийская научно-практическая конференция, с. 22 - 23. Томск 2006.

4. Bogacbek М. V., Protopopova Е, V., Temovoy V. A., ttachko А. V., Ivanova A.V., Ivanisenko V.A., Loktev V. В. Immunochemical properties of short recombinant polypeptides of protein E of West Nile vims bearing epitopes of domains I and II// Current trends in comparative immunology, DAAD Summer School, p. 12, St. Petersburg 2005.

5. Bogachek M. V., Protopopova E. V., Temovoy V. A., Ivanova A. V., Loktev V. B. Lam inta-binding protein mediates West Nile viius-host cell binding as co-receptor. // Frontiers of cellular microbiology and cell biology, PEBS workshop, publication on-line: http;//www,esf.org/esfjemesco_confererice.php, San Feliu de Guixols, Spain 2004,

6. Bogachek M. V., Protopopova E. V., Temovoy V. A.. Loktev V. B. Epitopes of 1-180 aa recombinant polypeptide and viral protein E of the West Nile virus are similar//Chemical and Biological Problems of Proteomics, International conference, p. 79, Novosibirsk 2004.

7. Bogachek M. V., Protopopova E. V. Investigation of immunogenic properties and variability of West Nile virus modem strains // Progress in fundamental and applied sciences for human health, Internationa) Congress, p.76, Sudak, Ukraine 2004.

8. Bogachek M.V. Receptor epitope on protein E of the West Nile and tick-bome encephalitis viruses react with the same monoclonal antibody // 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology, p.20, Pushchino 2002.

Богачек Мария Владимировна

ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ПОВЕРХНОСТНЫХ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ ВИРУСА ЗАПАДНОГО НИЛА

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 11.10.200&3акаэ,№ . Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им, Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Богачек, Мария Владимировна

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературных данных. Морфологическая, эпидемиологическая и клиническая характеристика ВЗН.

1.1. Общая характеристика ВЗН.

Классификация флавивирусов.

1.2. Эпидемиология ВЗН.

1.3. Клиническая картина ЛЗН.

1.4. Циркуляция ВЗН в природных очагах.

1.5. Структура вириона ВЗН и родственных флавивирусов.

1.6. Цикл репродукции флавивирусов в клетке хозяина.

1.7. Моноклональные антитела против структурных белков ВЗН 41 и их использование для изучения антигенной структуры.

1.8. Рекомбинантные белки, моделирующие структурные белки Е и М флавивирусов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков вируса Западного Нила"

Актуальность проблемы.

Вирус Западного Нила (ВЗН), относящийся к семейству Flaviviridae, является возбудителем инфекционного заболевания человека - лихорадки Западного Нила (J13H). Клинические формы течения JT3H разнообразны, от бессимптомных форм заболевания до тяжелых менингоэнцефалитов с высокой летальностью (Campbell G.L. et al, 2002). В настоящее время отсутствуют специфические средства терапии и профилактики JT3H. Нерешенной остается проблема специфичности и чувствительности разрабатываемых диагностических систем для выявления данного заболевания.

Глобальное распространение ВЗН на территории Евразии, Африки, Австралии, Северной Америки сочетается с увеличением частоты вспышек J13H с преобладанием тяжелых форм течения заболевания (Petersen L.R. et al, 2001). На территории России вспышки JI3H были описаны в южных регионах европейской части: Астраханской, Волгоградской областей и Краснодарского края (Lvov D.K. et al, 2004). В 2002 году ВЗН был также обнаружен в южных регионах Западной Сибири (Терновой В.А. и др, 2004). Эпидемиологические данные позволяют предполагать дальнейшее расширение ареала и активацию природных очагов ВЗН. Высокая чувствительность широкого спектра млекопитающих, птиц и членистоногих обусловливает распространение ВЗН с высокой скоростью после вторжения на новые территории. Ярким примером быстрой экспансии ВЗН является его распространение по территории Северной Америки в период с 1999 года, когда была зафиксирована первая в истории Северной Америки вспышка J13H в Нью -Иорке, по 2005 год. В настоящее время ареал ВЗН охватывает полностью территорию США, южных провинций Канады, север Мексики и страны Карибского Бассейна (Dauphin G. et al, 2004). Ежегодно регистрируется высокая заболеваемость JI3H, в 2005 году выявлено 2819 случаев J13H со 105 летальными исходами (http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile).

Повышению заболеваемости способствует наличие множества путей передачи ВЗН: наряду с заражением ВЗН посредством укуса комаров, описано инфицирование человека при переливании крови, кормлении грудью, трансплантации органов, пересадки стволовых клеток. Отсутствие диагностических систем для проверки донорской крови и органов на наличие ВЗН может привести к увеличению числа иатрогенных случаев заражения людей.

Таким образом, всемирное распространение ВЗН и рост заболеваемости J13H повышает актуальность задач по созданию специфических средств профилактики, диагностики и лечения данного заболевания. На современном этапе решение проблемы связано с исследованием антигенной структуры флавивирусов и выявлением наиболее иммунологически значимых участков структурных белков для последующего применения знаний в области создания полиэпитопных вакцин и систем диагностики.

Ранее картирование антигенных детерминант вирусов Марбург и Эбола было успешно проведено с использованием технологии создания рекомбинантных полипептидов (Sorokin A.V. et al, 2002; Рудзевич Т.Н. и др, 2003). В данной работе использовался этот же подход для картирования антигенных детерминант структурных белков ВЗН, формирующихся из различных фрагментов полипептидной цепи. Принципиальным отличием использованного подхода было наличие данных рентгеноструктурного анализа белка Е ВКЭ, что позволило, используя структурную схожесть белка Е флавивирусов, сконструировать короткие рекомбинантные полипептиды с минимальными нарушениями структуры доменов.

