Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада

Виноградова, Татьяна Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада"

На правахрукописи

Виноградова Татьяна Михайловна

ИЗМЕНЕНИЕ ОРГАНИЗАЦИИ ЦИТОСКЕЛЕТА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ ИНДУКЦИИ ЭКЗОЦИТОЗА ТЕЛЕЦ ВЕЙБЕЛЯ - ПАЛАДА 03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной и клеточной кардиологии Института экспериментальной кардиологии Российского кардиологического научно-производственного комплекса МЗ РФ. Научный руководитель:

кандидат биологических наук В. Б. Быстревская -Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г. Е. Онищенко кандидат биологических наук А. А. Минин

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет

Защита состоится 30 июня 2004 года в 11.00 на заседании диссертационного совета 208.073.01 в РКНПК МЗ РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института экспериментальной кардиологии РКНПК МЗ РФ.

Автореферат разослан «........» ..мая................................2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эндотелиальные клетки человека содержат специфические секреторные органеллы, тельца Вейбеля-Палада (тВП), которые запасают фактор фон Виллибранда (ФВ), играющий важную роль в регуляции свертывания крови (Ruggeгi, 2003). Учитывая, что при развитии ряда сосудистых заболеваний, способствующих развитию атеросклероза, таких как гипертония и диабет, повышается содержание циркулирующего ФВ, изучение механизмов контроля уровня секреции ФВ представляет не только теоретический, но и практический интерес. Имеются указания на то, что количество запасаемых тВП и их экзоцитоз зависят от организации цитоскелета эндотелиальных клеток, однако механизмы взаимодействия компонентов цитоскелета с тВП пока не изучены. На настоящий момент известны две цитоскелетные системы, обеспечивающие внутриклеточный транспорт мембранных органелл -передвижение по микротрубочкам (МТ) и передвижение по актиновым филаментам. Вовлеченность этих двух систем в передвижение различных органелл широко изучается, однако механизм перемещения запасающих секреторных гранул пока исследован слабо, и имеющиеся данные достаточно противоречивы. Эндотелиальные клетки являются удачной моделью для исследования роли цитоскелетных систем в регулируемой секреции, поскольку в отличии от остальных запасающих секреторных клеток содержат не только кортикальную сеть актиновых филаментов, но и стресс-фибриллы.

Цель и задачи работы. Цель работы состояла в том, чтобы выяснить, какую роль играют компоненты цитоскелета в распределении тВП в условиях индукции экзоцитоза и при цитоскелетных перестройках, вызванных воздействием агентов, разрушающих цитоскелет. Были поставлены следующие конкретные задачи: 1. Изучить закономерности распределения тВП относительно МТ, актиновых филаментов и промежуточных филаментов в культивируемых

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ ) БИБЛИОТЕКА [

оУ-Ж/ГМ 1

клетках эндотелия аорты при индукции экзоцитоза тромбином; 2. Изучить закономерности внутриклеточного - перераспределения тВП относительно компонентов цитоскелета при экспериментальном разрушении системы микротрубочек (колцемид), актиновых филаментов (цитохалазин • Б) и промежуточных филаментов (каликулин А); 3. Исследовать организацию центросомы эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза тВП; 4. Сравнить закономерности перераспределения тВП и организацию центросомы при действии тромбина на эндотелиальные клетки, выделенные из аорты (human aortic endothelial cells, HAEC) и пупочной вены (human umbilical venous endothelial cells, HUVEC).

Научная новизна и практическая значимость работы. В настоящей работе впервые показано, что секреторные органеллы могут использовать систему МТ для движения в сторону, противоположную направлению экзоцитоза и, следовательно, система МТ играет важную роль в регуляции уровня стимулированной секреции. Результаты впервые показывают, что при индукции экзоцитоза тВП физиологическим стимулятором тромбином происходит быстрое изменение организации центросомы: во-первых, в течение 3 минут возрастает число сабдистальных сателлитов на материнской центриоли; во-вторых, в течение 1-3 минут изменяется характер окрашивания центриолей антителами к тирозинированному и ацетилированному тубулину. Данные указывают на то, что центросома является участником сигнального пути, что расширяет представления о функциях центросомы в интерфазных клетках и имеет важное теоретическое значение.

Практическая значимость работы достаточно велика, поскольку результаты вносят новые представления о механизме регуляции уровня секреции одного из важнейших компонентов системы свертывания крови.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих научных конференциях: 6 Annual Scandinavian atherosclerosis conference, May 20-23, 1999, Copenhagen, Denmark; EMBO/EMBL conference"Centrosome and Spindle Pole Bodies". September 13-17, 2002, Heidelberg, Cermany, а также доложены на межлабораторном семинаре в ИЭК РКНПК МЗ РФ

(Москва, 15 апреля 2004 года).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы две статьи и два тезисных сообщения, одна статья находится в печати.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы». Работа изложена на 132 страницах и включает 25 рисунков и список литературы, содержащий 249 ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа была выполнена на первичных культурах эндотелиальных клеток, выделенных из аорты и пупочной вены человека по стандартным методикам (Л^юг^ et а1, 1986). Для анализа распределения тВП относительно элементов цитоскелета были применены стандартные методы иммунофлуоресцентной и электронной микроскопии (клетки были проанализированы на серийных ультратонких срезах). Для исследования количества пост-трансляционно модифицированного тубулина в центриолярных микротрубочках использовали метод иммуноэлектронной микроскопии (Са11агсо-ОШап et а1., 1983, Вге et а1., 1987) с моноклональными антителами к тирозинированному или ацетилированному тубулину. В качестве негативного контроля использовали окрашивание антителами неиммунизированных мышей. Анализ проводился на серийных ультратонких (светло-серых) срезах. Для оценки значимости различия между выборками при сравнении количественных параметров (анализ достоверности различия в количестве сателлитов на материнской центриоли эндотелиальных клеток в контроле и при действии тромбина) проводилась статистическая обработка данных с использованием критерия Стьюдента. Для оценки значимости различия между выборками при сравнении неколичественных параметров (интенсивность окрашивания центриолей антителами к пост-трансляционно модифицированному тубулину) использовался критерий Ъ на основании биноминального

распределения.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Индуцированное тромбином перераспределение тВП

Чтобы выяснить закономерности перераспределения тВП в системе МТ при стимуляции секреции, мы провели двойное окрашивание эндотелиальных клеток, выделенных из аорты человека (НАЕС) антителами к фактору Виллибранда и антителами к тубулину через 3,5 и 15 мин после добавления тромбина (2 единицы/мл). Через 3 мин после добавления агента число тВП заметно уменьшалось, но клетки, лишенные тВП, встречались достаточно редко даже через 15 мин. Число таких клеток варьировало от 5 до 20% в культурах, полученных из разных сосудов. Распределение тВП теряло характерную для контроля равномерность (рис.1-а), и можно было выделить две группы тВП в клетках: часть формировала небольшие кластеры в зоне центра организации МТ (ЦОМТ) (рис. 1-6), остальные находились на клеточной периферии. Через 15 минут в большинстве клеток обнаруживались только небольшие перицентриолярные кластеры тВП, а периферических тВП было мало. При двойном флуоресцентном окрашивании антителами к ФВ и антителами к различным компонентам цитоскелета, как в контрольных, так и в обработанных тромбином клетках не выявлялось колокализации между тВП и МТ, а также между тВП и расположением актиновых стресс-фибрилл. Не обнаруживалось различия между контрольными и обработанными тромбином клетками и по локализации тВП относительно виментиновых филаментов, в обоих случаях виментиновые филаменты были видны вокруг каждого тВП.

Рис.1. Перераспределение тВП в НАЕС при действии тромбина. Окрашивание антителами к ФВ, а - контроль, 6-5 минут действия тромбина

Чтобы выяснить, вызывает ли тромбин перемещение тВП к центриолям, мы сравнили с помощью электронной микроскопии частоту встречаемости тВП в перицентриолярном районе контрольных клеток и клеток, обработанных тромбином. В каждой изученной клетке были подсчитаны тВП, находящиеся в пределах сферы радиусом 2.5 мкм с центром между двумя центриолями. В контрольных культурах из 20 случайно выбранных клеток в 13 клетках перицентриолярные тельца не обнаруживались, в 7 других клетках в районе центриолей находились одно или два тельца. Во всех 10 клетках, обработанных тромбином 3 или 5 минут, в перицентриолярной области обнаруживалось 10-15 тВП, большинство из которых находилось на расстоянии меньше 0.5 мкм от материнской центриоли, причем некоторые тВП находились на расстоянии 0.1 мкм от перицентриолярных сателлитов. У мембраны перицентриолярных тВП обычно были видны МТ и промежуточные филаменты. Следует подчеркнуть что клетки, обработанные тромбином, не отличались от контрольных клеток по частоте встречаемости в перицентриолярном районе других мембранных органелл, например, митохондрий.

Что касается других районов цитоплазмы, то в клетках, обработанных тромбином, в отличие от контрольных клеток, периферические (не перицентриолярные) тВП располагались чаще всего непосредственно у плазматической мембраны. Обработанные и необработанные тромбином клетки не различались по микроокружению периферических тВП. Вокруг этих телец всегда присутствовали промежуточные филаменты, и лишь иногда были видны МТ.

Из наших данных следует, что физиологический стимулятор тромбин провоцирует движение тВП в двух направлениях - часть тВП движутся к центросоме, в то время как все остальные перемещаются к плазматической мембране. Понятно, что тВП, перемещающиеся к центросоме не подвергаются экзоцитозу, в отличии от тех, что движутся к плазматической мембране. Пока остается неясным, какой фактор определяет направление движения каждого конкретного тельца. В любом случае, наши результаты показывают, что в эндотелиальных

клетках существует механизм ограничения уровня секреции фактора Виллибранда, который включает в себя запуск быстрого перемещения части тВП по МТ к центросоме. Интересно, что в эндотелиальных клетках аорты человека, фиксированной in situ, мы также обнаруживали клетки с околоцентросомальными кластерами тВП.

2. Перераспределение тВП в клетках, обработанных цитохалазином Б

Далее мы попытались выяснить, каковы закономерности взаимодействия тВП с компонентами цитоскелета при индукции экзоцитоза цитохалазином Б (ЦБ), который как известно стимулирует экзоцитоз секреторных гранул во различных типах клеток за счет разрушения примембранного актинового кортекса. Клетки обрабатывали ЦБ в концентрации 2 мкг/мл. Окрашивание родамин-фаллоидином обнаружило уменьшение числа стресс-фибрилл и формирование аморфных агрегатов F-актина через 10 мин действия агента. Через 20 мин большинство клеток были лишены стресс-фибрилл. Окрашивание клеток антителами к виментину и родамин-фаллоидином выявило зависимость между распределением F-актина и виментиновых филаментов - в фокусах грубой сети, формируемой пучками виментиновых филаментов были видны звездообразные структуры или аморфные агрегаты F-актина. Иногда наблюдалось совпадение локализации виментиновых и актиновых филаментов в периферических районах цитоплазмы.

Уже через 10 мин после добавления ЦБ в НАЕС заметно падало число тВП по сравнению с контрольными необработанными клетками. Однако, клетки, полностью лишенные тВП, встречались в обработанных ЦБ культурах с той же частотой, с какой и в контроле, т.е. не более 2%. Через 10 или 20 мин после добавления агента в цитоплазме выявлялся один или несколько кластеров тВП. Двойное окрашивание антителами к фактору Виллибранда и тубулину или виментину показало что во всех клетках один из кластеров находится возле ЦОМТ, а в клетках, где обнаруживалось больше одного кластера тВП, дополнительные кластеры располагались

вокруг фокусов схождения пучков виментиновых филаментов, также обнаруживалась колокализация периферических тВП с пучками промежуточных филаментов..

