Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моноклональные антитела к структурным и неструктурным белкам вируса желтой лихорадки и их биологические свойства

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Моноклональные антитела к структурным и неструктурным белкам вируса желтой лихорадки и их биологические свойства"

академия медицинских НАУК СССР ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ имени Д.И.Ивановского

На правах рукописи УЖ 578.883.21:017.1

ТУРЧШСКАЯ Анастасия Львовна МОНОЮЮНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К СТРУКТУРНЫМ И НЕСТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА ЖЕЛТОЙ ЛИХОРАДКИ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА .

03.00.06 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР

Научный руководитель: .профессор, доктор медицинских .начас, почетный член академии Естественных наук РСФСР С.Я.Гайдамович Официальные' опйонеКты: профессор, доктор медицинских наук

ФАДЕЕВА Л.Л.

кандидат биологических наук ТИМОФЕЕВ A.B.

Ведущая организация: Научно-исследовательский Институт

вирусных препаратов АМН СССР Защита состоится м 199/г. в ^ час.

на заседании Специализированного ¡.эвета Д 001.20.02 при Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР по адресу: 1230986 г. Москва, ул. Гамалеи, 16. " "

Автореферат разослан "/ ■ ¡СбШРгЕ 199./г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института вирусологии им.Д.И.Ивановского А."Н СССР.

Ученый секретарь Специализированного Совета кандидат медицинских наук

А.М.Чуковский

Актуальность работы. Вирус кептой лихорадки /лЦГ/ является-эндемичным в странах Африка и йгчой Америки и вызывает тяжелейшее заболевание, которое во мкогжх случаях приводит к летальному исходу. В настоящее время эта инфекция приобрела глобаллчое значение ввиду быстрого и интрисивного передвижения людей в современном мире, Ключевым звеном в программе борьбы с этим инфекционным заболеванием является изучение биологических свойств вируса НЛ, молекулярно-биологических особенностей вирусной репродукции и структурно-функциональных свойств вирусных белков. Для приведения таких исследований особенно перспективным является применение моноклональных антител /МКА/. Получение и использование 1ЛКА к основным антигенам вируса XJI - белкам Е,NS1, N$3, и ifS5 позволит решить не только чисто теоретические задачи, но имеет и большое значение, в частности, для усовершенствования методов дифференциальной диагностики флавивирусных инфекций и выяснения вклада каждого конкретного белка в формирование противовирусного иммунитета.

В настоящее время .ЖЛ к белкам Е и НЯ1 вируса ЗЛ получены Шлезингером и Голдом /Schlesinger J.J.et al.,1983; Gould E.A. et

<o

al. ,1936 /. Клон гибридных клеток к этому вирусу создан также к в нашем институте /Новохатский A.C. и др.,1987/. Однако, ввя-цу того, что какцый-набор МКА по-своему уникален, каждый их вид обладает индивидуальными, неповторимыми свойствами, получение широкой панели МКА к вирусу Ш имеет большое значение

9

пдя изучения антигенов флавивярусов и идентификации вирусных лтаммов. Особенно интересным представляется получение МКА и цальнопгаее исследование с их помощью одного из наименее изученных антигенов - белка NE5, который, по-видимому, играет важную роль з репродукции в;шусов этого семейства, являясь РНК-

• -4-

зависимой РНК-полимзразой.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось получить гибридомы к белкам Е и N35 вируса 2Я, изучить биологические с ойства сенретируемых гибрядомами ЖЛ., применить эт.ч МКА. для исследования ряда структурно-функциональных характеристик антигенов Е и N85 и использовать эти ЫКА в качестве диагностических препаратов!

Поставленная цель обусловила необходимость решения следующих задач:

- получить и отобрать стабильные ктаммы гибридных клеток-продуцектоз моноклональкгс: антител к белкам Е иМ'ББ вируса ЗЛ.

- изучить серологические й биологические характеристики полученных МКА.

- проанализировать внутриклеточную локализацию и динамику накопления белка с помощью Ж А..

охарактеризовать антигенные связи в семействе Р1а\-1\о.г1с1ге и провести эпитопное картирование белка НЭ5.

- определить возможность использования полученных МКА в качестве диагностических препаратов.