Цели и задачи исследования.

Основной целью нашей работы являлось изучение антигенной структуры поверхностных структурных белков Е и М ВЗН.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи: исследование иммунохимических свойств рекомбинантных полипептидов, моделирующих структуру белков Е и М ВЗН;

- создание коллекций гибридом, секретирующих моноклональные антитела (МКА) против эпитопов белков Е и М ВЗН;

- картирование белка Е ВЗН при помощи созданных МКА;

- исследование биологической активности полученных МКА посредством реакций нейтрализации (РН) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА); изучение перекрестной реактивности МКА с другими флавивирусами: вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) и вирусом Японского энцефалита (ВЯЭ); поиск схожих по структуре эпитопов белков prM, М и белка Е взн.

Научная новизна и практическая ценность.

В результате проделанной работы впервые получены рекомбинантные полипептиды, соответствующие иммунологически значимым участкам поверхностного структурного белка Е Российского штамма LEIV-Vlg99-27889-human (Vlg 27889) ВЗН.

Получены оригинальные коллекции гибридом путем слияния клеток мышиной миеломы NS0 и клеток селезенки мышей линии Balb/C, иммунизированных полученными рекомбинантными полипептидами: двенадцать типов МКА распознавали участок 1-180 аминокислотных остатков (а.о.) и семь типов МКА - участок 260-466 а.о. белка Е ВЗН.

Впервые получены МКА, распознающие район 86-126 а.о. домена II, где расположен пептид слияния (98-110 а.о.) флавивирусов, который обеспечивает слияние вирусной и клеточной мембран.

Ранее Протопоповой Е.В. были получены МКА 10Н10 против эпитопа белка Е ВКЭ, распознающего клеточный рецептор - ламинин связывающий белок (Протопопова Е.В. с соавт., 1996). Картирование эпитопа для антирецепторных МКА 10Н10 между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН показало пространственную близость пептида слияния и ко-рецепторного района белка Е, взаимодействующего с ламинисвязывающим белком (ЛСБ) на поверхности клеток.

Мозаичность взаимодействия МКА с короткими рекомбинантными полипептидами и белком Е вируса клещевого энцефалита позволила выявить не менее шести различных антигенных детерминант в составе доменов I и II гликопротеина Е ВЗН. Результаты конкурентного ИФА позволили идентифицировать не менее 7 различных эпитопов в составе участка 260 -466 а.о. гликопротеина Е ВЗН. Полученные данные показали, что полипептид Е260-466 содержит эпитопы, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител и антител с антигемагглютинирующей активностью.

Впервые созданы рекомбинантные полипептиды с аминокислотной последовательностью, соответствующей белкам М и его предшественнику ргМ. Получены оригинальные МКА, распознающие эпитопы белка М ВЗН.

Показана возможность индуцирования вируснейтрализующих антител белком М ВЗН. Впервые описано наличие эпитопов со схожей структурой в пределах 260-466 а.о. белка Е и белка М ВЗН.

Полученные данные важны для разработки полиэпитопных вакцин, не несущих дополнительной антигенной нагрузки. В результате проведенной работы получены видоспецифические антитела и рекомбинантные полипептиды, которые могут быть использованы для разработки диагностических систем и терапевтических средств. Дальнейшее исследование ранних этапов взаимодействия ВЗН с клеткой хозяина с помощью созданных МКА поможет найти новые подходы к предотвращению заболевания ЛЗН.

Апробация работы и публикации.

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

- Международная школа - семинар "6th John Humphrey advanced summer programme in immunology", Пущино, 2002;

- Международная конференция " Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека", Судак, 2004;

- Международная конференция "Chemical and Biological Problems of Proteomics", Новосибирск, 2004;

- Международная конференция FEBS "Frontiers of cellular microbiology and cell biology", Сан Фелиу, Испания, 2004;

- Международная школа - семинар DAAD ""Current trends in comparative immunology", Санкт - Петербург, 2005;

- Всероссийская научно - практическая конференция "Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке", Томск, 2006;

- Международная конференция FEBS "Interface of cell biology and cellular microbiology. Macromolecular complexes in microbial pathogenesis, membrane trafficking and cell signalling", Сан Фелиу, Испания, 2006;

- Российская научная конференция с международным участием "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера", Новосибирск, 2006.

По материалам диссертации опубликована статья. Данные получены лично автором и в соавторстве с к.б.н. Протопоповой Е.В., к.б.н. Терновым В.А., Ивановой А.В., к.б.н. Качко А.В., к.ф.-м.н. Иванисенко В.А.

Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантные полипептиды ЕМ80, E53.I26, Ei-86, E26o-466, prM, М31.75-Е 1.зо имитируют соответствующие участки гликопротеина Е и белков М, ргМ ВЗН.

2. Получены три коллекции гибридом: из двенадцати типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка 1-180 а.о. белка Е ВЗН; из семи типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН; из шести типов гибридом, синтезирующих видоспецифические МКА против участка 31-75 а.о. белка М ВЗН.

3. Обнаружено 13 различных антигенных детерминант в структуре белка Е ВЗН: 6 эпитопов между 1-180 а.о. белка Е ВЗН, 7 эпитопов - в составе участка 260 - 466 а.о. белка Е ВЗН, включая индуцирующие образование вируснейтрализующих антител. Не менее четырех эпитопов в структуре участка 31-75 а.о. белка М ВЗН.

4. Локализован эпитоп для МКА 10Н10, распознающих сайт связывания гликопротеина Е ВКЭ с ламининсвязывающим белком, между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН.

5. Локализованы группо - и типоспецифических эпитопы в пределах участков 1 - 180 и 260 - 466 а.о. белка Е ВЗН.

