Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменение свойств хроматина лимфоцитов периферической крови человека под воздействием облучения He-Ne лазером

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение свойств хроматина лимфоцитов периферической крови человека под воздействием облучения He-Ne лазером"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ ЮЛЕКУЛЯРЮЙ ЕЮЛОГИИ иы. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

На правах рукописи

СМОЛЬЯНИЮВА Надежда Константиновна

УДК 577.391, 547.963.3, 621.375.8.

ИЗМЕНЕНИЕ СВОЙСТВ ХРОМАТИНА ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ЮД ВОЗДЕЙСТВИЕМ ОБЛУЧЕНИЯ Не-Не ЛАЗЕРОМ

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1991

Работа выполнена в Лаборатории функциональной морфологии хромосом Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор А.В.Зеленин доктор физико-математических наук Т.Й.Кару

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А.А.Кущ

кандидат физико-математических наук А.И.Полетаев

Ведущая организация: МГУ им.М.В.Ломоносова

Защита состоится в '((? ^ часов на заседании Специализированного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ С1ШЩШШЗИРОВАШОГО СОВЕТА кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАКШ

Актуальность проблемы. Одной из важнейших проблем современной биологии является изучение механизма активации пролиферации неделящихся клеток под воздействием специфических и неспецифических факторов. К числу таких факторов, могущих вызвать пролиферацию клеток, в последнее время стали относить излучение Не-Ие лазера. Это излучение используют в клинике для лечения трофических язв и долго незаживающих ран. В литературе имеются некоторые сведения о стимулирующем влиянии облучения на ряд клеточных процессов. Наиболее четко такое влияние было продемонстрировано на примере дрожжевых клеток (Федосеева и др., 1986). Имеются данные о стимуляции пролиферативных процессов и некоторых животных клеток. Однако нам не известны работы, в которых было бы детально изучено действие лазерного облучения на неделящиеся клетки, хотя некоторые данные в этом отношении имеются. Так, например, показано, что облучение Не-я.е лазером оказывает стимулирующее действие на ряд иммунологических свойств лимфоцитов (Гамалея и др., 1983, Трапезников и др., 1984). В то ке время стимуляции пролиферации этих клеток под воздействием лазерного облучения обнаружено не было (Ыеуегв еи а1., 1987).

Малые лимфоциты периферической крови здорового взрослого человека являются классической моделью неделящихся клеток. На •их долю приходятся 90# от всех содержащихся в крови человека лимфоцитов (Елисеев, 1983). При стимуляции их определенными ми-тогенами (например, фитогемагглютиняном) наблюдается выход большей части популяции из стадии покоя, продвижение по циклу, вступление в фазу синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты и митоз.

Представлялось' интересным изучить изменение свойств облученных лимфоцитов с помощью комплекса методов, используемых при исследовании свойств активированного хроматина, и сравнить с результатами, полученными при стимуляции лимфоцитов фитогемаг-глютинином.

Цель и задачи работы.

Во-первых, исследовать связывание хроматина облученных лимфоцитов с низкомолекулярным лигандом - акридиновым оранжевым, а также подробно изучить кинетику связывания этого лиганда в течение шести часов после воздействия.

Во-вторых, изучить матричную активность хроматина клеток

по включению меченого предшественника рибонуклеиновой кислоты -14С-уридина - в течение первых 12 часов после облучения.

В-третьих, посмотреть, изменяется ли содержание свободного внутриклеточного кальция в первые минуты после облучения, так как в этот период наблюдается резкий подъем в.содержании этого иона под воздействием митогена ( Копаda, 1989).

В-четвертых, детально изучить в течение длительного промежутка времени (одной недели) уровень включения за каждые сутки меченого предшественника дезоксирибонуклеиновой кислоты - тимиди-на-в облученные лимфоциты.

В-пятых, определить чувствительность облученных лимфоцитов к интерлеЙкину-2, являющемуся фактором роста активированных Т-лимфоцитов.

Научная новизна и практическая ценность.

Впервые подробно были исследованы некоторые свойства хроматина облученных- лимфоцитов на протяжении нескольких дней.

Было показано, что облучение Не-Не лазером вызывает усиление связывания хроматина с акридиновым оранжевым в интервале доз 28-112 Дж/м^ с максимальным эффектом при дозе 56 Дк/м? Поэтому с помощью теста на связывание хроматина с АО можно определить оптимальную дозу облучения суспензии лимфоцитов ( in vitro). Найденная таким способом оптимальная доза облучения Д=56 Дж/м^ способна вызвать в лимфоцитах события, аналогичные тем, которые происходят в процессе активации лимфоцитов при действии на них фитогемагглютинина. К ним относится кратковременное повышение концентрации свободного внутриклеточного кальция в первые минуты после облучения, а также кинетики связывания акридинового оранжевого с хроматином в течение первых 6 часов и включения ^^С-ури-дина. Однако в более поздние часы установлены отличия в свойствах хроматина облученных и митоген/стимулированных лимфоцитов. Во-первых, у облученных лимфоцитов it 12 часам нет резкого подъема включения *\!-уридина, характерного для митоген/стимулированннх клеток. Во-вторых, отсутствие синтеза дезоксирибонуклеиновой кислоты наблюдалось только в облученных клетках. В-третьих, чувствительность облученных клеток к интерлейнину-2 не отличалась от интактннх лимфоцитов. Показано потенциирущее действие облучения на бласттрасформацию лимфоцитов, вызванную фитогемагглютини-ном. Кроме того-, свойство излучения Не-де лазера позволяет пред. ложить объяснение механизма лечебното эффекта этого излучения

Не-дае лазера. Результаты работы могут послужить основой для разработки методов подбора доз облучения дри лазерной терапии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 1У Всесоюзной школе "Применение лазеров в биологии" (Кишинев, 1986г.'); на 2-ом Европейском фотобиологическом конгрессе (Падуя, 1987г.); на Всесоюзной конференции "Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь" (Киев, 1989г.); на 9-ом Всесоюзном семинаре "Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине" (Тарту, 1990 г.); на семинаре Отдела анатомии Медицинской школы штата Луизиана, Новый Орлеан (США, 1991 г.).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и описка цитируемой литературы. В списке литературы ¿С? наименований, из них иностранных источника. Работа содержит {Оо страниц, включая 8- рисунков и 7

таблиц.