Яаттая новизна. Впервые получена панель /12 гибридов продуцируете МКА к бейку N35 вируса П. Используя эти МКА, изучены некоторые физико-химические к биологические свойства этого белка. Установлено, что максимальное накопление белка

в клетках наблюдается через 48 часов после заражения. При изучении внутриклеточной локализации этого белна методом непрямой имглунофлюореецэнцга впервые было показано свечение ядер. Из полученной серии МКА только даа /ГЗЛ-10 и ГЯЛ-12/ взаимодействовала, кроме вируса ..11, еще я с вируса Нтайя, остальные МКА э»ой с<=рии не давали перекрестных реакций с вируса\ш кле-

щевого энцефалита, японского энцефалита,' Западного Нила, Уганда(3 Нтайя и денге 4. С помощью панели МКА серии ГЗЛ выявлено три антигенных зпитопа на неструктурном белке Н85„ МКА к белку НР5 были неактивны при проведения теста пассивной защиты мчтей.

Практическая ценность. Получены линии стабильных гибридом, продуцирующие МКА к белкам Е и N35 вируса ЖЛ. Гибридомы, секре-тирувдие МКА, использованы для препаративного накопления иммуноглобулинов и приготовления на их основе высокоспецифичных иглмунодиагностических реагентов.

Препараты МКА к вирусу И, обладающие ввдос пецифичеокой активностью, предназначены для экспресс-индикации вируса ЖЛ непряма» методом ишунофлюоресценции в инфицированных Клетках культуры ткани, органах и тканях животных и членистоногих. Разработана "Инструкция по применению моноклональной асцитной жидкости к вирусу НЛ для реакции непрямой шмунофлворесцэнции, мышиной, сухой".

Препараты МКА к вирусу КЯ используются В лаборатории* исследованиях для изучения свойств основных антигенов этого вируса в Институте вирусологии им.Д.И.Ивановского АМН СССР, а таккз в Институте вирусологии и микробиологии окрршицей среди з Оксфорде.

Основные положнния выносимые на защиту:

1. Получение моноклональных антител к белкам Е и N3 5 вируса ВД позволяет проводить-дальнейшее изучение свойств этих ы-гитенов, а также особенностей вирусной репргтукции.

2. !ЖА ГйЯ-16 к белку Е являются видоспецифичшми для вируса ЕЛ. Эти ЫКА активны в реакциях торможения гемагглютинации а радиального гемолиза, но не нейтрализуют вирус 201. МКА к 5елку 1® 5 вступают в реакции непрямой иммунофлюоресценции и

иммунофьрментного анализа и не защищают шгаей при проведении теста пассивной защиты.

3. С помощью ЖА к белку N35 вируса Ж выявлено три анти-генншс эпитопа а этом бе^ке: перзый - тестируется 1ЛКА Г2Я-10 и ГКЛ-12 и присутствует, кроме вируса 2Л, еще и на вирусе

.¿Нтайя; второй - обнаруживается ЖА ГЗД-1, ГВД-5, ГМ-17 и ГЖП-19 и характерен дая всех штаммов вируса НЛ; третий - определяется ГЭ1-9 и КЛ-14 и имеется на всех штаммах вируса НЕ, кроме штамла 902677.

4. Белок ж5 вируса 1Ш локализован как а цитоплазме, так и 2 ядрах инфицированных клеток млекопитающих. Максимальное накопление этого белка в клетках наблюдается через ^Я часов после заражения.

5. Применение ¡ЖА серии Г2Л позволяет получить высокоспе-цифичкые диагностические препараты для выявления вируса Н.

Апробация диссертации состоялась- 27 февраля 1991 г. на заседанш Совета предварительной экспертизы диссертационных работ при Институте вирусология игл.Д.И.Ивановского АШ СССР.

Материалы исследований по теме диссертации были представлены на международном с^шозиумв "Арбовярусы и арбов!фусные инфекции", в Москве, октябрь 1989 г., на Американском обществе вирусологов 1991г., на всесоюзном симпозиуме по арбовирусгм в Лнткино, март 1991 г., на конференциях молодых ученых Института вирусологии им.Д.й.Ивановского АМН СССР в 1937 и 1990 гг.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литература, собственных -лсследований, обсуядаения полученных

результгтов, выводов, списка литературы. Последний вклачает 203 источников отечественной и зарубежной литературы. Диссертация вюшчает 21 таблицу и 11 рисунков.

собственные йсощовашй

Материал и методы

В работе использовали следующие флавивирусн: вирус желтей лихорадки /штаммы 17Д, Дака^, W ^Д, А17Д, С17Д, Д17Д, Е17Д, Н17Д, &17Д, У).?Д, В17ДД, С17ДД, ДГЭД,?77 , Asibi , В1-В16, У5, 728 , 7420Ь, 90267',', 3031S5, 303547, 311584/, вирус клещавого энцефалита /4072/, вирус японского энцефалита /Нгкаяма/, вирус Западного Нила /1628/,«*декге 4 /Н-241/, вирус Уганда S, вирусы Спондвени и Hi-айя. Вырэщивани вирусов проводили на культурах клеток Vero, СПЗВ, PS , CV-1 Sff-13. Для проведения реакции антитело-зависимого усиления ияфекционности использовали макро-фагподобные клзтки Р388Д1. Очищенные вирусные препараты получали методом скоростного ультрацентрифугировакия в ступенчатом градиенте плотности сахароза 25-60/6.