6. Показано сходство по структуре эпитопов, локализованных между

260 - 466 а.о. гликопротеина Е ВЗН и 31 - 75 а.о. белка М ВЗН.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Богачек, Мария Владимировна

Выводы.

1. Показано, что рекомбинантные полипептиды Ei180, E]g6, Е53-126, Е2бо-4бб, ргМ, М3].75 - Е]30 имитируют антигенную структуру соответствующих белков ВЗН.

2. Созданы коллекции: из двенадцати типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка 1-180 а.о. белка Е ВЗН; из семи типов гибридом, синтезирующих МКА против эпитопов участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН; из шести типов гибридом, синтезирующих видоспецифические МКА против участка 31-75 а.о. белка М ВЗН.

3. С помощью панели МКА изучена антигенная структура белка Е ВЗН:

- Не менее 6 эпитопов обнаружено на N - концевом фрагменте 1-180 а.о. белка Е ВЗН. Локализован группоспецифический эпитоп II-b для антирецепторных МКА 10Н10, распознающих сайт связывания белка Е ВЗН с предполагаемым клеточным рецептором - ЛСБ, между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН.

- Методом КИФА было выявлено 7 эпитопов на С - концевом фрагменте 260466 а.о. белка Е ВЗН. Группоспецифический эпитоп I - 4С10 и видоспецифический эпитоп III - ЗВ9 вызывают образование вирус -нейтрализующих и тормозящих гемагглютинацию антител.

4. Исследование перекрестной реактивности МКА выявило:

- 4 видоспецифических эпитопа (I-a, I-b, II-а, П-с) и 2 группоспецифических (II-b, II-d) на N - концевом фрагменте 1-180 а.о. белка Е ВЗН,

- 2 видоспецифических эпитопа (III - 5А4, III - ЗВ9) и 5 группоспецифических (I - 8D9, I - 4С10, II - 8G8, II - ЗА6, II - 6Н4) на С -концевом фрагменте 260-466 а.о. белка Е ВЗН.

5. Не менее четырех видоспецифических эпитопа было обнаружено в структуре С - концевой части 31 - 75 а.о. белка М. Эпитоп I, распознаваемый МКА 7D11, связан с нейтрализацией инфекционности ВЗН.

6. Установлено наличие двух схожих эпитопов (I - 4С10; I - 8D9) в пределах 260-466 а.о. белка Е ВЗН и 3 эпитопов (I, III, IV) участка 31 - 75 а.о. белка М ВЗН.

Работа, опубликованная по теме диссертации:

Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В. Иванисенко В.А., Локтев В.Б. Иммунохнмические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила.// Молекулярная биология, №5, с. 813 - 822, 2005.

Участие в конференциях:

1. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В., Иванисенко В. А., Швалов А.Н., Локтев В.Б. Иммунохимические свойства белка ргМ и С - концевого фрагмента белка М вируса Западного Нила.// Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера, Российская научная конференция с международным участием, стр. 187, Новосибирск 2006.

2. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко А.В., Иванова А.В. Иванисенко В.А., Локтев В.Б. Иммунохимические свойства рекомбинантных полипептидов, моделирующих домены I и II белка Е вируса Западного Нила. // Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в XXI веке, Всероссийская научно-практическая конференция, стр. 22 - 23, Томск 2006.

3. Bogachek М. V., Protopopova Е. V., Ternovoy V. A., Kachko А. V., Ivanova

A.V., Ivanisenko V.A., Loktev V. В. Immunochemical properties of short recombinant polypeptides of protein E of West Nile virus bearing epitopes of domains I and II// Current trends in comparative immunology, DAAD Summer School, p. 12, St. Petersburg 2005.

4. Bogachek M. V., Protopopova E. V., Ternovoy V. A., Ivanova A. V., Loktev V.

B. Laminin-binding protein mediates West Nile virus-host cell binding as co-receptor. // Frontiers of cellular microbiology and cell biology, FEBS workshop, publication on-line: http://www.esf.org/esfeurescoconference.php, San Feliu de Guixols, Spain 2004.

5. Bogachek M. V., Protopopova E. V., Ternovoy V. A., Loktev V. B. Epitopes of 1-180 aa recombinant polypeptide and viral protein E of the West Nile virus are similar// Chemical and Biological Problems of Proteomics, International conference, p. 79, Novosibirsk 2004.

6. Bogachek M. V., Protopopova E. V. Investigation of immunogenic properties and variability of West Nile virus modern strains // Progress in fundamental and applied sciences for human health, International Congress, p.76, Sudak, Ukraine 2004.

7. Bogachek M.V. Receptor epitope on protein E of the West Nile and tick-borne encephalitis viruses react with the same monoclonal antibody // 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology, p.20, Pushchino 2002.

Благодарности.

Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Локтеву Валерию Борисовичу за организацию работы и помощь в апробации полученных результатов. Искреннюю благодарность автор выражает Протопоповой Елене Викторовне за обучение практическим методам, консультации при написании совместных работ и помощь в организации экспериментов. Автор выражает глубокую благодарность проф. Львову Д.К. и сотрудникам его лаборатории за предоставление штаммов LEIV-Vlg99-27889-human ВЗН. Автор приносит благодарность соавторам и рецензентам, благодаря которым стало возможным опубликование результатов проделанной работы: Терновому В. А., Качко А. В., Ивановой А. В., Иванисенко В. А., Швалову А. Н., Гилевой И. П., Сиволобовой Г. Ф., Гашниковой Н. М., а также всем сотрудникам отдела молекулярной биологии флавивирусов и вирусных гепатитов за практическую и консультационную помощь.