Сокращения:

ФГА - фитогемагглшинин

АО - акридиновый оранжевый

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

рйЛ-2 - рекомбинантный интерлейкин-2

ЖВР - забуференный физиологический раствор

ТХУ - тряхлоруксусная кислота

дмсо - даметилсульфоксид

ппо - 2,5-дифенилоксазол

долоп - 1,4-бис-Г2-(5-фенилоксазолил)] -бензол

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I. ёцдзлезчэ, ддойгадуов.

Малые мононуклеаряые клетки (лимфоциты + моноциты) выделяли из периферической крови здоровых доноров мужского пола в градиенте плотности фиколл-верографина (J> = 1,077 г/см3) при комнатной температуре. В качестве антикоагулянта был' использован 3,8$ раствор цитрата натрия в соотношении 1:5. Выделение производили в стерильных условиях. Для этого в центрифужные пробирки (7 =10 мл) вносили по.2 мл смеси фиколл-верографина, на которую наслаивали 6,5 мл крови, содержащей 1,5 мл ЗФР (120 мМ Had, 14 мМ Н agHPO.^,

2,64 мМ КН2К)41 рН=7,2-7,4). Центрифугировали в течение 35 минут при 450й в центрифуге Т-23. Белый слой мононуклеаров собирали пастеровской пипеткой, затем двавды отмывали ЗФР при 200 е в течение 20 минут и 10 минут соответственно. Полученный осадок ресуспендироваля в культуральной среде 199, в которую была добавлена (5$ от общего объема) инактивированная в течение 40 минут при 56°С аутологичная сыворотка 1У группы крови и антибиотики: стрептомицин и ценициллин - по 75 ед/мя каждого. Подсчет клеток в камере Горяева показал, что на долю лимфоцитов приходятся 90$ от всех клеток.

После выделения суспензию клеток инкубировали при 37°С в течение 1,5-2 часов.

2. Облучение клеточной р.у.ддедзии

0,5 мл суспензии клеток (7,5 х Ю5 кл/мл) наносили на чистые покровные стекла стандартного веса, находящиеся в лунках

30 мм) тефлоновых брусков, затем облучали. Облучение производили с помощью Н&&© лазера ДГ-75 или ЛГ-52. мощностью 6 мВт на выходе. Луч от источника был расфокусирован при помощи короткофокусной положительной линзы до диаметра 30 мм. Плотность мощности светового потока на уровне образца равнялась 6 _Вт/м*\

3. Определение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток определяли с помощью теста исключения триланового синего. Окрашивание клеточной суспензии проводили в пробирке 0,2$ раствором грипанового синего в соотношении 7 кл. : .V краски = 1:1. Каплю окрашенной суспензии вносили в камеру Горяева, где подсчитывали не менее 100 клеток. Жизнеспособные клетки составляли 95$.

Затем облученные клетки наряду с интактными и стимулированными ФГА инкубировали при 37°С в С0£ термостате. Временной интервал инкубации зависел от целей опыта.

4. Окрашивание лимсЬолитов АО и изменение интенсивности Флуоресценции

Препараты готовили по методу Риглера в модификации, принятой в Лаборатории функциональной морфологии хромосом (Колесников и др., 1973 г.). Клетки фиксировали в смеси этанол (100°):ацеток (100°) = 1:1 в течение 12-14 часов при 4°С, после чего исследуемые клетки проводили по растворам этанола: 100°, 96°, 60 , 30 -

по 5 минут в каждом, промывали в дистиллированной воде (3 мин) и ацетатном буфере (63 мМ СН3С0Ш, 37 мМ СН3С0СГа, ¡41=4,4) в течение 5 минут, далее стекла с клетками помещали в раствор АО (Ю-4 мМ) на 15 минут, после чего проводили отмывку в трех сменах раствора АО (2 х Ю-6 мМ) в ацетатном буфере (рН=4,4) по 5 мин. в каждом. Готовые препараты заключали в каплю этого же раствора. Связывание АО с хроматином определяли измерением интенсивности (флуоресценции А0-ДНК(1530) с помощью зондового цитофлюориметра (Бабаджанян и др.', 1976 г.). Параллельно проводили опыты с использованием митогена ФГА ("Wellcome" или 'Eifco ") в концентра-.ции 4 мкг/мл или 2 мкг/мл соответственно. Данные по связыванию представляют собой относительную величину интенсивности флуоресценции .комплексов АО-ДНК опытных клеток к интактным.

5. Определение матричной активности хроматирд

Активацию синтеза РНК оценивали по уровню включения ^С-ури-дина в кислотонерастворимую внутриклеточную фракцию.