Рис.2. Ультраструктура перицентриолярной области НАЕС в необработанных клетках (а) и через 10 минут после добавления ЦБ (б). М - материнская цектриоль, Р - дочерняя центриоль.

При электронномикроскопическом анализе мы не нашли какого-либо различия между клетками, обработанными ЦБ или тромбином, ни по числу перицентриолярных тВП, ни по их локализации относительно материнской центриоли. В разных клетках число перицентриолярных тВП варьировало от 8 до 16 независимо от времени после добавления ЦБ. В 8 из 10 клеток не менее 10 тВП располагались на расстоянии меньше чем 0.5 мкм от материнской центриоли и некоторые тВП располагались на расстоянии 0.1 мкм от перицентриолярных сателлитов (рис.2-б).

Дополнительные кластеры тВП были расположены у плазматической мембраны около агрегатов электронно-плотного аморфного материала. Рядом со всеми тВП всегда обнаруживались промежуточные филаменты.

3. Перераспределение тВП в клетках, обработанных каликулином А

Поскольку мы обнаружили колокализацию тВП с виментиновыми филаментами при цитоскелетных перестройках, вызванных разрушением актина с помощью ЦБ, мы исследовали распределение тВП в НАЕС в ходе реорганизации цитоскелета, включающей в себя разрушение сети виментиновых филаментов каликулином А (10-8 М). Каликулин А (КЛ) является ингибитором

серин-протеиновых фосфатаз и усиливает фосфорилирование виментина, что вызывает полную или частичную разборку виментиновых филаментов (ЕгИжоп Ы а1., 1992).

Уже через 5 мин после добавления агента интенсивность окрашивания виментина становилась более слабой по сравнению с необработанными клетками; но аморфная сеть виментиновых филаментов сохранялась в обработанных каликулином клетках на всем протяжении эксперимента. Двойное окрашивание антителами к виментину и родамин-фаллоидином показало, что через 5 или 15 минут действия КЛ виментиновая сеть занимает только центральную область клетки. При окрашивании антителами к виментину и ФВ не выявлялось локализации тВП с виментиновыми филаментами, и тВП обнаруживались как в зоне, занятой виментином, так и на лишенной виментина периферии. Через 5 мин после добавления агента в клетках обнаруживались необычайно длинные МТ, радиально расходящиеся из ЦОМТ. Через 15 мин радиальное распределение МТ становилось менее выраженным, однако, ЦОМТ оставался ясно различимым. Двойное окрашивание клеток антителами к ФВ и тубулину выявило соответствие между локализацией периферических тВП и МТ через 5 мин действия агента. В это же время в области ЦОМТ в большинстве клеток обнаруживались кластеры тВП, и через 15 минут почти все тВП видимые в клетках формировали большой компактный кластер около ЦОМТ, а на периферии тВП практически не оставалось.

При электронно-микроскопическом исследовании, в каждой из 10 изученных обработанных КЛ клеток обнаруживалось не менее 10 перицентриолярных тВП, причем через 5 минут действия КЛ таких тВП насчитывалось от 10 до 20, а через 15 минут их количество возрастало до нескольких десятков. У мембраны перицентриолярных тВП были видны и МТ и промежуточные филаменты, а периферические тВП контактировали, как правило, только с МТ.

Во всех случаях, когда мы обнаруживали образование в клетках НАЕС перицентриолярных кластеров тВП, как при действии тромбина, так и при обработке КЛ или ЦБ, у мембраны перицентриолярных тВП всегда присутствовали перицентриолярные МТ. Известно, что хотя материнская и дочерняя центриоли одинаково способны к нуклеации МТ, только материнская

центриоль ассоциирована с белками, удерживающими минус-концы МТ у центросомы. Поэтому логично предполагать, что в эндотелиальных клетках аорты тВП способны к быстрому движению к минус-концу МТ, заякоренных на материнской центриоли, вероятно, при помощи динеина или динеиноподобного моторного белка. Эти результаты являются первым указанием, что секреторные везикулы используют базирующуюся на МТ транспортную систему для перемещения от периферии к центру клетки, т.е. сторону, противоположную направлению экзоцитоза.

4. Перераспределение тВП в клетках, обработанных колцемидом

В предыдущих экспериментах мы обнаружили перемещение тВП к ЦОМТ в эндотелиальных клетках, обработанных тромбином, ЦБ или КЛ, а также колокализацию тВП с МТ при действии КЛ. Чтобы выяснить, каким образом изменяется локализация тВП при разрушении сети МТ, было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание цитоскелетных белков и ФВ в клетках, обработанных колцемидом (0.4 мкг/мл).

Через 30 минут действия агента в большинстве эндотелиальных клеток антитела к тубулину гомогенно окрашивали цитоплазму, лишь в некоторых клетках встречались единичные МТ. Двойное окрашивание антителами к виментину и родамин-фаллоидином показало, что промежуточные филаменты были собраны в околоядерном районе и отсутствовали в периферических областях клеток. Двойное окрашивание антителами к ФВ и виментину показало, что все тВП находились только в пределах области, занятой промежуточными филаментами и отсутствовали на периферии.

При электронно-микроскопическом исследовании клеток, обработанных 30 мин колцемидом, мы не обнаружили МТ вокруг центриолей. В околоядерной обрасти многочисленные тВП были расположены в пучках промежуточных филаментов.

Таким образом, исследуя микроокружение периферических и околоцентриолярных тВП и перераспределение тВП при перестройках цитоскелета, вызванных воздействием повреждающих

различные цитоскелетные элементы, мы обнаружили, что тВП часто колокализуются с виментиновыми филаментами. Такая колокализация имеет место при разрушении системы МТ с помощью колцемида, а также у периферических тВП в условиях экзоцитоза (тромбин, ЦБ). Это позволяет предполагать, что движение тВП к плазматической мембране обеспечивается взаимодействием тВП с виментиновыми филаментами.

Все вышеизложенные результаты были получены на эндотелиальных клетках, выделенных из аорты (НАЕС). Известно, что хотя все эндотелиальные клетки имеют ряд общих характеристик, некоторые их свойства отличаются среди клеток, происходящих из различных кровеносных сосудов. Чтобы проверить, является ли возможность к ретроградному движению тВП общим свойством эндотелия, мы исследовали перераспределение тВП в культуре эндотелиальных клеток, выделенных из пупочной вены человека (НЦУЕС). Распределение тВП в НЦУЕС было изучено при воздействиях, вызывающих образование кластеров тВП вокруг центросомы в НАЕС (обработка тромбином, цитохалазином и каликулином А). Оказалось, что в клетках НЦУЕС тВП перемещаются к центросоме только в ответ на обработку КЛ, а воздействие тромбина и ЦБ вызывают только экзоцитоз тВП. Возможно, что система ограничения уровня выброса ФВ в ходе экзоцитоза тВП работает по-разному в эндотелии артерий и вен.

5. Реорганизация центросомы в эндотелиальных клетках при действии тромбина

Анализируя закономерности распределения тВП при индукции экзоцитоза тромбином, мы обнаружили факт перемещения тВП вплотную к сабдистальным сателлитам материнской центриоли. Далее мы попытались выяснить, изменяется ли число сателлитов в эндотелиальных клетках (НАЕС и НЦУЕС) в короткие сроки после воздействия тромбина.

5.1. Подсчет количества сателлитов в эндотелиальных клетках до и на ранние сроки после добавления тромбина

Используя серийные ультратонкие срезы мы посчитали количество сателлитов на материнской центриоли в необработанных тромбинам клетках культур НАЕС и ЫЦУЕС, а также на сроки 3 и 15 мин после добавления тромбина. На каждом сроке было проанализировано по 10 клеток.

В необработанных тромбином НАЕС количество сателлитов варьировало от 1 до 4 на клетку, а среднее значение составляло 2.9 (рис. 3), тогда как в клетках, обработанных тромбином 3 минуты, разброс был от 1 до 7 сателлитов, среднее значение составляло 4.1. Через 5 минут после добавления тромбина разброс числа сателлитов составлял от 3 до 7, а среднее значение 4.3. Статистический анализ показал, что различие в количестве центриолярных сателлитов между необработанными клетками и клетками, обработанными тромбином 3 и 5 минут, является статистически достоверным с вероятностью 95%. В дальнейшем, через 15 мин после начала воздействия, количество центриолярных сателлитов в среднем несколько уменьшалось, однако все равно максимальное количество сателлитов составляло 6, а среднее значение 3.8 (рис.3).

В отличие от НАЕС, в клетках культуры ЫЦУЕС, где нет формирования перицентриолярных скоплений тВП при действии тромбина, количество сателлитов на материнской центриоли при действии тромбина не изменялось (рис. 4).

■а*лро1ъ

xJ 1.

Iii.

I I I .

1 2 3 4 S в 7

2 3 4 5 6 7

2 3 4 5 в 7

Рис.4. Диаграмма распределения количества сателлитов в HUVEC , необработанных тромбином (контроль), или обработанных тромбином S или 15 мин. По оси х - количество сателлитов, по оси у — количество клеток.

На настоящий момент известно, что сателлиты задействованы в заякоривании пула МТ на центросоме (Mogensen et al., 2000), и кажется вероятным, что изменение количества сателлитов связано с изменением заякоривающих свойств центросомы. Так как период направленного к центросоме движения тВП совпадает с появлением на материнской центриоли дополнительных сателлитов, не исключено, что именно заякоривание дополнительного пула МТ на сателлитах обеспечивает "рельсы" для движения тВП к центросоме. Наши результаты являются первыми данными об изменении числа центриолярных сателлитов в связи с запуском сигнального каскада, что предоставляет собой первые указания на возможность регуляции МТ-заякоривающих свойств центросомы посредством внешнего сигнала.

5.2. Иммунопероксидазное окрашивание центриолей эндотелиальных клеток антителами к пост-трансляционно модифицированному тубулину

В предыдущей части работы мы обнаружили увеличение количества сабдистальных сателлитов в эндотелиальных клетках (НАЕС), обработанных тромбином. Сабдистальные сателлиты являются элементом перицентриолярного матрикса, тесно ассоциированным со стенкой цилиндра материнской центриоли. Факторы, регулирующие взаимодействие центриолей с белками перицентриолярного матрикса на настоящий момент не изучены. Известно, что МТ центриолярного цилиндра содержат пост-трансляционно-модифицированный тубулин, а именно глютамилированный, ацетилированный и детирозинированный тубулин. Показано, что в

цитоплазматических МТ ацетилированный и детирозинированный тубулин вовлечен во взаимодействие МТ с различными МАРами, и что количество модифицированного тубулина в цитоплазматических МТ может регулироваться внешним сигналом. В нашей работе мы использовали метод иммуноэлектронной микроскопии чтобы сравнить уровень окрашивания центриолей антителами к ацетилированному и тирозинированному тубулину в клетках эндотелия в контроле и в течении 15 минут после добавления тромбина.

5.2.1 Окрашивание клеток НАЕС антителами к тирозинированному тубулину Во всех 10 исследованных необработанных тромбином клетках НАЕС при окрашивании антителами против тирозинированного тубулина обе центриоли выглядели черными, четкими, явно окрашенными по сравнению с негативным контролем (рис.5). В перицентриолярной области были видны МТ, часть из них подходили к сателлито-подобным структурам на материнской центриоли, интенсивность их окрашивания варьировала от тонких серых МТ, до толстых черных. Диффузный фон в перицентриолярной области был более ярким, чем в негативном контроле, а на периферии цитоплазмы встречались области, близкие по окрашиванию к негативному контролю.