Исследования были поддержаны грантом Международного научнотехнического центра [МНТЦ-2087] и Федеральной целевой научнотехнической программой Министерства промышленности, науки и технологий РФ. Исследования по построению пространственных моделей белков были поддержаны грантом РФФИ № 05-04-49283 и Госконтрактами 02.434.11.3004 от 01.04.2005 и № 02.467.11.1005 от 30.09.2005

Идентификация перспективных мишеней действия новых лекарственных препаратов на основе реконструкции генных сетей" с Федеральным агентством по науке и инновациям в рамках федеральной целевой научно-технической программы "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники" на 2002-2006 годы.

Заключение.

Полученные данные свидетельствуют об успешности применения рекомбинантных полипептидов для изучения антигенной структуры флавивирусов. Несмотря на обширный объем знаний, полученный в отношении строения белка Е Североамериканских штаммов ВЗН (Chu J.J.H. et al, 2005; Beasley D.W.C. et al, 2002; Volk D.E. et al, 2004; Nybakken G.E. et al, 2005), аналогичные исследования структуры отечественных штаммов отсутствовали. Кроме того, практически не проводилось исследования роли белков М и ргМ ВЗН в формировании противовирусного иммунитета.

Выбор участков моделирования 1-86, 53-126, 1-180, 260 - 466 а.о. белка Е ВЗН был основан на полученных ранее данных об иммунологически значимых участках белка Е флавивирусов. Выбранные участки включали: (1) пептид слияния (98 - 113 а.о.), обеспечивающий слияние мембран флавивирусов и клетки хозяина (Allison S.L. et al, 2001; Roehrig J.T. et al, 1989; Roehrig J.T. et al, 1990), (2) участки доменов II и III, индуцирующие образование вируснейтрализующих антител (Chu J.J.H. et al, 2005; Beasley D.W.C. et al, 2002; Volk D.E. et al, 2004; Nybakken G.E. et al, 2005), (3) RGD -мотив, обеспечивающий взаимодействие вируса и интегрина на поверхности клетки хозяина (Pytela R., 1987).

Проверка сохранности антигенной структуры рекомбинантными полипептидами подтвердила, что все полученные фрагменты успешно моделируют соответствующие участки белка Е ВЗН. Это позволило использовать в дальнейшем созданные полипептиды E].|g0 и Е2бо-4бб Для

131 создания уникальных коллекций гибридом, секретирующих МКА против иммунологически значимых участков белка Е ВЗН.

Классическим методом гибридизации были получены двенадцать типов МКА против Е]ш и семь типов МКА против Е2бо-4бб- Взаимодействие созданных МКА и белка Е ВЗН, подтвержденное методами ИФА и иммуноблотинга, подтвердило антигенную тождественность рекомбинантных полипептидов и участков белка Е ВЗН.

Ранее при исследовании взаимного расположения эпитопов широко применялся метод конкурентного ИФА. Успехи рекомбинантной технологии позволили нам совместить этот апробированный подход с изучением взаимодействия МКА с короткими фрагментами белка Е ВЗН, моделируемыми рекомбинантными полипептидами. Таким образом удалось картировать не менее тринадцати различных антигенных детерминант в структуре белка Е ВЗН: шесть эпитопов в пределах участка 1-180 а.о. и семь эпитопов в пределах участка 260-466 а.о. При этом не менее семи типов МКА распознавали участок 86-126 а.о. белка Е ВЗН, где расположен пептид слияния.

Дальнейшее изучение взаимодействия созданных МКА с вирусами ВКЭ и ВЯЭ позволило выявить перекрестно реагирующие МКА, распознающие эпитопы в пределах участков 1-180 и 260-466 а.о. белка Е ВЗН. Полученные данные важны при разработке полиэпитопных вакцин в районах совместной циркуляции флавивирусов.

Два типа полученных МКА против Е2бо-4бб и одиннадцать типов МКА против Ем go являлись видоспецифическими и могут быть успешно использованы при разработке высокоспецифичных тест систем.

Исследование биологической активности МКА показало, что два типа полученных МКА (ЗВ9 и 4С10) против участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН обладали вируснейтрализующей активностью, при этом МКА ЗВ9 были активны в РТГА. Механизм блокирования проникновения ВЗН в клетки VERO данными МКА мог включать их взаимодействие с рецептор -распознающим эпитопом, расположенным в пределах домена III белка Е ВЗН. Полученные вируснейтрализующие МКА являются основой для разработки терапевтических рекомбинантных антител.

Проведенные исследования позволили получить новые знания о молекулярном механизме ранних этапов взаимодействия вируса и клетки. Картирование эпитопа для антирецепторных МКА 10Н10 между 53 и 86 а.о. домена II белка Е ВЗН показало пространственную близость пептида слияния и ко-рецепторного района белка Е, взаимодействующего с ламинисвязывающим белком на поверхности клеток. Пространственная модель белка Е позволила предположить, что Ьс-петля (73-89 а.о.) домена II взаимодействует с ЛСБ и вместе с cd-петлей (пептид слияния) участвует в ранних фазах проникновения вирионов флавивирусов в клетку. Информация о локализации участка, распознаваемого антирецепторными антителами МКА 10Н10, в пределах домена II белка Е ВЗН должна быть учтена при разработке вакцин нового поколения.

Последующие исследования иммунохимических свойств рекомбинантных полипептидов, моделирующих белок ргМ ВЗН и иммунодоминантный участок 31-75 а.о. белка М ВЗН, позволили получить целый комплекс знаний, важный для разработки полиэпитопных вакцин. Во-первых, следует обратить внимание на наличие эпитопов, индуцирующих вируснейтрализующие антитела в пределах участка 31-75 а.о. белка М ВЗН. Полученные данные подтверждаются результатами зарубежных исследователей о важной роли белков М и ргМ в развитии противовирусного иммунитета. Кроме того, были получены данные о наличии схожих эпитопов в пределах участка 31-75 а.о. белка М, белка ргМ и участка 260-466 а.о. белка Е ВЗН, включающего рецептор - распознающий эпитоп. Таким образом, участок 31-75 а.о. белка М ВЗН является иммунодоминантным и крайне привлекательным для включения в структуру полиэпитопных вакцин.