Клетки инкубировали в 24-луночных пластиковых плейтах в С0о термостате при 37 С. В кавдую лунку помещали I мл суспензии, содержащей Ю6 клеток, затем облучали. В контрольных опытах ФГА добавляли непосредственно в пробирку с клеточной суспензией, которую потом переносили в лунки плейга. В разные сроки после воздействия (облучение или ФГА) в каждую лунку вносили ^С-уридин (3 мкКи/мл, уд.акт. 54 мКи/мМ) и инкубировали еще 40 минут в тех же условиях. Затем ллейты помещали в ледяную баню. Клетки переносили на мембранные фильтры (Синпор, ¿ = 0,2-0,4 мкм)промывали холодным ЗФР и 7% раствором ТХУ, потом фиксировали 100° этанолом и высушивали на воздухе (Остерман, 1983г.). Радиоактивность подсчитывали в толуоловом сцянтилляторе (100 мл толуола + 333 мл Тритона X-I0Q + 4 г ППО + 0,1 г ПОПОП) на приборе " Intertechnique SL " (Франция).

6. Определение свободного внутриклеточного кальция

Клеточная суспензия ,(0,5 х I08 кл/W), приготовленная на основе солевого раствора (145 мМНаС1, 5 мМ KCI, I мМ На2НР04, I Ш СаС12, 0,5 мМ №0О4, 5 Л глюкозы, 10 М Hep es, рН=7,6), была смешана с матричным раствором кальциевого ионофора квин-2АМ (20 мМ в ДМСО) до конечной концентрации красителя 10 мМ. Затем эту смесь инкубировали в течение 60 минут при 37°С в темноте согласно методике (ff atinan et al.,1988 г.). Затем клетки были

осаждены с помощью центрифугирования при 400g в течение 10 минут , а затем дважды промыты подогретым солевым раствором (37°С) при 200g в течение 10 минут. Осадок был ресуспендирован в этом же теплом солевом растворе до концентрации 7хЮ6 кл/мл, Готовые образцы содержали при 37®С в темноте до регистрации флуоресценции на спектрофотометре. Возбуждение флуорохрома происходило при облучении образца светом Л=339 нм, а эмиссия при Л=492 нм. Облучение клеток He-ire лазером проводили в кюветах. ФГА также добавляли непосредственно в юоветы (2 мкг/мл ) . Флуоресценцию регистрировали в течение первых 6 минут после воздействия. Концентрацию свободаого внутриклеточного кальция вычисляли по формуле:

Са+^=----------'х 115 нМ, где Ш - измеренная флуоресценция экспе-

Ф мак,- Ф

риментального образца. Максимальная флуоресценция была определена путем лизиса клеток Тритоном Х-100 (0,5%) . Минимальную флуоресценцию получали после добавления 15 мМ раствора триса, который имел рН=8,0.

7. Определение включения меченого тимидина в облученные

лимфоциты

Для исследования синтеза ДНК выделенные клетки инкубировали во флаконах с резиновыми пробками в концентрации 2 х 10 клеток в 3 мл среды в термостате при 37°С в течение 72 часов. Облучение производили через отверстие флакона в условиях, описанных выие. Меченый предшественник, которым был либо -^-тимидин (удел. акт. 54 мКи/мМ) , либо 3Н-тимидин Гудел, акт. 2,5 Ки/мЮ , вносили или за сутки (1 мкКи/мл] или за 4 часа (3 мкКи/мл) до окончания срока инкубации. Последующую обработку клеток для изучения юс радиоактивности проводили по стандартной методике с использованием толуолового сцинтиллятора.

При исследовании совместного действия облучения и ФГА последний добавляли сразу же после облучения, причем величина дозы ФГА варьировала от 0,5 мкг/мл до 4-мкг/мл.

8. Определение-чувствительности облученных и стимулированных <$РА клеток к интерлейкину-2

РекомбинантннЯ Ш1-2 ("Биоген") использовали в концентрации 150 ME/мл. Изучали следующие образцы клеток: интактные, интакт-ные с добавлением рИЛ-2, стимулированные ФГА (2 мкг/мл)в течение всего срока инкубации (72 часа) , стимулированные ФГА в тече-

ние 45 минут с последующим отмыванием 199 средой, стимулированные ФГА в течение 45 минут с последующим отмыванием 199 средой и добавлением рИЛ-2, облученные в присутствии рИЛ-2, облученные (Д = 7-745 Дд/м2). Эффект действия рШГ-2 оценивали по включению в клетки меченого тимидана.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I, Действие Не-уе ладана на связывание АО с хроматином

I.I. Лозовая зависимость

В первой серии опытов изучали связывание АО с хроматином облученных лимфоцитов. Для этого за 45 минут до фиксации клетки облучали Не-и'е лазером в дозах, выбранных произвольно, но с ориентацией на литературные данные, или обрабатывали.ФГА (4 мкг/мл). Выбор этого срока инкубации клеток после действия на них света или митогена обусловлен тем, что,как было показано ранее, к этому сроку наступает существенное возрастание связывания АО с хроматином лимфоцитов при действии на них ФГА (Мантей-фель и др., 1982г.). На рис.1 и в табл.1 представлена подученная в этих опытах зависимость доступности ДНК хроматика для АО от дозы света.

Таблица I

Интенсивность связывания АО с хроматином облученных лимфоцитов в зависимости от дозы света

Интактные i Лазер, о-. Лазер, о) Лазер 9) Лазер Лазер , 9 клетки ] 28 ДяЛп 42 дЯДг; 56 Дж/м} 86 Дд/м | 112 ДжДг

I ± 0,4 1,42*0,12 56+0,13 1,82*0,1 1,39+0,11 1,41+0,08

Видно, что при увеличении дозы облучения от 28 до 56 Дж/м2 связывание красителя с хроматином достоверно возрастает. При дальнейшем увеличении дозы света наблюдается сникение связывания АО хроматином. Такой характер дозовой кривой свидетельствует о существовании специфического воздействия света Не-ЛТе лазера на лимфоциты в относительно узком интервале доз. Во всех последующих опытах лимфоциты облучали светом в дозе Д=56 Дж/м^, которая соответствует максимуму на дозовой кривой.