Моноклональнне антитела к вирусу ."Ш получата путем слияния клеток миеломк NS-0 с клеткам селезенки мышей. трехкратно иммунизированных суспензией мозга мышей-сосунксв, инфицированных вирусом 2Л /Eoiler, misteia, 1975 /. Для отбора позитивных клонов использовали метод непрямой кмкунофлюоресцен-иии /®/. Зтст метод применяли для анализа внутриклеточного распределения вирусных белков. Кариолсгический анализ полученных гкбрвдом проводили по общепринятому методу /МоогЬеаа

Реакции непрямой ÍS, торможения гзиагглптинэцте /?1ТА/, нейтрализации /РН/, связывания комплемента /РСК/, радиальной диффузии б ге^хе, »апиукоблоттииге п тест пассивной защиты про-

водили по стандартным методикам /Свешникова H.A., 1986; Мельки-' коса'' а.Э., 1986; Madrid A.,Porfce:efield J. , 19?iVsBumette Я.,1981/.

Антигенную специфичность, РЖА устанавливали методом раДио-ишуно преципитации, применяя в качество антигенного материала ра-даоактпвномеченые лизаты клеток Vero и СПЗВ. Этот же метод использовали при анализе динамики накопления" белка HS5.Разделение белков осуществляли методом электрофореза в ДСН-ПААГе / Lasmmii, 1972/.

Выделение ядер из """фицированных клеток проводили двумя спссобалт: 1. лизировалк клетка к очищали ядра ЗО-минутккк центрифугированием в ступенчатом градиенте плотности сахарозы 1,6 - 2 М при 2500 oú/мин, 4°С; 2. к этки выращивали на покровных стеклах, заражали вирусом Ш к обрабатывали буферным раствором содержащим 0,75$ №40.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение гибридом, прояуготоувдю. МКА к вирусу ШТ.

Для получения гибридом мышей иммунизировали 10$ неочищенной суспензией мозга мьшей-сосунков,. зараженных вирусом Ш /итамм FW/. Было выполнено тр^ иммунизации с недельным интерзалом. Через 6 месяцев после иммунизации мыиам вводили бустер-ную дозу вируса к спустя 4 дня у них извлекали селезенку. Такая схема иммунизации позволяла рассчитывать на получение ЖА как к структурным, так и неструктурным белкам вируса XI. В качестве родительской миеломной- линии использовали перевиваемую культург клеток iis-0 , а в качестве сливающего агента - поли-гтилвнгликоль. Для тестирования позитивных клонов, полученных при слиянии, вспользозали реакции непрят.гек ИФ. Иолэйнгельнне гибрид э.-«ы были про клонированы ■•этодом преда.тьпчх разведений ка уровне 15-20 пассажей. При этом активный рост и стабильная

«

продукция иммуноглобулинов выявлялась у 1.3 клонов.. Эти клоны -были отобраны для дальнейшего изучения и получили название ГШ. Основные характеристики МКА серии ГХЛ представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Характеристика моноклональных антител серии ГНД,

Гибридомн

"!-

1Тнп имму-!ноглобули-!нов ' ! I )

т-1-

!Модальный! Титр антител в реакции '»йомооом I непрямой Уя .яммунь.ЗрГ" ! !с культу-!с асцкт-'ментного

! 'ралыюй !ной жид-!

! !жвдкостью!костью !

анализа

. ГЖЛ-1 1БС2а 94 1:32 1:8000 1:1000

Г2Л-5 1{£2а 87 1:8 1:8000 1:1000

ГЗЛ-7 Ц.и. н.и. 1:8 1:4000 "1:100

Ш1-8 '90 1:32 1:4000 1:1000

ГКЛ-9 85 1:32 1:8000 1:500

ГЖП--12 1^28 н.и. 1:32 1:8000 1:500

гш-и , 1С52а 91 1:32 ,1:6400. 1:500

ГЗЛ-16 ■ Н.И. н.и. 1:32 1:8000 1:800

ГКЯ-17 н.и. 1:4 1:1000 н.и,

гаг-18 н.и. к.и. 1:32 1:1000 н.и.