Суммарные данные о функциональной значимости участков белков Е и М ВЗН, полученные в ходе проведенного исследования, представлены в таблице 12.

Основываясь на данных зарубежных авторов о более высокой специфичности белков М и ргМ флавивирусов по сравнению с белком Е, можно было ожидать специфичность созданных МКА против данных белков.

Ожидания оправдались - все шесть типов полученных против белка ргМ

МКА являлись высокоспецифичными, не взаимодействуя с родственными флавивирусами - ВКЭ и ВЯЭ. Будущие системы детекции ВЗН,

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Богачек, Мария Владимировна, Кольцово

1. Белавин П.А. Нетесова Н.А., Решетников С.С., Иванисенко В.А., Ерошкин A.M., Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Малыгин Э.Г. Экспрессия фрагментов гена Е вируса японского энцефалита в клетках Escherichia coli.// Биотехнология.- 1997.- № 3- С. 3-9.

2. Биокинетика: Практический курс. Под ред. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г., Москва, "Фаир пресс", 1999.

3. Гайдамович С.Я., Локтев В.Б., Лаврова Н.А. Кросс-реактивность, выявленная при помощи моноклональных антител, между вирусом клещевого энцефалита и вирусом венесуэльского энцефаломиелита лошадей.// Вопр. Вирусологии,- 1990- № 3- С. 221-225.

4. Иммуноферментный анализ. Под ред. Нго Т.Т., Ленхоффа Г., Москва, "Мир", 1988, Иммунопероксидазные методы с использованием системы авидин-биотин.- С. 413 -423.

5. Моноклональные антитела. Под ред. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б., Москва, "Мир", 1983, Гибридомы: новый уровень биологического анализа. С. 365 - 375.

6. Общая и частная вирусология. Под ред. Гайдамович С .Я., Логинов Н.Б. 1982. Семейство Togaviridae,M., т.2 С. 49 - 94.

7. Протопопова Е.В., Хусаинова А.Д., Коновалова С.Н., Локтев В.Б. Получение и характеризация антиидиотипических антител несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита.// Вопр. Вирусологии 1996- №2- С. 50-53.

8. Adams S.C., Broom А.К., Sammels L.M., Hartnett A.C., Howard M.J., Coelen R.J., Mackenzie J.S. and Hall R.A. Glycosylation and antigenic variation among Kunjin virus isolates.// Virology.- 1995.- V. 206- P. 49-56.

9. Allison S. L, Stadler K., Mandl C. W., Kunz C. and F. X. Heinz. Synthesis and secretion of recombinant tick-borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form.// J. Virol.- 1995.- V. 69- P. 5816-5820.

10. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C.W. and Heinz F.X. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E.// J. Virology.- 2001,- V. 75- P. 4268-4275.

11. Allison S.L., Schalich J., Stiasny K., Mandl C.W., Kunz C. and Heinz F.X. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH.// J. Virol.- 1995.- V. 69- P. 695-700.

12. Allison S.L., Stiasny К., Stadler К., Mandl C.W. and Heinz F.X. Mapping of Functional Elements in the Stem-Anchor Region of Tick-Borne Encephalitis Virus Envelope Protein E.// J. Virol.- 1999.- V.73- P. 5605— 5612.

13. Bakonyi Т., Hubalek Z., Rudolf I. and Nowotny N. Novel flavivirus or new lineage of West Nile virus, central Europe.// Emerg. Infect. Dis.- 2005.- V. 11-P. 225-231.

14. Beasley D.W.C. and Barrett A.D.T. Identification of neutralizing epitopes within structural domain III of the West Nile vims envelope protein.// J. Virol.- 2002.- V. 76- P. 13097 13100.

15. Besselaar T.G. and Blackburn N.K. Antigenic analysis of West Nile virus strains using monoclonal antibodies.// Arch. Virol.- 1988.- V. 99- P.75-88.

16. Butrapet S., Kimura-Kuroda J., Zhou D.-Sh. and Yasui K. Neutralizing mechanism of a monoclonal antibody against Japanese encephalitis virus glycoprotein E.//Am. J. Trop. Med. Hyg.- 1998,- V.58- P. 389-398.

17. Calisher C.H., Karabatsos N. (1988), Arbovirus serogroups: definition and geographic distribution., in The arboviruses: epidemiology and ecology.,ed.

18. Monath T.P., CRC Press, Inc., Baca Raton, FLA, p.19-57.

19. Campbell G.L., Ceianu C.S., Savage H.M. Epidemic West Nile encephalitis in Romania: waiting for history to repeat itself.// Ann. N. Y. Acad. Sci.-2001,-V. 951-P. 94-101.

20. Campbell G.L., Marfin A.A., Lanciotti R.S. and Gubler D.J. West Nile vims. //Lancet. Infect. Dis.- 2002,- V. 9- P. 519-529.

21. Cardosa M. J., Wang S. M., Sum M. S. H. and Tio P.H. Antibodies against PrM protein distinguish between previous infection with dengue and Japanese encephalitis viruses.// BMC Microbiology.- 2002.- V.5- P. 2-9.

22. Cecilia D. and Gould E.A. Nucleotide changes responsible for loss of neuroinvasiveness in Japanese encephalitis vims neutralization-resistant mutants.//Virology.- 1991.- V. 181- P.70-77.

23. Chambers T.J., Hanh C.H., Galler R. and Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression and replication.// Annu. Rev. Microbiol.- 1990.-V.44- P. 649-688.

24. Chanas A.S., Johnson B.K. and Simpson D.I.H. Antigenic relationships of alfaviruses by a simple microculture cross-neutralizations method.// J. Gen. Virol.- 1976.- V. 32- P. 295-300.

25. Charrel R.N., Brault A.C., Gallian P., Lemasson J.-J., Murgue В., Murri S.,

26. Pastorino В., Zeller H., Chesse R., Micco P. and Lamballeriea X.

27. Evolutionary relationship between Old World West Nile virus strains. Evidence for viral gene flow between Africa, the Middle East, and Europe.// Virology.- 2003.- V.315- P. 381-388.

28. Chu J.J. and Ng M.L. Interaction of West Nile Virus with alphaVbeta3 integrin mediates virus entry into cells.// The J. Biol. Chem.- 2004. -V. 279-P. 54533-54541.

29. Chu J.J., Rajamanonmani R., Li J., Bhuvanakantham R., Lescar J. and Ng M.L. Inhibition of West Nile virus entry by using a recombinant domain III from the envelope glycoprotein.// J. Gen. Virol.- 2005.- V. 86- P. 405-412.

30. Clarke D.A. and Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination inhibition with arthropod-born viruses.// Amer. J. Trop. Med. Hyg.- 1958.- V.7- P. 561-573.

31. Crill W. D. and Roehrig J. T. Monoclonal antibodies that bind to domain III of dengue virus E glycoprotein are the most efficient blockers of virus adsorption to Vera cells.// J. Virol.- 2001.- V.75- P. 7769-7773.

32. Damle R.G., Yeolekar L.R. and Rao B.L. Strain analysis and epitope mapping of West Nile virus using monoclonal antibodies.// Act. Virol.- V. 42-P. 389-395.

33. Dauphin G., Zientara S., Zeller H. and Murgue B. West Nile: worldwide current situation in animals and humans.//Comp. Immunol. Microbiol. Infect.Dis. -2004.- V.27- P.343-355.

34. Elshuber S., Allison S.L., Heinz F. X. and Mandl C. W. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK-21 cells by tick-borne encephalitis virus.//J. of Gen. Virology.- 2003,- V.84- P. 183-191.

35. Gao G.F, Hussain M.H., Reid H.W. and Gould EA. Identification of naturally occurring monoclonal antibody escape variants of louping ill virus.// J. Gen. Virol.- 1994.- V. 75- P. 609-614.

36. Gaunt M.W., Sail A.A., Lamballerie X., Falconar A.K., Dzhivanian T.I. and Gould E.A. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography.// J. Gen. Virol.- 2001.-V. 82-P. 1867-1876.

37. Gefter M.L., Margulies D.H. and Scharft M.D. A simple method for polyethylene glycol-promoted hybridization of mouse myeloma cells.// Somat. Cell. Genet.- 1977.- V.3- P.231-236.

38. Guirakhoo F., Hunt A.R., Lewis J.G. and Roehrig J.T. Selection and partial characterization of dengue 2 virus mutants that induce fusion at elevated pH.// Virology.- 1993,- V.194- P. 219-223.

39. Hall R.A., Burgess G.W., Kay B.H. and Clancy P. Monoclonal antibodies to Kunjin and Kokobera viruses.//Immunol. Cell. Biol.-1991.- V. 69- P. 47-49.

40. Hanna J.N., Ritchie S.A., Phillips D.A., Shield J., Bailey M.C., Mackenzie

41. J.S., Poidinger М., McCall В.J. and Mills P.J. Experience with WN virus in the Old World and SLE. An outbreak of Japanese encephalitis in the Torres Strait, Australia, 1995.//Med. J.- 1996,- V.165- P. 256-260.

42. Hasegawa H., Yoshida M., Shiosaka Т., Fujita S. and Kobayashi Y. Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice.//Virology.- 1992,- V.191- P. 158165.

43. Hayes C.G. (1989), West Nile fever., in: The arboviruses: epidemiology and ecology., ed. Monath T.P., CRC Press, Inc., BocaRaton, Florida, p. 59-88.

44. Heinz F.X., Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Harris B.A., Rey F. and Harrison S.C. The flavivirus envelope protein E: isolation of a soluble form from tick-borne encephalitis virus and its crystallization.// J. Virol.- 1991.-V. 65- P.5579-5583.

45. Holzmann H., Heinz F.X., Mandl C.W., Guirakhoo F. and Kunz C. A single amino acid substitution in envelope protein E of tick-borne encephalitis virus leads to attenuation in the mouse model.// J. Virol. 1990.- V. 64-P.5156-5159.

46. Hubalek Z. European experience with the West Nile virus ecology and epidemiology: could it be relevant for the new World?// Viral. Immunol.-2000.-V. 13-P. 415-426.

47. Jiang W.R., Lowe A., Higgs S., Reid H. and Gould E.A. Single amino acid codon changes detected in louping ill virus antibody-resistant mutants with reduced neurovirulence.// J. Gen. Virol.- 1993.- V.74- P.931-935.

48. Kawano H., Rostapshov V., Rosen L. and Lai C.J.Genetic determinants of dengue type 4 virus neurovirulence for mice.//J. Virol.- 1993.- V.67-P.6567-6575.

49. Kimura-Kuroda J. and Yasui K.J. Antigenic comparison of envelope protein E between Japanese encephalitis virus and some other flaviviruses using monoclonal antibodies.//Gen. Virol.- 1986.- V. 67- P. 2663-2672.