Через 1 мин после добавления тромбина характер окрашивания центриолей и перицентриолярной области не претерпевал заметных изменений по сравнению с необработанными тромбином клетками. Однако, на более поздние сроки только часть клеток показывали такое же окрашивание, как клетки, необработанные тромбином, в остальных мы обнаружили более светлое окрашивание обеих центриолей (рис.5). В 6 из 10 клеток, изученных через 3 мин после добавления тромбина, обе центриоли были такими же черными, как в необработанных клетках, а в 4 клетках обе центриоли были серыми. Через 5 мин клеток с черными центриолями было только 4 из 10. Через 15 мин воздействия число клеток с черными центриолями вновь возросло до 7 из 10 (рис.5). Статистический анализ показал значимое различие в количестве клеток с темными и светлыми центриолями между необработанными

тромбином культурой и через 3 мин действия тромбина (р<0.01 по критерию z на основании биноминального распределения).

НАЕС тир-тубулин

11 а. и 91 II1. 11

Ни\/ЕС тир-тубулин

время после добавления тромбина

НАЕС ацет-тубулин

время после добавления тромбина

, Ни\/ЕС ацет-тубулин

Ц- с! а [I Л d-0.nl

время после добавления тромбина

В П.

время после добавления тромбина

Рис.5. Распределение эндотелиальных клеток с разным уровнем интенсивности окрашивания центриолей антителами к тирозинированному и ацетилированному тубулину в клетках, необработанных тромбином (0), и при действии тромбина. Черный цвет - черные центриоли, белый - светлые центриоли, серый - клетки, в которых дочерняя центриоль окрашивается ярче материнской.

Как и в НАЕС, в необработанных тромбином клетках HUVEC при окрашивании антителами к тир-тубулину обе центриоли выглядели черными и четкими во всех 10 просмотренных клетках (рис.5). Перицентриолярные МТ в-основном были слабокрашенными, светло-серыми, и встречались лишь единичные более темные МТ. Диффузный фон в перицентриолярной области был выше, чем на периферии клеток.

Как и в НАЕС, при действии тромбина мы наблюдали гетерогенность окрашивания центриолей в разных клетках. В HU"VEC этот эффект заметен даже раньше, чем в НАЕС (рис), уже на срок 1 мин воздействия половина (6 из 10) исследованных клеток имела серые центриоли, окрашенные гораздо менее ярко, чем центриоли в необработанных клетках и сравнимые по окрашиванию с негативным контролем. Через 3 мин таких клеток было 7, через 5 мин 6. Однако через 15 мин вновь обе центриоли большинства исследованных клеток (7 из 10) вновь были черными и четкими, как в необработанных клетках, тогда как в 3 оставшихся интенсивность окрашивания была слегка слабее, но явно выше, чем при окрашивании негативного контроля

(рис.5). Статистический анализ показал значимое различие в количестве клеток с темными и светлыми центриолями между необработанными тромбином культурой и через 1 минуту действия тромбина (р<0.01 по критерию г на основании биноминального распределения).

5.2.3Окрашивание клеток НАЕС антитепами к ацетилированному тубулину В отличии от окрашивания антителами к тирозинированному тубулину, при окрашивании к ацет-тубулину мы обнаружили некоторую гетерогенность в окрашивании центриолей в необработанных клетках. В 8 из 10 исследованных клетках НАЕС обе центриоли выглядели светло-серыми (рис.5). В 2х оставшихся материнская и дочерняя центриоли были окрашены сильнее. В перицентриолярной области визуализировалось небольшое количество МТ с яркостью окраски примерно как у МТ центриолярного цилиндра и несколько ярче. В перицентриолярной области цитоплазмы диффузный фон был более ярким, чем на периферии клеток, где окрашивание цитоплазмы было сравнимо с негативным контролем.

При действии тромбина соотношение клеток с черными и серыми центриолями претерпевает резкое изменение. В то время, как в большинстве необработанных клеток обнаруживались светло-серые центриоли, уже через 1 мин после начала воздействия, клеток с черными центриолями было б из 10, через 3 мин - 5 из 10, остальные клетки показывали светло-серый характер окрашивания центриолей (рис.5). Через 15 мин действия тромбина соотношение ярко и светло окрашенных клеток вновь становилось близко к исходному - 7 клеток с серыми центриолями, 3 с черными. Статистический анализ показал значимое различие в количестве клеток с темными и светлыми центриолями между необработанными тромбином культурой и через 1 минуту действия тромбина (р<0.02 по критерию г на основании биноминального распределения).

5.2.1 Окрашивание клеток HUVECантителами к ацетилированному тубулину Как и в НАЕС, в НЦУЕС в необработанных клетках наблюдалась гетерогенность по окрашиванию центриолей в различных клетках. В большинстве (7 из 10) обе центриоли были серыми, слабоокрашенными, в 3 центриоли выглядели черными, четко окрашенными (рис.5). Во

всех изученных клетках материнская и дочерняя центриоли не различались по уровню окрашивания. В клетках со светлыми центриолями, как правило, не наблюдалось ярко-окрашенных перицентриолярных МТ, в то время, как в 3 клетках с яркими центриолями наблюдалось довольно много яркоокрашенных МТ в перицентриолярной области.

После добавления тромбина соотношение клеток с серыми и черными центриолями поменялось на диаметрально противоположное, причем мы в первый раз обнаружили различие в уровне яркости окрашивания материнской и дочерней центриолей. Через 1 минуту воздействия тромбина в 7 клетках центриоли выглядели черными, в 2 светло-серыми, в одной клетке материнская центриоль выглядела светло-серой, а дочерняя была значительно темнее (рис.5). Через 3 минуты после добавления тромбина число клеток с черными центриолями оставалось достаточно высоким - в 6 клетках материнские центриоли были темными, при этом в одной из них дочерняя центриоль выглядела густо-черной, заметно более яркой чем материнская, а в 5 других обе центриоли были одинаковы. В 4 оставшихся клетках материнская центриоль была светло-серой, в 3 из них дочерняя центриоль была окрашена с той же интенсивностью, что и материнская, а в одной она была черной. Через 5 минут после начала воздействия во всех 10 изученных клетках материнские центриоли были светло-серыми. При этом в 3 клетках дочерняя центриоль была черной, более интенсивно окрашенной, чем материнская, в остальных обе центриоли имели одинаковую интенсивность окрашивания (рис.5). Через 15 минут, как и на срок 5 минут, материнские центриоли во всех изученных клетках были серыми, однако число клеток с черной дочерней центриолью выросло до 7 (рис.5). Через 30 мин клеток, в которых дочерняя центриоль окрашена ярче материнской, было лишь 4 из 10 исследованных. В остальных клетках обе центриоли выглядели одинаково серыми, как в необработанных тромбином клетках. Статистический анализ показал значимое различие в количестве клеток с темными и светлыми центриолями между необработанными тромбином культурой и через 1 мин действия тромбина (р<0.02 по критерию г на основании биноминального распределения).

Есть два альтернативных объяснения полученным нами результатам - первое, что происходит реальное изменение количества модифицированного тубулина в центриолярных МТ, второе, что при воздействии тромбина изменяется структура перицентриолярного матрикса, что приводит к изменению доступности эпитопов для использованных антител. Как бы там ни было, в любом случае наши результаты впервые демонстрируют, что при активации системы передачи внешнего сигнала происходит быстрое изменение организации центросомы.

При изучении изменений организации центросомы эндотелиальных клеток, вызванных воздействием тромбина, мы обнаружили, что в НАЕС имеют место два параллельных процесса -изменение интенсивности окрашивания центриолей антителами к ацетилированному и тирозинированному тубулину, а также увеличение количества сабдистальных сателлитов на материнской центриоли. Поскольку сабдистальные сателлиты являются структурой, тесно ассоциированной со стенкой центриоли, заманчиво предположить, что образование дополнительного количества сателлитов может быть связано с изменением уровня посттрансляционных модификаций центриолярного тубулина. Если сопоставлять эти процессы по времени видно, что увеличение количества сателлитов развивается вслед за падением уровня тирозинирования центриолярного тубулина, тогда как в период, предшествующий образованию дополнительных сателлитов в НАЕС, уровень ацетилирования центриолей остается прежним. В ИиУЕС, где количество сателлитов при действии тромбина не отличается от контроля, динамика изменений ацетилирования и тирозинирования центриолей несколько иная - одновременно с падением интенсивности окрашивания центриолей к тирозинированному тубулину увеличивается яркость окрашивания к ацетилированному тубулину.

Интересно, что в ИиУЕС, в отличии от НАЕС, при действии тромбина появляется различие в интенсивности окрашивания двух центриолей в составе одной центросомы - в части клеток дочерняя центриоль окрашивается гораздо ярче, чем материнская. Наши результаты представляют собой первые данные о различии между дочерней и материнской центриолями по окрашиванию антителами к пост-трансляционно модифицированному тубулину. Известно, что ряд белков

центросомы в начале G1 -периода ассоциированы только с материнской центриолью, и присоединяются к дочерней по мере ее созревания (Lange, Gull, 1995). Факторы, делающие дочернюю центриоль «узнаваемой» для этих белков, пока не известны. Ранее было показано, что на HUVEC, в отличии от НАЕС, тромбин оказывает митогенный эффект, и через сутки инкубации с тромбином пролиферативная активность этих клеток вдвое возрастает. Возможно, что в нашем случае временное повышение уровня ацетилирования дочерней центриоли в ответ на тромбин является как раз начальным этапом изменения ее организации в связи с продвижением по клеточному циклу. Чтобы выяснить, является ли изменение количества модифицированного тубулина дочерней центриоли одним из факторов, делающих «безразличную» ранее дочернюю центриоль узнаваемой для неких перицентриолярных белков требуются дополнительные исследования.

ВЫВОДЫ

1. Тромбин индуцирует направленное к центросоме движение части тВП в эндотелиальных клетках аорты человека в течении 5 минут после добавления, в то время как остальные тВП перемещаются к плазматической мембране и подвергаются экзоцитозу.

2. Тромбин вызывает быстрые изменения организации центросомы в эндотелиальных клетках аорты, а именно: 1) в течении 1 минуты уменьшается интенсивность окрашивания центриолей антителами к тирозинированному тубулину; 2) в течении 3 минут увеличивается интенсивность окрашивания центриолей антителами к ацетилированному тубулину; 3) в течении 5 минут происходит увеличение количества центриолярных сателлитов.

3. При индукции экзоцитоза тВП тромбином в эндотелиальных клетках пупочной вены не происходит изменения количества центриолярных сателлитов и отсутствует направленное к центросоме движение тВП.

4. В эндотелиальных клетках пупочной вены тромбин вызывает уменьшение окрашивания центриолей антителами к тирозинированному тубулину и увеличение окрашивания

центриолей антителами к ацетилированному тубулину в течении одной минуты после добавления. После пяти минут обработки тромбином выявляется различие в интенсивности окрашивания материнской и дочерней центриолей антителами к ацетилированному тромбину, причем дочерняя центриоль окрашена ярче материнской.

5. При индукции коллапса промежуточных филаментов в условиях разрушения сети микротрубочек колцемидом происходит перемещение тВП в околоядерную область вместе с промежуточными филаментами.

6. Разрушение сети промежуточных филаментов в клетках эндотелия аорты и пупочной вены при действии каликулина А сопровождается перемещением тВП к центросоме с образованием компактных кластеров тВП вокруг материнской центриоли. В клетках, обработанных каликулином А, периферические и перицентриолярные тВП колокализованы с микротрубочками.

7. Разрушение актинового цитоскелета с помощью цитохалазина В вызывает в клетках эндотелия аорты образование перицентриолярных кластеров тВП.