ГНЛ-19 1Б01 99 1:32 1:3200 1:100

гжл-ю 95 1:32 1:8000 1:100

гзл-зз 1с<я 87 н.и. 1:4000 н.и.

н.и. - не исследовали

Гибридная природа полученных клеток была подтверждена ка-риологическим анализом. Модальный класс миеломной линии составляет 60 хромосом, клетки мши имеют диплоидный набор из 41) хромосом. Модальный класс гибридом серии И варьировал от 85 до 99 хромосом.

При исследовании типа секретируемых иммуноголбулинов было выявлено', чгс гибрвдомы ГЗП-1, ГЖЯ-5, Г2Ш-9, ГЗЛ-12, ГЖЛ-14 и ГЖД-17 продуцируют иммуноглобулины относящиеся к подклассу IgG2a„ а остальные гибридомы ГЖ-8, ГЗЛ-19, ГЯЛ-10 и Г.1Л-33

- lgG1 о Титры секретируешх различными гибрндомамп антител в реакции непрямой ИФ с зараженными вирусом Sil клетками Vero составили в культуральной жидкости 1:4-1:32, в асцитной 1:800

- 1:8000. Титры антител в асшшюй жидкости, определение методом ИФА с использованием в качестве антигена клеток СПЗВ, зараженных вирусом 5ЗД, варьировали от 1:100 до 1:1000. Было предположено, что такие невысокие титры МКА, по-видимому, объясняются не только свойствами самих полученных гибридом, но

• такте и незначительным количеством в зараженных клетках антигена, тестируемого МКА.. Кроме того, при использовании в ИФА в качестве антигенного материала очшценого вируса ХЛ Есе ЫКА, за исключением МКА ГЛ-16, были неактивны. Из приведенных данных следовало, что МКА ГХЯ-16 направлено к одному из структурных белков, а все остальные М!А взаимодействуют с неструктурными белками /белком/ вируса II.

"В

2. Серологическая характеристика МКА.

Для изучения анитенной специфичности ЖА, продуцируемых гибридомаш серии Г2Я, в отношении структурных и неструктурных белков вируса ЕЛ использовали высокочувствительный метод радто-иммунопреципитации . При атом было определено, что 12 клонов секрета;-уют МКА направленные к неструктурному белку из 5, и, что только ЫКА ГЖЯ-16 преципитирсвали основной иммуноген фла-вивирусоз - структурный белок 3 /рис.1/. Аналогичным образом была определена антигенная направленность полученных ранее МКА ::ЕЯ-2 л показано, что ->ни также взаимодействуют с с'злком S

вируса 2JI.

N35 ■« №3

Е №1

1 2 3 4-5 6

Рис.1. Анализ антигенной специфичности ЖА методом радиоимму-нопреципиталии.

Радиоактивномеченый лизат клеток СИЭБ зараженных штаммом 17Д вируса 2СЛ инкубировали с I. поликлоналыюй сывороткой к вирусу ЖЛ; 2. МКА ГЗЛ-1: 3. МКА Г20Г-5; 4. МКА ГШ-7; 5. ÚKA ГН-8; 6. МКА ГНЛ-16. - Электрофорез в 10% ПААГе.

Для изучения серологических свойств МКА ГЕЛ-IS и ЖЕЛ--2 исследовали в реакциях сзязыьания комплемента, торможения ге-магглютинации,радиального гемолиза в геле, нейтрализации и способности вызывать антитело-зависимое усиление инфекционнос-тк /табл.2/. PiC'vA KJI-16 имели низкие титры в РТГА, вступали в реакцию радиальной диффузии в геле, но не обладали нейтрализующими свойствами.ЖА 3EJI-2 имели высокие титры в РТГА, обладали слабой нейтрализующей активностью, в субнейтрализующих разведениях усиливали репликацию вируса ЕЯ на макрофагподобных клетка;: Р388Д1, но не были активны в реакции радиального гемолиза в геле.Пи МКА Г5И-16 ни МХА. SEJI-2 не вступали в РСК.

Антитела, полученные Годдом к белку Е вируса Ш / üould а.а. «fc aL 1ЭЭС/,наиболее высокими титрами обладали в реакции не-

пряшй V.i _ долее низкие титры имели б PITA и HL Это характерно ь. для полученных нами МКА ГШ1-16. МКА ЖЕ!ЬЙ8 напротдв, наивысшею активность обнаруживали в РТТА /1:40000/, а в реакции непрямой № били сравнительно менее активны /1:10240/, в РН их титр составил 1:20.

Таблица 2.

Серологическая характеристика МКА к белку Б вируса КЛ.