50. Klingberg M.S., Jasinka-Klingberg W. and Goldblum N. Certain aspects of the epidemiology and distribution of immunity to West Nile virus in Israel.// Proc. 6th Int. Congr. Trop. Med. Malaria.- 1959.- V.5- P. 132-140.

51. Kuno G., Chang G.J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N. and Cropp C.B. Phylogeny of the genus Flavivirus.// J. Virol.- 1998.- V. 72- P. 73-83.

52. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature.- 1970,- V.227- P. 680-685.

53. Lambert C., Leonard N., De Bolle X. and Depiereux E. ESyPred3D: Prediction of proteins 3D structures.// Bioinformatics.- 2002.- V.18- P. 12501256.

54. Lanciotti R.S., Roehrig J.T., Deubel V., Smith J., Parker M., Steele K., Crise

55. В., Volpe K.E., Crabtree M.B., Scherret J.H, Hall R.A., MacKenzie J.S,

56. Cropp C.B., Panigrahy В., Ostlund E., Schmitt В., Malkinson M., Banet C.,

57. Weissman J., Komar N., Savage H.M., Stone W., McNamara T. and Gubler

58. D.J. Origin of the West Nile virus responsible for an outbreak of encephalitisin the northeastern United States.// Science.- 1999.- V. 286- P. 2333-2337.

59. Lee E. and Lobigs M.Substitutions at the putative receptor-binding site of an encephalitic flavivirus alter virulence and host cell tropism and reveal a role for glycosaminoglycans in entry.//! Virol.- 2000.- V.74- P.8867-8875.

60. Lee J.W., Chu J.J. and Ng M.L. Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin.// J. Biol. Chem.- 2006,- V.281- P.1352-1360.

61. Lindenbach B.D., Rice C.M. (2001), Flaviviridae: The viruses and their replication., in Fundamental Virology, 4-th ed. Knippe D.M., Howley P.M., Philadelphia: Lippincott Williams &Wilkins Press, p. 589-641.

62. Lu G. and Moriyama E.N. Vector NTI, a balanced all-in-one sequence analysis suite.//Brief Bioinform.- 2004.- V.5- P.378-388.

63. Mandl C. W., Heinz F. X. and C. Kunz. Sequence of the structural proteins of tick-borne encephalitis virus (Western subtype) and comparative analysis with other flaviviruses.// Virology- 1988.- V.l 66- P. 197-205.

64. Mandl C.W., Guirakhoo F., Holzmann H., Heinz F.X. and Kunz C. Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level, using tick-borne encephalitis virus as a model.//J. Virol.- 1989.- V.63-P.564-571.

65. Mathiot C.C., Georges A.J. and Deubel V. Comparative analysis of West Nile virus strains isolated from human and animal hosts using monoclonal antibodies and cDNA restriction digest profiles.// Res. Virol.- 1990.- V. 141-P.533-543.

66. Mcintosh B.M., Jupp P.G., Dos Santos I. and Meenehan G.M. Epidemics of West Nile and Sindbis viruses in South Africa with Culex univittatus Theobald as vector.// S. Afr. J. Sci.- 1976.- V. 72- P. 295-300.

67. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses.// J. Gen. Virol.- 1997.- V. 78- P. 2711-2722.

68. Modis Y., Ogata S., Clements D. and Harrison S.C. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion.// Nature.- 2004.- V. 427- P. 313-320.

69. Morvan J., Besselaar Т., Fontenille D. and Coulanges P. Antigenic variations in West Nile virus strains isolated in Madagascar since 1978.// Res. Virol.- 1990,- V.141- P. 667-676.

70. Mukhopadhyay S., Kuhn R.J. and Rossmann M.G. A structural perspective of the flavivirus life cycle.//Nat. Rev. Microbiol.- 2005,- V.3- P. 13-22.

71. Murgue В., Murri S., Triki H, Deubel V. and Zeller H.G. West Nile in the Mediterranean basin: 1950-2000.// Ann. N. Y. Acad. Sci.- 2001.- V. 951- P. 176-126.

72. Nash D., Mostashari F., Fine A., Miller J., O'Leary D., Murray K., Huang A., Rosenberg A., Greenberg A., Sherman M., Wong S. and Layton M. Outbreak of West Nile virus infection, New York City area, 1999.// N. Engl. J. Med.-2001.-V. 344-P. 1807-1814.

73. Niedrig M., Klockmann U., Lang W., Roeder J., Burk S., Modrow S. and Pauli G. Monoclonal antibodies directed against tick-borne encephalitisvirus with neutralizing activity in vivo .//Act. Virol.- 1994.- V. 38(3): 141149.

74. Nowak T. and Wengler G. Analysis of disulfides present in the membrane proteins of the West Nile flavivirus.// Virology- 1987,- V. 156- P. 127-137.

75. Nybakken G.E., Oliphant Т., Johnson S., Burke S., Diamond M.S. and Fremont D.H. Structural basis of West Nile virus neutralization by a therapeutic antibody.//Nature- 2005,- V. 437- P. 764-769.

76. Peiris J.S., Porterfield J.S. and Roehrig J.T. Monoclonal antibodies against the flavivirus West Nile.//J. Gen. Virol.- 1982.- V. 58- P. 283-289.

77. Petersen L.R. and Roehrig J.T. West Nile virus: a reemerging global pathogen.// Emerg. Infect. Dis.- 2001.- V.7- P.611-614.

78. Philip C.B. and Smadel J.E. Transmission of West Nile virus by infected Aedes albopictus.// Proc. Soc. Exp. Biol.- 1943,- V. 53- P. 49-50.

79. Pletnev A.G., Bray M. and Lai C.J. Chimeric tick-borne encephalitis and dengue type 4 viruses: effects of mutations on neurovirulence in mice.//J. Virol.- 1993,- V. 67- P. 4956-4963.