По материаламдиссертации опубликованы следующие работы:

1.Vinogradova TM, Roudnik VE, Bystrevskaya VB, Smimov VN. Centrosome-directed translocation of Weibel-Palade bodies is rapidly induced by thrombin, calyculin A, or cytochalasin В in human aortiv endothelial cells. Cell Motility and the Cytoskeleton 47:141-153 (2000)

2. Быстревская В.Б., Виноградова Т.М., Смирнов В.Н. Система микротрубочек в клетках сосудистого эндотелия как возможный регулятор уровня секреции фактора Виллибранда. Российский физиологический журнал имени И.МСеченова, 90,522-536 (2004).

3. Vinogradova T.M., Bystrevskaya V.B. Staining pattern of endothelial centrioles by antibodies to tyr-or ecet-tubulin changes in response to thrombin. Abstracts of papers presented at the EMBO/EMBL conference on centrosomes and spindle pole bodies, Heidelberg, Germany, Sept 13-17,2002. Cell Motil. &Cytoskel. 54:104(2003).

4. Vinogradova T.M., Bystrevskaya V.B. Thrombin induces centrosome-directed translocation of Weibel-Palade bodies in human aortic endothelial cells but not umbilical vein endothelial cells. 6 Annual Scandinavian atherosclerosis conference, May 20-23, 1999, Copenhagen, Denmark. Program and Abstracts, 21.

5. Vinogradova TM, Balashova ЕЕ, Smirnov VN, Bystrevskaya VB. The pattern of centriole immunostaining for tyr- or acet-tubulin changes rapidly in endothelial cells treated with thrombin. Cell Motility and the Cytoskeleton, (2004) (в печати)

Подписано в печать 25.05.2004 г. Зак. 108. Тир. 100 экз. Объем 1,2 п.л. Участок оперативной печати ИЭ РАН

№ 13 94 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Виноградова, Татьяна Михайловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Эндотелий и тельца Вейбеля-Палада.

1.1 .Тельца Вейбеля-Паллада, фактор Виллибранда.

1.2. Особенности организации цитоскелета эндотелиальных клеток экзоцитоз тВП.

1.3. Воздействие тромбина на эндотелиальные клетки

2. Цитоскелет и внутриклеточный транспорт

2.1. Система микротрубочек.

2.2. Актиновый цитоскелет

2.3. Промежуточные филаменты.

3. Центросома.

3.1. Структура и состав центросомы.

3.2. Роль центросомы в клеточном цикле и митозе.

3.3. Редупликация центросомы

3.4. Центросома и внешние сигналы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада"

Эндотелиальные клетки являются основным источником плазматического фактора вон Виллибранда (ФВ), большого мультимерного белка, играющего важную роль в гемостазе. Этот белок накапливается в специфических секреторно-запасающих гранулах эндотелиальных клеток, тельцах Вейбеля-Палада (тВП). При экзоцитозе тВП ФВ высвобождается в виде крупного мультимера, который более активно индуцирует агглютинацию тромбоцитов (Moake et al, 1986) и более эффективно связывается с внеклеточным матриксом (Sporn et al, 1987), чем более мелкие формы этого белка. Массированный экзоцитоз тВП из эндотелиальных клеток происходит в ответ на воздействие некоторыми стимулирующими секрецию агентами, в том числе тромбином (Levin et al, 1982), который обладает протеазной активностью и участвует в каскаде свертывания крови. В мембране тВП находится трансмембранный белок GMP-140, который при экзоцитозе тВП попадает на плазматическую мембрану (Hattori et al, 1989) и функционирует, там как молекула адгезии для нейтрофилов (Geng et al, 1990). Таким образом, запасание и высвобождение тВП является важным элементом участия эндотелиальных клеток как в процессе гемостаза, так и при развитии воспалительных процессов, протекающих в кровеносных сосудах.

Ряд доказательств свидетельствует в пользу того, что количество запасаемых тВП и полярность регулируемого экзоцитоза зависят от организации цитоскелета эндотелиальных клеток. Так целый ряд работ показывает, что в ответ на воздействия, приводящие к долговременным перестройкам цитоскелета, в эндотелиальных клетках происходят заметные изменения как в количестве тВП, так и в уровне высвобождения ФВ, хотя уровень ФВ-специфической мРНК при этом не изменяется (Reinders et al, 1987; Molony and Amstrong, 1991; Galbusera et al, 1997; Galbraith et al, 1998). А эндотелиальные клетки, растущие на коллагеновом геле и на поликарбонатных фильтрах, демонстрируют противоположную полярность экзоцитоза тВП в ответ на одно и тоже воздействие форболовым эфиром, стимулирующим секрецию (Sporn et al, 1987; van Buul-Wortelboer et al, 1989). Эта разница, вероятно, обусловлена различной* организацией цитоскелета, заданной двумя разными субстратами, на которых выращивались клетки. Ряд данных показывает, что во время некоторых сосудистых заболеваний, таких как атеросклероз (Yost and Herman, 1988) происходят изменения в организации цитоскелета, а при сравнительном анализе эндотелиальных клеток из эмбриональных аорт или из аорт взрослых с атеросклеротическими поражениями или липидными бляшками было показано, что в эндотелиальных клетках, выделенных из пораженных сосудов, наблюдаются изменения в длине и триплетном составе цилиндра материнской центриоли (Bystrevskaya et al., 1992). Учитывая эти данные и то, что при условиях, когда у людей развиваются сосудистые дисфункции (т.е. гиперхолистеринемии, диабете, гипертензии) в крови, пациентов обнаруживается повышенное содержание циркулирующего ФВ (Boneu et al, 1975; Blann et al, 1993,1997), кажется весьма актуальной задача изучения возможной роли цитоскелета в запасании и секреции тВП.

На настоящий момент известны две цитоскелетные системы для внутриклеточного транспорта — микротрубочко-зависимое передвижение органелл при помощи моторных белков и перемещение по актиновым филаментам (для обзора см. Rogers and Gelfand, 2000). Вовлечена ли какая-либо из этих систем в перемещение тВП от аппарата Гольджи к клеточной поверхности пока остается неизвестным, хотя показано, что разрушение МТ блокирует как образования тВП, так и их регулируемый экзоцитоз. Для того чтобы выявить возможную связь между распределением и направленным перемещением тВП и компонетами цитоскелета в эндотелиальных клетках мы использовали два подхода -изучали состояние цитоскелета во время индуцированного с помощью тромбина экзоцитоза тВП, а также проверяли, как цитоскелетные перестройки, вызванные с помощью повреждающих агентов, влияют на локализацию и перемещение тВП. Чтобы выяснить, вовлечена ли центросома эндотелиальных клеток в цитоскелет-опосредованный ответ на воздействие тромбина, мы также провели сравнение уровня посттрансляционных модификаций тубулина центриолярного цилиндра в эндотелиальных клетках до и после добавления тромбина.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Виноградова, Татьяна Михайловна

выводы

Тромбин индуцирует направленное к центросоме движение части тВП В эндотелиальных клетках аорты человека в течении 5 минут после добавления, в то время как остальные тВП перемещаются к плазматической мембране и подвергаются экзоцитозу. тромбин вызывает быстрые изменения организации центросомы в эндотелиальных клетках аорты, что выражается в следующем: 1) в течении 1 минуты уменьшается интенсивность окрашивания центриолей антителами к тирозинированному тубулину; 2) в течении 3 минут увеличивается интенсивность окрашивания центриолей антителами к ацетилированному тубулину; 3) в течении 5 минут происходит увеличение количества центриолярных сателлитов, при индукции экзоцитоза тВП тромбином в эндотелиальных клетках пупочной вены не происходит изменения количества центриолярных сателлитов и отсутствует направленное к центросоме движение тВП.

В эндотелиальных клетках пупочной вены тромбин вызывает уменьшение окрашивания центриолей антителами к тирозинированному тубулину и увеличение окрашивания центриолей антителами к ацетилированному тубулину в течении одной минуты после добавления. После пяти минут обработки тромбином выявляется различие в интенсивности окрашивания материнской и дочерней центриолей антителами к ацетилированному тромбину, причем дочерняя центриоль окрашена ярче материнской.

При индукции коллапса промежуточных филаментов в условиях разрушения сети микротрубочек колцемидом происходит перемещение тВП в околоядерную область вместе с промежуточными филаментами.

Разрушение сети промежуточных филаментов в клетках эндотелия аорты и пупочной вены при действии каликулина А сопровождается перемещением тВП к центросоме с образованием компактных кластеров кластеров тВП вокруг материнской центриоли. В клетках, обработанных каликулином А периферические и перицентриолярные тВП колокализованы с микротрубочками. Разрушение актинового цитоскелета с помощью цитохалазина В вызывает в клетках эндотелия аорты образование перицентриолярных кластеров тВП.

Заключение

В настоящей работе впервые показано, что секреторные органеллы могут использовать систему МТ для движения в сторону, противоположную направлению экзоцитоза. Исходя из наших данных, можно предполагать, что движение части тВП к центросоме и образование перицентриолярного кластера тВП является механизмом ограничения уровня секреции ФВ в эндотелиальных клетках, и уровень стимулированного высвобождения секреторного продукта из запасающего клеточного пула зависит от соотношения гранул, двигающихся в направлении к плазматической мембране и от нее. Эти результаты указывают, что система МТ играет важную роль в регуляции уровня стимулированной секреции.

Также результаты, представленные в настоящей работе, впервые демонстрируют, что в эндотелиальных клетках внешний сигнал (тромбин) вызывает быстрое изменение в организации центросомы, включающее изменение уровня иммуноокрашивания центриолей антителами к тирозинированному и ацетилированному тубулину и увеличение количества перицентриолярных сателлитов. Эти результаты представляют первые данные о том что центриоль может выступать как участник событий сигнального каскада при внешнем воздействии, и позволяют предполагать возможность регуляции МТ-заякоривающих или нуклеирующих свойств центросомы посредством внешнего сигнала. Поскольку практически одновременно с увеличением количества перицентриолярных сателлитов в НАЕС происходит перемещение части тВП вплотную к центросоме, кажется весьма вероятным, что именно образование дополнительных сателлитов и заякоривание на них дополнительного пула МТ обеспечивает "рельсы" для движения тВП к центросоме.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Виноградова, Татьяна Михайловна, Москва

1. Alieva Ш, Gorgidze LA, Komarova YA, Chernobelskaya OA, Vorobjev IA. (1999) Experimental model for studying the primary cilia in tissue culture cells. Membr Cell Biol.;/2(6):895-905.

2. Alieva IB, Vorobjev IA. (1995) Centrosome behaviour and orientation of centrioles under the action of energy transfer inhibitors. Cell Biol Int. 19(2): 103-12.

3. Allan VJ, Vale RD. (1991) Cell cycle control of microtubule-based membrane transport and tubule formation in vitro. J Cell Biol. 113(2):347-59.

4. Almahbobi G, Williams LJ, Han XG, Hall PF. (1993) Binding of lipid droplets and mitochondria to intermediate filaments in rat Leydig cells. J Reprod Fertil. P<5(1):209-17.

5. Almahbobi G, Hall PF. (1993) Indirect immunofluorescence modified to display two antigens with one light filter. Histochem J. 25(1): 14-8.

6. Andersen SS. (1999) Molecular characteristics of the centrosome. Int Rev Cytol. /57:51-109.

7. Arce CA, Barra HS. (1985) Release of C-terminal tyrosine from tubulin and microtubules at steady state. Biochem J. 226(1):311-7.

8. Argarana CE, Barra HS, Caputto R. (1978) Release of 14C.tyrosine from tubulinyl-[14C]tyrosine by brain extract. Separation of a carboxypeptidase from tubulin-tyrosine ligase. Mol Cell Biochem. 19(1): 17-21.

9. Balczon R, Bao L, Zimmer WE, Brown K, Zinkowski RP, Brinkley BR. (1995) Dissociation of centrosome replication events from cycles of DNA synthesis and mitotic division in hydroxyurea-arrested Chinese hamster ovary cells. J Cell Biol. 130(1): 105-15.

10. Bashour AM, Bloom GS. (1998) 58K, a microtubule-binding Golgi protein, is a formiminotransferase cyclodeaminase. J Biol Chem. 275(31):19612-7.

11. Bershadsky AD, Tint IS, Svitkina TM. (1987) Association of intermediate filaments with vinculin-containing adhesion plaques of fibroblasts. Cell Motil Cytoskeleton. <S(3):274-83.

12. Black MM, Baas PW, Humphries S. (1989) Dynamics of alpha-tubulin deacetylation in intact neurons. JNeurosci. P(l):358-68.

13. Blann AD, Naqvi T, Waite M, McCollum CN. (1993). von Willebrand factor and endothelial damage in essential hypertension. J Hum Hypertens, 7:107-111.

14. Blann AD, Goode GK, Miller JP, McCollum CN. (1997). Soluble P-selectin in hyperlipidaemia with and without symptomatic vascular disease: relationship with von Willebrand factor. Blood Coagul Fibrinol, 5:200 -204.

15. Bloom GS, Brashear ТА. (1989) A novel 58-kDa protein associates with the Golgi apparatus and microtubules. J Biol Chem. 264(21): 16083-92.

16. Bloom G. S., Goldstain L. S. B. (1998) Cruising along microtubule highways: how membranes move through the secretory pathway. J. Cell Biol. 140 : 1277-1280.

17. Bobinnec Y, Khodjakov A, Mir LM, Rieder CL, Edde B, Bornens M. (1998) Centriole disassembly in vivo and its effect on centrosome structure and function in vertebrate cells. J Cell Biol. 143(6): 1575-89.

18. Bobinnec Y, Moudjou M, Fouquet JP, Desbruyeres E, Edde B, Bornens M. (1998) Glutamylation of centriole and cytoplasmic tubulin in proliferating non-neuronal cells. Cell Motil Cytoskeleton. 5P(3):223-32.

19. Bogatcheva NV, Garcia JG, Verin AD. (2002) Molecular mechanisms of thrombin-induced endothelial cell permeability. Biochemistry (Mosc). 67(l):75-84.

20. Boneu B, Abbal M, Plante J, Bierme R. (1975). Factor-VIII complex and endothelial damage. Lancet, 7:1430.

21. Bonfanti R, Furie ВС, Furie B, Wagner DD. (1989) PADGEM (GMP140) is a component of Weibel-Palade bodies of human endothelial cells.Blood. 73(5): 1109-12.

22. Bonnet C, Boucher D, Lazereg S, Pedrotti B, Islam K, Denoulet P, Larcher JC. Differential binding regulation of microtubule-associated proteins MAPI A, MAP1B, and MAP2 by tubulin polyglutamylation. (2001) J Biol Chem. 276(16): 12839-48.

23. Brinkley BR, Cox SM, Pepper DA, Wible L, Brenner SL, Pardue RL. (1981) Tubulin assembly sites and the organization of cytoplasmic microtubules in cultured mammalian cells. J Cell Biol. P0(3):554-62.

24. Brinkley BR. (1985) Microtubule organizing centers. Annu Rev Cell Biol. 7:145-72.

25. Brown MJ, Hallam JA, Liu Y, Yamada KM, Shaw S. (2001). Cutting edge: integration of human T lymphocyte cytoskeleton by the cytolinker plectin. J Immunol., 767(2):641-5.

26. Brown A, Bernier G, Mathieu M, Rossant J, Kothary R; (1995) The mouse dystonia musculorum gene is a neural isoform of bullous pemphigoil antigen. J Nat Genet /0:301—306.

27. Burkhardt JK, Mcllvain JM Jr, Sheetz MP, Argon Y. (1993) Lytic granules from cytotoxic T cells exhibit kinesin-dependent motility on microtubules in vitro. J Cell Sci. 104 (1):151-62.

28. Burton PR, Paige JL. (1981) Polarity of axoplasmic microtubules in the olfactory nerve of the frog. Proc Natl Acad Sci USA. 7«§(5):3269-73.

29. Bystrevskaya VB, Lichkun W, Krushinsky AV, Smirnov VN. (1992) Centriole modification in human aortic endothelial cells. J Struct Biol. 709(1):1-12 .

30. Bystrevskaya VB, Balashova EE, Smirnov VN., (2000) Pattern of centriole immunostaining for acetylated or tyrosynated tubulin changes during mitosis in 3T3 (A-31) cells bun not in SV40 3T3 cells. Mol. Biol. Cell. ll(suppl):372a.

31. Cabre F, Tost D, Suesa N, Gutierrez M, Ucedo P, Mauleon D, Carganico G. (1993) Synthesis and release of platelet-activating factor and eicosanoids in human endothelial cells induced by different agonists. Agents Actions. 3<5(3-4):212-9.

32. Gard DL, Hafezi S, Zhang T, Doxsey SJ. (1990) Centrosome duplication continues in cycloheximide-treated Xenopus blastulae in the absence of a detectable cell cycle. J Cell Biol. //0(6):2033-42.

33. Caron JM. (1997) Posttranslational modification of tubulin by palmitoylation: I. In vivo and cell-free studies. Mol Biol Cell. S(4):621-36.

34. Сагу RB, Klymkowsky MW, Evans RM, Domingo A, Dent JA, Backhus LE: (1994) Vimentin's tail interacts with actin-containing structures in vivo. J Cell Sci. 107 (6): 1609-22

35. Catlett NL, Weisman LS. (1998) The terminal tail region of a yeast myosin-V mediates its attachment to vacuole membranes and sites of polarized growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 95(25): 14799-804.

36. Chang P, Giddings TH Jr, Winey M, Stearns T. (2003) Epsilon-tubulin is required for centriole duplication and microtubule organization. Nat Cell Biol. 5(l):71-6.

37. Chevrier V, Paintrand M, Koteliansky V, Block MR, Job D. (1995) Identification of vinculin as a pericentriolar component in mammalian cells. Exp Cell Res. 2/9(2):399-406

38. Chretien D, BuendiaB, Fuller SD, Karsenti E. (1997) Reconstruction of the centrosome cycle from cryoelectron micrographs. J Struct Biol. 120(2): 117-33.

39. Cole N. В., Lippincott-Schwartz J. (1995) Organization of organelles and membrane traffic by microtubules. Cur. Opin. Cell Biol. 7: 55-64.

40. Correia I, Chu D, Chou YH, Goldman RD, Matsudaira P. (1999) Integrating the actin and vimentin cytoskeletons. adhesion-dependent formation of fimbrin-vimentin complexes in macrophages. J Cell Biol. 74tf(4):831-42.

41. DeFoor PH, Stubblefield E. Effects of actinomycin D, amethopterin, and 5-fluro-2-deoxyuridine on procentriole formation: in Chinese hamster fibroblasts in culture. Exp Cell Res. 1974 Mar 30;85(1): 136-42.

42. Dillman JF, Pfister KK. (1994). Differential phosphorylation in vivo of cytoplasmic dynein associated with anterogradely moving organelles. J Cell Biol./27:1671-1681.

43. Diviani D, Scott JD. (2001) AKAP signaling complexes at the cytoskeleton. J Cell Sci. //4(8): 1431-7.

44. Dulic V, Lees E, Reed SI. (1992) Association of human cyclin E with a periodic Gl-S phase protein kinase. Science. 257(5078): 1958-61.

45. Eckert BS. (1986) Alteration of the distribution of intermediate filaments in PtKl cells by acrylamide. П: Effect on the organization of cytoplasmic organelles. Cell Motil Cytoskeleton. 6(1): 15-24.

46. Edde B, Rossier J, Le Caer JP, Desbruyeres E, Gros F, Denoulet P. (1990) Posttranslational glutamylation of alpha-tubulin. Science. 247(4938):83-5.

47. Eitzen G. (2003) Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 18: 175-81.

48. Eriksson JE, Brautigan DL, Vallee R, Olmsted J, Fujiki H, Goldman RD. (1992) Cytoskeletal integrity in interphase cells requires protein phosphatase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 89(22): 11093-7.

49. Espina Al, Castellanos AV, Fereira JL. (2003) Age-related changes in blood capillary endothelium of human dental pulp: an ultrastructural study. Int Endod J. 36(6):395-403.

50. Ettenson DS, Gotlieb Al. (1992) Centrosomes, microtubules, and microfilaments in the reendothelialization and remodeling of double-sided in vitro wounds. Lab Invest. 66(6): 72233.

51. Euteneuer U, Mcintosh JR. (1981) Structural polarity of kinetochore microtubules in PtKl cells. J Cell Biol. <SP(2):338-45.

52. Euteneuer U, Jackson WT, Mcintosh JR. (1982) Polarity of spindle microtubules in Haemanthus endosperm. J Cell Biol. P4(3):644-53.

53. Ewenstein BM, Warhol MJ, Handin Rl, Pober JS. (1987) Composition of the von Willebrand factor storage organelle (Weibel-Palade body) isolated from cultured human umbilical vein endothelial cells. J Cell Biol. 104(5): 1423-33.

54. Farshori P, Holzbaur EL. (1997). Dynactin phosphorylation is modulated in response to cellular effectors. Biochem Biophys Res Commun. 232: 810-816.

55. Faruki S, Geahlen RL, Asai DJ. (2000) Syk-dependent phosphorylation of microtubules in activated B-lymphocytes. J Cell Sci. //3(14):2557-65.

56. Fath KR, Trimbur GM, Burgess DR. (1994). Molecular motors are differentially distributed on Golgi membranes from polarized epithelial cells. J Cell Biol. 126: 661- 675.

57. Fuller MT. (1995) Riding the polar winds: chromosomes motor down east. Cell. 5/(l):5-8.

58. Galbraith CG, Skalak R, Chien S. (1998). Shear stress induces spatial reorganization of the endothelial cell cytoskeleton. Cell Motil Cytoskeleton. 40:317-330.

59. Galdal KS, Evensen SA, Hoglund AS, Nilsen E. (1984). Actin pools and actin microfilament organization in cultured human endothelial cells after exposure to thrombin. Br J Haematol, 55(4):617-25.

60. Gao XD, Albert S. (2003) A role for exocytosis in the spatial regulation of actin organization. Scientific WorldJournal., 18:1359-62.

61. Gasman S, Chasserot-Golaz S, Bader MF, Vitale N. (2003) Regulation of exocytosis in adrenal chromaffin cells: focus on ARF and Rho GTPases. Cell Signal., 75(10):893-9

62. Gasman S, Chasserot-Golaz S,.Malacombe M, Way M, Bader MF. (2004) Regulated exocytosis in neuroendocrine cells: a role for subplasmalemmal Cdc42/N-WASP-induced actin filaments. Mol Biol Cell. 75(2):520-31.

63. Geiger B, Rosen D, Berke G. Spatial relationships of microtubule-organizing centers and the contact area of cytotoxic T lymphocytes and target cells.

64. Gelfand VI, Scholey JM. (1992) Cell biology. Every motion has its motor. Nature. 55P(6395):480-2.

65. Georgatos SD, Blobel G. (1987) Lamin В constitutes an intermediate filament attachment site at the nuclear envelope. J Cell Biol. /05(1): 117-25.

66. Gilbert SP, Sloboda RD. (1984) Bidirectional transport of fluorescently labeled vesicles introduced into extruded axoplasm of squid Loligo pealei. J Cell Biol. PP(2):445-52.

67. Golden CL, Kohler JP, Nick HS, Visner GA. (1995) Effects of vasoactive and inflammatory mediators on endothelin-1 expression in pulmonary endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. /2(5):503-12.

68. Gotlieb Al, Subrahmanyan L, Kalnins VI. (1983) Microtubule-organizing centers and cell migration: effect of inhibition of migration and microtubule disruption in endothelial cells. J Cell Biol. 96(5): 1266-72.

69. Gromley A, Jurczyk A, Sillibourne J, Halilovic E, Mogensen M, Groisman I, Blomberg M, Doxsey S. (2003) A novel human protein of the maternal centriole is required for the final stages of cytokinesis and entry into S phase. J Cell Biol. /б/(3):535-45.

70. Gundersen GG, Khawaja S, Bulinski JC. (1987) Postpolymerization detyrosination of alpha-tubulin: a mechanism for subcellular differentiation of microtubules. J Cell Biol. /05(1):251-64.

71. Gurland G, Gundersen GG. 1995 Stable, detyrosinated microtubules function to localize vimentin intermediate filaments in fibroblasts. J Cell Biol. /3/(5): 1275-90.

72. Geng JG, Bevilacqua MP, Moore KL, Mclntyre TM, Prescott SM, Kim JM, Bliss GA, Zimmerman GA, McEver RP. (1990). Rapid neutrophil adhesion to activated endothelium mediated by GMP-140. Nature, 343:151-160.

73. Gospodarowicz D., Ill C. (1980) Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cell. J Clin Invest, 55:1351-1364.

74. Gotlieb Al, Subrahmanyan L, Kalnins VI. (1983). Microtubule-organizing centers and cell migration: effect of inhibition of migration and microtubule disruption in endothelial cells. J Cell Biol, 95(5): 1266-72.

75. Govindan B, Bowser R, Novick P. (1995) The role of Myo2, a yeast class V myosin, in vesicular transport. J Cell Biol. /25(6): 1055-68.

76. Hartwell LH, Weinert ТА. (1989) Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246(4930):629-34.

77. Hay M, De Boni U. (1991) Chromatin motion in neuronal interphase nuclei: changes induced by disruption of intermediate filaments. Cell Motil Cytoskeleton. 7S(l):63-75.

78. Havel MP, Griesmacher A, Weigel G, Owen A, Simon P, Teufelsbauer H, Vukovich T, Wolner E. (1992) Aprotinin increases release of von Willebrand factor in cultured human umbilical vein endothelial cells. Surgery. 112(3):573-7.

79. Heidemann SR, Landers JM, Hamborg MA. (1981) Polarity orientation of axonal microtubules. J Cell Biol. 9/(3):661-5.

80. Herman IM, Pollard TD, Wong AJ. (1982) Contractile proteins in endothelial cells. NY Acad Sci, 407:50-60.

81. Hinchcliffe EH, Miller FJ, Cham M, Khodjakov A, Sluder G. (2001) Requirement of a centrosomal activity for cell cycle progression through G1 into S phase. Science. 29/(5508): 1547-50.

82. Hirokawa N. (1994) Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins. Curr Opin Cell Biol. 6(1):74-81.

83. Hirokawa N. (1998) Kinesin and dynein superfamily proteins and the mechanism of organelle transport. Science. 279(5350):519-26.

84. Hirokawa N, Noda Y, Okada Y. (1998) Kinesin and dynein superfamily proteins in organelle transport and cell division. Curr Opin Cell Biol. /0(1):6О-73.

85. Hunziker W, Male P, Mellman I. (1990) Differential microtubule requirements for, transcytosis in MDCK cells. EMBO J. 9(11):3515-25.

86. Hyman AA, Karsenti E. (1996) Morphogenetic properties of microtubules and mitotic spindle assembly. Cell. <W(3):401-10.

87. Izushi K, Fujiwara Y, Tasaka K. (1992). Identification of vimentin in rat peritoneal mast cells and its phosphorylation in association with histamine release. Immunopharmacology, 23:153161.

88. Jaffe EA, Hoyer LW, Nachman RL. (1974) Synthesis of von Willebrand factor by cultured human endothelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 7/(5): 1906-9.

89. Jackson PK, Chevalier S, Philippe M, Kirschner MW. (1995) Early events in DNA replication; require cyclin E and are blocked by p21CIPl. J Cell Biol. 130(4):755-69.

90. Jaffe EA, Nachman RL, Becker CG, Minick CR: (1973) Culture of human endothelial cells derived from umbilical veins. Identification by moфhologic and immunologic criteria. J Clin Invest. J2(ll):2745-56.

91. Jones JC, Goldman AE, Yang HY, Goldman RD. (1985) The organizational fate of intermediate filament networks in two; epithelial cell types during mitosis. J Cell Biol. /00(1):93-102.

92. Jones JC, Goldman AE, Steinert PM, Yuspa S, Goldman RD. (1982) Dynamic aspects of the supramolecular organization of intermediate filament networks in cultured epidermal cells. Cell Motil. 2(3): 197-213.

93. Kapeller R, Toker A, Cantley LC, Carpenter CL. ( 1995) Phosphoinositide 3-kinase binds constitutively to alpha/beta-tubulin and binds to gamma-tubulin in response to insulin. J Biol Chem. 270(43):25985-91.

94. Kasprzak AA, Hajdo L. (2002) Directionality of kinesin motors. Acta Biochim Pol. 49(4):8 13-21.

95. Keryer G, Skalhegg BS, Landmark BF, Hansson V, Jahnsen T, Tasken K. (1999) Differential localization of protein kinase A type П isozymes in the Golgi-centrosomal area. Exp Cell Res. 249(1): 131-46.

96. Khodjakov A, Lizunova EM, Minin AA, Koonce MP, Gyoeva FK. (1998) A specific light chain of kinesin associates with mitochondria in cultured cells. Mol Biol Cell. 9(2):333-43.

97. Khodjakov A, Rieder CL. (1999) The sudden recruitment of gamma-tubulin to the centrosome at the onset of mitosis and its dynamic exchange throughout the cell cycle, do not require microtubules. J Cell Biol. 146(3):585-96.

98. Khodjakov A, Cole RW, Oakley BR, Rieder CL. (2000) Centrosome-independent mitotic spindle formation in vertebrates. Curr Biol. 10(2):59-67.

99. Khodjakov A, Rieder CL. (2001) Centrosomes enhance the fidelity of cytokinesis in vertebrates and are required for cell cycle progression. J Cell Biol. 753(l):237-42.

100. King-Smith C, Paz P, Lee CW, Lam W, Burnside B. (1997) Bidirectional pigment granule migration in isolated retinal pigment epithelial cells requires actin but not microtubules. Cell Motil Cytoskeleton. 5S(3):229-49.

101. Kreitzer G, Liao G, Gundersen GG. (1999) Detyrosination of tubulin regulates the interaction of intermediate filaments with microtubules in vivo via a kinesin-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 10(4): 1105-18.

102. Kupfer A, Dennert G, Singer SJ. ( 1985) The reorientation of the Golgi apparatus and the microtubule-organizing center in the cytotoxic effector cell is a prerequisite in the lysis of bound target cells. J Mol Cell Immunol. 2(l):37-49.

103. Kuznetsov SA, Langford GM, Weiss DG. (1992) Actin-dependent organelle movement in squid axoplasm. Nature. 356(6371):722-5.

104. Lacey KR, Jackson PK, Stearns T. (1999) Cyclin-dependent kinase control of centrosome duplication. Proc Natl Acad Sci U S A. P6(6):2817-22.

105. Lange BM, Gull K. (1995) A molecular marker for centriole maturation in the mammalian cell cycle. J Cell Biol. 130(4):919-27.

106. Lange BM. (2002) Integration of the centrosome in cell cycle control, stress response and signal transduction pathways. Curr Opin Cell Biol. 14(l):35-43.

107. Larsen TH, HuitfeldtHS, Myking O, Saetersdal T. (1993) Microtubule-associated distribution of specific granules and secretion of atrial natriuretic factor in primary cultures of rat cardiomyocytes. Cell Tissue Res. 272(2) :201 -10.

108. Lee TY, Rosenthal A, Gotlieb Al. (1996) Transition of aortic endothelial cells from resting to migrating cells is associated with three sequential patterns of microfilament organization. J Vase Res, 33(1): 13-24.

109. Levine JD, Harlan JM, Harker LA, Joseph ML, Counts RB. (1982): Thrombin-mediated release of factor VIE antigen from human umbilical vein endothelial cells in culture. Blood 60:531-534.

110. L'Hernault SW, Rosenbaum JL. (1985) Chlamydomonas alpha-tubulin is posttranslationally modified by acetylation on the epsilon-amino group of a lysine. Biochemistry. 24(2):473-8.

111. Liu SM, Magnusson KE, Sundqvist T. (1993) Microtubules are involved in transport of macromolecules by vesicles in cultured bovine aortic endothelial cells. J Cell Physiol. 755(2):311-6.

112. Lloyd RA, Gentleman S, Chader GJ. (1994) Assay of tubulin acetyltransferase activity in subcellular tissue fractions. Anal Biochem. 275(l):42-6.12125.

113. Loesberg C, Gonsalves MD, Zandbergen J, Willems C, van Aken WG, Stel HV, van Mourik JA, de Groot PG. (1983). The effect of calcium on the secretion of factor УШ-related antigen by cultured human endothelial cells. Biochim Biophys Acta, 763: 160-168.

114. Malik AB, Lo SK, Bizios R. (1986) Thrombin-induced alterations in endothelial permeability. Ann NY Acad Sci. 485:293-309.

115. Mandeville EC, Rieder CL. (1990) Keratin filaments restrict organelle migration into the forming spindle of newt pneumocytes. Cell Motil Cytoskeleton. /5(2): 111-20.

116. Marcus K, Moebius J, Meyer HE. (2003) Differential analysis of phosphorylated proteins in resting and thrombin-stimulated human platelets. Anal Bioanal Chem. 376(7): 973-93.

117. Marshall WF, Rosenbaum JL. (1999) Cell division: The renaissance of the centriole. Curr Biol. P(6):218-20. Matteoni R, Kreis ТЕ. Translocation and clustering of endosomes and lysosomes depends on microtubules. J Cell Biol. 1987 Sep;105(3):1253-65.

118. McEver RP, Beckstead JH, Moore KL, Marshall-Carlson L, Bainton DF. (1989) GMP-140, a platelet alpha-granule membrane protein, is also synthesized by vascular endothelial cells and1 is localized in Weibel-Palade bodies. J Clin Invest. 84(l):92-9.

119. McIntosh JR, Pfarr CM. (1991) Mitotic motors. J Cell Biol. 115(3):577-85.

120. McIntosh JR, Porter ME. (1989) Enzymes for microtubule-dependent motility. J Biol Chem. 264( ll):6001-4.

121. Mermall V, Post PL, Mooseker MS. (1998) Unconventional myosins in cell movement, membrane traffic, and signal transduction. Science. 279(5350):527-33.

122. Mitchison ! T, Kirschner M. (1984) Dynamic instability of microtubule growth. Nature, 312(5991):237-42.

123. Mizuno O, Hirano K, Nishimura J, Kubo C, Kanaide H. (2000). Proteolysis and phosphorylation-mediated regulation of thrombin receptor activity in in situ endothelial cells. Eur J Pharmacol, 389(1): 13-23.

124. Morris RL, Hollenbeck PJ. (1995) Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol. /57(5):1315-26.

125. Mogensen MM, Malik A, Piel M, Bouckson-Castaing V, Bornens M. (2000) Microtubule minus-end anchorage at centrosomal and non-centrosomal sites: the role of ninein. J Cell Sci. Sep;//3 (17):3013-23.

126. Molony L, Armstrong L. (1991). Cytoskeletal reorganization in human umbilical vein endothelial cells as a result of cytokine exposure. Exp Cell Res, /96:40-48.

127. Moritz M, Braunfeld MB, Sedat JW, Alberts B, Agard DA. (1995) Microtubule nucleation by gamma-tubulin-containing rings in the centrosome. Nature. 575(6557):638-40.

128. Muallem S., Kwiatkowska K., Xu X., Yin H. (1995) Actin filament disassemble is a ufficient final trigger for exocytosis in nonexcitable cells. J Cell Biol. /25(4):589-98.

129. Nachman RL, Jaffe EA. (1975) Subcellular platelet factor VIII antigen and von Willebrand factor. J Exp Med. 141{5):\ 101-13.

130. Neco P, Rossetto O, Gil'A; Montecucco C, Gutierrez LM. (2003) Taipoxin induces F-actin fragmentation and enhances release of catecholamines in bovine chromaffin cells. J Neurochem., 55(2): 329-37.

131. Niclas J, Allan VJ, Vale RD. (1996) Cell cycle regulation of dynein association with membranes modulates microtubule-based organelle transport. J Cell Biol. 133(3):585-93.

132. Paintrand M, Moudjou M, Delacroix H, Bornens M. (1992) Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations. J Struct Biol. 108(2): 107-28.

133. Pape R, Plattner H. (1990) Secretory organelle docking at the cell membrane of Paramecium cells: dedocking and synchronized redocking of trichocysts. Exp Cell Res. 191(2):263-72.

134. Pearson JD. (1993): The control of production and release of haemostatic factors in the endothelial cell. Baillieres Clin Haematol. 6(3):629-51.

135. Phillips SG, Rattner JB. (1976) , Dependence of centriole formation on protein synthesis. J Cell Biol. 70(1):9-19.

136. Piel M, Meyer P, Khodjakov A, Rieder CL, Bornens M. (2000) The respective contributions of the mother and daughter centrioles to centrosome activity and behavior in vertebrate cells. J Cell Biol. 149(2):317-30.

137. Polgar J, Lane WS, Chung SH, Houng AK, Reed GL.(2003) Phosphorylation of SNAP-23 in activated human platelets. J Biol Chem., 275(45): 44369-76.

138. Polyak K, Kato JY, Solomon MJ, Sherr CJ, Massague J, Roberts JM, Koff A. (1994) p27Kipl, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contact inhibition to cell cycle arrest. Genes Dev. S(l):9-22.

139. Poole CA, Jensen CG, Snyder JA, Gray CG, Hermanutz VL, Wheatley DN. (1997) Confocal analysis of primary cilia structure and colocalization with the Golgi apparatus in chondrocytes and aortic smooth muscle cells. Cell Biol Int. 2/(8):483-94.

140. Poole CA, Zhang ZJ, Ross JM. (2001) The differential distribution of acetylated and detyrosinated alpha-tubulin in the microtubular cytoskeleton and primary cilia of hyaline cartilage chondrocytes. J Anat. /99(4):393-405.

141. Pryzwansky KB, Merricks EP. (1998). Chemotactic peptide-induced changes of intermediate filament organization in neutrophils during granule secretion: role of cyclic guanosine monophosphate. Moll Biol CelL, 9: 2933-2947.

142. Raff JW, Glover DM. (1988) Nuclear and cytoplasmic mitotic cycles continue in Drosophila embryos in which DNA synthesis is inhibited with aphidicolin. J Cell Biol. /07(6):2OO9-19.

143. Raposo G, Cordonnier MN, Tenza D, Menichi B, Durrbach A, Louvard D,. Coudrier E. (1999) Association of myosin I alpha with endosomes and lysosomes in mammalian cells. Mol Biol Cell. /0(5): 1477-94.

144. Redeker V, Levilliers N; Schmitter JM, Le Caer JP, Rossier J, Adoutte A, Bre MH. (1994) Polyglycylation of tubulin: a posttranslational modification in axonemal microtubules. Science. 266(5191): 1688-91.

145. Reinders JH, Vervoorn RC, Verweij CL, van Mourik JA, de Groot PG. (1987). Perturbation of cultured human vascular endothelial cells by phorbol ester or thrombin alters the cellular von Willebrand factor distribution. J Cell Physiol. /55:79-87.

146. Reinton N, Collas P, Haugen ТВ, Skalhegg BS, Hansson V, Jahnsen T, Tasken K. (2000) Localization; of a novel; human; A-kinase-anchoring protein, hAKAP220, during spermatogenesis. DevBiol. 223(1): 194-204.

147. Rieder C.L. Borisy G.G. (1982) The centrosome cycle in PtK2 cells: assymetric distribution and structural change in the pericentriolar material. Biol. Cell. 44: 117-132

148. Risen LA, Binder PS, Nayak SK. (1987) Intermediate filaments and their organization in human corneal endothelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 25(12): 1933-8.

149. Robbins E., Jentzsch G., Micali A (1968) The centriole cycle in synchronized HeLa cells. J. Cell Biol. 36: 329-339

150. Robinson JM, Vandre DD. (1995) Stimulus-dependent alterations in macrophage microtubules: increased tubulin polymerization and detyrosination. J Cell Sci. /0£(2):645-55.

151. Rodionov VI, Gyoeva FK, Gelfand VI. (1991) Kinesin is responsible for centrifugal movement of pigment granules in melanophores. Proc Natl Acad Sci USA. 88(11):4956-60.

152. Rogers SL, Tint IS, Fanapour PC, Gelfand VI. (1997) Regulated bidirectional motility of melanophore pigment granules along microtubules in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. P4(8):3720-5.

153. Rogers SL, Gelfand VI. (1998) Myosin cooperates with microtubule motors during organelle transport in melanophores. Curr Biol. 5(3): 161-4;

154. Rogers SL, Gelfand VI. (2000) Membrane trafficking, organelle transport, and the cytoskeleton. Curr Opin Cell Biol. 12(l):57-62.

155. Rossanese OW, Reinke CA, Bevis BJ, Hammond AT, Sears IB, O'Connor J, Glick BS. (2001) A role for actin, Cdclp, and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Biol. /53(l):47-62.

156. Rosenbaum J. (2000) Cytoskeleton: functions for tubulin modifications at last. Curr Biol. 70(21):8Ol-3.

157. Rothwell SW, Nath J, Wright DG. (1989) Interactions of cytoplasmic granules with microtubules in human neutrophils. J Cell Biol. 108(6):2313-26.

158. Rothwell SW, Nath J, Wright DG. (1993) Rapid and reversible tubulin tyrosination in human neutrophils stimulated by the chemotactic peptide, fMet-Leu-Phe. J Cell Physiol. 154(3):582

159. Sakamoto T, Hinton DR, Sakamoto H, Gopalakrishna R, Ryan SJ, McDonnell PJ. (1995) Thrombin induced cytoskeletal change in cultured bovine corneal endothelial cells mediated via protein kinase С pathway. Curr Eye Res. /4(l):35-45.

160. Saetersdal T, Greve G, Dalen H. (1990) Associations between beta-tubulin and mitochondria in adult isolated heart myocytes as shown by immunofluorescence and immunoelectron microscopy. Histochemistry. 95(1): 1-10.

161. Saragoni L, Hernandez P, Maccioni RB. (2000) Differential association of tau with subsets of microtubules containing posttranslationally-modified tubulin variants in neuroblastoma cells. Neurochem Res. 25(l):59-70.

162. Sathish K, Padma B, Munugalavadla V, Bhargavi V, Radhika KV, Wasia R, Sairam M, Singh SS. (2004) Phosphorylation ofprofilin regulates its interaction with actin and poly (L-proline). Cell Signal., I6(5):589-96.

163. Savion N, Vlodavsky I, Greenburg G, Gospodarowicz D. (1982) Synthesis and distribution of cytoskeletal elements in endothelial cells as a function of cell growth and organization.! Cell Physiol.,//0(2)129-41.

164. Sawin KE, Scholey JM. (1991) Motor proteins in cell division. Trends Cell Biol. /(5): 122-9.

165. Schneider A, Plessmann U, Weber K. (1997) Subpellicular and flagellar microtubules of Trypanosoma brucei are extensively glutamylated. J Cell Sci. 110 ( 4):431-7.

166. Schmitz F, Wallis KT, Rho M, Drenckhahn D, Murphy DB. (1994).Intracellular distribution of kinesin in chromaffin cells. Eur J Cell Biol 63:11- 83.

167. Schnackenberg BJ, Khodjakov A, Rieder CL, Palazzo RE. (1998) The disassembly and reassembly of functional centrosomes in vitro. Proc Natl Acad Sci USA. 95( 16):9295-300.

168. Schnackenberg В J, Palazzo RE. (1999) Identification and function of the centrosome centromatrix. Biol Cell. 9/(6):429-38.

169. Schott D, Ho J, Pruyne D, Bretscher A. (1999) The COOH-terminal domain of Myo2p, a yeast myosin V, has a direct role in secretory vesicle targeting. J Cell iol. 147(A):191-808.

170. Shikata Y, Birukov KG, Birukova AA, Venn A, Garcia JG. (2003) Involvement of site-specific FAK phosphorylation in sphingosine-1 phosphate- and thrombin-induced focal adhesion remodeling: role of Src and GIT. FASEB J., 77(15):2240-9.

171. Sinha S, Wagner DD. (1987) Intact microtubules are necessary for complete processing, storage and regulated secretion of von Willebrand factor by endothelial cells. Eur J Cell Biol. 43(3):377-83.

172. Sluder G, Lewis K. (1987) Relationship between nuclear DNA synthesis and centrosome reproduction in sea urchin eggs. J Exp Zool. 244( 1):89-100.

173. Sluder G, Miller FJ, Cole R, Rieder CL. (1990) Protein synthesis and the cell cycle: centrosome reproduction in sea urchin eggs is not under translational control. J Cell Biol. //0(6):2O25-32.

174. Smith S, de Lange T. (1999) Cell cycle dependent localization of the telomeric PARP, tankyrase, to nuclear pore complexes and centrosomes. J Cell Sci. 112 ( 21):3649-56.

175. Snyder JA, Mcintosh JR. (1975) Initiation and growth of microtubules from mitotic centers in lysed mammalian cells. J Cell Biol. 67(3):744-60.

176. Sporn LA, Marder VJ, Wagner DD. (1987): Von Willebrand factor released from Weibel-Palade bodies bind more avidly to extracellular matrix that secreted constitutively. Blood 69,: 1531-1534.

177. Sporn LA, Marder VJ, Wagner DD. (1989) Differing polarity of the constitutive and regulated secretory pathways for von Willebrand factor in endothelial cells. J Cell Biol 108(A): 1283-9.

178. Stein PA, Toret CP, Salic AN, Rolls MM, Rapoport ТА. (2002) A novel centrosome-associated protein with affinity for microtubules. J Cell Sci. 775(17):3389-402.

179. Stowers L, Yelon D, Berg LJ, Chant J. Regulation of the polarization of T cells toward antigen-presenting cells by Ras-related GTPase CDC42. Proc Natl Acad Sci U S A. 1995 May 23;92(11):5027-31.

180. Stromer MH, Bendayan M. (1990) Immunocytochemical identification of cytoskeletal linkages to smooth muscle cell nuclei and mitochondria. Cell Motil Cytoskeleton. /7(1):11-8.

181. Swan JA, Solomon F. (1984) Reformation of the marginal band of avian erythrocytes in vitro using calf-brain tubulin: peripheral determinants of microtubule form. J Cell Biol. 99(6):2108-13.

182. Tabb JS, Molyneaux BJ, Cohen DL, Kuznetsov SA, Langford GM. (1998) Transport of ER vesicles on actin filaments in neurons by myosin V. J Cell Sci. Ill (21):3221-34.

183. Takahashi M, Shibata H, Shimakawa M, Miyamoto M, Mukai H, Ono Y. (1999) Characterization of a novel giant scaffolding protein, CG-NAP, that anchors multiple signaling enzymes to centrosome and the golgi apparatus. J Biol Chem. 274(24):17267-74.

184. Takahashi M, Mukai H, Oishi K, Isagawa T, Ono Y. (2000) Association of immature hypophosphorylated protein kinase cepsilon with an anchoring protein CG-NAP. J Biol Chem. 275(44):34592-6

185. Thierry D, Traineau R, Adam M, Vannifterick, Brossard Y, Gerotta A, Richard P, Devergie A, Benbunan M, Gluckman E. (1991) Study on the hematopoietic stem cells from umbilical cord blood; Bone Marrow Transplant: 7 (Suppl 2): 123.

186. Thurston G, Turner D. (1994) Thrombin-induced increase of F-actin in human umbilical veinsendothelial cells. Microvasc Res. 47(1): 1-20.

187. Thyberg J, Moskalewski S. (1985) Microtubules and the organization of the Golgi complex. Exp Cell Res. /59(1): 1-16.

188. Tiruppathi C, Minshall RD, Paria ВС, Vogel SM, Malik AB. (2002) Role of Ca2+ signaling in the regulation of endothelial permeability. Vascul Pharmacol. 59(4-5): 173-85.

189. Todorov PT, Hardisty RE, Brown SD. (2001) Myosin УПА is specifically associated with calmodulin and microtubule-associated protein-2B (MAP-2B). Biochem J. 354(2):267-74.

190. Toyoshima H, Hunter T. (1994) p27, a novel inhibitor of G1 cyclin-Cdk protein kinase activity, is related to p21. Cell. 7<S(l):67-74.

191. Traub P, Bauer C, Hartig R, Grub S, Stahl J. (1998) Colocalization of single ribosomes with intermediate filaments in puromycin-treated and serum-starved mouse embryo fibroblasts. Biol Cell. 90(4):319-37.

192. Trevor KT, McGuire JG, Leonova EV. (1995) Association of vimentin intermediate filaments with the centrosome. J Cell Sci. 108 (l):343-56.

193. Trinczek B, Ebneth A, Mandelkow EM, Mandelkow E. (1999) Tau regulates the attachment/detachment but not the speed of motors in microtubule-dependent transport of single vesicles and organelles. J Cell Sci. 112 (14):2355-67.

194. Tseng S, Kim R, Kim T, Morgan KG, Hai CM. (1997). F-actin disruption attenuates agonist-induced Ca2+., myosin phosphorylation, and force in smooth muscle. Am J Physiol. 272(6): 1960-7.

195. Vaisberg EA, Grissom PM, Mcintosh JR. (1996) Mammalian cells express three distinct dynein heavy chains that are localized to different cytoplasmic organelles. J Cell Biol. /33(4):831-42.

196. Vischer UM, Barth H, Wollheim CB. (2000) Regulated von Willebrand factor secretion is associated with agonist-specific patterns of cytoskeletal remodeling in cultured endothelial cells. Arterioscler Thromb Vase Biol. 20(3):883-91;

197. Vogel JM, Steams T, Rieder CL, Palazzo RE. (1997) Centrosomes isolated from Spisula solidissima oocytes contain rings and an unusual stoichiometric ratio of alpha/beta tubulin. J Cell Biol. /37(1): 193-202.

198. Vorobjev IA, Chentsov YuS. (1982) Centrioles in the cell cycle. I. Epithelial cells. J Cell Biol. 93(3):938-49.

199. Whitehead CM, Winkfein RJ, Rattner JB. (1996) The relationship of HsEg5 and the actin cytoskeleton to centrosome separation. Cell Motil Cytoskeleton.35(4):298-308.

200. Walker RA, Pryer NK, Salmon ED. (1991) Dilution of individual microtubules observed in real time in vitro: evidence that cap size is small and independent of elongation rate J Cell Biol. //4(1):73-81.

201. Wan KM, Nickerson JA, Krockmalnic G, Penman S. (1994) The B1C8 protein is in the dense assemblies of the nuclear matrix and relocates to the spindle and pericentriolar filaments at mitosis. Proc Natl Acad Sci USA. 9/(2):594-8

202. Wang HS, Li F, Runge MS, Chaikof EL. (1997) Endothelial cells exhibit differential chemokinetic and mitogenic responsiveness to alpha-thrombin. J Surg Res, 65(2): 139-44.

203. Wheatley D.N. (1982) Centriole: The central enigma of cell biology. Amsterdam: Elsevier, North Holland Biomedikal Press, p. 224

204. Woehlke G, Schliwa M. (2000) Walking on two heads: the many talents of kinesin. Nat Rev Mol Cell Biol. i(l):50-8.

205. Wong AJ, Pollard TD, Herman IM. (1983) Actin filament stress fibers in vascular endothelial cells in vivo. Science, 2iP(4586):867-9.

206. Wright HP. (1972). Mitosis patterns in aortic endothelium. Atherosclerosis 15:93—100.

207. Wu BY, Yu FX, Lynch TJ, Taylor JD, Tchen TT. (1990) Partial characterization of atcarotenoid droplet ATPase and its possible significance in carotenoid droplet dispersion in goldfish xanthophores. Cell Motil Cytoskeleton. 15(3): 147-55.

208. Wu X, Bowers B, Wei Q, Kocher B, Hammer JA 3rd. (1997) Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. J Cell Sci. 110 (7):847-59.

209. Wyatt ТА, Lincoln TM, Pryzwansky KB. (1991). Vimentin is transiently co-localized with and phosphorylated by cyclic GMPdependent protein kinase in formyl-peptide stimulated neutrophils. J Biol Chem., 266: 21274-21280.

210. Xia L, Hai B, Gao Y, Bumette D, Thazhath R, Duan J, Bre MH, Levilliers N, Gorovsky MA, Gaertig J. (2000) Polyglycylation of tubulin is essential and affects cell motility and division in Tetrahymena thermophila. J Cell Biol. 149(5): 1097-106.

211. Yang YJ, Dowling QC, Kouklis YuP, Cleveland DW, Fuchs E. (1996). An essential cytoskeletal linker protein connecting actin microfilaments to intermediate filaments. Cell, 86: 6556-6565.

212. Yatsunami J, Fujiki H, Suganuma M, Yoshizawa S, Eriksson JE, Olson MO, Goldman RD. (1991) Vimentin is hyperphosphorylated in primary human fibroblasts treated with okadaic acid. Biochem Biophys Res Commun. 177(3): 1165-70.

213. Yoon M, Moir RD, Prahlad V, Goldman RD. (1998) Motile properties of vimentin intermediate filament networks in living cells. J Cell Biol., 143(1): 147-57.

214. Yost JC, Herman IM. (1988). Age-related and site-specific adaptation of the arterial endothelial cytoskeleton during atherogenesis. Am J Pathol, 130:595- 604

215. Young WC, Herman IM. (1985) Extracellular matrix modulation of endothelial cell shape and motility following injury in vitro. J Cell Sci. 73:19-32.

216. Yu JC, Gotlieb Al. (1993) Thrombin promotes aortic endothelial cell spreading and microfilament formation in nonconfluent monolayer cultures. Exp Mol Pathol. 55(2): 139-52.

217. Zeng C, He D, Brinkley BR. (1994) Localization of NuMA protein isoforms in the nuclear matrix of mammalian cells. Cell Motil Cytoskeleton. 29(2): 167-76.

218. Zhou Y, Ching YP, Chun AC, Jin DY. (2003) Nuclear localization of the cell cycle regulator CDH1 and its regulation by phosphorylation. J Biol Chem. 275(14): 12530-6. Epub 2003 Jan 29.

219. Рис.1. Иммунофлуоресценпюе окрашивание эндотелиальных клеток аорты человека антителами к тубулину (а), виментину (б), фактору Виллибранда (г) и фаллоидин-родамином (д) в необработанных тромбином клетках. Увеличение х6400.

220. Рис.З. Усиление актиновых филаментов в 1IAEC при действии тромбина а — необработанные тромбином клетки, б — 3 минуты после добавления тромбина. Окрашивание актина родамин-фаллоидином. Увеличение х9000.

221. Рис.6. Коллапс промежуточных филаментов в НАЕС, обработанных колцемидом. Двойное иммунофлуоресцентное окрашивание виментина (а, в) и актина (б,г), а,б — необработанные клетки, в,г — 30 минут после добавления колцемида. Увеличение х4800.

222. Рис. 8 Ультраструктура эндотелиалыюй клетки после 30 минут воздействия колцемида Распределение тВП и митохондрий Увеличение х I 7000.

223. Рис.9, Сравнительное распределение тВ1 1, актина и виментина в 1IAHC, обработанных ЦБ 10 минут, а-б — Двойное окрашивание виментина (а) и актина (б), вч — двойное окрашивание виментина (в) и тВП (г). Увеличение А, Г> -- х6400. В,Г -- Х4800.

224. Рие. 10. Распределение тВП в НАЕС, необработанных ЦБ (а) или обработанных I IB 20 минут (б). Иммунофлуоресцентное окрашивание антителами кФВ. Увеличение х2400.

225. Рис.1!. Локализация тВП в НАЕС в районе клеточного центра при действии цВ (10 минут). Двойное иммунофлуоресиентное окрашивание мг (а) и гВП (б). Увеличениех3200.

226. Рис. 13. Отсутствие колокал изации тВП и промежуточных филаментов в НАЕС, обработанных 5 мннут КЛ. Двойное окрашивание антителами к виментину (а) и ФВ (б). Увеличение х4800

227. Rue. 14,.Колдкали»цщ, т!Щ с МТ л MAtC, обработать 5 лишу' КЛ-Двойное иммуноокрашивание антителами к тубулину (а, в) и ФВ (в,г). а,б — оптический уровень клеточного центра, в,г — периферические МТ и тВП. Увеличение A,li х 3200, В,Г х5400.

228. Рис. 15. Ультраструктура эндотелиальной клетки интимы аорты человека in situ. Стрелка указывает на центриоль. Увеличение х12500.

229. Рис. 16. Распределение тВП в клетках культуры HUVEC. а — необработанные тромбином клетки, б — 5 минут воздействия тромбина, в — 10 минут воздействия ЦБ, г — 5 минут воздействия KJ1. Увеличение х3200.

230. Рис 17. Ультраструктура перицентриолярной области клеток культуры HUVEC в контроле (а) и через 3 минуты воздействия тромбина (б) Увеличение х28000

231. Рис. 18. Отсутствие кластеров тВП в нентросомальной области HUVEC, обработанных ЦБ 20 минут Двойное нммуноокрашивание антителами к фВ (а) и тубулину (б) Увеличение х 2200.

232. Рис 19, Колокализация тВГ! с МТ в HUVEC, обработанных KJI 5 минут

233. Двойное иммуноокрашивание антителами к тубулину (а, в) и ФВ (б,г)а-б — уровень клеточного центра, в-г — периферические мт. Увеличение х3200

Информация о работе

Виноградова, Татьяна Михайловна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Изменение организации цитоскелета эндотелиальных клеток при индукции экзоцитоза телец Вейбеля-Палада - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы