Изучение анти-ВИЧ активности новых комплексных мембранотропных соединений

Тимофеев, Денис Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение анти-ВИЧ активности новых комплексных мембранотропных соединений
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение анти-ВИЧ активности новых комплексных мембранотропных соединений"

На правах рукописи

Тимофеев Денис Игоревич

ИЗУЧЕНИЕ АНТИ-ВИЧ АКТИВНОСТИ НОВЫХ КОМПЛЕКСНЫХ МЕМБРАНОТРОПНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.06 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ.

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук Н.Г. Перминова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.Н. Загребельный кандидат биологических наук A.M. Шестопалов

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Защита состоится « 12 » ноября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559. тел. 3832-36-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан « 11 » октября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Э.Г. Малыгин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), описанный впервые в 1981 году в США, на сегодняшний день является одним из наиболее опасных инфекционных заболеваний. Распространение ВИЧ/СПИД приняло характер глобальной эпидемии. По данным Всемирной Организации Здравоохранения, на конец 2003г. в мире зарегистрировано около 40 млн. человек инфицированных ВИЧ, а 23 млн. человек погибли от СПИДа с начала его распространения [UNAIDS/WHO, 2003]. В течение последнего десятилетия в Российской Федерации также отмечается исключительно резкий рост случаев инфицирования ВИЧ. На 1 января 2004 года, по официальным данным, в стране зарегистрированы более 264 тысяч ВИЧ-инфицированных, которые выявлены практически во всех субъектах Российской Федерации.

Учитывая скорость распространения ВИЧ-инфекции и отсутствие лекарств, способных излечивать СПИД, очевидна актуальность поиска как эффективных препаратов для терапии ВИЧ/ СПИД, так и средств защиты от инфекции, в частности, вакцины и микробицидов, предотвращающих половую передачу ВИЧ.

Возможно, основой для создания эффективных ингибиторов ВИЧ станут достижения последнего десятилетия по детальному изучению механизма многостадийного взаимодействия вирус-клетка. Новые возможности для блокады ВИЧ-инфекции открывает установление роли клеточных хемокиновых рецепторов CCR5 и CxCR4 в механизме проникновения вируса в клетку [Brelot et al., 2000; Chabot et al., 1999; Farzan et al., 1998; 2002] и обнаружение конформационных изменений, происходящих с белками оболочки вируса gp 120 и gp41 [Moore et al., 1993; Root et al., 2001; Sullivan et al., 1998; Wyatt et al., 1998]. Мишенями для ингибиторов ВИЧ-1 могут стать как трансмембранные клеточные корецепторы ВИЧ: CCR5 и CxCR4, так и консервативные участки белка оболочки вируса gp120, отвечающие за связывание с корецепторами, или структурные элементы вирусного гликопротеина gp41, задействованные в трансформации данного белка. Препараты, обладающие мембра-нотропными свойствами, в настоящее время находятся в стадии разработки и в клинической

npatmnrr rrnirn its |дшугптгтотгт[

рос. национал»)

библиотека .

1е

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы являлась разработка и исследование высокоэффективных анти-ВИЧ препаратов, действующих на стадии адсорбции и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки. В задачи работы входило:

♦ Исследовать цитотоксичность и анти-ВИЧ активность (in vitro) мембранотропных полимеров различного строения и комплексных соединений типа Матрица-Гидрофобный Агент (МГА), полученных путем модификации полимеров известным противовирусным агентом адамантаном. Определить наиболее подходящий полианион для последующих модификаций.

♦ Выявить принципиальные особенности структурной организации комплексных мембранотропных соединений, обеспечивающие достижение наибольшего противовирусного эффекта.

♦ Определить этап жизненного цикла ВИЧ, на котором соединения реализуют противовирусную функцию.

♦ Провести литературный поиск функционально важных доменов корецепторов ВИЧ-1/2 CCR5 и CxCR4, выбрать фрагменты, обеспечивающие взаимодействие с белком оболочки ВИЧ-1 gpl20 для синтеза пептидов - имитаторов данных участков корецепторов ВИЧ.

♦ Изучить цитотоксичность и противовирусную активность (in vitro):

а) выбранных пептидов, как самостоятельных противовирусных агентов, так и в смеси с изучаемыми мембранотропными соединениями;

б) новых мембранотропных соединений типа Матрица-Пептид (МП) и Матрица-Гидрофобный Агент-Пептид (МГАП), содержащих ковалентно связанные пептиды.

♦ Оценить влияние комбинаций полученных соединений на репродукцию ВИЧ-1 на модели лимфобластоидных клеток человека.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые предложены и изучены перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа на основе полианионных матриц, модифицированных низкомолекулярными гидрофобными агентами карбоциклического строения (производными адамантана и норборнана) и/или пептидными имитаторами фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На комплексные пептид-содержащие соединения подана заявка на патент Российской Федерации № 2004117904 приоритет от 11 июня 2004г.

Подтверждена целесообразность применения полианионных соединений, несущих упорядочение расположенные карбоксильные группы, в качестве «сборочных молекулярных платформ» для конструирования комплексных анти-ВИЧ препаратов.

Выявлены принципиальные особенности структурной организации исследуемых соединений, обеспечивающие реализацию противовирусной активности. Доказана эффективность включения в состав комплексных противовирусных препаратов пептидов, тропных к сайтам гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, участвующих в связывании с клеточными кэрецепторами ВИЧ.

Показано, что ингибирующее действие испытанных соединений локализовано на этапе проникновения ВИЧ в клетку-мишень.

Установлено, что большинство изученных бинарных препаратов проявляют независимый и синергичный характер действия при совместном применении, что создает хорошие предпосылки для их комбинированного использования в качестве агентов, блокирующих проникновение вируса в чувствительные клетки.

Разработанные комплексные соединения являются перспективными анти-ВИЧ препаратами, и могут быть использованы как микробициды, т.е. средства, предохраняющие от передачи ВИЧ-инфекции половым путем при местном применении.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изучена анти-ВИЧ активность четырех поликарбоксилатов различного строения и их производных, модифицированных аминоадамантаном. Среди исследованных соединений полимер As470 (синтетический сополимер малеиновой кислоты) является лучшим кандидатом для получения на его базе комплексных анти-ВИЧ препаратов.

2. Выявлены принципиальные особенности структурной организации комплексных мембранотропных соединений, обеспечивающие достижение максимального противовирусного эффекта препаратами. Наиболее важными факторами являются гибкость полианионной матрицы (за счет включения дополнительных метиленовых групп в мономерное звено) и тип стереоизомера гидрофобного агента.

3. Исследованы перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа - МП (As641, As643, As645), полученные путем модификации полимерной матрицы As470 пептидами - имитаторами фрагментов корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На модели острой ВИЧ-инфекции (in vitro) определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений.

4. Изучена анти-ВИЧ активность новых трехкомпонентных соединений (тип МГАП), содержащих как пептидные фрагменты корецепторов ВИЧ, так и известные мембранотропные гидрофобные агенты (адамантан, норборнен). Определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1.

5. Определен этап жизненного цикла ВИЧ, на котором исследованные соединения реализуют противовирусную функцию.

6. Выявлен аддитивный эффект при совместном применении бинарных соединенийАз337, As504, As632 (тип МГА) и AS643, AS645 (тип МП) в соотношениях - 1:1; 5:1; 10:1 (МГА:МП). Обнаружен синергизм анти-ВИЧ действия препаратов As337 и As504 с бинарным соединением As641, содержащим пептид Р5 - имитатор N-концевого фрагмента корецептора ВИЧ CCR5, в соотношении 1:1 и аддитивность их совместного действия в соотношении 10:1.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 5 опубликованных статей, были представлены и обсуждены на следующих конференциях и семинарах: II научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); международных семинарах «New Technologies in Medicine and Ecology, Integrative Medicine» (Высокие Татры, Словакия, 2002; 2003); международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере» (Сургут, 2002); I международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Крым, Украина, 2002); X международной конференции «Новые информационные технологии в медицине и экологии» (Феодосия, Крым, Украина, 2002); конгрессе «Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Крым, Украина, 2003); XTV научной конференции - конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, 2003).

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах, состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов исследования, Обсуждения полученных результатов, Заключения, Выводов, Приложения 1 и Списка литературы, представленного 296 работами отечественных и зарубежных авторов. Основная часть работы изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 29 рисунков и 12 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и основные методы исследования.

В работе были использованы следующие вирусы: штамм ВИЧ-1ЕЖ [Карамов Э.В. и соавт., 1986; Руднева И.А. и соавт., 1993], который получен из Государственной коллекции вирусов (институт вирусологии им. Д.И. Ивановского, г. Москва, депонент № 4005).; штамм ВИЧ-12 [Ерёмин В.Ф., 1997; Рытик П.П и соавт., 1990], получен из НИИ эпидемиологии и микробиологии (г. Минск, республика Беларусь). Данные штаммы являются макрофаго-Т-лимфоцитотропными и относятся к группе rapid/high.

Для определения инфекционной активности штаммов ВИЧ-1, анализа токсичности и анти-ВИЧ действия исследуемых соединений использовали высокочувствительную к ВИЧ-инфекции перевиваемую лимфобластоидную культуру клеток человека МТ-4. Культура получена из коллекции Института клеточных культур ГНЦВБ «Вектор». Клетки культивировали на ростовой среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальной сыворотки, 0,06% L-тутамина, 60 ед/мл линкомицина, 100 ед/мл гентамицина, при температуре 37°С и 5% содержании СО2.

Исследуемые в работе соединения представляют собой карбоксикислотные полимеры различного строения, а также их производные, модифицированные известными гидрофобными агентами карбоциклического строения (адамантан, норборнан, норборнен) и пептидами. Соединения были синтезированы методами органического и полимерного синтеза и очищены от низкомолекулярных примесей к.х.н. А.В. Сербиным в Исследовательском центре биомодуляторов и лекарственных Соединений НИФ Здоровья (Москва, Россия). Изученные в работе пептиды являются синтетическими аналогами фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. Пептиды были синтезированы, хроматографически очищены и лиофилизованы к.х.н. Н.Н. Карпышевым (ГНЦ ВБ «Вектор»).

Цитотоксичность тестируемых соединений в концентрациях 0,1-Ю мг/мл оценивали по жизнеспособности неинфицированных клеток и индексу их пролиферации через 4 суток инкубации. По полученным данным расчитывали индексы цитотоксичности препаратов и определяли концентрации препаратов, снижающие на 50% жизнеспособность клеток по сравнению с контролем (СС50).

Анализ анти-ВИЧ активности исследуемых соединений проводили по следующей схеме: клетки обрабатывали десятикратными разведениями препаратов, приготовленными на среде RPMI-1640 без добавок (конечные концентраций соединений 0,1500 мкг/мл); далее клетки инфицировали вирусом с множественностью заражения 1-4х 10'2 инфекционных единиц на клетку. В качестве контролей использовали ВИЧ-инфицированные клетки

без добавления препаратов и неинфицированные клетки. После адсорбции в течение 1 часа при 37°С не связавшийся вирус и препараты отмывали дважды ростовой средой RPMI-1640. При оценке действия препаратов в течение всей культивации, а не только на стадии адсорбции, дополнительно вносили в лунки препараты до необходимой концентрации. По окончании инкубации (4 суток) учитывали долю жизнеспособных клеток и с помощью программы «LAV» (В.В. Неклюдов, ГНЦ ВБ «Вектор») определяли степень защиты клеток препаратами от цитопатогенного действия ВИЧ-1 (ЕС) и концентрации препаратов, защищающие инфицированные клетки от гибели на 50% (ЕС50) и на 90% (ЕС90). Ингибирующий эффект соединений (1С) оценивали по подавлению накопления вирусного антигена р24 в культуральной среде с помощью иммуноферментной тест-системы "Векто ВИЧ-1 р24-антиген" (Вектор-Бест, Россия). По полученным экспериментальным данным с помощью программы «ELISA» [Неклюдов В.В., ГНЦ ВБ «Вектор»] определяли концентрации препаратов, на 50% (1С50) и на 90% (1С90) снижающие накопление вирусного белка р24 в культуре.

Индекс селективности определяли, как отношение: IS=CC50/IC50. При совместном применении бинарных препаратов рассчитывали комбинационные индексы (CI) для испытанного сочетания препаратов согласно методу, предложенному Чоу [Chou, 1984]. Статистическую обработку результатов проводили методом Стьюдента-Фишера и методом оценки существенности различий [Ашмарин И.П., 1962].

2. Анти-ВИЧ активность базовых полимерных соединений и их производных, модифицированных адамантаном.

На первом этапе исследований все вновь синтезированные соединения тестировали на цитотоксичность и лишь затем на противовирусную активность. Показано, что изучаемые мембрано-тропные препараты и их компоненты, не токсичны для лимфо-бластоидных клеток человека МТ-4 при концентрациях до 2 мг/мл и выше.

В качестве базовых компонентов (матриц - М) для комплексных противовирусных препаратов были выбраны карбоксикислотные полимеры различного строения. По литературными данным, именно отрицательно заряженные полимерные субстанции способны конкурировать с поверхностью клеточной мембраны, имеющей аналогичный заряд, за связывание с положительно заряженными зонами гликопротеинов ВИЧ и ряда других вирусов. Кроме того, данные полимеры, благодаря наличию множества карбоксильных групп, можно использовать как «сборочные молекулярные платформы» при конструировании более сложных противовирусных препаратов.