Возрастание связывания АО с хроматином обычно расценивает-

Доза, Дж/м2

Рис Л. Зависимость связывания хроматина с АО от дозы облучения лимфоцитов Не-Не лазером.

ся как повышение его матричной активности. Однако, прежде чем сделать такое заключение в отношении облученных лимфоцитов, необходимо рассмотреть возможность того, что повышение связывания АО с хроматином обусловлено не его активацией, а радиационным повреждением (деаротеинизацией) хроматина. Нижеследующие факты позволяют отбросить это предположение.

Во-первых, кривая связывания АО с хроматином с возрастанием дозы сначала имеет подъем (лик кривой соответствует дозе 56 Дж/м2), а дотом падает. Если бы э#ект был вызван разрушающим действием облучения на ядра, то с увеличением дозы облучения связывание АО пропорционально возрастало бы.

Во-вторых, с помощью теста на жизнеспособность клеток не было' обнаружено сколько-нибудь значительной гибели клеток после облучения: на долю живых приходилось до 95$ от общего количества лимфоцитов.

В-третьих, эксперименты по включению предшественников синтеза нуклеиновых кислот показали, что после лазерного, облучения эта способность клеток сохраняется, а в ряде случаев даже. усиливается.

В-четвертых, облученные клетки нормально реагируют на сти-

мулирующее действие ФГк.

Все это дает основание считать, что повышение связывания АО после облучения клеток действительно является следствием активации хроматина.

2. Изменение концентрации свободного внутриклдуочдогр ШШШ

Исследования показали, что в течение первых 6 минут после облучения суспензии лимфоцитов наблюдается скачкообразное изменение концентрации свободного внутриклеточного кальция (рис.2). Кривая J6 I опыта I доказывает, что через 2 минуты после облучения концентрация кальция резко возрастает (в 5'раз) по сравнению с исходным уровнем. Этот подъем сменяется падением, достигая к 3 минутам стимуляции исходного уровня. Аналогичные результаты были получены в двух других опытах: № 2, № 3. Однако обнаружены индивидуальные различия как в отношении исходного уровня концентрации свободного внутриклеточного кальция, так и величине ее подъема через 2 минуты после облучения (в опытах № 2, № 3 лишь в два раза). Аналогичная картина бьша получена я для лимфоцитов, стимулированных ФГА (рис.2, кривая 2, опыты Ji I, № 2, № 3). Однако в этом случае концентрация свободного внутриклеточного кальция во всех трех опытах увеличивалась не более, чем в два раза. Впрочем, есть сведения, что и ФГА способен вызывать увеличение содержания в лимфоцитах свободного кальция более, чем в два раза (Hesketb et ei.t 1987).

Полученные результаты по изменению содержания свободного внутриклеточного кальция в первые шесть минут после облучения или после действия ФРА обнаружили близкое сходство в ответе клеток на эти факторы (табл.2). Совпадение пиков по. времени позволяет предположить, что в обоих случаях клеточная реакция однотипна. По-видимому, она осуществляется как за счет потоков ионов из внеклеточной среды, через кальциевые каналы клеточной мембраны, так и за счет внутриклеточного пула ионов^кальция, прежде всего из митохондрий ( Hesketh et al,, 1987).

айн.

мин.

Рис.2. Содержание свободного внутриклеточного кальция в облученных и ФГА/стимулированных лимфоцитах

Таблица 2

Содержание свободного внутриклеточного кальция в лимфоцитах при' действии ФГА или после облучения Не-Ке лазером

т пп f 2 минуты ! 3 минуты j 6 минут

1 • г j контрj ФГА ¡лазер !конт|ФГА |лазер •конт. '! ФГА i i ; лазер

I П ш. 124,2 135 .129 254 297 263 622,2 319 270 125 195 81,6 137 20Ö 121 123 173 115 122 131 122 150 133 132 92 129 119

3. Кинетика связывания ДО о хроматином облученных клеток

В этой серии опытов изучали зависимость изменения доступности хроматина к АО от времени, прошедшего с момента облучения лимфоцитов. Параллельно проводили аналогичные эксперименты с клетками, стимулированными ФГА. Результаты нескольких опытов представлены графически в виде кривых, в которых каждая точка соответствует среднему значению 50-60 измерений, выраженных в процентном отношении к необлученным клеткам того же образца крови (рис.-З). Как видно, изменение исследуемого связывания АО хроматином в ответ на облучение или обработку ФГА зависит от времени, прошедшего после воздействия указанных факторов на клетки. Обе кривые имеют сходную форму: в первые 45-90 минут наблюдается увеличение связывания лиганда с ДНК на 80-90$, затем доступность ДНК к лиганду падает, достигая контрольного уровня через 3-4 часа после воздействия. Но ка 5-ом часу стимуляции снова наблкдается увеличение связывания лиганда с ДНК, которое к 6 часам превышает контрольное значение приблизительно на 50$. Однако имеются и некоторые различия между этими кривыми. Во-первых, максимум связывания АО хроматином достигался после облучения раньше (через I час), чем при действии ФГА (через 1,5 часа). Во-вторых, величина пика на кривой связывания АО облученными клетками меньше, чем лимфоцитов, стимулированных ФГА (разница составляла примерно.20$). В-третьих, связывание АО достигает своего минимума у облученных .лимфсштов через 4 часа после воздействия, т.е. на I час позднее, чем при действии ФГА. Но к 6 часам связывание АО хроматином как после облучения, так

Рис.3. Кинетика связывания хроматина лимфоцитов с АО досле облучения Не-Я е лазером или действии ФГА. I - после облучения, 2 - при действии ФГА.