Í , Активность МКА в реакции

МКА i торможе- ¡радиапь-!нейтрали-!антитело-за-!связывания !ния ге- !ного ге-!зацки ¡зисимого уси'комплемен-!ыагг.тоти-!молиза в! !ления инфек-!та

¡нации 'геле ! !ционности !

ГЗД-16 1:20 6 ш - Е.и.

ЖЕЛ-2 1:40000 - 1:20 +

"+" - наличие, "-" - отсутствие активности в соответствующей реакции;- н.и. - не исследовали.

Для изучения антигенных связей в семейстче Plaviviridae исследовали взаимодействие полученных МКА с представителями разных антигенных подгрупп этого семейства - вирусами клещевого энцефалита, японского энцефалита, Западного Нила, Спондвени, НтаЯя и денге 4 и с различными штаммами вируса 7LT. Реакцию непрямой ИФ ставили с асцитнюти жидкостями гибридом. MICA Г1Л-13 одинаково реагировали со всеми исследованными штрлдагми вируса М, но не были активны с другими флавивирусами. ivíKA ЖМ--2 взаимодействовали, кроме штаммов вируса ЖЛ, еще и с вирусами Спондвени , гшща S и японского энцефалита.

Используя метод непрямой Ш с помощью панели ЫКА были картированы 5 антигенных домеьов на оболочечном х-ликопротеине Е штамма 17Д вируса ЗЛ /óould в.А. ¿386/. Первый - специфичный только для штамма 17Д второй - специфичный для в^ех вакцинных

штаммов вируса 3JL, третий - общий для веек шташов вируса КЯ, * четвертый - с промежуточной перекрестной специфичностью, пя^чй домен характеризовался широкой перекрестной реактивностью. Можно предположить, что эгпиогу: которому специфичны НКА T2JI-16, располагается на третьем антигенном домене, а МКА ЖЕЛ-2-на .пятом.

В настоящее время пог.-чены и охарактеризованы МКА к двум мажорным неструктурным белкам йяавизирусов Ñsi и нзЗ /с-ouia е. ¿t а1.Д986;Тап C.et si.,1990;T.impfsev A.et al.,1990/. Нами впервые были получены 1ЛКА. к белку N35 вируса 1Л. Свойства р^ого белка практически не исследованы и так как предполагается, что US5 играет ва?де£шур роль в репродукции &ЫБИвлрусов и, возможно, является РЖ-зависимой РНК-полимеразой /Rice et al. ,1985/, то в дальнейших экспериментах основное внимание было уделено изучению его структурно-функциональных свойств.

3. Эпктопннй анализ беляа KS5 с помощью мококяональннх

антител.

Для эпитошюго картирования белка ks5 было исследовано взаимодействие 1ЖА к зтоку белку с рядом флавивирузов и о различными итакмазла вируса ЕЛ методом непрямой Результаты тестирования показал!'., что только ГЕЛ-10 и Гд.Т-12 взаикодейст-зуют, кроме вируса ЕЛ, ещз и с вирусом Нтайя, а Г2Л-1, ТЕЛ 5, ГЗЛ-9, ГЗЛ-14, ГЯП-17 а Г1Л-19 не показали никакой лерекрестной активности с другими флавивирусамн /табл. 3/.

Из этого можно сделать вывод, что П'Л-10 и ПЕ-12 по всей вероятности, взаимодействуют с эгоггопами белка NS5, которые не тестируются остальными МКЛ. Это также свидетельствует о том, что (vikk вкусов Нтайя и DI имеют, л о крайиь;: ;.:ере, сдан антитеннъ'й эпитоп не представлении^ на jjpyrvx исслсдовакшгс вирусах.

Таблица 3

Взаимодействие ГЖА к белку lis5 вируса Ш. с флавивирусами.

Шк

В И? У С У

клещевого ! -донского ! Западного ! Сиоэд- ! Уганда ! Нтаия

энцефалита!энцефалита!Нила

!вени ! s

Г2Е-1

ГДЛ-5

¿ДЛ-9

Г.11-10

ГЗЕ-12

ГЗЛ-14

ГЗЛ-1?

+ +

отсутетьаэ езечения в реакция :епрямой : л/мунофлюореоцонции.

Как уже упоминалось ранее, неструктурные белки флавивиру-соч яеляются ьысокококсерватиккыш, поэтому отсутствие шфокого перекреста указывает, что эти ЖА, ко-вздимому, направлены к вариабельным ггштолам белка i<*t£>. Подобнче данные были получены и для ЖА к белку вируса клещевого энцефалита /'Пшо/е-«v а.?. ео al.s ^990/.

Для второй серии экспериментов использовали более 30 штаммов Bi.jyca .'£)[ различного происхождения, которые можно разделить на три группу: 1 - Еакцлннь-е штамын; 2 - штаммы дикого тгаха Африки; 3 - штаммы дикого типа из Южной Америки. Было Показано что №СА ГШГ-Î, ГМ-5,. ГМ-10, .ТЗЛ-1Й, ПЛ-i? и ГУЛ-1Э ро^ирулг со всеми изучаемыми штаммами вируса Г/Л, а дза МКА -а Г—Е-14 не дзаимодэйстиуки* со штаммом 90267?, который upiiHijyieiHiT к ûi гаммам дикого типа и существенно не отличается от других лти.П'лоз дггкого типа гтого вируса /табл.4/.

Таблица 4.

Взаимодействие МКА к белку ш 5 с разлкчндаи штаммами вир/сз 'ЙТ

!

шташы ! ?л К А

зи иуца Ш !т-1 !Г.ТШ- ■5!Гь1-9!ГНЯ- ■10!Г1Л- ■12 !Ш- -14!гаТ-17! ГЕЛ-19

У1Г17Д + + + + + + т +

А17Д + + + л. + + + +

У1?Д + + + + + + + + .

317Д -Т- + + + + + +

В17ДД + + + + т- + + +

С17ДЦ + + -г -т- + + +

УТГУ + + й -г + +■ + + +

Л<Т + -г + + + + f

АБЗ/Ы + + + ' + + о. + +

В1 + + + + + + + +

В5 + + + + + + + +

Ы2 + + + + + + +

В14 + + + + + + + т

Т 4205 + + + + + + -г +

У5 + + + + + -г +

У 28 + -г ч- + + + + +

9С2677 + т- - + н- - + +

303165 ь X. + 4- + + + -Г

311584 + + -г + + + + +

'V - наличие свечения, "-" - отсутствие свечения в реаа^ич непрямой шмуко&яворесценшп;.

'¡"акнл озразогл, различные по цроисхсжению штэмгл вируса ЯЛ могут отличаться по структура б елка из в частности, у tu.Pi яла

9Gz677 отсутствуют некоторые из имеющихся у других штампэ гдитопы. 7.з этого так® следует, что Жк ГШ1-9 и rZJI-14 направлены к другому или, возможно, к другим антигенным детерминантам на белке USE. чем Г2Л-1 ,Еи1-5, ГЮ1-10, Шг12, Г2Я-17 и ГГЛ-1Э.

Итак, на основании изучения взаимодействия I.KA к белку NS'5 с рядом йлавивирусов и с различны;,гл итаммами вируса Ш мы можем ндент1:х'1щирс атъ, по крайней мере, три антигенных эпи-топа на этом белке: первый - тестируется Ш-Ю л Г£Л-12 и присутствует, кроме вируса лЛ, еще и на вирусе Нтайя, второй - обнарушшается 1Ш. ГЗЛ-i, ГйЕЛ-5, Г1Е-17 и ГХ1-1Э и характерен для всех шгашов вируса Ш, третий - определяется Г1СЛ—с/ к ГЕЛ-14 и имеется на всех штаммах вируса ЗА, кроме штамма

4. ..зучекие дя-'аулш накопления н внутриклеточной локализации белка N35 вирусе, желтой лихорадки.

Использование MK/V к белку NS5 позволило провести изучение дп;а>лики накопления зоого антигена. Как показало /еследование методом непрямой Л^чс-рс г 24 часа лоеяе чараленш появляется первое свечение с i.tKA к белку ;iS5, но количество флюоресцирующих клеток еще маю, максимальное накопление этого белка тестируется через 48 часов, а через 72 часа он уг.е определяется слабо. Аналогичные результаты были получены и при использовании более чувствительного метода радкокатунопреципитаций. Полученная динамика накопления белка ЛС5 хорошо согласуется с данными о наличии латентного периода при синтезе вирусной РНК и достижении максимума полылоразьой активности через 24 часа после :п1фицирования клеток /Ohj, '.Yestaway, V}85 /'. Однако, мак-симгАЛЬЯое накопление белка KSb в клетке мохе? не совпадать с :.'с. :с:и.:умом полкморязной активности, гак кис, по-видимому,

только незначительное количество этого белка необходимо для функционировать полимеразного комплекса.