Для выявления зависимости анти-ВИЧ активности от структурных параметров базовых соединений исследована противовирусная активность выбранных полимерных карбо-ксикислотных матриц (рис. 1) в отношении двух штаммов ВИЧ-1 ^ и Evk) в течение всей инкубации. Сравнительный анализ анти-ВИЧ активности матриц показал преимущество полимерных соединений As282 и As386 Ьтипа (1а и 1Ь). Так для подавления репродукции ВИЧ-1 на 50% требуются сравнительно невысокие концентрации (2-7 мкг/мл) данных «жесткокаркасных» матриц, в то время как наиболее конформационно-подвижный поликар-боксилат As470 (тип 1с) в несколько раз менее эффективен (1С50 2147 мкг/мл). Соединение As485 на полисахаридной основе (П тип) не оказало заметного воздействия на репродукцию ВИЧ-1 во всем диапазоне исследованных концентраций (0,1-100 мкг/мл).

Представлялось интересным проследить возможные изменения ВИЧ-ингибирующей активности базовых соединений I-го и П-го типа при модификации их известным противогриппозным агентом - адамантаном. Из результатов, проведенных исследований (табл. 1), видно, что данная модификация базовых соединений привела к резкому увеличению противовирусной активности препаратов. Самый показательный тому пример - соединение As488 (производное карбоксиметилированного декстрана). Так, если исходная матрица As485 не проявляет значимой анти-ВИЧ активности, то As488 действует в отношении штамма BH4-1EVK на уровне близком к уровню действия препарата As347 на базе высокоактивной жесткокаркасной матрицы As282. 8

мм

СООМа

' ноос соон

1а 1Ь 1с

(___ он < ^

------СО-^р)

п ГЛ

соон

Адамантан (трицнкло[3,3,1 Д • ]декан) &

эндо- экзо-

Норборнен (бицикло[2,2,1]гепта-2,3-ен)

Рис. 1. Молекулярная структура полимерных карбоновых кислот и комбинированных препаратов на их основе, содержащих гидрофобные агенты (ГА); Бр - спейсерная группа; средняя степень полимеризации (п илит): 1а- 80-130; 1Ь - 40-60; 1с - 60-100; П - 60-80.

Примечание: полимерные матрицы I типа относятся к синтетическим сополимерам малеиновой кислоты, а матрица II типа является продуктом искусственного карбоксиметилирования природного полисахарида декстрана.

Таблица 1. Анти-ВИЧ-1 активность адамантан-содержащих производных различных типов матриц в отношении штаммов ВИЧ-1 (Бук и 7) на культуре клеток МТ-4 (в течение всей инкубации).

Соединение Структура штамм ВИЧ-1еук штамм ВИЧ-12

ЕС»" мкг/мл ЕС90 мкг/мл 1С*, мкг/мл 1С*, мкг/мл ЕС50 мкг/мл ЕС*, мкг/мл 1С5„ мкг/мл 1С«, мкг/мл

Аз337 М(1с)-1-Ас1 1,3 3,5 0,7 2,6 4,4 8,8 1,4 ЗДО

Аб525* М(1с)-0-Ад 1,6 2,3 1,3 2,8 - - - -

Аб347 М(1Ь)-А<1 2,9 6,9 3,9 8,1 0,9 8,5 1,3 3,1

М348 М(1а)-А(1 - - - - 4,6 8,8 1,5 3,5

Ая488 М(1Г>Ас1 1,8 3,3 3,3 6,3 53,4 95,8 12,7 36,5

* соединение Аз525 в отличие от Аз337 не имеет спейсерной группы между матрицей и адамантаном; Аз337 содержит в качестве спейсера одно метиленовое звено.

** здесь и далее приведены средние значения эффективных концентраций соединений, полученные минимум в двух независимых повторах эксперимента.

Однако в отношении штамма ВИЧ-12 А8488 проявил активность на порядок меньшую, чем все прочие соединения (табл. 1). Возможно, это отражает межштаммовые различия в структуре поверхностных белков ВИЧ-1.

Соединения Аз337 и Аз525, на базе «гибкой» поликарбо-ксилатной матрицы Аз470, проявили в ряде случаев анти-ВИЧ активность большую, чем соединения (Аз347 и Аз348), полученные путем модификации матриц «жесткокаркасного» строения. Теоретически, это можно объяснить наличием у матрицы типа 1с дополнительных метиленовых мостиков между мономерами, что обеспечивает лучшую возможность адаптироваться к сложным молекулярным рельефам биологических мишеней.

Суммируя полученные результаты, приходим к выводу, что наличие высокой противовирусной активности базовых соединений является не обязательным условием для получения эффективных бинарных анти-ВИЧ препаратов. Учитывая результаты проведенного исследования, в качестве исходной матрицы для дальнейшего синтеза ряда новых соединений был выбран поликарбоксилат типа 1с - Аз470.

3. Определение фазы жизненного цикла ВИЧ, на котором исследуемые соединения проявляют ингибирующее

действие.

Для подтверждения теоретических предпосылок об активности соединений изучаемого класса на этапе проникновения вируса в клетку были выполнены сравнительные эксперименты, где соединения добавляли в культуру МТ-4:

1. за 1 час до инфицирования клеток вирусом ВИЧ-к;

2. одновременно с внесением вируса;

3. через 1 час после инфицирования клеток вирусом.

Результат проведенного анализа представлен на примере соединениия Аз470 (базовый компонент большинства сконструированных комплексных препаратов), рисунок 2. При внесении соединения Аз470 в культуру клеток за 1 час до адсорбции или одновременно с вирусом наблюдаем 50% уровень защиты клеток от гибели уже при 100 мкг/мл, тогда как при добавлении препарата

через 1 час после инфицирования, уровень защиты ЕС50 достигается только при концентрации 500 мкг/мл.

Рис. 2. Эффективность соединения ^470 против штамма ВИЧ-12 (в течение всей инкубации) в зависимости от времени его внесения в клеточную культуру МТ-4

Лучшие результаты получены при внесении соединения в клеточную культуру перед заражением. Дополнительно этот вывод подтверждают результаты экспериментов, проведенных с соединением As5 04 (поликарбоксилат типа 1с, модифицированный норборненом), которое по уровню проявляемой активности против ВИЧ-1 (при одновременном внесении препарата и вируса в культуру ЕС50 - 0,5-4,8 мкг/мл) значительно превосходит исходную матрицу As470. Так, однократная обработка культуры клеток препаратом As504 в концентрации 10 мкг/мл, непосредственно перед заражением, достаточна для 95% подавления вируспродукции. Кроме того, предобработка клеток или интактного вируса препаратом в течение 1 часа не приводит к увеличению анти-ВИЧ активности, что говорит о доступности мишени для атаки именно во время проникновения вируса в клетку. Таким образом, очевидно, что противовирусная активность исследуемых соединений проявляется на этапе инфицирования клеток ВИЧ (стадия адсорбции и проникновения вируса в клетку).

4. Активность комплексных препаратов в отношении штаммов ВИЧ-1 в зависимости от длины спейсера и типа

модификатора.

Создание высокоактивных комплексных препаратов требует обеспечения наилучших стерических условий для работы всех составных компонентов молекулярной системы. В нашем случае теоретически это достигается частотой посадки модификаторов на матрицу, регулированием отдаленности гидрофобных агентов и пептидов от остова поликарбоксилата за счет введения гибких аминотерминальных «спейсерных» групп.

В экспериментах было показано, что увеличение степени модификации карбоксильных групп матрицы гидрофобными агентами с 4% до 20% существенно не меняет противовирусную активность соединений, поэтому при проведении дальнейших экспериментов использовали препараты, имеющие степень модификации в указанных пределах.

Влияние длины спейсерной группы на анти-ВИЧ активность препаратов было изучено на ряде соединений, модифицированных адамантаном (табл. 2). Препараты содержали спейсерные группы длиной от 1-го до 3-х метиленовых звеньев. В качестве контроля использовали препарат As525, не содержащий спейсер между матрицей и адамантаном. Кроме того, исследовали два препарата - стереоизомера, несущих другой гидрофобный агент- норборнен в эндо- или экзо-конфигурации. Анализ был проведен совместно с Я.Ю. Киселевой (ГНЦ ВБ «Вектор») в отношении двух штаммов ВИЧ-1 (ВИЧ-1ЕУК и АЗТ-устойчивый вариант ВИЧ-1ЕУК со сниженной в 5 раз чувствительностью к азидотимидину) на модели острой ВИЧ-инфекции в культуре клеток человека МТ-4. Как видно надиаграмме (рис. 3.), адамантан-содержащие препараты As461,As473 и Лз532 имеют сравнимые количественные характеристики защиты (ЕС50) в обоих случаях, тогда как препараты As337, As456 и As525 эффективнее защищают клетки в случае АЗТ-устойчивого варианта. Варьирование длины «спейсерной» группы, связывающей гидрофобный агент с матрицей, незначительно сказывается на эффективности защиты клеток от данных штаммов ВИЧ-1. Можно отметить лишь определенную тенденцию изменения уровня защиты

(ЕС50) от количества атомов углерода в цепочке «спейсерной» группы. Максимальная анти-ВИЧ активность обнаружена у соединения Л8337, что соответствует монометиленовой «спейсерной» группе.

Активность последовательно снижается по мере удлинения спейсера до 2 и 3 атомов углерода (Л8456, Л8473 и Л8461). Таким образом, короткая дистанция между гидрофобным агентом и полимерным остовом матрицы является благоприятной для воздействия на специфические мишени ВИЧ-1.

Таблица 2. Структурные особенности комплексных соединений, созданных на базе матрицы типа 1с.

Модификация*

Соединение ГА а) % от й)

соон

Ав525 АА 8 0

Аз337 АА 4 1

Аз473 Ас! 5 2

Ав456 А<1 7 2

Ав532 Ай 7 2+Ш д)

Ав461 Ас! 7 3

Ав504 №э-ехо 8 1

Аб530 ЫЬ-епс1о 8 1

*а) Модификация Гидрофобными Агентами: Лё - адамантаном; № - норборненом; б) процент модификации карбоксикислотных групп; с) число атомов углерода в «спейсерной» группе (Бр); д) Ш - дополнительная аминогруппа в спейсере.

Оба препарата с норборненовым модификатором ^504, Л8530) проявляют сходный уровень защиты клеток от патогенного действия штамма ВИЧ-1БУК. Однако, концентрация препаратаЛ^3О (эндо-изомер), необходимая для защиты клеток, инфицированных АЗТ-устойчивым вариантом ВИЧ-1, в 2 раза выше таковой для защиты от инфицирования исходным штаммом. При этом оба норборненовых изомера, в случае с АЗТ-резистентным вариантом ВИЧ-1, обеспечивают уровень защиты клеток от гибели ЕС90 при большей концентрации, нежели чем препараты адамантанового ряда.

Применение стереоизомеров против штамма ВИЧ-12 также обнаружило преимущество экзо-конфигурации норборнена. Результаты иммуноферментного анализа (оценка ингибирования накопления вирусного белка р24 в клеточной культуре) показали, что анти-ВИЧ активность эндо-изомера As530 (Ю90> 20 мкг/мл) ниже, чем - экзо-изомера As504 (Ю90 - 7,5-10 мкг/мл).

А8461 /\s456 Ав532 Аз337 Аз473 Ав525 Аз504 Аз530

Рис. 3. Защитное действие комплексных соединений, наоснове матрицы типа 1с, против штамма ВИЧ-1^ и 5х-устойчивого к АЗТ варианта ВИЧ-1 в зависимости от длины спеисера и типа модификатора. Примечание: 5х-устойчивый кАЗТВИЧ-1 получен экспериментально (при пассировании штамма Evk в присутствии АЗТ) и хранится в лаборатории ретровирусов ГНЦВБ «Вектор». Результаты анализа активности соединений в отношенииданного варианта ВИЧ-1 предоставлены Я.Ю. Киселевой (ГНЦ ВБ «Вектор»).

5. Анализ анти-ВИЧ активности пептид-содержащих мембранотропных соединений.

Для повышения эффективности ингибиторов передачи ВИЧ-инфекции нами было предложено ввести в структуру мембрано-тропных препаратов синтетические пептиды - имитаторы

функционально значимых фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ ССЯ5 или СхСЯ4.

Данные корецепторы ВИЧ взаимодействуют с гаикопротеином §р120 ВИЧ-1 и играют, наряду с рецептором СБ4, ключевую роль в процессе проникновения вируса внутрь клетки. На основе анализа литературных данных и результатов моделирования структур корецепторов были выбраны 5 таких пептидов (Р1-Р5 - см. Рис. 4.).

ССЫ5 СхСК4

мембраны

Рис. 4. Субмолекулярные позиции синтетических пептидов, имитирующих §р120-восприимчивые сайты клеточных рецепторов CCR5 и CxCR4 -корецепторов ВИЧ-1: Р1 и Р5 - имитаторы N-концевого участка CCR5 (сульфатированная и несульфатированная формы соответственно); Р2 - имитатор фрагмента CCR5 на стыке второго трансмембранного домена и первой внешней петли макромолекулы рецептора; РЗ - имитатор gp 120-связывающего сайта второй внешней петли CxCR4; Р4 - имитатор gpl 20-связывающего сайта, прилегающего KN-концевой части CxCR4. Примечание: цифрами обозначены порядковые номера внешнихи внутриклеточных петель рецепторов.

Эксперименты по изучению анти-ВИЧ активности синтезированных пептидов in vitro (против штамма ВИЧ- lz) показали, что пептиды Р1-Р5, как и низкомолекулярные соединения адамантана [Kolocouris, 1996], будучи не связанными с полимерной матрицей, не проявляют существенного ВИЧ-ингибирующего действия.

Совместное применение комбинаций пептидов Р1-Р4 с матрицей As470 во всем диапазоне тестированных соотношении (П/М -1:1,1:5 или 1:10) не дает значимого прироста противовирусной активности по сравнению с собственной активностью матрицы.

Аэ470+Р3 -Х-А8643 -*-РЗ -*-Ав470

Рис. 5. Защита клеток линии МТ-4 от цитопатического действия ВИЧ-12 комплексным препаратом As643 (матрица типа 1с, ковалентно связанная с пептидом РЗ) и его функциональными компонентами: матрицей Л470, пептидом РЗ (имитатор корецептора ВИЧ CxCR4), комбинацией матрицы и пептида РЗ.