и при действии ФГА совпадают, превышая контрольный уровень примерно на 5055 (табл.3). Эти результаты согласуются с ранее полученными данными по связыванию АО хроматином лимфоцитов периферической крови крыс в результате воздействия ФГА, гепато-цитов в результате частичной гепатэктомии и других типов клеток (Зеленин, Кущ, 1985).

По-видимому, волновой характер кривой связывания АО хроматином после облучения объясняется теми же самыми событиями, которые происходят и в раннем пререпликативном периоде при активации лимфоцитов митогенами, а именно: ослаблением связей ДНК. с гистонами, в результате чего наблюдается деконденсация хроматина, степень которой изменяется во времени. В ходе процесса де-конденсации повышается уровень матричного синтеза РНК, характерного для позднего пререпликативного периода и связанного, с подготовкой клеток к вступлению в фазу синтеза ДНК,

Таблица 3.

Кинетика связывания АО с хроматином облученных и стимулированных ФГА лимфоцитов

Время Лазер ФГА

45 мин 1,82 + 0,1 1,9 + . 0,15

1,5 часа 1,67 + 0,15 1,97 + 0,04

2,5 часа 1,48 + 0,1 1,62 + 0,11

3 часа 1,18 + 0,04 1,04 + 0,08

4 часа 1,09 + 0,05 1,27 + 0,025

5 часов ч 1,18 + 0,02 1,13 + 0,02

6 часов 1,48 + 0,03 1,48 + 0,03

4. Включение -уридина

В следующей серии экспериментов было получено прямое доказательство повышения матричной активности хроматина в облученных клетках. На рис.4 и в табл. 4 представлены средние данные нескольких опытов по включению ^ чЗ-уриднна в кисло тонераствори-мую внутриклеточную фракцию лимфоцитов в разные сроки после облучения или добавления ФГА. Каждая точка на рис. 4 представляв ет. собой объединенные-результаты двух или трех опытов.-Ив рис.4 видно, что в обоих случаях лазерное облучение и ФГА в первые полтора-два часа после воздействия происходив увеличение включения ^С-уридина, затем уровень включения предшественника снижается до контрольного значения к 3-4 часам после лазерного облучения или добавления ФГА. Далее наступает повторное усиление включения ^С-уридина с максимумами в 5 часов, которое сменяется падёниеы к 7 часам. Эти данные наряду с электронно-микроскопическими данными других .авторов, полученными для этой же модели клеток (Мантейфель и др., 1990г.) свидетельствуют о том, что Не-Ие облучение приводит к усилению синтеза РНК.

Рис.4. Включение ^С-уридина в лимфоциты.

I - после облучения, 2 - при действии ФГА.

Га блица 4

Включение ^-уридина в лимфоциты

часы Лазер ФГА

40 минут 115,66 + 6,18 117,9+4,05

Г час 119,6 +~4,8 125,46 + 8,56

2 часа 166,7 + 6,73 192,5.+""7,1

3 часа П2,29~+ 1,55 117,6+4,5

3,5 часа 98 + 3,5 104 4,1

4 часа И0Т4 ¿3,65 105,88 + 4,31

5 часов 136,1 + 4,75 165,9 +~6,44

6 часов 116,68"+ 6,04 149,9 + 10,13

7 часов 100,5 +~2,83 117,3 + 2,84

8 часов 94,6 +~~2,64 118,7 + 2,12

9 часов 93,1 + 2,3 127,76~+ 5,71

10 часов 95,5 7 3,45 123,38 + 4,55

12 часов- 116,57 + 4,99 231,3 +~9,86

5. Включение тимидина

В этой серии экспериментов были получены данные по включению ■^С-тимидина в облученные клетки. Результаты исследований показали, что облучение лимфоцитов. Не-не лазером не приводит к стимуляции синтеза ДНК в ядрах лимфоцитов, так как включение меченого теми дина в. изученные сроки (2-8 суток,) оставалось на контрольном уровне (рис.5) . В параллельных опытах с обработкой лимфоцитов ФГА в дозе 2 мкг/мл была получена значительная (в 80-130 раз) сти-муляциявключения в клетки меченого тимидина на вторые й третьи сутки после добавления митогена (табл.5).

Таблица 5

Кинетика включения -тимидина

Сутки Контроль Лазер ФГА

2 I + 0,09 0,8 + 0,05 83 + 9,1

3 I + 0,08 1,2 + 0,08 130,1 + 8

4 I + 0,09 1,1 + 0,09 -

5 I + 0,1 1,2 + 0,09 -

8 I + "0,08 1,1 + 0,08 -

14О

120 -100 80 6040200

Зключение [ С]-тимиЗина

Дни

□

иитоютыа

I лазер ЕВ ФГА

Рис.5. Кинетика включения ^с-тимидина в лимфоциты.