80. Protopopova E.V., Sorokin A.V., Konovalova S.N., Kachko A. V., Netesov S.V. and Loktev V.B. Human laminin binding protein as a cell receptor for tick-borne encephalitis virus.// Zentrablatt fur Bacteriologie.- 1999.- V. 289-P. 632-638.

81. Pytela R. and Pierschbacher M.D. Arginine-glycine-aspartic acid adhesion receptors.// Methods Enzymol.- 1987.- V. 144- P. 475-489.

82. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C. and Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2 A resolution.// Nature.-1995.- V.375-P. 291-298.

83. Roehrig J.T., Hunt A.R, Johnson A.J. and Hawkes R.A. Synthetic peptidesderived from the deduced amino acid sequence of the E glycoprotein of

84. Murray Valley encephalitis virus elicit antiviral antibody.// Virology.- 1989.-V.171-P. 49-60.

85. Sanchez M.D. Characterization of neutralizing antibodies to WNV.//Virology.- 2005.- V. 336- P. 70-82.

86. Sardelis M.R, Turell M.J, Dohm D.J. and O'Guinn M.L. Vector competence of selected North American Culex and Coquillettidia mosquitoes for West Nile virus.//Emerg. Infect. Dis.- 2001. V. 7- P. 1018-1022.

87. Scherret J.H, Poidinger M, Mackenzie J.S, Broom A.K, Deubel V, Lipkin W.I, Briese, T, Gould E.A. and Hall R.A. The relationships between West Nile and Kunjin viruses.// Emerg. Infect. Dis.- 2001. V. 7- P. 697-705.

88. Shatsky M, Nussinov R, Wolfson H.J. MultiProt a multiple protein structural alignment algorithm.// Lecture Notes in Computer Science- 2002.-V.2452- P. 235-250.

89. Shindyalov I.N. and Bourne P.E. Protein structure alignment by incremental combinatorial extension (CE) of the optimal path.// Protein Engineering- 1998,- V. 11- P. 739-747.

90. Smithburn K.C. and Jacobs H.R. Neutralization-tests against neurotropic viruses with sera collected in Central Africa.// J. Immunol.- 1942.- V. 44- P. 25-31.

91. Smithburn K.C., Hughes T.P., Burke A.W. and Paul J.H. A neurotropic virus isolated from the blood of a native of Uganda.// Am. J. Trop. Med.- 1940.-V. 20-P. 471-492.

92. Solomon T. and Vaughn D.W. Pathogenesis and clinical features of Japanese encephalitis and West Nile virus infections.//Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2002,- V.267- P. 171-194.

93. Sorokin A.V., Kazachinskaia E.I., Ivanova A.V., Kachko A.V., Netesov S.V., Bukreyev A.A., Loktev V.B. and Razumov I.A. Mapping of Two Dominant Sites of VP35 of Marburg Virus.// Viral Immunol.- 2002.- V.15- P. 481-493.

94. Stadler K., Allison S.L., Schalich J. and Heinz F.X. Proteolytic activation of tick-borne encephalitis virus by furin.// J. Virol.- 1997.- V. 71- P. 84758481.

95. Stiasny K., Allison S.L., Marchler-Bauer A., Kunz C. and Heinz F.X. Structural requirements for low-pH-induced rearrangements in the envelope glycoprotein of tick-borne encephalitis virus.// J. Virol.- 1996.- V. 70- P. 81428147.

96. Suchetana M., Kuhn R.J. and Rossmann M.G. A structural perspective of the flavivirus life cycle.// Nat. Rev. Microbiol.- 2005,- V.3- P. 13-22.

97. Thepparit С. and Smith D.R. Serotype-specific entry of Dengue virus into liver cells: identification of the 37-Kilodalton/67-Kilodalton high-affinity laminin receptor as a Dengue virus serotype 1 receptor.// J. Virology.- 2004,-V.78-P. 12647-12656.

98. Towbin H.T. and Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding -current status and outlook.//J. Immunol. Meth.- 1984.- V.72- P. 313-340.

99. Towbin H.T. and Staehelin J.G. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.// Proc. Nat. Acad. Sci. USA.- 1979.- V.76- P. 4350-4354.

100. Vazquez S., Guzmana M.G., Guillenb G., Chineab G., Pereza А. В., Pupoa

101. M., Rodrigueza R., Reyesb O., Garayb H. E., Delgadoa I., Garciaa G. andi

102. Alvareza M. Immune response to synthetic peptides of dengue PrM protein.// Vaccine.- 2002,- V. 20- P. 1823-1830.

103. Wang Т., Anderson J.F., Magnarelli L.A., Wong S.J., Koski R.A. and Fikrig E. Immunization of mice against West Nile virus with recombinant envelope protein.//J. Immunol.- 2001.- V.167- P.5273-5277.

104. Wang Т., Magnarelli L.A., Anderson J.F., Gould L.H., Bushmich S.L., Wong S.J., Fikrig E. A recombinant envelope protein-based enzyme-linked immunosorbent assay for West Nile virus serodiagnosis.// Vector Borne Zoonotic. Dis.- 2002.- V. 2- P. 105-109.

105. Wei-Ming L. J., Chu J. J. and Ng M. Quantifying the specific binding between West Nile virus envelope domain III protein and the cellular receptor alphaVbeta3 integrin.// J Biol Chem.- 2006,- V. 281- P.1352-1360.

106. Wengler G. and Wengler G. Cell-associated West Nile flavivirus is covered with E+Pre-M protein heterodimers which are destroyed and reorganized by proteolytic cleavage during virus release. //J. of Virology-1989.-V. 63-P. 2521-2526.