Однако модификация матрицы типа 1с данными пептидами приводит к резкому увеличению анти-ВИЧ активности последней. Так, на рисунке 5 можно видеть, что соединение Л8643, в котором пептид РЗ ковалентно связан с матрицей (М-РЗ), демонстрирует наибольшую активность против ВИЧ-1 среди сравниваемых соединений во всем исследованном диапазоне концентраций (0,150 мкг/мл). Этот факт подтверждают и найденные значения концентраций препаратов, обеспечивающие 50% подавление продукции вирусного белка р24: 1С50(Лз470) - 27,9-54,1 (мкг/мл); ГС50(Лз643) - 1,4-2,9 (мкг/мл).

Другие исследованные препараты (^639, Лз641, ^645), где матрица ковалентно связана с пептидами, также проявили высокую анти-ВИЧ активность, особенно против штамма ВИЧ-1Бте (рис. 6.). Полученные результаты говорят, как о функциональной важности выбранных сайтов клеточных трансмембранных белков CxCR4 и CCR5 при взаимодействии с gpl20 ВИЧ-1, так и о несомненной роли полианионной матрицы, помогающей проявить скрытый противовирусный потенциал низкомолекулярных агентов.

Рис. 6. Результат анализа противовирусной активности комплексных пептид-содержащих соединений на базе матрицы А470 (кулыура клеток МТ-4, штаммы ВИЧ-1: Z и Бук).

Таким образом, получены эффективные комплексные соединения нового типа - МП и показано их явное преимущество перед исходным немодифицированным полимером и комбинациями функционально значимых компонентов соединений.

Кроме того, были созданы и исследованы комплексные препараты другого типа - МГАП, несущие на полимерной Матрице и Гидрофобные Агенты, и Пептидные имитаторы корецепторов ВИЧ. Прототипными соединениями для новых препаратов послужили

ранее испытанные наиболее эффективные и нетоксичные образцы, где матрица типа 1с была модифицирована либо норборненом (As504), либо адамантаном (As337). Степень модификации комплексных препаратов пептидами составила до 3%, а адамантаном или норборненом до 20% (из расчета на общее число СООН групп матрицы).

Анализ анти-ВИЧ активности соединений типа МГАП показал отсутствие преимуществ, созданных композиций перед исходными соединениями (см. рис. 7). Отсутствие взаимоусиления противовирусного потенциала каждой из составных частей говорит, как о слабом вкладе пептидных компонент (низкая степень модификации), так и о необходимости оптимизации структуры для учета дополнительно возникающих стерических факторов.

Интересно отметить, что наличие сульфатированных тирозинов в пептиде Р1 (имитатор N-концевого участка корецептора CCR5) не стимулировало противовирусную активность комплексного препарата As63 6 (M-Nb-Pl) в отношении исследованных штаммов ВИЧ-1, хотя по литературным данным сульфатирование CCR5 важно для связывания с гликопротеином gpl20 ВИЧ-1 [Cormier et al., 2001]. На диаграмме (рис. 7) видно, что комплексный препарат As642, несущий пептид Р5 (несульфатированный аналог Р1), проявляет анти-ВИЧ активность, такую же, как препарат As636, содержащий сульфатированный по тирозину пептид Р1. По-видимому, снижение отрицательного заряда в данном случае эффективно компенсируется электростатическим действием фрагментов янтарной кислоты, представляющих основную структурную единицу, регулярно повторяющуюся вдоль полимерной цепи матрицы.

При анализе новых препаратов отмечены условные меж-штаммовые различия в проявляемой ими анти-ВИЧ активности. Так, наблюдается характерное снижение средних значений эффективных концентраций препаратов (IC50,IC90), обеспечивающих подавление продукции белка р24 на 50% и 90%, на штамме ВИЧ-lEVKno сравнению с ВИЧ-12, который характеризуется более высоким уровнем репликации.

Важно подчеркнуть, что эффективность ряда соединений, где поликарбоксилатная матрица модифицирована только пептидом-имитатором одного из корецепторов ВИЧ (CCR5 или CxCR4), сравнима с эффективностью препаратов, модифицированных гидрофобными агентами (табл. 4).

Рис. 7. Результат анализа анти-ВИЧ активности комплексных норборнен-содержащих соединений иммуноферментным методом. На диаграммах А и В приведены значения эффективных концентраций препаратов 1С50 и ГС^ соответственно.

6. Исследование противовирусной активности комбинаций мембранотропных соединений.

Наличие высокоактивных анти-ВИЧ соединений, отличающихся между собой функционально важными компонентами и, как следствие, мишенями для воздействия, навело на мысль о возможности их комбинированного применения. Для проверки данной гипотезы были отобраны три препарата, модифицированных только гидрофобными агентами: Аз337 (адамантаном); Аз504 (норбор-неном); Аз632 (сдвоенными норборненовыми группировками) - и четыре препарата, содержащих пептиды: Аз639 (М-Р1-Р2), Аз641 (М-Р5) и Л8643 (М-Р3), Л8645 (М-Р4). Результаты анализа соединений и их комбинаций в отношении штамма ВИЧ-1Бте (в течение всей инкубации) приведены в таблице 3.

Таблица 3. Влияние мембранотропных препаратов и их комбинаций (в соотношении 1:1) на репродукцию штамма ВИЧ-1БУК в культуре клеток МТ-4 (в течение всей инкубации).

Незакрашенныеячейки содержат значения 1С указанных препаратов, а закрашенные ячейки - 1С5Юкомбинаций соответствующих препаратов щ - синергизм; ц - аддитивность; ц- антагонизм действия.

Как следует из полученных данных, лучшие показатели подавления продукции вирусного белка р24 (1С50) обнаруживают комбинации препаратов As3 37, As5 04 ЫЛ8632 С соединением Л8641, содержащим пептид Р5. Комбинационные индексы, расчитанные по значениям 1С50 данных препаратов и их смесей, указывают на синергизм либо аддитивность действия этих соединений при совместном применении (С150%: 0,68; 0,74 и 1,13 соответственно). Полученные результаты свидетельствуют о доступности для атаки исследуемыми соединениями сайтов-мишеней поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1. При совместном применении препарата As643 с As337 или As504 наблюдается антагонизм действия (С150%: 3,40 и 8,94 соответственно). Антагонизм также выявлен при комбинации соединения As639, содержащего пептиды Р1 и Р2 с Лз337, As504 или аз632 наблюдаем (С150% - 4,79; 4,83; 1,21, соответственно). Это означает, что данные соединения либо склонны к ассоциации друг с другом и образуют слабоактивный комплекс, либо, что более вероятно, частично перекрывают сайты-мишени, стерически препятствуя, друг другу полноценно взаимодействовать с ними.

В случае комбинированного применения пептид-содержащего препарата Л8645 с любым из соединений, модифицированных гидрофобными агентами, характер взаимодействия независимый. Такой же характер действия проявили в смеси препараты As632 и Л8643. Данные закономерности подтверждает анализ существенности различий в проявляемой препаратами и их комбинациями анти-ВИЧ активности [Ашмарин И.П., 1962] и графическое представление данных (рис. 8).

Дополнительно был проведен анализ ВИЧ-ингибирующей активности комбинаций данных препаратов в других соотношениях (МГА:МП - 5:1; 10:1) и только на стадии адсорбции ВИЧ на пермиссивные клетки.

Рис. 8. Результат анализа анти-ВИЧ активности соединений типа МП -^641 ^^5), ^643 (М-РЗ), типа МГА-As337 (M-Ad) и их комбинаций в соотношении 1:1. Приведены данные ИФА по ингибированию накопления антигена р24 ВИЧ-1EVK в культуре клеток МТ-4: А -проявление синергизма действия соединений (As337+As641); В -проявление антагонизма действия препаратов ^337+^643).

Явных преимуществ использования таких соотношений препаратов Лз337, As632 и As641, As643, As645 обнаружено не было (рис. 9). Учитывая, что показатели подавления продукции вирусного белка р24 (1С50) у соединений As337, As504 и As632, модифицированных гидрофобными агентами, равны 1,3; 0,6 и 1,1 (мкг/мл), соответственно, а у препаратов типа МП - находятся в диапазоне 0,5-3,1 (мкг/мл), обнаруживаем независимый характер действия препаратов в комбинациях в данных соотношениях.

Рис. 9. Результат анализа противовирусной активности (1С50) комбинаций препаратовтипаМГАиМПвсоогношениях(5:1; 10:1) в период адсорбции вируса (штамм ВИЧ-1ЕУК, линияклетокМТ-4).

Проявляемый препаратами ВИЧ-ингибирующий эффект при использовании только на стадии адсорбции вируса подтвердил верность утверждения о действии соединений на первоначальных этапах проникновения ВИЧ в чувствительные клетки.

В таблице 4 представлены суммарные характеристики исследованных соединений по анти-ВИЧ активности, цитото-ксичности и селективности. Из представленных данных, очевидно, что предложенный нами подход к молекулярному дизайну противовирусных агентов подтвердил целесообразность использования поликарбоксилатов, в качестве «сборочных молекулярных платформ», и позволил получить целый ряд новых перспективных анти-ВИЧ соединений.

Таблица 4. Суммарные характеристики исследованных соединений по анти-ВИЧ активности, цитотоксичности и индексу селективности.

Соединение Струюура СС50, мг/мл 1Сян мкг/мл ГСяьнМ В

тип М (немодифицированные мат] зицы)

А5282 М(1Ь) >3 5,9 389 >510

А$386 Маа) >2 2,8 94 >715

Ав470 мае) 7,2 37,6 1617 191

А$485 М(11) >2 • _

тип МГА (матрица + гидрофобный агент)

Ав347 М(1Ь>Ас1 >2 3,7 229 >540

А$348 М(1а)-Ас! >2 2,8 232 >720

А$488 М(П>А<1 >2 8,0 496 >250

А5337 М(1с)-1-Ас1 >3 2,4 96 >1260

Ав473 М(1с)-2-А<1 >3 2,8 117 >1070

Аг4б1 М(1с)-3-А£1 >3 3,4 136 >880

А$525 М(1с>0-М >3 1,7 68 >1170

А«532 М(1с)-2-Ы-А<1 >2 3,5 140 >860

А$504 М(1с)-МЬ-ехо >3 1,5 60 >2000

А$530 М(1с)-М>-егк1о >3 3,6 144 >830

А$632 М(1с>ОМ) >3 1,0 38 >3000

тип МГАП (мал жца + гидрофобный агент + пептид

АябЗЗ М(1с>Ас1-Р 1 >3 3,0 114 >1000

Ах635 М(1с>А<1-Р2 >3 3,0 114 >1000

АвбЗб М(1с>1МЪ-Р1 >3 2,7 103 >1110

А$638 М(1с)-М>-Р2 >3 1,7 65 >1770

А$б42 М(1с)-ЫЬ-Р5 >3 2,4 90 >1270

А$644 М(1сНМЬ-РЗ >3 2,3 88 >1300

Аз646 М(1с)->Л>-Р4 >3 2,0 74 >1530

тип МП (матрица + пептид)

А$639 М(1с>Р1-Р2 >3 11,6 394 >260

А$641 М(1с>Р5 >3 4,9 185 >620

А$643 М(1с)-Р3 >3 1,9 71 >1610

А$645 Щс)-Р4 >3 4,9 186 >610

выводы

1. Изучена анти-ВИЧ активность четырех поликарбоксилатов различного строения и их производных, модифицированных аминоадамантаном. Установлено, что полианион As470 с гибкой структурой (синтетический сополимер малеиновой кислоты), является лучшим кандидатом, среди исследованных полимеров, для получения на его базе комплексных анти-ВИЧ препаратов типа МГА или МП.

2. Выявлена зависимость степени анти-ВИЧ активности бинарных соединений типа МГА от особенностей их макро-молекулярного строения. Установлено, что для обеспечения противовирусного действия наиболее важными факторами являются гибкость полианионной матрицы (за счет включения в мономерное звено дополнительных метиленовых групп) и тип стереоизомера модификатора, тогда как длина спейсерной группы играет меньшую роль в процессе ингибирования ВИЧ.

3. Впервые изучены перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа МП (As641, As643, As645), полученные путем модификации полимерной матрицы As470 выбранными пептидами - имитаторами фрагментов корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. Определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений в культуре клеток МТ-4 (штамм ВИЧ-1ЕУК 1С50 - 19-129 нМ; штамм ВИЧ-12 1С50 - 53-369 нМ; IS>600). Эффективность действия новых соединений in vitro сопоставима с таковой широко известных препаратов PRO 2000, Т-20 и Т134, блокирующих ВИЧ на этапе инфицирования клеток.

4. Впервые предложены и исследованы на анти-ВИЧ активность трехкомпонентные соединения типа МГАП, содержащие как пептидные фрагменты корецепторов ВИЧ, так и известные мембранотропные гидрофобные агенты (адамантан, норборнен). Определены количественные характеристики ВИЧ-инги-бирующей активности данных соединений (штамм ВИЧ-1ЕУК 1С50 - 19-168 нМ; штамм ВИЧ-121С50 - 49-167 нМ; ISM000). Преимуществ комплексных препаратов типа МГАП перед исходными бинарными соединениями As3 37 (М-Ad) и As504 (M-Nb) и соединениями типа МП не выявлено.

5. Показано, что исследованные соединения эффективны против ВИЧ-1 на этапе проникновения вируса в клетку и, следовательно, препятствуют инфицированию вирусом иммунодефицита человека чувствительных клеток.

6. Показано, что бинарные соединения А337, А8504, А8632 (тип МГА) и Аз643, А8645 (тип МП) с включенными в состав пептидами РЗ и Р4 - имитаторами фрагментов корецептора ВИЧ СхСК4, при совместном применении в соотношениях -1:1; 5:1; 10:1 (МГА:МП) проявляют аддитивный эффект. Выявлен синергизм анти-ВИЧ действия препаратов А8337 и А8504 с бинарным соединением А8641, содержащим пептид Р5 -имитатор МТ-концевого фрагмента корецептора ВИЧ ССЯ5, в соотношении 1:1 и аддитивность их совместного действия в соотношении 10:1.

Список опубликованных научных работ по теме диссертации.

1. Тимофеев И.В., Бакунина А.Ю., Сербии А.В., Тимофеев Д.И.,

Киселева Я.Ю., Перминова Н.Г. /Биотехнологические аспекты изучения функции хемокинового рецептора CCR5, его пространственной организации и роли в патогенезе ВИЧ-инфекции.// Биотехнология, №4,2002, с. 15-30.

2. Тимофеев И.В., Сербии А.В., Тимофеев Д.И., Бакулина А.Ю.,

Киселева Я.Ю., Перминова Н.Г. /Анализ структурно-функциональной организации хемокинового рецептора CXCR4 и поиск новых подходов к терапии ВИЧ-инфекции.// «Биотехнология» № 4,2003 с. 3-21.

3. Перминова Н.Г, Сербии А.В., Тимофеев Д.И., Плясунова О.А.,

Карпышев Н.Н., Киселева Я.Ю., Ватолин Г.Ю., Неклюдов В.В., Бакулина А.Ю., Тимофеев И.В. /Экспериментальная оценка анти-ВИЧ эффективности комплексных мембра-нотропных соединений с включением пептидных псевдо-лигандов.//Биотехнология, 2003, №5, с. 26-36.

4. Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г, Сербии А.В., Тимофеев И.В.-

Мембранотропные соединения и препараты, воздействующие на ранние стадии ВИЧ-инфекции.// Антибиотики и химиотерапия, 2003а, т.48, №2, с. 29-41.

5. Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г, Сербии А.В., Киселева Я.Ю.,

Неклюдов В.В., Ватолин Г.Ю., Касьян Л.И., Гребиник Т.С., Тимофеев И.В. - ВИЧ-ингибирующая активность полианионных матриц и соединений на их основе, содержащих адамантовые и норборненовые фармакофоры.//Антибиотики и химиотерапия, 2003b, т.48, №5, с.7-15.

IM fi 7 8 f

РНБ Русский фонд

2005-4 1748 1

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимофеев, Денис Игоревич

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор Литературы.

1.1. Антиретровирусные препараты и их мишени.

1.2. Взаимодействие ВИЧ-1 с рецепторами клеточной мембраны.

2.2. Взаимодействие рецептора CD4 с гликопротеином оболочки ВИЧ-1 gpl20.

2.3. Рецепторы хемокинов - корецепторы ВИЧ.

2.3.1. CCR5 - клеточный корецептор ВИЧ.

2.3.2. CxCR4 - клеточный корецептор ВИЧ.

3. Анти-ВИЧ соединения, действующие на стадии проникновения вируса в клетку.

3.1. Соединения, блокирующие взаимодействие гликопротеина gp 120 ВИЧ-1 с клеточным рецептором CD4.

3.1.1. Соединения, воздействующие па вирусный ополочечный белок gp 120.

3.1.2. Соединения, блокирующие клеточный рецептор CD4.

3.2. Соединения, воздействующие на хемокиновый рецептор CCR.5.

3.3. Соединения, воздействующие на хемокиновый рецептор CxCR4.

3.4. Ингибиторы слияния вирусной оболочки и клеточной мембраны.

3.5. Соединения комбинированного действия.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Материалы.

2.1.1. Вирус.

2.1.2. Культуры клеток.

2.1.3. Исследуемые соединения.

2.2. Методы.

2.2.1. Ведение культуры лимфобластоидных клеток МТ-4.

2.2.2. Культивирование и определение инфекционности штаммов ВИЧ-1.

2.2.3. Оценка цитотоксичности противовирусных препаратов.

2.2.4. Определение анти-ВИЧ активности мембранотропных препаратов.

2.2.5. Иммуноферментный анализ иигибирования накопления вирусного АГр24 в культуре клеток.

2.2.6. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. Результаты исследований.

3.1. Токсичность комплексных мембранотропных соединений и их компонентов.

3.2. Определение фазы жизненного цикла ВИЧ, на котором исследуемые соединения проявляют ингибирующее действие.

3.3. Анти-ВИЧ активность базовых полимерных соединений.

3.4. Анти-ВИЧ активность адамантан-содержащих соединений на базе матриц разных типов.

3.5. Активность комплексных препаратов в отношении штаммов ВИЧ-1 в зависимости от длины спейсера и типа модификатора.

3.6. Анализ анти-ВИЧ активности соединений, с включенными в состав пептидами.

3.6.1. Выбор и синтез пептидов - имитаторов корецепторов ВИЧ CCR5, CxCR4.

3.6.2. Анализ анти-ВИЧ активности пептидов - имитаторов корецепторов ВИЧ, комплексных пептид-содержащих препаратов и смесей их компонентов.

3.6.3. Анти-ВИЧ активность комплексных препаратов, содержащих гидрофобные агенты и пептидные имитаторы корецепторов ВИЧ.

3.6.4. Сравнение бинарных пептид-содержащих соединений с препаратами, модифицированными адамаитаном или иорборпеном.

3.6.5. Исследование анти-ВИЧ эффективности препаратов при многократном внесении их в культуру клеток МТ-4 в течение инкубации.

3.6.6. Анти-ВИЧ активность комбинаций мембранотропных препаратов.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение анти-ВИЧ активности новых комплексных мембранотропных соединений"

Актуальность проблемы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), описанный впервые в 1981 году в США, продолжает распространяться по всему миру. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2003 году вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) было инфицировано 5 млн. человек, около 3 миллионов человек умерло. В настоящее время в мире по приблизительным оценкам зарегистрировано 40 млн. человек инфицированных ВИЧ [UNAIDS/WHO, 2003].

По самым оптимистическим прогнозам с 2003 по 2010 годы еще 40 миллионов человек будет инфицировано ВИЧ, если человечество не сможет осуществить кардинальные, глобальные профилактические мероприятия. Ожидается, что более 40% случаев инфицирования произойдет в Азии и странах Тихоокеанского региона (в котором уже сейчас отмечается около 20% всех новых случаев инфицирования в год). Эпидемия быстро распространяется и в большинстве стран Восточной Европы и СНГ. В течение последнего десятилетия в Российской Федерации также отмечается исключительно резкий рост случаев инфицирования ВИЧ [UNAIDS/WHO, 2003]. По данным Федерального научно-методического Центра по профилактике и борьбе со СПИД в стране на 1 января 2004 года зарегистрированы более 264 тысяч ВИЧ-инфицированных, которые выявлены практически во всех субъектах Российской Федерации.

Все это свидетельствует о необходимости незамедлительно решать проблему пандемии ВИЧ-инфекции и пожизненной дорогостоящей терапии миллионов людей в мире и сотен тысяч в нашей стране. Однако, интенсивные работы по поиску эффективных анти-ВИЧ препаратов, которые проводятся в ведущих научных лабораториях всего мира, до сих пор не принесли ощутимых успехов. Лекарства, способные излечивать ВИЧ-инфекцию, пока не найдены [De Clercq, 2002а], а к применяемым сегодня препаратам вирус довольно быстро приобретает устойчивость [LaBranche et al., 2001].

В борьбе со столь изменчивым вирусом становится важным не только эффективно блокировать конкретную вирус-специфическую мишень, но и снизить вероятность появления новой, устойчивой к лекарственному препарату, генерации вирусного потомства. Актуальным становится вопрос: «На какой стадии жизненного цикла вируса препарат эффективней реализует свое действие?» Очевидно, что наиболее надежных результатов терапии следует ожидать в том случае, когда инфекционный процесс подавляется «в зародыше» - на самых ранних стадиях. Так как стартовая агрессия вирусов в отношении клеток-мишеней начинается на внешней стороне плазматической мембраны, то именно здесь целесообразно локализовать приоритетные усилия по блокаде вирусной адсорбции/фузии, прежде чем инфекционный материал вируса проникнет внутрь клетки. Таким образом, наиболее действенным способом контроля эпидемии СПИДа оказываются противовирусные препараты, которые способны предотвратить инфицирование, в частности, при гетеросексуальных контактах, т.е. микробициды.

Возможно, основой для создания эффективных ингибиторов ВИЧ станут достижения последнего десятилетия по детальному изучению механизмов многостадийного взаимодействия вирус-клетка. Так, выяснение роли клеточных хемокиновых рецепторов CCR5 и CxCR4 в механизме проникновения вируса в клетку [Blanpain et al., 1999; Brelot et al., 2000; Chabot et al., 1999; Farzan et al., 1998; Piatt et al., 2001; Rabut et al., 1998] и обнаружение конформационных изменений, происходящих с белками оболочки вируса gpl20 и gp41 [Moore et al., 1993; Root et al., 2001; Sattentau et al., 1993; Sullivan et al., 1998; Wyatt et al., 1998], открывают новые возможности для блокады ВИЧ-инфекции. Мишенью для ингибиторов ВИЧ-1 могут быть, как трансмембранные клеточные корецепторы ВИЧ: CCR5 и CxCR4, так и высококонсервативные участки белка оболочки вируса gpI20, отвечающие за связывание с корецепторами, или структурные элементы вирусного гликопротеина gp41, задействованные в трансформации данного белка. Подобные ингибиторы ВИЧ-1 уже предложены и активно изучаются. Это противовирусные соединения различной природы: антитела [Allaway et al., 1995; Golding et al., 2002], низкомолекулярные соединения циклического строения (цикламы [Donzella et al., 1998; Schols et al., 1997a; 2003], производные пиррола [Howard et al., 1998], пиперидина [Dom et al., 2001; Finke et al., 2001a; Ichiyama et al., 2003; Strizki et al., 2001; Trkola et al"., 2002], пиперазина [Maeda et al., 2001; Tagat et al., 2001] и др. [Hale et al., 2001a; Willoughby et al., 2001]), пептидные имитаторы корецепторов или их антагонисты [Baba et al., 1999; Dorr et al., 2003; Fenard et al., 2001; Sakaida et al., 1998; Tamamura et al., 1998a; 2001a; 2003; Tarasova et al., 1999], имитаторы их естественных лигандов - хемокинов [Brandt et al., 2002; Doranz et al., 1999; Heveker et al., 1998; Kim S. et al., 2001; Proudfoot et al., 1999; Townson et al., 2000; Yang A. et al., 1998]. Подробнее указанные молекулярные мишени и вирус-ингибирующие агенты рассмотрены в литературном обзоре.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка и исследование высокоэффективных анти-ВИЧ препаратов, действующих на стадии адсорбции и проникновения ВИЧ в чувствительные клетки.

В задачи исследования входило: Исследовать цитотоксичность и анти-ВИЧ активность (in vitro) мембранотропных полимеров различного строения и комплексных соединений на их основе, полученных путем модификации полимеров известным противовирусным агентом адамантаном. Определить наиболее подходящий полианион для последующих модификаций. Выявить принципиальные особенности структурной организации комплексных мембранотропных соединений, обеспечивающие достижение наибольшего противовирусного эффекта.

Определить этап жизненного цикла ВИЧ, на котором соединения реализуют противовирусную функцию.

Провести литературный поиск функционально важных доменов корецепторов ВИЧ-1/2 CCR5 и CxCR4, выбрать фрагменты, обеспечивающие взаимодействие с белком оболочки ВИЧ-1 gpl20 для синтеза пептидов - имитаторов данных участков корецепторов ВИЧ.

Изучить цитотоксичность и противовирусную активность (in vitro): а) выбранных пептидов, как самостоятельных противовирусных агентов, так и в смеси с изучаемыми мембранотропными соединениями; б) новых мембранотропных соединений типа МП и МГАП, содержащих ковалентно связанные пептиды.

Оценить влияние комбинаций полученных соединений на репродукцию ВИЧ-1 на модели лимфобластоидных клеток человека.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые предложены и изучены перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа на основе полианионных матриц, модифицированных низкомолекулярными гидрофобными агентами карбоциклического строения (производными адамантана и норборнана) и/или пептидными имитаторами фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На комплексные пептид-содержащие соединения подана заявка на патент Российской Федерации № 2004117904 приоритет от 11 июня 2004г.

Положения, выносимые на защиту:

3. Исследованы перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа — МП (As641, As643, As645), полученные путем модификации полимерной матрицы As470 пептидами -имитаторами фрагментов корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. На модели острой ВИЧ-инфекции (in vitro) определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений.

6. Выявлен аддитивный эффект при совместном применении бинарных соединений As337, As504, As632 (тип МГА) и As643, As645 (тип МП) в соотношениях - 1:1; 5:1; 10:1 (МГА:МП). Обнаружен синергизм анти-ВИЧ действия препаратов As337 и As504 с бинарным соединением As641, содержащим пептид Р5 - имитатор N-концевого фрагмента корецептора ВИЧ CCR5, в соотношении 1:1 и аддитивность их совместного действия в соотношении 10:1.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации вошли в 5 опубликованных статей, были представлены и обсуждены на следующих конференциях и семинарах: II научной конференции "Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера" (Новосибирск, 2002); международных семинарах "New Technologies in Medicine and Ecology, Integrative Medicine" (Высокие Татры, Словакия, 2002; 2003); международной научной конференции "Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на Севере" (Сургут, 2002); I международном симпозиуме "Стресс и экстремальные состояния" (Кара-Даг, Крым, Украина, 2002); X международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Феодоссия, Крым, Украина, 2002); конгрессе "Прогрессивные научные технологии для здоровья человека» (Кара-Даг, Крым, Украина, 2003); XIV научной конференции - конкурсе молодых ученых ГНЦ ВБ «Вектор» (Кольцово, 2003).

Личный вклад автора заключается в проведении основной части экспериментов по оценке цитотоксичности и анти-ВИЧ активности исследуемых соединений, как вирусологическим, так и иммуноферментным методом; обработке и анализе полученных данных; активном участии в поиске и анализе литературных данных при выборе фрагментов клеточных корецепторов ВИЧ для синтеза пептидов - псевдолигандов для поверхностных гликопротеинов ВИЧ-1.

Автор искренне благодарен ближайшим коллегам и соавторам и, персонально, выражает благодарность А.В. Сербину (НИФ "Здоровья", Москва), за синтез исследуемых полимерных соединений, активное участие в обсуждении результатов и написании статей; Н.Н. Карпышеву (ГНЦ ВБ «Вектор») за синтез пептидов; Я.Ю. Киселевой (ГНЦ ВБ «Вектор») за любезно предоставленные данные по протективному действию ряда изучаемых препаратов на клетки, инфицированные устойчивым к АЗТ вариантом ВИЧ-1; В.В. Неклюдову (ГНЦ ВБ «Вектор») за разработку программного обеспечения для обсчета полученных данных; Н.М. Бормотовой и О.А. Щуке (ГНЦ ВБ «Вектор») за помощь при проведении экспериментальных работ; Н.Г. Перминовой, О.А. Плясуновой и И.В. Тимофееву (ГНЦ ВБ «Вектор») за обучение навыкам культуральной работы и ценные советы при написании статей и обсуждении результатов.

Работа выполнена при поддержке гранта ВТЕР#Ш 21/МНТЦ № 2175р.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Тимофеев, Денис Игоревич

выводы

Изучена анти-ВИЧ активность четырех поликарбоксилатов различного строения и их производных, модифицированных аминоадамантаном. Установлено, что полианион As470 с гибкой структурой (синтетический сополимер малеиновой кислоты), является лучшим кандидатом, среди исследованных полимеров, для получения на его базе комплексных анти-ВИЧ препаратов типа МГА или МП.

Выявлена зависимость степени анти-ВИЧ активности бинарных соединений типа МГА от особенностей их макромолекулярного строения. Установлено, что для обеспечения противовирусного действия наиболее важными факторами являются гибкость полианионной матрицы (за счет включения в мономерное звено дополнительных метиленовых групп) и тип стереоизомера модификатора, тогда как длина спейсерной группы играет меньшую роль в процессе ингибирования ВИЧ.

Впервые изучены перспективные анти-ВИЧ соединения нового типа МП (As641, As643, As645), полученные путем модификации полимерной матрицы As470 выбранными пептидами - имитаторами фрагментов корецепторов ВИЧ CCR5 и CxCR4. Определены количественные характеристики противовирусной активности данных соединений в культуре клеток МТ-4 (штамм ВИЧ-1 evk IC50 - 19-129 нМ; штамм ВИЧ-lz IC50 - 53-369 нМ; IS>600). Эффективность действия новых соединений in vitro сопоставима с таковой широко известных препаратов PRO 2000, Т-20 и Т134, блокирующих ВИЧ на этапе инфицирования клеток.

Впервые предложены и исследованы на анти-ВИЧ активность трехкомпонентные соединения типа МГАП, содержащие как пептидные фрагменты корецепторов ВИЧ, так и известные мембранотропные гидрофобные агенты (адамантан, норборнен). Определены количественные характеристики ВИЧ-ингибирующей активности данных соединений (штамм ВИЧ-Ievk IC50 - 19-168 нМ; штамм ВИЧ-lz IC50 - 49-167 нМ; IS>1 ООО). Преимуществ комплексных препаратов типа МГАП перед исходными бинарными соединениями As337 (M-Ad) и As504 (M-Nb) и соединениями типа МП не выявлено.

Показано, что исследованные соединения эффективны против ВИЧ-1 на этапе проникновения вируса в клетку и, следовательно, препятствуют инфицированию вирусом иммунодефицита человека чувствительных клеток.

Показано, что бинарные соединения As337, As504, As632 (тип МГА) и As643, As645 (тип МП) с включенными в состав пептидами РЗ и Р4 - имитаторами фрагментов корецептора ВИЧ CxCR4, при совместном применении в соотношениях - 1:1; 5:1; 10:1 (МГА.МП) проявляют аддитивный эффект. Выявлен синергизм анти-ВИЧ действия препаратов As337 и As504 с бинарным соединением As641, содержащим пептид Р5 - имитатор N-концевого фрагмента корецептора ВИЧ CCR5, в соотношении 1:1 и аддитивность их совместного действия в соотношении 10:1.

Заключение. у Результаты анализа противовирусной активности базовых полимерных соединений показывают, что ее уровень определяется структурой полимерного остова и плотностью расположения карбоксильных групп. Однако, поскольку электростатическое связывание молекулы ингибитора (поликарбоксилата) с поверхностью вириона в водной межклеточной фазе носит обратимый характер, включение в состав полианиона гидрофобных агентов, способных к образованию с белками оболочки ВИЧ-1 (gpl20/gp41) прочных связей, включая водородные и гидрофобные, может существенно повысить уровень противовирусной активности комплексных соединений. Действительно, модификация полианионных матриц низкомолекулярными гидрофобными агентами (производными адамантана и норборнана, блокирующими проникновение вируса гриппа в чувствительные клетки), ведет к резкому усилению анти-ВИЧ активности исходных полимеров. Выявлено, что противовирусная активность созданных комплексных препаратов существенно зависит от особенностей их макромолекулярного строения: типа модификатора (Ad, Nb, Nba), типа стереоизомера (экзо-/эндо-), наличия и длины «спейсера» (метиленовые мостики), регулирующей дистанцию между модификатором и полимерным остовом матрицы.

Исследование анти-ВИЧ активности соединений, в зависимости от времени ^ внесения их в клеточную культуру (до или после инфицирования), показало, что действие препаратов явно выражено на этапе проникновения вируса в клетку. Анализ ВИЧ-ингибирующего эффекта изучаемых агентов при добавлении их в культуральную среду только на период адсорбции вируса, с последующим удалением препарата подтверждает указанную направленность действия соединений.

Испытания in vitro показали, перспективность использования в комплексных препаратах пептидов-имитаторов, тропных к сайтам связывания клеточных корецепторов гликопротеина gpl20 ВИЧ-1. Сравнительный анализ анти-ВИЧ действия, проявляемого функциональными компонентами препаратов типа МП в механической смеси (каждой * структурной единицей отдельно), со свойствами комплексных препаратов, где компоненты ковалентно связаны в единое целое, показал несомненное преимущество работы целостной макромолекулярной системы.

Оптимизированные по структурно-функциональным параметрам противовирусные агенты, предложенного нами типа (МГА, МП), обеспечивают высокий химиотерапевтический индекс (IS> 1 ООО) и эффективно действуют в отношении различных штаммов ВИЧ-1, включая варианты вируса, резистентные к азидотимидину [Киселева Я.Ю. и соавт., 2002; Перминова Н.Г. и соавт., 2003; Сербии А.В. и соавт., 2000].

Таким образом, подтверждена целесообразность применения полианионных соединений, несущих упорядоченно расположенные карбоксильные группы, в качестве «сборочных молекулярных платформ» для конструирования комбинированных анти-ВИЧ препаратов, блокирующих инфицирование клеток вирусом.

В связи с высокой генетической изменчивостью вируса иммунодефицита человека, является обоснованным применение комбинаций исследуемых анти-ВИЧ соединений, нацеленных на разные молекулярные мишени. Так, бинарные препараты типа МП обеспечивают блокаду белка gpl20 на стадии вирусной адсорбции и связывания ВИЧ-1 с корецепторами, а препараты типа МГА ингибируют процесс конформационных ^ преобразований белков оболочки ВИЧ-1 gpl20 и gp41 на последующей стадии проникновения, ведущей к слиянию вирусной и клеточной мембран. Действительно, большинство изученных бинарных препаратов проявляют аддитивный и синергичный характер действия при совместном применении, что создает хорошие предпосылки для их комбинированного использования в качестве агентов блокирующих проникновение вируса в чувствительные клетки.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимофеев, Денис Игоревич, Кольцово

1. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград, 1962. С. 173.

2. Ерёмин В.Ф. ВИЧ-инфекция в республике Беларусь (вирусологические, серологические и молекулярно-биологические исследования). Дисс. док. мед. наук. Минск, 1997. С. 199.

3. Змушко Е.И., Белозеров Е.С. ВИЧ инфекция. Санкт-Питербург: Изд. Питер, 2000. С. 320.

4. Карамов Э.В., Богомолов Б.П., Жданов В.М. Обзор центров, сотрудничающих с ВОЗ по вирусным инфекциям. М., 1986. С. 4-7.

5. Киселев О.И., Блинов В.М., Козелецкая К.Н. и др. Молекулярный механизм действия антивирусных препаратов адамантанового ряда // Вестн. РАМН. 1993. № 3. С. 10-15.

6. Киселева Я.Ю., Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г. и др. Противовирусный эффект мембранотропных препаратов на АЗТ-устойчивые и исходные штаммы ВИЧ-1 II Мат. Междунар. Семинара Новые технологии в медицине и экологии. Словакия, 2002. Тез. 16.

7. Козелецкая К.Н., Стоцкая Л.Л., Сербии А.В., Мунши К., Соминина А.А., Киселев О.И. Структура и антивирусная активность адамантансодержащих полимерных препаратов // Вопр. Вирусол. 2003. Т. 48. № 5. С. 19-26.

8. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия:Учебник/ 4-е изд. М.: Медицина, 2002. С. 656.

9. Руднева И.А., Карамов Э.В., Горчакова Т.А., Черных А.И., Мамаева О.А., Плясунова О.А., Покровский А.Г. Штамм перевиваемых моноцитов человека продуцент вируса иммунодефицита человека I типа // Патент РФ № 1554370, выдан 19.03.1993 г.

10. Рытик П.Г., Ван Дер Гроен Г., Ерёмин В.Ф., Коломиец Н.Д., Попов С.А., Нис П., Виллемс В., Веркаутерен Г., Илькевич Ю.Г., Лемешко Н.Н. Биологические свойства ВИЧ, выделенного от вирусоносителя, проживающего в БССР // Вопр. вирусол. 1990. №5. С. 389-390.

11. Сербии А.В., Стоцкая Л.Л., Букринская А.Г. и др. Усиление и расширение диапазона вирус-специфической активности лекарственных соединений // XII Российский нац конгресс Человек и лекарство. Москва, 2000. Тез. 544.

12. Сербии А.В., Алиханова О.Л., Бурштейн М.Е. и др. Gag белки ВИЧ-1 как терапевтические мишени на ранних и/или завершающих стадиях репликации вируса // Русский журнал ВИЧ/СПИД и родств. пробл. 2002. Т. 6. № 1. С. 167.

13. Сербии А.В., Стоцкая Л.Л., Алымова И.В. и др. Изучение новых адамантан-содержащих препаратов против ВИЧ // III Международ, конф. СПИД, рак и родств. пробл. С.-Петербург, 1995. Тез. 72-73.

14. Сербии А.В., Стоцкая JI.JI., Кренцель Б.А. и др. Сополимеры на основе фурана и мапеинового ангидрида и перспективы их использования в медицине // Сб. Полимеры медицинского назначения. М.: ИНХС, 1988. С. 127-152.

15. Неклюдов В.В. Стандартная методика по обработке экспериментальных данных, полученных при изучении противовирусной активности препаратов в отношении вируса иммунодефицита человека // Соп №СМИ 2/038/01-03. 2003. С. 1-15.

16. Стоцкая Л.Л., Сербии А.В., Мунши К. и др. Эффективность новых адамантансодержащих полимерных соединений против вируса гриппа и их влияние на мембранный транспорт ионов //Хим. фарм. ж. 1995. Т. 29 № 3. С. 19-21.

17. Тимофеев И.В., Сербии А.В., Тимофеев Д.И., Бакулина АЛО., Киселева Я.Ю., Перминова Н.Г. Анализ структурно-функциональной организации хемокинового рецептора CXCR4 и поиск новых подходов к терапии ВИЧ-инфекции // Биотехнология. 2003. № 4. С. 3-21.

18. Тимофеев Д.И., Перминова Н.Г., Сербии А.В., Тимофеев И.В. Мембранотропные соединения и препараты, воздействующие на ранние стадии ВИЧ-инфекции // Антибиотики и химиотер. 2003а. Т.48. № 2. С. 29-41.

19. Abad J.L., Gonzalez М.А., G. del Real, Mira E., Manes S., Serrano F., Bernad A. Novel interfering bifunctional molecules against the CCR5 coreceptor are efficient inhibitors of HIV-1 infection // Mol. Therapy. 2003. V. 8. № 3. P. 475-484.

20. Alkhatib G., Combadiere С., Broder C.C., Feng Y., Kennedy P.E., Murphy P.M., Berger E.A. CC CKR5: a RANTES, MIP-1, MIP-1 receptor as a fusion cofactor for macrophage-tropic HIV-1 // Science. 1996. V. 272. P. 1955-1958.

21. Arakaki R., Tamamura H., Premanathan M. et al. T134, a small-molecule CXCR4 inhibitor, has no cross-drug resistance with AMD3100, a CXCR4 antagonist with a different structure // J. Virol. 1999. V. 73. № 2. P. 1719-1723.

22. Arthos J., Cicala C., Steenbeke T.D. et al. Biochemical and biological characterization of a dodecameric CD4-Ig fusion protein: implications for therapeutic and vaccine strategies // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 13. P. 11456-11464.

23. Asagarasu A., Uchiyama Т., Achiwa K. Syntheses of HIV-protease inhibitors having a peptide moiety which binds to gpl20 // Chem. Pharm. Bull. 1998. P. 697-703.

24. Baba M., Nishimura O., Kanzaki N. A smoll-molecule, nonpeptide CCR5 antagonist with highly potent and selective anti-HIV-1 activity // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 5698-5703.

25. Baldwin C.E., Sanders R.W., Berkhout B. Inhibiting HIV-1 entry with fusion inhibitors // Curr. Med. Chem. 2003. V. 10. № 17. P. 1633-1642.

26. Batinic D., Robey F.A. The V3 region of the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 binds sulfated polysaccharides and CD4-derived synthetic peptides // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. № 10. P. 6664-6671.

27. Bennetts B.H., Teutsch S.M., Buhler M.M., Heard R.N., Stewart G.J. The CCR5 deletion mutation fails to protect against multiple sclerosis // Hum. Immunol. 1997. V. 58. № 1. P. 52-59.

28. Berger E.A., Murphy P.M., Farber J.M. Chemokine receptors as HIV-1 coreceptors: roles in viral entry, tropism, and disease // Annu. Rev. Immunol. 1999. V. 17. P. 657-700.

29. Bieniasz P.D., Fridell R.A., Aramori I., Ferguson S.S., Caron M.G., Cullen B.R. HIV-1-induced cell fusion is mediated by multiple regions within both the viral envelope and the CCR-5 co-receptor// EMBO J. 1997. V. 16. № Ю. P. 2599-2609.

30. Blanpain С., Doranz B.J., Vakili J. et al. Multiple charged and aromatic residues in CCR5 amino-terminal domain are involved in high affinity binding of both chemokines and HIV-1 Env protein // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 34719-34727.

31. Bleul C.C., Wu L., Hoxie J.A. et al. The HIV coreceptors CXCR4 and CCR5 are differentially expressed and regulated on human T lymphocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 5. P. 1925-1930.

32. Boutet A., Salim H., Leclerc P., Tardieu M. Cellular expression of functional chemokine receptor CCR5 and CXCR4 in human embryonic neurons // Neurosci. Lett. 2001. V. 311. №2. P. 105-108.

33. Brandt S.M., Mariani R., Holland A.U. et al. Chemokine-mediated block to HIV entry is associated with CCR5 internalization efficiency // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 19. P. 17291-17299.

34. Brelot A., Heveker N.t Adema K., Hosie M.J., Willett В., Alizon M. Effect of mutations in the second extracellular loop of CXCR4 on its utilization by human and feline immunodeficiency viruses//J. Virol. 1999. V. 73. № 4. P. 2576-2586.

35. Brelot A., Heveker N., Montes M., Alizon M. Identification of residues of CXCR4 critical for human immunodeficiency virus coreceptor and chemokine receptor activities // J. BioL Chem. 2000. V. 275. № 31. P. 23736-23744.

36. Brelot A., Heveker N. Pleskoff O., Sol N. Alizon M. Role of the first and third extracellular domains of CXCR-4 in human immunodeficiency virus coreceptor activity // J. Virol. 1997. V. 71. № 6. P. 4744-4751.

37. Bukrinskaya A.G., Serbin A.V., Bogdan O.P. et al. Adamantane Analogues Block Early Steps of HIV Infection // VII Int. Conf. Antivir. Res. Venice, 1993. Abs. 63.

38. Bukrinskaya A.G., Serbin A.V., Bogdan O.P. et al. Polymeric Adamantane Analogues // US Pat. US005880154A. 1999.

39. Burstein M.E., Serbin A.V., Khakhulina T.V. et al. Newly developed polyanionic derivative of norbomene inhibits HIV-1 replication // Antivir. Res. 1999a. V. 41. № 2. P. 45.

40. Burstein M.E., Serbin A.V., Khakhulina T.V. et al. Inhibition of HIV-1 replication by newly developed adamantane-containing polyanionic agents // Antivir. Res. 1999b. V. 41. №3. P. 134-144.

41. Chabot D.J., Broder C.C. Substitutions in a homologous region of extracellular loop 2 of CXCR4 and CCR5 alter coreceptor activities for HIV-1 membrane fusion and virus entry // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 31. P. 23774-23782.

42. Chabot D.J., Chen H., Dimitrov D.S., Broder C.C. N-linked glycosylation of CXCR4 masks coreceptor function for CCR5-dependent human immunodeficiency virus type 1 isolates // J. Virol. 2000. V. 74. № 9. P. 4404-4413.

43. Chan D.C., Fass D., Berger J.M. et al. Core structure of gp41 from the HIV envelope glycoprotein // Cell. 1997. V. 89. P. 263-273.

44. Chen Z., Ни В., Huang W. et al. HIV-1 Mutants Less Susceptible to SCH-D, a Novel Small-Molecule Antagonist of CCR5 // 9th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2002. Seattle. USA. Abs. 396-T.

45. Choi Y.H., Rho W.S., Kim N.D. et al. Short peptides with induced beta-turn inhibit the interaction between HIV-1 gpI20 and CD4 // J. Med. Chem. 2001. V. 44. № 9. P. 13561363.

46. Chou T.C., Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships: the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors // Adv. Enzyme Regul. 1984. V. 22. P. 2755.

47. Cooley L.A., Lewin S.R. HIV-1 cell entry and advances in viral entry inhibitor therapy // J. Clin. Virol. 2003. V. 26. № 2. P. 121-132.

48. Cormier E.G., Tran D.N., Yukhayeva L., Olson W.C., Dragic T. Mapping the determinants of the CCR5 amino-terminal sulfopeptide interaction with soluble human immunodeficiency virus type 1 gpl20-CD4 complexes // J. Virol. 2001. V. 75. № 12. P. 5541-5549.

49. Daar E.S., Ho D.D. Relative resistance of primary HIV-1 isolates to neutralization by soluble CD4 // Am. J. Med. 1991. V. 90 № 4A. P. 22-26.

50. De Clercq E. Chemotherapeutic approach to the treatment of the acquired immune deficiency syndrome (AIDS) // J. Med. Chem. 1986. V. 29. P. 1561-1569.

51. De Clercq E. New anti-HIV agents and targets // Med. Res. Rev. 2002a. V. 22: № 6. P. 531-565.

52. De Clercq E. New developments in anti-HIV chemotherapy // Biochim. Biophys. Acta. 2002b. V. 1587. P. 258-275.

53. De Clercq E., Yamamoto N., Pauwels R. et al. Highly potent and selective inhibition of human immunodeficiency virus by the bicyclam derivative JM3100 // Antimicrob. Agents Chemother. 1994. V. 38. P. 668-674.

54. Debnath A.K., Radigan L., Jiang S. Structure-based identification of small molecule antiviral compounds targeted to the gp41 core structure of the human immunodeficiency virus type 1 //J. Med. Chem. 1999. V. 42. № 17. P. 3203-3209.

55. Derdeyn C.A., Decker J.M., Sfakianos J.N., Zhang Z., O'Brien W.A., Ratner L., Shaw

56. Di Marzio P., Tse J., Landau N.R. Chemokine receptor regulation and HIV type 1 tropism in monocyte-macrophages // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1998. V. 14. № 2. P. 129-138.

57. Dimitrov D.S., Xiao X., Chabot D.J., Broder C.C. HIV coreceptors // J. Membr. Biol. 1998. V. 166. №2. P. 75-90.

58. Doms R.W., Peiper S.C. Unwelcome guests with master keys: how HIV uses chemokine receptors for cellular entry//J. Virol. 1997. V. 235. P. 179- 190.

59. Donzella G.A., Schols D., Lin S.W., Este J.A., Nagashima K.A., Maddon P.J., Allaway G.P., Sakmar T.P., Henson G., De Clercq E., Moore J.P. AMD3100, a small molecule inhibitor of HIV-1 entry via the CXCR4 co-receptor// Nat. Med. 1998. V. 4. P. 72-77.

60. Doranz B.J., Filion L.G., Diaz-Mitoma F., Sitar D.S., Sahai J., Baribaud F., Orsini M.J., Benovic J.L., Cameron W., Doms R.W. Safe use of the CXCR4 inhibitor ALX40-4C in humans // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2001. V. 17. № 6. P. 475-486.

61. Doranz B.J., Grovit-Ferbas K., Sharron M.P. et al. A small-molecule inhibitor directed against the chemokine receptor CXCR4 prevents its use as an HIV-1 coreceptor // J. Exp. Med. 1997b. V. 186. № 8. P. 1395-1400.

62. Doranz B.J., Lu Z., Rucker J. et al. Two distinct CCR5 domains can mediate coreceptor usage by human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 1997a. V. 71. № 9. P. 63056314.

63. Doranz B.J., Orsini M.J., Turner J.D. et al. Identification of CXCR4 domains that support coreceptor and chemokine receptor functions // J. Virol. 1999. V. 73. № 4. P. 2752-2761.

64. Dorr P., Macartney M., Rickett G. et al. UK-427,857, a Novel Small Molecule HIV Entry Inhibitor is a Specific Antagonist of the Chemokine Receptor CCR5 // 10th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2003. Boston. USA. Abs. 12.

65. Douglas S.D. Methadone may promote HIV replication: study // AIDS Alert. 2001. V. 16. №9. P. 120.

66. Dragic T. An overview of the determinants of CCR5 and CXCR4 co-receptor function // J. Gen. Virol. 2001. V. 82. № 8. P. 1807-1814.

67. Dragic Т., Litwin V., Allaway G.P., Martin S.R., Huang Y., Nagashima K.A., Cayanan C., Maddon P.J., Koup R.A., Moore J.P., Paxton W.A. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5 // Nature. 1996. V. 381. P. 667-673.

68. Eckert D.M., Malashkevich V.N., Hong L.H. Inhibiting. HIV-1 entry: Discovery of D-peptide inhibitors that target the gp4l coiled-coil pocket // Cell. 1999. V. 99. P. 103-115.

69. Este J.A., Cabrera C., De Clercq E. et al. Activity of different bicyclam derivatives against human immunodeficiency virus depends on their interaction with the CXCR4 chemokine receptor// Mol. Pharmacol. 1999. V. 55. № 1. P. 67-73.

70. Fantini J., Hammache D., Pieroni G., Yahi N. Role of glycosphingolipid microdomains in CD4-dependent HIV-1 fusion // Glycoconj. J. 2000. V. 17. № 3 -4. P. 199-204.

71. Farzan M., Babcock G.J., Vasilieva N., Wright L., Kiprilov E., Mirzabekov Т., Choe H. The role of post-translational modifications of the CXCR4 amino-terminus in SDF-la. association and HIV-1 entry // J. Biol. Chem. 2002. V. 277. № 33. P. 29484-29489.

72. Fenard D., Lambeau G., Maurin T. et al. A peptide derived from bee venom-secreted phospholipase A2 inhibits replication of T-cell tropic HIV-1 strains via interaction with the CXCR4 chemokine receptor // Mol. Pharmacol. 2001. V. 60. № 2. P. 341-347.

73. Feng Y., BroderC.C., Kennedy P.E., Berger E.A. HIV-1 entry cofactor: functional cDNA cloning of a seven-transmembrane G protein coupled receptor// Science. 1996. V. 272. P. 872-877.

74. Feng Y., Leavitt M., Tritz R. Inhibition of CCR5-dependent HIV-1 infection by hairpin ribozyme gene therapy against CC-chemokine receptor 5 // J. Virol. 2000. V. 276. № 2. P. 271-278.

75. Franti M„ Nagashima K„ Maddon P. et al. The CCR5 Co-Receptor Inhibitor PRO 140 Effectively Controls Established HIV-1 Infection in Vivo // 9th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2002. Seattle. USA. Abs. 403-T.

76. Gabuzda D., Wang J. Chemokine receptors and mechanisms of cell death in HIV neuropathogenesis // J. Neurovirol. 2000. V. 6. P. 24-32.

77. Gerlach L.O., Skerlj R.T., Bridger G.J. et al. Molecular interactions of cyclam and bicyclam non-peptide antagonists with the CXCR4 chemokine receptor // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 17. P. 14153-14160.

78. Ghezzi S., Vicenzi E., Soldini L. et. al. Experiences in immune reconstitution. The rationale for interleukin-2 administration to HIV-infected individuals // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 1997. V. 11. № 1-2. P. 74-78.

79. Golding H., Aliberti J., King L.R., Manischewitz J., Andersen J., Valenzuela J., Landau N.R., Sher A. Inhibition of HIV-1 infection by a CCR5-binding cyclophilin from Toxoplasma gondii // Blood. 2003. V. 102. № 9. P. 3280-3286.

80. Golding H., Zaitseva M., de Rosny E. Dissection of human immunodeficiency virus type 1 entry with neutralizing antibodies to gp41 fusion intermediates // J. Virol. 2002. V. 76. № 13. P. 6780-6790.

81. Gupta S.K., Lysko P.G., Pillarisetti K. et al. Chemokine receptors in human endothelial cells. Functional expression of CXCR4 and its transcriptional regulation by inflammatory cytokines // J. Biol.Chem. 1998. V. 273. № 7. P. 4282-4287.

82. Harrison P.F., Rosenberg Z., Bowcut J. Topical Microbicides for Disease Prevention: Status and Challenges // Clin. Infect. Dis. 2003. V. 36. P. 1290-1294.

83. Heil M., Decker J., Chen D. et al. Analysis of Patient-derived HIV-1 Isolates Suggests a Novel Mechanism for Decreased Sensitivity to Inhibition by Enfuvirtide and T-649 // 10th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2003. Boston. USA. Abs. 615.

84. Hernandez-Lopez C., Varas A., Sacedon R. et al. Stromal cell-derived factor 1/CXCR4 signaling is critical for early human T-cell development // Blood. 2002. V. 99. № 2. P. 546-554.

85. Heroid B.C., Bourne N., Marcellino D., Kirkpatrick R., Strauss D.M. Poly(sodium 4-styrene sulonate): an ef fective candidate topical antimicrobial for prevention of sexually transmited diseases // J. Infect. Dis. 2000. V. 181. P. 770-773.

86. Heveker N., Montes M., Germeroth L. et al. Dissociation of the signaling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides // Current. Biol. 1998, V. 8. P. 369-376.