6. Воздействие интерлейкина-2 на вюшчение ^Н-тимидина

Экспериментальные данные по изучению чувствительности облученных ,-•крапиввременно стимулированных (45 минут) ФГА и интакт-ных клеток сведены в таблицу (т&бяг&), На рис.6 графически представлены результаты одного наиболее характерного опыта. Из табл.6 видно, что интактные клетки, находившиеся в среде с рИЛ-2 в течение трех суток, к концу срока инкубации дали лишь незначительное превышение уровням включения ^Н-тимидина по сравнению с таковым в штатных клетках в отсутствии рИЛ-2. Клетки,, содержавшиеся в среде с. ФГА-в течение лишь первых 45 минут трехдневного срока инкубации, обладали уровнем.включения %-тимидина, близким к таковому для интактннх клеток, находившихся.на протяжении всего срока инкубации в среде с. рИЛ-2, Судя по результатам, такая краткосрочная инкубация-клеток с $ГА или- присутствие в среде рИЛ-2 дают лишь невысокий уровень бласттрасформации. В то же время лимфоциты, которые сначала находились в среде с ФГА в течение 45 минут, а потом были-перенесены в среду с рИЯ-2, имели уровень включения, сравнимый с таковым тех клеток, которые содержались с ФГА в течение всего срока инкубации (табл.6j, ¿агртя последние все же имели несколько более высокий уровень включения меченого тимидина. Такая краткосрочная инкубация клеток с ФГА необходима, чтобы в них

СРМ

ЕЭ ишятше СШ I . 1 «ГА <4$ мин) ВВ «ГА (45 минНрИА-2

ЕШО <ГА (3 Ом) О лазер 119 рИЛ-г+ламр

Рис.6 Чувствительность .лимфоцитов к рИЛ-2 после облучения Не-^е лазером или стимуляции ФГА.

произошли события, сделавшие их компетентными к действию рйЛ-2. Уровень включения Т1-ттзд1Ша в облученные лимфоциты в отсутствии т£1Л-2 сравним лишь с таковш контрольных клеток, инкубированных в среде 199 без каких-^либо воздействий. Облученные же лимфоциты в присутствии рМЛ-2 сохранили чувствительность к нему, сравнимую лишь с интактными клетками при наличии в их среде хМЛ-2. Такие же результаты были получены для широкого интервала доз, которыми часто пользуются другие исследователи, а также в медицинской практике.

Полученные результаты помогают объяснить одну из возможных причин отсутствия бласттрансформацш у облученных лимфоцитов. Дело в том, что процесс активации лимфоцитов многоступенчат, и на каком-то его этапе может произойти по ряду причин остановка прода-н-жения клеток по циклу. Одним из главных моментов прохождения , клеток по циклу является переход из ранней стадии фазы в позднюю, что, по мнению ряда авторов фахаугОЛе^са еъ а!., 1980 ) ( определяется уровнем матричной.активности хроматина. Поскольку уровень матричной активности хроматина лимфоцитов в первые часы стимуляции связан с экспрессией ряда генов, го можно полагать, что именно недостаточный уровень экспрессии или полное ее отсутствие какого-то одного или нескольких генов в облученных лимфоцитах объясняет неспособность клеток синтезировать ДНК. К числу таких необходимых продуктов генной экспрессии относятся фактор роста Т-лимфоцитов

Табл.6. Анализ чувствительности лимфоцитов к ¡Щ-2 (150 МЕ/ыл) после облучения или стимуляции ФГА (2 мнг/мл)

! № !. !

Конг

пуль

Стимуляпця клеток^$ГА

. ! интактше интакт. ! g OVTOK } дк мин I 45 ин. j j метки jVji.+iMJI-2j d суток } 40 мин'{ +рИЛ-2

I

Облучение клеток Не-Не лазагюм

5€ Дя/м2 iрШ-2+ , 9!рИЛ-2+9!рИЛ-2+ ! ГЙЛ-2+ 9 '+56 Дда/м^|+7Дж/м^{+112й1/м2{745 ДжАГ

I 1±0,2 9.89t ±1.21 168,77t ±11.1 9,39t t 0,75 85,09t ±cofi I0;2Sjt ±P,79 5,03t ±1,18 8,4± 4,75t ±1,27 ±0,85

П 1±0,09 4,66± ± 0,35 17,461 ± 3,35 4,5t ¿0,62 16,63t ± 3,1 2,84t ±0,23 -

Ш 1±0,1 6,4i ¿0,39 205,87t ±ß,26 - 1+0,1 7,28t ±P,63 - _

я

Q)

S к а>

PQ

Инлекс мечения ^-ттшдина = орд кл|' °инт|

Даны средние значения каждой серии опытов ± абсолютная ошибка среднего значения.

ИЛ-2 и его рецептор на клеточной мембране.

Известно, что лимфоциты, активированные митогеном, например ФГА в течение I часа (Watman, 1968) или Кон А в течение 30 минут (Bourguiguoa et al.,I9S3) , приобретают повышенную, по сравнению с интактными клетками, чувствительность к экзогенному ИЛ-2. Это делает.клетки способными возобновить репликацию ДНК и вступить- в митоз. Было показано, что это связано с появлением на клеточной мембране необходимого количества рецепторов для рИЛ-2. Аналогичные результаты были получены и при электростимуляции лимфоцитов. Поскольку ряд ранних внутриклеточных событий после лазерного облучения лимфоцитов протекает подобно стимуляции ФГА, можно было ожидать, что облучение сделает эти клетки компетентными к рИЛ-2. Однако' результаты показали, что лазерное облучение не делало лимфоциты чувствительными к рИЛ-2,

Считается, что бласттрансформация лимфоцитов происходит при соблюдении, по крайней мере, трех условий:.I. Необходимая плотность поверхностных рецепторов для ИЛ-2; 2. Оптимальная концентрация ИЛ-2 эндогенного или экзогенного происхождения; 3. Достаточное время взаимодействия ИЛ-2 с его рецепторами. Так как последние два условия в наших опытах были соблюдены, то остается предположить, что отсутствие бластгрансформации облученных лимфоцитов объясняется недостаточной.плотностью поверхностных рецепторов для ИЛ-2 или их отсутствием.

7. Совместное действие облучения и ФГА на включение ^Н-тимидина В заключительной серии опытов было изучено совместное действие облучения He-ire лазером и ФГА на включение меченого предшественника ДНК - Зн-тимидина. Для этого сразу же после облучения серии образцов примерно через 30 минут дозой 56 Дж/м^в сре'ду вносили ФГА. ФГА использовали в разных концентрациях: 0,5 мкг/мл, I мкг/мл, 2 мкг/мл, 4 цкг/m. В каждом опыте использовали лишь 2-3 дозы ФГА. Среди них обязательно была оптимальная доза 2 мкг/мл,

о

которая вызывала максимальный эффект включения Н-тимидина. После добавления ФГА клеточную суспензию инкубировали при 37°С в течение трех суток.

Результаты шести опытов (табл.7)показали,, что во всех рассмотренных здесь случаях совместного действия облучением Не-Не лазером и ФГА происходило усиление включения меченого тимидина в ДНК по сравнению со стимуляцией ФГА в соответствующей концентрации.

Таблица ?

Включение "^н-тимидана при комбинированном действии облучения Не—N е лазером (Д=56 Да/м2) и ФГА

'Г... '!

т

I {

I 9.5 МКГ/МД Ш- | I мкг/шт

I' ФГА | Л+ФГА усил. ! ФГА | Л+ФГА | % у с ил".

Ж.

ФГА

2 мкг/мл ФГА

4 мкг/мл ФГА

Л+ФГА { % усил.! ФГА [ Л+ФГА | % усил.

%

8 ш

в

я

40,8± 48,4± То с 85,431 129,41± пТ * 102,4± 143,45 Ап ' ±£,4. ±3|45 18'6 ¿11 ±3)9 51'5 ±6,^ ±27)98 40

11 82,86± ±4,54 71,6 84± ±2,98 со -Н 1,1 - -

ш 59,1+ ¿8,47 60,2+ ±11,55 1,9 •88,5± ±5,4 120,8± ±5,05 36,5 - |

1У - 22,84± ±3,02 33,75± ±4|бГ 74 • 47,53± ±7,82 73.63+ 54,9 - м _ _ о 1

У - - - 100,5± ¿2,3 123,5± ±7,02 22,9 85,6£ ±6,62 87,6± ±7,28 2'3

л - - - Ы8,1± ±15,5 120,95± ±5,32 2,4 85,4± ±7,85 1П,6± 30,7 ±7,61

.Идны средние значения'каждой серии опытов ± абсолютная ошибка среднего значения, усил. - увеличение уровня включения %-тимидина после Л+ФГА по сравнению с ФГА, выраженное в

Индекс включения ^Н-тимвдина =

Разница уровней включения %-тишдина при действии одним ФГА и совместным эффектом облучения и ФГА, выраженная в процентах,, представлена в графе: процент усиления индекса включения "%-тими-дина..Во всех шести опытах почти для всех использованных доз ФГА (за исключением четырех случаев, когда эффект был настолько мал, что им можно пренебречь) наблюдалось потенциировавие реакции бласттрансфоршции благодаря предварительному облучению клеток. Эффект потенциирования выражен сильнее при дозе ФГА I мкг/мл (в 3-х из 4-х случаев), если проводить сравнение процентов усиления индексов включения "^-тишдина для всех доз ФГА в пределах каждого опыта. Если сравнить проценты усиления индексов включения ^Н-тимидина всех опытов с одной и той же дозой ФГА, то можно за^-метить проявление индивидуального различия, которое связано с реактивностью иммунной системы данного организма. Наибольшее усиление включения ^Н-тимвдина наблвдалосъ при дозе ФГА I мкг/мл (в 3-х из 4-х опытов). В результате этого в ряде случаев уровень включения меченого тимидина после комбинированного действия облучения и ФГА в дозе I мкг/мл равнялся или даже превышал стимулирующий эффект одного ФГА, взятого в оптимальной дозе 2 мкг/мл. На основе этого можно полагать, что наблодается тенденция к снижению порога действия митогена на реакцию бласттрансформации лимфоцитов под влиянием облучения Не-н.е лазером. Этот факт позволяет предложить объяснение лечебному действию лазерного облучения: под его влиянием в ранах или язвах происходит активизация хроматина содержащихся там покоящихся клеток (лимфоцитов, макрофагов и срибробластов), что делает их более чувствительными к содержащимся там естественным стимуляторам. В результате клетки раневого и язвенного экссудата начинают активно функционировать, что приводит к стимуляции процессов очищения раны, пролиферации шиброблас-тов и эпителиальных клеток и, в конечном итоге, к заживлению ран и язв.

ВЫВОДЫ:

1. Облучение Не-Не лазером вызывает увеличение связывания АО хроматином лимфоцитов периферической крови в интервале доз 28-112 Дж/м2 с максимальным эффектом при дозе 56 Дя^/м2, облученные клетки при этом полностью сохраняют свою жизнеспособность.

2. Кинетика связывания АО облученными лимфоцитами имеет сложный волновой характер: в первые 60 минут наблюдается подъем свя-

зыванмя АО, который затем сменяется падением почти до контрольно. го уровня (к 4 часу), за которым следует (в течение последующих 2 часов) новый подъем в связывании хроматином лиганда.

3. Облучение Не-н .е лазером приводит к усилению включения меченого уридана в лимфоциты. Кинетика этого процесса, подобно изменению связывания АО, имеет волновой характер: в первые два часа наблюдается подъем, потом к 3 часам происходит снижение до контрольного уровня, которое затем сменяется новым подъемом к 5 часам. После этого снова наступает падение включения до уровня контроля,и лишь к 12, часам происходит незначительное повышение включения ■'•^С-уридина.

4. Облучение Не-Не лазером вызывает в первые две минуты повышение концентрации в лимфоцитах свободного внутриклеточного кальция примерно в два раза по сравнению с контролем; затем происходит его снижение до уровня интактных клеток (к 3 минутам).

5. Облучение Не-не лазером не приводит к стимуляции синтеза ДНК в лимфоцитах: уровень включения 3В-тимадина в облученные клетки через 2-8 суток оставался на уровне интактных клеток. В параллельных контрольных экспериментах с той же суспензией клеток, обработанных ФГА, получена типичная стимуляция реакции бласттрансфорда-ции лимфоцитов.

6. Чувствительность облученных клеток к интеряейкину-2 не ■отличается от таковой интактных клеток, в то же время кратковременно стимулированные (в течение 45 минут) с помощью ФГА клетки обладали повышенной по сравнению с интактнши клетками чувствительностью к рИ1-2.

7. Предварительное облучение клеток перед стимуляцией их ФГА' вызывает усиление включения %-тшидина по сравнению с таковым только под влиянием ФГА. Это свидетельствует о потенциирущем действии облучения на бласттрансформацию лимфоцитов. Достаточно высокий уровень включения меченого тимидина в облученные клетки при добавлении ФГА в дозе I мкг/мл, который превышает или, по крайней мере, равен оптимальному эффекту одного ФГА, взятого в концентрации, оптимальной для данной реакции, предполагает наличие тенденции к снижению порога действия ФГА благодаря предварительному облучению клеток.

8. Потенцшрующее действие облучения на бласттрансформацию лимфоцитов позволяет дать объяснение лечебному эффекту лазерного воздействия: под его влиянием в ранах и язвах происходит активация хроматина. содержащихся там клеток (лимфоцитов, макрофагов и фибробластов), что делает юс более чувствительными к естественным стимуляторам,

присутствутоцим в ранах. В результате клетки раневого и язвенного экссудата начинают активно пролиферировать, что приводит к стимуляции процессов очищения раны, размножению фибробластов и эпителиальных клеток и, в конечно» счете, к заживлению ран и язв.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ:

1. Г.Е.Федосеева, Н.К.Смольянинова, Г.А.Романов, Т.Й.Кару, А.В.Зеленин. Изменение структуры хроматина лимфоцитов периферической крови человека при'облучении Не-Ие лазером. Тезисы доклада 1У Всесоюзной школы¡"Применение лазеров в биологии". Кишинев, 1986, с.209-210.

2. Г.Е.Федосеева, Н.К.Смольянинова, Т.Й.Кару, А.В.Зеленин. Изменение структуры хроматина лимфоцитов после облучения He-î№ лазером. Радиобиология, 1987, т.27, № 5, с.605-609.

3. N.K.Smol'yaninova, G.E.Fedoseyeva, Ï.I.Karu, A.V.Zelenin. Human lymphocyte chromatin changes following irradiation with Hs-Ke laser. Second Européen Photobiological congress. Padova,

. 1987, p.166.

4. G.E.Fedoseyeva, N.K.Smolîyaninova, T.I.Karu, A.V.Zelenin. Hu-nian lymphocyte chromatln changes following irradiation vrith

. He-Ne laser. Laser in Life Sciences,' 1988, v,2, 3, p.197-205.

5. Т.Й.Кару,-Н.К.Смольянинова, Т.Н.Андрейчук, Т.П.Рябых, H.И.Пучке ва, А.В.Зеленин. Действие излучения He-îïè-лазера на структурные и функциональные изменения клеток крови и лимфоидных органов. Тезисы-доклада Всесоюзной конференции:"Действие низкоэнергетического лазерного излучения на кровь". Киев, 1989,

. с.189-190.

6. Н.К. Смольянинова, Т.Й.Кару, А.В.Зеленин. Активация синтеза РНК лимфоцитов после облучения Не-Яе лазером. Радиобиология,

. 1990, т.Э0,.№3, с.424-426.

7. Т.Й.Кару, Н.К.Смольянинова, Т.Н.Андрейчук, А.В.Зеленин, Т.П. Рябых, Н.И.Пучкова. Действие излучения Не-ие лазера на структурные и функциональные изменения клеток крови и лимфоидных органов. Тезисы доклада 9-ого Всесоюзного семинара:"Лазерная биофизика и новые применения лазеров в медицине". Тарту, 1990, с.68-83.

8. Н.К.Смольянинова, Т.Й.Кару, А.В.Зеленин. Облучение Не-Яе лазером .усиливает бласттрансформацию, вызванную фитогемагглюти-нином. ДАН, 1990,т.315, № 5, с.1256-1259. '

-249. lî.K.Smol'yaninova, T.I.Karu, G.E.Fedoseeva, A.V.Zelenin.

Effect of Ee-Ke laser irradiation on chromatin properties and synthesis of nucleic acids of human periferal blood lymphocytes» Biomedical Sciences, 1991, v.2, 2, p.I2I-126.

MIÏÏ"3BT6KT]iKa" 3,aK. 649 rap. 100