Для выяснения механизмов репродукций вируса SI очень важно изучение внутриклеточной локализации белка es 5. Анализ внутриклеточного распределения этого белка проводили методом непрямой Ь-г о использованием панели полученных Í.5KA «а клетках Vero. Считаете.-., что цикл репродукции флагивярусов гроходит в цитоплазме, соответственно,при исследовании методом непрямой 1й> свечение должно наблюдаться в цитоплазме зараженных клеток. Однако, в Н8дих экспериментах ША к балку N35 вызывали флюоресценцию не только цитоплазмы, ао и ядер инфицированных клеток, причем свечение в ядрах было гораздо интенсивное,чем в цитоплазма /рис.2/. К тому же во многих клетках накболез яркая флюоресценция наблюдалась з ядрышках, что подтверждает внутриядерную локализацию свечения. В качестве контроля в этиг экспе-ршзнтах использовали скраллшаь л негараженкых клеток МКА к белку HS5 и зараженных клеток МКА к белку Е. В первом контроле свечение отсутствовало полностью, а во втором флшресцен-няя наблюдалась только в цитоплазме.

Данный феномен не уклздызается в общепринятую модель репродукция флавивирусов, поэтому для подтверждения ядерного езе-чения был выполнен специальный анализ - r-аделекнке из зараженных клеток ядра исследовал.« методом непрямей ИФ с ЖА к белку K¡>5. При этом в очищенных препаратах ядер та:--.~е наблюдали яркое еззчение.

Следовало выяснить, сохраняется .та стособпосгь свечение ядер при окразтизгяни юг ток, ш&шзфозанжх spj jara штампами ."¿¡I. Чтобы решить этот вопрос,зсследснаяг~ были прозе-дбчк более чем на 30 адашах этого вгруса. Ир" этом сведение

даер обнаруживалось у клеток инфицированных каздкм из этих штвм-:лов. Одновременно било показано, что в клетках.инфицированных дикуш зтажлзми зируса^яярымка чаще всегп оставлись негативном- , а в клетках^заратюнных вакцинными штаммами,они обычно ярко сзетились.

Рис. 2. ¿'ылунойлоотзеоионцкд клецек f~.ro, инфицированных вирусом 23 /атамм /48 часов после заражения/. Анализ проводился методом непрямой с ЖА KDI-S.

Тахяе необходимо било изучать сохраняется ли "способность вызывать свечение .тдер при испатлзованяа для заражения других клеточных культур, кроме клеток Vero. Для этого про-зли агелрз ■ внутриклеточной лскзлизгдки белив, нз5, применял культуры клеток ?"Лй.-:о1П!тавдих 7а и sw-l" и комара CS/36, инфицированных вирусом КГ... lia изучзшггдХ. метках гиекоъктаецях также как и на кллткс-и v«.?ot «оглю било каОлвдьть .чркоъ спечениз s ядре z белое слабое в цгто.чл^зуе, в то к-к в колэругпл- клерках све-тяаась тольло цэтокяакаи

Механкзм репликации флавлвирусов предполагает фуннцпошфо-вание белка как РНК~зависимо£ РНК-пслш.гаразы в цигопла?"е ааракенкых клеток, что согласуется с каблюлаемым нами свечением в цитоплазме. Функциональное значение накопления белка ¡>'55 в ядрах гаракенних глеток остается неясным и требует дальнейшего изучения. Ранее было показано, что в клетках зараженных вкусом' Каддз"ин РНК-поламераз: гя активность ассоциирована с фракцией "тяжелых" эздоплазматичес-лгл. мембран, однако, на поздних 'стадиях инфекции /32 часа после заражения/ эта активность была в большей степени связана с ядерной фракцией /сь.у рч улзъач*.? е., "¡987 /. С другой стороны,^ исключена также возглояность, что наштчпе белка .N"35 з яДрач зараженных клеток не связано с его предполагаемым участием з репликации гирусной РНК. Возможно, данный белок является би- пли полифуякциональным, как, например, другой крупный белок N3.3, функционирующий в качестве полимерам при синтезе "+" цепи вирусноь РНК Д'орозоза О.В. и др.,1990/ и как протеаза при нарезании полипрегежна-гфедшесгвенника /р^еие^-сЬа^ а1.,1990/.

В практическом плаке важно изучение возможного участия неструктурных белкоБ з обеспечении противовирусного кялунитета. Для неструктурного белка язз. было показано., что этот белек защищает мыпей при ишуимзация, МХА к нему активны в секции лас-сиьной защиты и способны вступать в реакцию связывания комплемента /зсЫеахпЕе! ^т.е^ а!., 1985/. Для анализа возможного вклада белка n55 в обеспечение протект;:з:гых свойств пслучег-ц'ке МКА также тестировали в реакции пассивной защиты и в РСК. Наличие активности в данных тостах свидетельствовало бы в пользу учас.ля белка N. 3 в индукции иммунитета про""тв вируса ПЛ. Одьа-ко, полученные МКА не защищали экспериментальных нивотных от гибели вне зависимости от времени введения антител и биш . эак-

т~:вны в РСК Окончательный ответ о роли белка мё в обеспечение протиьовирусного иммунитета мотет быть получен при иммунизации животных афЬинноочищенным препаратом этого белка.

Б лабораторной практике для диагностики вирусных инфекций успешно применяется метод непрямой ИФ. Асцитная жидкость полу- -ченнкх кшг гибридом была использована в качестве диагности-ч.еского препарата для выявления вируса ЖЯ этим методом. Полуденный препарат б"я высокоспецифичен, так как взаимодействовал только со штаммами вируса Л, и не вступал в реакции с другими флавивирусами.

ВЫВОДУ

1. Получена панель /13 штаммов/ гибридных меток, продуцирующих моноклональные антитела к структурным и неструктурным белкам вируса далгой лихорадки. Впервые получены гибридомы сек-ретирувуме моноклональные антитела к неструктурному белку №55 этого вируса.

2. Анализ серологических и биологических свойств монокло-ньл-ных антител г. белку Е показал, что ЖА ГдЛ-16 и .ДКА Ж1--2 акт/вкы в реакциях непрямой иммунофлюоресцетщи,торможения ге-магглютинации и иммуноферментном анализе. Клон ГЙЛ-16 вступает в реак'цоо ради" чьного гемолиза и является неиейтрализующим, МКА ЖЕЛ-2 неактивны в реакции радиального гемолиза, нейтрализуют вирус и способны вызывать антитело-зависимое усиление шрекцг.он-ности. 'ЖА Г2Л-16 являются вздоспецифичннми для вируса МКА ХиП~2 обладают группоспецчфичньаки свойствами и взаимодействуют, кроме вируса желтой лихорадки, с вирусами японского энцефалита, Спондасни и Уганда г.

3. Моноклональные антитела к белку-«3 5 активны в реакциях негтрг-т.юй о^июоресценции и ¡шмуноферментном анализе и не занжпаот мшеЛ при проведении теста пассивной защиты.

"""" -4. Зпервг.е с помощью тлоиоклон-'.'льнкх здтптед виявтекс не

4. Впервые с помощью моноклоналъних антител выявлено кэ менее трех антигенных эпитопов на белке N35 вируса 71Я : нерьг"; -присутствует на всех штамма;: вируса желтой лихорадки к на флави-вирусе Нтайя; второй - характерен для всех штаммов вируса яелтой лихорадки; третий - тлеется на всех стаетах вируса яялтой лихорадки, кроме штамма 902677.

5. Установлено, что 'елек HS 5 локализован как в цитоплазме, тек и в ядрах" инфицированных клеток. Максимальное количество 'этого белка определяется в клетках через 48 часоз после заражения.

6. На основе моноклоьальных антител к белку NS5 получен ш-сокоспецифЕЧНыи диагностический препарат для выявления вируса желтой лихорадки. Особенностью этого препарата является■строгая видоспецифичностъ, при отсутствии групповых реакций с другими флавивкрусами.

СПИСОК

научных работ, опублгковакшх по теме диссертации

1. Гайдамович С.Я. ,'Турчинская A.JI., Мельникова 3.3., Лаврова H.A., Калю'кная Ю.А., Шаноян М.К.Библиотека конокконалъа.« антител к вакцинному штамму вируса .желтой лихорадки. В сб."Экология и диагностика арбовирускых инфекций", М.. 1983., с. 78-84.

2. Иаксян Н.К., Турчинская A.I., Шугкоеа Т.М. Метод рЛ^ул:-ной хроматографии для получения иммуноглобулинов кь препаратов, содержащих моноклоналыше антитела к арбовирусам. сб. "Эколс--гия вирусов и диагностика арбовирускых инфекций", Ы., 1289,

с. 88-92

3. Гайдамович С.Я., Портерфилд Д., Мельникова S.S., Свош никова H.A., Турчинская А.Л., Шуткова Т.М., Шаноян К,К.,£анк Б. Нейтрализующие к усиливавший репликацию вируса монсклокг." антитела к вирусу желтой лихорадки. Материалы Международного

сьлюзиума " \.рйовирусы и арбовкруо-ше инфекция" - М., 1989,

с.50

4. Гайдамошга С.Я., Турчинская А.Л., Голд Е.А., Бакли А., Мельникова Е.Э., Свешникова К.А. Моноклональные антитела к белку иб5 ~ируса# желтой лихорадки. "Итоги науки и техники" вирусология, т.24, 1991, с.60-69.

I.