87. Jansen R.W., Schols D., Pauwels R. et al. Novel, negatively charged, human serum albumins display potent and selective in vitro anti-human immunodeficiency virus type 1 activity // Mol. Pharmacol. 1993. V. 44. № 5. P. 1003-1007.

88. Ji H., Shu W., Burling F.T., Jiang S., Lu M. Inhibition of human immunodeficiency virus type 1 infectivity by the gp41 core: role of a conserved hydrophobic cavity in membrane fusion // J. Virol. 1999. V. 73. № 10. P. 8578-8586.

89. Jinquan Т., Quan S., Jacobi H.H. et al. CXC chemokine receptor 4 expression and stromal cell-derived factor-1 alpha-induced chemotaxis in CD4+ T lymphocytes are regulated by interIeukin-4 and interleukin-10 //J. Immunol. 2000. V. 99. № 3. P. 402-410.

90. Jourdan P., Abbal C., Noraz N. et al. IL-4 induces functional cell-surface expression of CXCR4 on human T cells // J. Immunol. 1998. V. 160. № 9. P. 4153-4157.

91. Jourdan P., Vendrell J.P., Huguet M.F. et al. Cytokines and cell surface molecules independently induce CXCR4 expression on CD4+ CCR7+ human memory T cells // J. Immunol. 2000. V. 165. № 2. P. 716-724.

92. Kanamoto Т., Kashiwada Y., Kanbara K. et al. Anti-human immunodeficiency virus activity of YK-FH312 (a betulinic acid derivative), a novel compound blocking viral maturation // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. V. 45. № 4. P. 1225-1230.

93. Kashiwada Y., Nagao Т., Hashimoto A. et al. Anti-AIDS agents 38. Anti-HIV activity of 3-O-acyl ursolic acid derivatives Hi. Nat. Prod. 2000. V. 63. № 12. P. 1619-1622.

94. Kashiwada Y., Wang H.K., Nagao T. et al. Anti-AIDS agents. Anti-HIV activity of oleanolic acid, pomolic acid, and structurally related triterpenoids // J. Nat. Prod. 1988. V. 61. №9. P. 1090-1095.

95. Khatri V.P., Fehniger T.A., Baiocchi R.A. et. al. Ultra low dose interleukin-2 therapy promotes a type 1 cytokine profile in vivo in patients with AIDS and AIDS-associated malignancies//J. Clin. Invest. 1998. V. 101. №6. P. 1373-1378.

96. Kim D., Wang L., Caldwell C.G., et al. Design, synthesis, and SAR of heterocycle-containing antagonists of the human CCR5 receptor for the treatment of HIV-1 infection // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. № 24. P. 3103-3106.

97. Kim S., Jao S., Laurence J.S., LiWang P.J. Structural comparison of monomelic variants of the chemokine MlP-lbeta having differing ability to bind the receptor CCR5 // Biochem. 2001. V. 40. № 36. P. 10782-10791.

98. Kolocouris N., Foscolos G.B., Kolocouris A. et al. Synthesis and antiviral activity evaluation of some new aminoadamantane derivatives // J. Med. Chem. 1994. V. 37. P. 2896-2902.

99. Konishi K., Ikeda K., Achiwa K. et al. Synthesis of peptides mimicking chemokine receptor CCR5 and their inhibitory effects against HIV-1 infection // Chem. Pharm. Bull.2000. V. 48. № 2. P. 308-309.

100. Kuhmann S.E., Piatt E.J., Kozak S.L., Kabat D. Cooperation of multiple CCR5 coreceptors is required for infections by human immunodeficiency virus type 1 // J. Virol. 2000. V. 74. № 15. P. 7005-7015.

101. Kuipers M.E., Huisman J.G., Swart P.J. et al. Mechanism of anti-HIV activity of negatively changed albumins: biomolecular interaction with the HIV-1 envelope proteine gpl20 // J. AIDS Hum. Retrovir. 1996. V. 11. № 5. p. 419-429.

102. Kuritzkes D.R., Jacobson J.M., Powderly W. et al. Safety and Preliminary Anti-HIV Activity of an Anti-CD4 mAb (TNX-355; Formerly Hu5A8) in HIV-infected Patients // 10th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2003. Boston. USA. Abs. 13.

103. Kutza J., Hayes M.P., Clouse K.A. Interleukin-2 inhibits HIV-1 replication in human macrophages by modulating expression of CD4 and CC- chemokine receptor-5 // AIDS. 1998. V. 12. №8. P. F59-F64.

104. Kwong P.D., Wyatt R., Robinson J., Sweet R.W., Sodroski J., Hendrickson W.A. Structure of an HIV gpl20 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody// Nature. 1998. V. 393. № 6686. P. 648-659.

105. LaBranche C.C., Galasso G., Moore J.P. et al. HIV fusion and its inhibition // Antivir. Res.2001. V. 50. P. 95-115.

106. Labrosse В., Brelot A., Heveker N., Sol N., Schols D., De Clercq E., Alizon M. Determinants for sensitivity of human immunodeficiency virus coreceptor CXCR4 to the bicyclam AMD3100//J. Virol. 1998. V. 72. P. 6381-6388.

107. Larack-Stone A., Melton D.J., Lewis M.S. Structure-function relations of heparin-mimetic sulfated xylan oligosaccharides: inhibition of human immunodeficiency virus-1 infectity in vitro // Glycoconjugate J. 1988. V. 10. P. 697-712.

108. Lavi E., Kolson D.L., Ulrich A.M., Fu L., Gonzalez-Scarano F. Chemokine receptors in the human brain and their relationship to HIV infection // J. Neurovirol. 1998. V. 4. № 3. P. 301-311.

109. Lazzarino D.A., Diego M., Musi E., Hirschman S.Z., Alexander R.J. CXCR4 and CCR5 expression by H9 T-cells is downregulated by a peptide-nucleic acid immunomodulator // Immunol. Lett. 2000. V. 74. № 3. P. 189-195.

110. Lin P.F., Robinson В., Gong Y.F. et al. Identification and characterization of a novel inhibitor of HIV-1 entry // Works of IX Conf. Retrovir. Opportunistic Infec., Seattle. 2002. Virology and resistance. Abs. 9.

111. Liu S., Jiang S., Wu Z. Identification of inhibitors of the HIV-1 gp41 six-helix bundle formation from extracts of Chinese medicinal herbs Prunella vulgaris and Rhizoma cibotte //Life Sci. 2002. V. 71.№ 15. P. 1779-1791.

112. Lorens O., Filizola M., Spisani S. et al. Amygdalin binds to the CD4 receptor as suggested from molecular modeling studies// Bioorg. Med. Chem. Lett. 1998. V. 8. P. 781-786.

113. Louis J.M., Bewley C.A., Clore G.M. Design and properties of N(CCG)-gp41, a chimeric gp41 molecule with nanomolar HIV fusion inhibitory activity // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. №31. P. 29485-29489.

114. Luo Z., Zhou N., Luo J. et al. The role of positively charged residues in CXCR4 recognition probed with synthetic peptides // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999. V. 263. №3. P. 691-695.

115. Maeda К., Nakata H., Miyakawa Т. et al. AK602: A Novel HIV-specific Spirodiketopiperazine CCR5 Inhibitor Potent Against a Wide Spectrum of R5-HIV // 10th

116. Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2003. Boston. USA. Abs. 10.

117. Maeda K., Yoshimura K., Shibayama S. et al. Novel low molecular weight spirodiketopiperazine derivatives potently inhibit R5 HIV-1 infection through their antagonistic effects on CCR5 // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. № 37. P. 35194-35200.

118. Margolis L., Grivel J-Ch., Ito Y. et al. Mechanisms of differential pathogenesis of R5 and X4 HIV-1 variants in human lymphoid tissue // Antivir. Res. 2002. V. 53. № 3. A68.

119. Mayer K.H., Karim S.A., Kelly C., Maslankowski L., Rees H„ Profy A.T., Day J., Welch

120. J., Rosenberg Z. Safety and tolerability of vaginal PRO 2000 gel in sexually active HIV-uninfected and abstinent HIV-infected women // AIDS. 2003. V. 17. № 3. P. 321-329.

121. McGrath K.E., Koniski A.D., Maltby K.M., McGann J.K., Palis J. Embryonic expression and function of the chemokine SDF-1 and its receptor, CXCR4 // Dev. Biol. 1999. V. 213. № 2. P. 442-456.

122. Meanwell N.A., Kadow J.F. Inhibitors of the entry of HIV into host cells // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2003. V. 6. № 4. P. 451-461.

123. Mennicken F., Chabot J.G., Quirion R. Systemic administration of kainic acid in adult rat stimulates expression of the chemokine receptor CCR5 in the forebrain // Glia. 2002. V. 37. №2. P. 124-138.

124. Michael N.L., Chang G., Louie L.G., Mascola J.R., Dondero D., Birx D.L., Sheppard H.W.

125. The role of viral phenotype and CCR-5 gene defects in HIV-1 transmission and disease progression // Nat. Med. 1997. V. 3. № 3. P. 338-340.

126. Montaner L.J. Structured treatment interruptions to control HIV-1 and limit drug exposure // Trends Immunol. 2001. V. 22. № 2. P. 92-96.

127. Moore J.P., Jameson B.A., Weiss R.A., Sattentau Q.J. The HIV-cell fusion reaction. In:

128. Viral Fusion Mechanisms / Eds. Bentz J. Boca Raton, Florida: CRC Press. 1993. P. 233— 289.

129. Moriuchi M., Moriuchi H. Increased susceptibility to HIV-1 of peripheral blood lymphocytes in acute infection with Epstein-Barr virus // J. Med. Virol. 2003. V. 71. № 3.1. A P. 343-346.

130. Murakami Т., Zhang T.Y.r Koyanagi Y. et al. Inhibitory mechanism of the CXCR4 antagonist T22 against human immunodeficiency virus type 1 infection // J. Virol. 1999. V.1. Ф 73. № 9. P. 7489-7496.

131. Nagasawa Т., Tachibana K., Kishimoto T. A novel CXC chemokine PBSF/SDF-1 and its ^ receptor CXCR4: their functions in development, hematopoiesis and HIV // Semin.1.munol. 1998. V. 10. № 3. P. 179-185.

132. Nagase H., Miyamasu M., Yamaguchi M., Fujisawa Т., Kawasaki H., Ohta K., Yamamoto K., Morita Y., Hirai K. Regulation of chemokine receptor expression in eosinophils // Int. Arch. Allergy Immunol. 2001. V. 125. P. 29-32.

133. Nakakuma H., Kawaguchi Т., Koito A., Hattori Т., Kagimoto Т., Takatsuki K. Inhibition of human immunodeficiency virus infection of human lymphocytes by gangliosides // J. Cancer Res. 1989. V. 80. № 8. P. 702-705.

134. National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, Division of AIDS. DAIDS Virology Manual for HIV Laboratories. Publication NIH-97-3828. Washington, DC: US Department of Health and Human Services. 1997. P. 78-89.

135. Nishimura S.I.,. Kai H., Shinada K. et al. Regioselective synthesis of sulfated ^ polysaccharides: Specific anti-HIV-1 activity of novel chitin sulfates // Charbohyd. Res.1998. V. 5. P. 427-433.

136. Onuffer J J., Horuk R. Chemokines, chemokine receptors and small-molecule antagonists: recent developments // Trends Pharmacol. Sci. 2002. V. 23. № 10. P. 459-467.

137. Pannecougue C., Fikkert V., Schols D. et al. Quaternary Ammonium Solts inhibiting HIV replication in vitro // Antivir. Res. 2000. V. 46. № 1. A43.

138. Patterson S., Rae A., Hockey N., Gilmour J., Gotch F. Plasmacytoid dendritic cells are highly susceptible to human immunodeficiency virus type 1 infection and release infectious virus//J. Virol. 2001. V. 75. № 14. P. 6710-6713.

139. Pauwels R., De Clercq E. Development of vaginal microbicides for the prevention of heterosexual transmission of HIV // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 1996. V. 11. № 3. P. 211-221.

140. Pelchen-Matthews A., Signoret N., Klasse P.J. et al. Chemokine receptor trafficking and viral replication// Immunol. Rev. 1999. V. 168. P. 33-49.

141. Picone D., Rivieccio A., Crescenzi O., Caliendo G., Santagada V., Perissutti E., Spisani S., Traniello S., Temussi P.A. Peptide T revisited: conformational mimicry of epitopes of anti-HIV proteins // J. Pept. Sci. 2001. V. 7. № 4. P. 197-207.

142. Polianova M.T., Ruscetti F.W., Pert C.B. et al. Antiviral and immunological benefits in HIV patients receiving intranasal peptide T (DAPTA) // Peptides. 2003. V. 24. № 7. P. 1093-1098.

143. Premanathan M., Kathiresan K., Yamamoto N., Nakashima H. In vitro anti-human immunodeficiency virus activity of polysaccharide from Rhizophora mucronata Poir // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. V. 63. №7. P. 1187-1191.

144. Proudfoot A.E., Buser R., Borlat F. et al. Amino-terminally modified RANTES analogues demonstrate differential effects on RANTES receptors // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 45. P. 32478-32485.

145. Puri A., Riley J.L., Kim D., Ritchey D.W., Hug P., Jernigan K., Rose P., Blumenthal R., Carroll R.G. Influenza virus upregulates CXCR4 expression in CD4+ cells // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 2000. V. 16. № 1. P. 19-25.

146. Reynes J., Rouzier R., Kanouni T. et al. SCH C: Safety and Antiviral Effects of a CCR5 Receptor Antagonist in HIV-1- Infected Subjects // 9th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2002. Seattle. USA. Abs. 1.

147. Rezaie P., Trillo-Pazos G., Everall I.P., Male D.K. Expression of beta-chemokines and chemokine receptors in human fetal astrocyte and microglial co-cultures: potential role of chemokines in the developing CNS // Glia. 2002. V. 37. № 1. P. 64-75.

148. Rimsky L.T., Shugars D.C., Matthews T.J. Determinants of human immunodeficiency virus type 1 resistance to gp41-derived inhibitory peptides // J. Virol. 1998. V. 72. № 2. P. 986-993.

149. Rizzuto C.D., VVyatt R., Hernandez-Ramos N., Sun Y., Kwong P.D., Hendrickson W.A., Sodroski J. A conserved HIV gpl20 glycoprotein structure involved in chemokine receptor binding // Science. 1998. V. 280. P. 1949-1953.

150. Rollins B.J. Chemokines // Blood. 1997. V. 90. № 3. P. 909-928.

151. Root M.J., Kay M.S., Kim P.S. Protein design of an HIV-1 entry inhibitor// Science. 2001. V. 291. P. 884-888.

152. Ross T.M., Cullen B.R. The ability of HIV type 1 to use CCR-3 as a coreceptor is controlled by envelope V1/V2 sequences acting in conjunction with a CCR-5 tropic V3 loop // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 7682-7686.

153. Ruff M.R., Melendez-Guerrero L.M., Yang Q.E., Ho W.Z., Mikovits J.W., Pert C.B., Ruscetti F.A. Peptide T inhibits HIV-1 infection mediated by the chemokine receptor-5 (CCR5) // Antiviral Res. 2001. V. 52. № 1. P. 63-75.

154. Rusconi S., Merrill D.P., La Seta Catamancio S. et al. In vitro inhibition of HIV-1 by Met-SDF-lbeta alone or in combination with antiretroviral drugs // Antivir. Ther. 2000. V. 5. № 3. P. 199-204.

155. Saccani A., Saccani S., Orlando S. et al. Redox regulation of chemokine receptor expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 6. P. 2761-2766.

156. Sakaida H., Hori Т., Yonezawa A. et al. T-tropic human immunodeficiency virus type 1 (HlV-l)-derived V3 loop peptides directly bind to CXCR-4 and inhibit T-tropic HIV-1 infection // J. Virol. 1998. V. 72. № 12. P. 9763-9770.

157. Samson M., Labbe O., Mollereau C., Vassart G., Parmentier M. Molecular cloning and functional expression of anew human CC-chemokine receptor gene // Biochemistry. 1996. V. 35. № 11. P. 3362-3367.

158. Sattentau Q.J., Moore J.P., Vignaux F., Traincard F., Poignard P. Conformational changes induced in the envelope glycoproteins of the human and simian immunodeficiency viruses by soluble receptor binding// J. Virol. 1993. V. 67. P. 7383-7393.

159. Schols D., Claes S., Hatse S. et al. Anti-HIV Activity Profile of AMD070, an Orally Bioavailable CXCR4 Antagonist H // 10th Conf. Retroviruses Opportunistic Infect. 2003. Boston. USA. Abs. 563.230231232233234235236237,238.239.240.241.242.243.244.

160. Schols D., Este J.A., Henson G., De Clercq E. Bicyclams, a class of potent anti-HIV agents, are targeted at the HIV coreceptor fusin/CXCR-4 // Antiviral. Res. 1997a. V. 35. № 3. P. 147-156.

161. Schols D., Struyf S., Van Damme J., Este J.A., Henson G., De Clercq E. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the chemokine receptor CXCR4 // J. Exp. Med. 1997b. V. 186. P. 1383-1388.

162. Secchiero P., Zella D., Barabitskaja O. et al. Progressive and persistent downregulation of surface CXCR4 in CD4(+) T cells infected with human herpesvirus 7 // Blood. 1998. V. 92 № 12. P. 4521-4528.

163. Serbin A.V. New anti-viral drug design for ecological security of people // Ecol. Congress Int. J. 1997. V. 1. № 2. P. 31-34.

164. Serbin A.V., Kasyan L.I., Burstein M.E. et al. Norbornene containing antivirals: synthesis and evaluation of new polyanionic derivatives // Antivir. Res. 1999. V. 41. № 2. P. 46.

165. Shalekoff S., Tiemessen C.T. Duration of Sample Storage Dramatically Alters Expression of the Human Immunodeficiency Virus Coreceptors CXCR4 and CCR5 // Clin. Diagnost. Lab. Immunol. 2001. V. 8. № 2. P. 432-436.

166. Shukla D., Liu J., Blaiklock P., Shworak N.W., Bai X., Esko J.D., Cohen G.H., Eisenberg R.J., Rosenberg R.D., Spear P.G. A novel role for 3-O-sulfated heparan sulfate in herpes simplex virus 1 entry//Cell. 1999. V. 99. № 1. P. 13-22.

167. Signoret N., Oldridge J., Pelchen-Matthews A. et al. Phorbol esters and SDF-1 induce rapid endocytosis and down modulation of the chemokine receptor CXCR4 // J. Cell Biol. 1997. V. 139. №3. p. 651-664.

168. Signoret N., Pelchen-Matthews A., Mack M., Proudfoot A.E., Marsh M. Endocytosis and recycling of the HIV coreceptor CCR5 // J. Cell Biol. 2000. V. 151. № 6. P. 1281-1294.

169. Simmons G., Reeves J.D., Hibbitts S., Stine J.T., Gray P.W., Proudfoot A.E., Clapham P.R. Co-receptor use by HIV and inhibition of HIV infection by chemokine receptor ligands // Immunol. Rev. 2000. V. 177. P. 112-126.

170. Stephenson J. Researchers Explore New Anti-HIV Agents // JAMA. 2002. V. 287. № 13. P. 1635-1637.

171. Szekely Z., Fabian P., Torday L.L. et al. Binding between the CD4 receptor and polysulfonated azo-dyes. An exploratory theoretical study on action-mechanism // J. Mol. Struct. (Theochem.) 1998. V. 423. P. 153-159.

172. Tamamura H., Hiramatsu K., Mizumoto M. et al. Enhancement of the T140-based pharmacophores leads to the development of more potent and bio- stable CXCR4 antagonists // Org. Biomol. Chem. 2003. V. 1. № 21. P. 3663-3669.

173. Tamamura H., Ishihara Т., Otaka A. et al. Analysis of the interaction of an anti-HIV « peptide, T22 (Tyr5,12, Lys7.-polyphemusin II), with gpl20 and CD4 by surface plasmonresonance // Biophim. Biophys. Acta. 1996. V. 1298. P. 37-44.

174. Tamamura H., Xu Y., Hattori T. et al. A low-molecular-weight inhibitor against the chemokine receptor CXCR4: a strong anti-HIV peptide T140 // Biochem. Biophys. Res. Comm. 1998b. V. 253. № 3. P. 877-882.

175. Tarasova N.I., Rice W.G., Michejda C.J. Inhibition of G-protein-coupled receptor function by disruption of transmembrane domain interactions // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 49. P. 34911-34915.

176. Thelen M., Dancing to the tune of chemokines // Nat. Immunol. 2001. V. 2. P. 129-134.

177. Timofeyev D.I., Perminova N.G., Kiseleva Ya.U., Serbin A.V., Timofeyev I.V. Membranotropic compounds new class of anti-HIV drugs // Works of an international seminar New technologies in medicine and ecology. Slovakia. 2002. P. 40.

178. Timofeyev I., Serbin A., Timofeyev D., Plyasunova O., Karpyshev N., Varaksin N,

179. Ryabicheva Т., Nekludov V., Kiseleva Y., Perminova N. Design of anti-HIV microbicides with inclusion of pharmacophore modifiers and pseudo-ligands // "Microbicides 2004" conference abstracts. London, 2004. Abs. 02656.

180. Townson J.R., Graham G.J., Landau N.R. et al. Aminooxypentane addition to the chemokine macrophage inflammatory protein-1 alpha P increases receptor affinities and HIV inhibition//J. Biol. Chem. 2000. V. 275. № 50. P. 39254-39261.

181. Trkola A., Ketas T.J., Nagashima K.A. et al. Potent, broad-spectrum inhibition of human immunodeficiency virus type 1 by the CCR5 monoclonal antibody PRO 140 // J. Virol. 2001. V. 75. №2. P. 579-588.

182. Trkola A., Kuhmann S.E., Strizki J.M. et al. HIV-1 escape from a small molecule, CCR5-specific entry inhibitor does not involve CXCR4 use // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. V. 99. № 1. P. 395-400.

183. Tscheming C., Alaeus A., Fredriksson R., Bjomdal A., Deng H., Littman D.R., Fenyo E.M., Albert J. Differences in chemokine coreceptor usage between genetic subtypes of HIV-1 //Virology. 1998. V. 241. №2. P. 181-188.

184. Ueki M., Watanabe S., Saitoh T. et al. Synthesis and chain length-anti-HIV activity relationship of fully N- and O-sulfated homooligomers of tyrosine // Bioorg. Med. Chem. 2001. V. 9. №2. P. 487-492.

185. Ugolini S. HIV-1 attachment: another look // Trends Microbiol. 1999. V. 7. № 4. P. 144149.

186. UNA IDS and WHO, AIDS Epidemic Update 2003. http://www.unaids.org/en/

187. Van Der Meer P., Goldberg S.H., Fung K.M., Sharer L.R., Gonzalez-Scarano F., Lavi E.

188. Expression pattern of CXCR3, CXCR4, and CCR3 chemokine receptors in the developinghuman brain// J. Neuropathol. Exp. Neurol. 2001. V. 60. № 1. P. 25-32.

189. Van der Meer P., Ulrich A.M., Gonzalez-Scarano F., Lavi E. Immunohistochemical analysis of CCR2, CCR3, CCR5, and CXCR4 in the human brain: potential mechanisms for HIV dementia // Exp. Mol. Pathol. 2000. V. 69. № 3. P. 192-201.

190. Vassiliadou N., Tucker L., Anderson D.J. Progesterone-induced inhibition of chemokine receptor expression on peripheral blood mononuclear cells correlates with reduced HIV-1infectability in vitro // J. Immunol. 1999. V. 162. № 12. P. 7510-7518.

191. Wang J., Guan E., Roderiquez G., Norcross M.A. Inhibition of CCR5 expression by 1L-12through induction of beta-chemokines in human T lymphocytes // J. Immunol. 1999. V. 163. № 11. P. 5763-5769.

192. Wang J., Harada A., Matsushita S. et al. 1L-4 and a glucocorticoid up-regulate CXCR4 expression on human CD4+ T lymphocytes and enhance HIV-1 replication // J. Leukoc. Biol. 1998b. V. 64. № 5. P. 642-649.

193. Wang J.F., Liu Z.Y., Groopman J.E. The alpha-chemokine receptor CXCR4 is expressed on the megakaryocyte lineage from progenitor to platelets and modulates migration and adhesion // Blood. 1998a. V. 92. № 3. P. 756-764.

194. Werner A., Winskowsky G., Kurth R. Soluble CD4 enhances simian immunodeficiency virus SIVagm infection // J. Virol. 1990. V. 64. № 12. P. 6252-6256.

195. Willoughby C.A., Berk S.C., Rosauer K.G. et al. Combinatorial synthesis of CCR5antagonists // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2001. V. 11. № 24. P. 3137-3141.

196. Wyatt R., Kwong P.D., Desjardins E., Sweet R.W., Robinson J., Hendrickson W.A., Sodroski J.G. The antigenic structure of the HIV gpl20 envelope glycoprotein // Nature. 1998. V. 393. № 6686. P. 705-711.

197. Xiao X.D., Wu L., Stantchev T.S., Feng Y.R., Ugolini S., Chen H., Shen Z., Riley J.L., Broder C.C., Sattentau Q.J., Dimitrov D.S. Constitutive cell surface association between CD4 and CCR// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. P. 7496-7501.

198. Yang A.G., Zhang X., Torti F., Chen S.Y. Anti-HIV type 1 activity of wild-type and functional defective RANTES intrakine in primary human lymphocytes // Hum. Gene Ther. 1998. V. 9. № 14. P. 2005-2018.

199. Yang J., Liu C. Molecular modeling on human CCR5 receptors and complex with CD4 antigens and HIV-1 envelope glycoprotein gpl20 // Acta Pharmacol. Sin. 2000. V. 21. № LP. 29-34.

200. Zaitseva M., Peden K., Golding H. HIV coreceptors: role of structure, posttranslational modifications, and internalization in viral-cell fusion and as targets for entry inhibitors // Biochem. Biophys. Acta. 2003. V. 1614. P. 51-61.

201. Zaneveld L.J., Waller D.P., Anderson R.A. et al. Efficacy and safety of a new vaginal contraceptive antimicrobial formulation containing high molecular weight poly(sodium 4-styrenesulfonate) // Biol. Reprod. 2002. V. 66. № 4. P. 886-894.

202. Zang Y.C., Haider J.B., Samanta A.K., Hong J., Rivera V.M., Zhang J.Z. Regulation of chemokine receptor CCR5 and production of RANTES and MIP-1 alpha by interferon-beta //J. Neuroimmunol. 2001. V. 112.№ .-2. P. 174-180.

203. Zanussi S., Simonelli C., Bortolin M.T. et.al. Dynamics of provirus load and lymphocyte subsets after interleukin 2 treatment in HIV-infected patients // AIDS Res. Hum. Retroviruses. 1999. V. 15. № 2. P. 97-103.

204. Zhang Y.J., Moore J.P. Will multiple coreceptors need to be targeted by inhibitors of human immunodeficiency virus type 1 entry? // J. Virol. 1999 V. 73. № 4. P. 3443-3448.

205. Zhou N., Luo Z., Hall J.W., Luo J., Han X., Huang Z. Molecular modeling and site-directed mutagenesis of CCR5 reveal residues critical for chemokine binding and signal transduction// Eur. J. Immunol. 2000. V. 30. № 1. P. 164-173.

Информация о работе

Тимофеев, Денис Игоревич
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Изучение анти-ВИЧ активности новых комплексных мембранотропных соединений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы