Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследования в области синтеза олигодезоксирибонуклеотидов на твердой фазе в неавтоматическом режиме. Синтез генов пептидных гормонов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследования в области синтеза олигодезоксирибонуклеотидов на твердой фазе в неавтоматическом режиме. Синтез генов пептидных гормонов"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ имени В.А. Энгельгардта

На правах рукописи

Позмогова Галина'Евгеньевна

УДК 547.963'.32 577.ПЗ.6

ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ СИНТЕЗА 0ЛИГ0ДЕ30КСИРИБ0-НУКЛЕОТИДОВ НА ТВЕРДОЙ ФАЗЕ В НЕАВТОМАТИЧЕСКОМ РЕЖИМЕ. СИНТЕЗ ГЕНОВ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ

Специальность - 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

)

Москва 1988 год

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии имени В.А, Эн-гельгардта All СССР

Научные руководители:

академик А.А. Баев

кандидат химических наук,

ведущий научный сотрудник Б.К, Чернов

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор

доктор химических наук

М.Я. Карпейский' В.К. Потапов

Ведущая организация: МГУ имени М.В. Ломоносова (кафедра химии

природных соединений химического факультета)

Защита систоится 988 г. в ^У***часов

на заседании Специализированного совета Д 002.79.01 Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта АН СССР по адресу: Москва 117984 В-334, ул. Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта АН СССР.

Автореферат разослан V/" 1988 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук

Крицын/

. шзецрц!

^ ш*

• з. ЛСЯНМ

тд ел

ьность проблемы.В

проблем генетической инженерии, молекулярной и физико-химической биологии, решение которых непосредственно связано с применением олигодезбксирибоНуклеотидов заданной последовательности. Поэтому усовершенствование известных и создание новых эффективных методов направленного синтеза фрагментов ДНК на базе доступных компонентов является одной из актуальных задач биоорганической химии. Цель работы. Настоящая работа посвящена исследованию основных аспектов фосфотриэфирного синтеза олигонуклеотидов на твердой фазе в неавтоматическом режиме в рамках фосфатной и фосфамидитной методологий.

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе большое внимание уделено усовершенствованию методов -получения исходных строительных блоков и нуклеозидполимеров, что позволило в итоге вести синтез олигодезоксирибонукяеотидов на базе доступных компонентов.

Эксперименты в области фосфатного синтеза посвящены блочной стратегии наращивания олигонуклеотидной цепи. С использованием широкого набора нуклеозидполимеров на основе.стеклянных шариков с контролируемым размером пор (срй), отличающихся своими характеристиками (размером пор носителя, длиной якорной группы, удельной нагрузкой 3-концевого нуклеозида), и банка из 16 динуклеотидных блоков осуществлен синтез гена 28-члеиного пептидного гормона атриального натриуретического фактора человека. При этом впервые выяснена чёткая зависимость эффективности реакции конденсации от указанных выше параметров нуклеозидаолимеров.

Раздел,посвященный фосфамидитног<у методу, охватывает как мономерную, так и блочную стратегии. В процесса по.йучения II олигомэров. составлявших фрагменты генов гормонов роста крупного рогатого скота и свиньи, подобраны условия дшт основных операций реакционного цик-

ла, а также сопоставлена эффективность синтеза при использовании амидофосфитов с метальной и 2-цианэтильной Р-защнташ.

Описаны два новых способа получения полных банков фосфат-фюс-фитных димеров с 4-хлорфенильной и метальной межнуклеотидкыма защитами. Применение таких блоков значительно расширило возможности фосфамидитного метода, что было продемонстрировано при синтеза гена 2,5з РНК ветвящего фермента из мышцы кролика, содержащего 37 пар оснований.

Объем работы. Диссертация изложена на 74 стр. машинописного-текста .и состоит из введения, трех глав и выводов. Список литературы содержит 80 наименований.

Результаты и их обсуждение. I.Выбор полимерного носителя и получение нуклеозидлолимеров. Многочисленные исследования свидетельствуют, что в качестве нерастворимой матрицы.для синтеза олигонуклеотидов наиболее пригодны полимеры силикатной природы. Из возможных вариантов мы остановились на.стеклянных шариках (сро) с размером пор 400, 700, 1500 и о

2000 А. Такой выбор был обусловлен тем обстоятельством, что к моменту начала работы отсутствовали корректные данше о влиянии пористости ■•носителя на ход синтеза, хотя отдельные примеры свидетельствовали о наличии такой зависимости.

¡Г 5 Гр 0 гнг,«ьм Гр

уц» У«-5 ЛУ®

"Т у а 0

а~ 40ОА. »-1500А

НСШ - и-оксисукцинимид . 700А г-20001

ЬСС - дициклогексилкарбодиимид В'- см. пояснения к рис.2

Рис.1

Согласно схеме, изображенной на рис.1, нуклеозидполимери За-г получали реакцией аминолиза активированных сукцинатов 2 модифицированными 3-(триэтоксисилил)пропиламином срй. Использование в качестве активирующего- заместителя и-оксисукцинильной группы позволяло легко варьирогать степень пришивки 3-концевого звена к носителю в пределах от 15 до 70 мкМ/г при минимальном избытке нуклеозидов 2 по отношению к аминогруппам сро. Как оказалось, для синтеза в неавтоматическом режиме наиболее удобны полимеры с нагрузкой 15-30 мкМ/г. -

П. Фосфатный триэфирный синтез.

Наращивание нуклеотидной цепи на твердой фазе можно проводить мономерными Р-компонентами или блоками. По нашему мнению, для фосфатной триэфирной методологии в неавтоматическом режиме наиболее рационально использовать динуклеотида. Схема синтеза фосфатных блоков 10 представлена на рис.2. В 2-дезоксинуклеозидах 4 сначала блокировали экзоциклические аминофункции с помощью усовершенствованного нами метода Ти. Одно из преимуществ модификации состоит в том, что продукты ацилирования 5, полученные сразу же после обработки реакционной смеси, практически не содержат примесей. Это позволяло вводить их в реакцию с штгИ, не прибегая к очистке кристаллизацией. После хроматографии на силикагеле соединения 6 были выделены с выходом 75-93$ в расчете на исходные компоненты 4.

Фосфорилирование 3-гидроксильной группы нуклеозида 6 смесью арилдихлорфосфата и триазола в течете 10-15 мин количественно приводило к интермедиату 7. Для получения фосфодиэфиров 8 реакционную смесь разлагали ^О-пиридин-триэтиламин; после упаривания и экстракционной обработки Р-компонеНты 8 высаживали в гексан. Синтезированные таким образом соединения обладали высокой степенью чистота .(по данным ВЭЖХ), а их выход достигал 95-97$.

Интермедиаты 7 превращали в ОН-компонанты 9 обработкой циан-

Я О

&

4 он

НО

2- ЬгСС

«ЬгО)

5 он

виТгег

ви^

он 6

Ь'

ОрКРЬ

1№0 о

е.

V

у/** ■чиоссна^с«,^*

г. н1

Н$ыт/ Су

«г. ¿-биЫ^/Ру

О- -.0 р«рш' "о(снг) сн 9 г

л

О-р-.О о

р««И.О ' - О-Л^

ш

мзме- 1-(мезитилен-2-сульфонил)-З-нитро-1,2,4-триазолид Рас.2

Р

серю'"о" В'« АЪъ, СЪа,

„1Ъ

Ей

этанолом в присутствии ограниченного количества триэтиламина с последующим удалением шег -группы 2% раствором бекзолсульфокислоты.

Динуклеотидные фосфат-фосфатные блоки 10 получали с выходом 80-95$ конденсацией Р- и ОН-компонентов 8 и 9 в присутствии гшш. и обработкой очищенных на силикагеле продуктов тр&т-бутиламином в пиридине.

Эксперименты по оптимизации основных стадий реакционного цикла проводили с использованием нуклеозидполимарой За-г. Необходимость предварительных исследований была вызвана тем, что представленные в

литературе методические разработки, за редким исключением относились к мономерной стратегии. Реактором для синтеза служила стеклянная колонка размером 50-70x3-5 мм с пористым фильтром и шлифом МО. Растворители для,промывок поступали из колб под давлением сухого аргона со скоростью потока 2-3 мл/мин, порядок подачи которых регулировали о помощью шестиходового крана. Деблокирующий реагент наносили на колонку из полиэтиленовой промывашш. Компоненты аци-лирующего раствора смешивали в пробирке и подавали пипеткой. Перед стадией конденсации носитель промывали абсолотным растворителем и прод^гвали аргоном. Навески Р-компонентных блоков 10 с конденсирующим реагентом высушивали в вакууме, разбавляли раствором нуклео-фяльного катализатора и вносили в ¡реактор. Колонку снабжали съемным шприцем со шлифом, который использовали для перемешивания и рециклизации реакционной смеси. Мы варьировали:конденсирующие реагенты (изит,ХР5), нуклеофплыше катализаторы (сшр, те1ш ), раство^ рители (пиридин, дихлорэтан), соотношения реагентов реакционной смеси", продолжительность операций, состав деблокирующего раствора. Прохождение каддого цикла элонгации нуклеотидной цепи контролировали фотометрически по количеству щтг-катиона, а окончательные выводы делали на основании ВЭЖХ анализа полностью деблокированных реакционных смесей синтеза оллгомеров сначала в анионообменном, а затем в обращеннофазовом режимах.

Оказалось, что воспроизводимые выходы на стадии конденсации обеспечивает следугацее соотношение реагентов: ОН-компонент - Р-

I

компонент - конденсирующий реагент - катализатор, 1:10:50:150. Оптимальная в этих условиях продолжительность реакции при комнатной температуре составляла 30-35 мин.'

Из сравнения результатов синтеза с применением указанных выше конденсирующих реагентов, нуклеофильных катализаторов и растворителей установлено, что эффективность конденсации выше в пиридине

а

,б

в

г

13"

■30

А-

~Т5 зо

10-20 (ищ)

I

Енс.З Хроматографические профили выделения и очистки 17-меров:а,б- , синтез в присутствии мзго+ве1ш, в,г - синтез с ЮТ1+рмАР;а,в-анионообменная ВЭЖХ, б,г - обращеннофазовая ВЭЖХ фракций, обозначешшх стрелками.

в присутствии 1ШТ. Причем комбинация МЗнт+теЬп предпочтительнее по сравнению с мзм+смар , т.к. в первом варианте образуется меньше побочных продуктов. В качестве иллюстрации на рис.3 приведены хроматографические профили выделения и очистки гептадекануклеоти-дов, синтезированных с использованием различных нуклеофильных катализаторов.

Из детритшшрувщих реагентов мы выбрали дахлоруксусную и/шш трихлоруксусную кислоты. В зависимости от растворителя и природа гетероциклического основания продолжительность реакции деблокирования составляла от 16-30 с (3/5 трихлоруксусная кислота в хлороформе) до 3-5 мин (3$ дихлоруксусная кислота в нитрсметане). Лучшими свойствами обладали 2-35? растворы этих кислот в хлорированных углеводородах, таких как сн2сх2, с^ся^» 0НС1Э,

На основании подученных данных был разработан реакционный цикл блочного фосфатного синтеза олигомеров, см. таблицу I.

Изложенные выше методические разработки обеспечили основу для синтеза многочисленных олигонуклеотидов_,в том числе, гена 28-членного пептидного гормона атриального натриуретического фактора человека (а®1), нуклеотидная последовательность которого представле-

Таблица I. Реакционный цикл блочного фосфатного тризфнрного синтеза олигодезоксирибонуклеотидов.

Операция Реагент Продолжительность, мин

I. Детрдтшшрование 3% дихлоруксусцая кислота

в дихлорэтане 0,5

2. Промывка Дихлорэтан 0,5

3. Промывка Пиридин 0,5

4.Конденсация Р-К0МП0НеНТ%М81ГЕ+тв1в1 30 - 35 1,0

б.Кепирование в пиридине АС2О +те1ш ■ в пиридине

6. Промывка Пиридин ' ' 0,5

7.. Промывка •Дихлорэтан 0,5

Концентрация в реакционной смеси 0,05 М.

на на рис.4. Поскольку экспрессию синтетического гена планировали проводить в дрожжевых клетках, кодирующие триплеты подбирали о учетом частоты их встречаемости в ЗаооЬагалусез сегеу!з1ао.

Транслируемая и комплементарная цепи гена были разбита на 10 пе-

*

рекрнващихоя блоков 1-Х (см. рис.4) размером 17-19 звеньев . Их синтез проводили на основе нуклеозидпояимеров Зв в масштабе I мвМ. После удаления межнуюгаотидных 4-хлорфенильных групп тетраметилгу-агошгаиевой солью п-нитробензальдоксима, аммонолиэа и снятия 5-штг защиты реакционные смеси обессоливали на иПАЕ-сорбентах. Олигонук-леотиды выделяли с помощью двух последовательных хроматографий: сначала анионообменной,•а затем обращеннофазовой ВЗЖХ. Во всех случаях хроматографические профили фракционирования олигомеров 1-Х содержали превалирующий пик целевого продукта с незначительным содержанием фрагментов меньшего размера, см. рис.3,6.

Несмотря на то , что блочный синтез позволяет получать олиго-нуклеотида высокой чистоты я в достаточном для модекуяярнобиологи-

* Работы по секвенированию фрагментов 1-Х, ферментативная сборка гена ЛИТ, его клонирование и экспрессии осуществлены в лаборатории ■ генетической инженерии растений ИМБ АН СССР имени В.А. Эягельгард-та.

Ser Leu Arg Arg Ser Ser Cys ïhe Gly Gly Arg Met Aap Arg Ile

I-i-1- m —:—i- V -

AQCT TCI TTG CGI AGA ТСШ AGI TGT TTC GGC GGT AGA ATG GAO CGI ATT AGA AAC GCA TCT AGA TCA ACA AAG CCG GOA TCT TAC CTG GCA TAA I-И---1-:- IV -1-

Gly Ala Gin Ser Gly Leu Gly Cya Asn Ser Phe Arg Tyr Stop

- vil--f-—:—:-ix -

GGC GCT CAA AGT GGT TTG GGT ÏGT AAC TCT TTC AGA TAC TAG

CCG CGA GTS TCA CCA AAC CCA ACA ITS AGA AAG TÛT ATG АТС CTAG -VI-1--VIII-1-X--(

■ Рис.4 Структура и соответствующая ей аминокислотная последовательность синтетического гена атриального катриуретического фактора человека (АН?). Обозначена разбивка цепей гена на оли-

гонуклеотидные фрагменты 1-Х.

(Pro) (Ser)

Met ïhe Pro Ala liet Ser leu Ser Gly leu И}е Ala Asa. Ala

-XIII —--1

-XI-

• XII-:---г- XIV-

(C) (A)

AATTCGG ATG TTC CCA GCT ATG ТОТ СТА TCT GGT СТА TTC GCT AAT CCT

GCC IAO AAA GGT OGA XAO AGA GAT AGA CCA GAT AAG CGA TTA CGA (G) (T) J

XVIII-:--XX-

-:-(XIX) -1

-XVII

Val leu Arg Ala Gin His Gl» leu

—-XV -1- XVI-,

OTT OTT CGG GCC CAG CAT, CTT CAT CAG CTGA

CAA GAA GCC CGG GTC GTA GAA GTA GTC' GACTTCGA -1- XXI.-1-XXII-1

Рис.б Нуклеотидная и соответствующая ей аминокислотная последовательности синтетических участков генов гормонов роста крупного рогатого скота и свиньи. Для конструирования гена гормона роста крупного рогатого скота использовали олигомеры Х1,ХП,Х1У-ХУП,ХХ1 и ХХП. В гене гормона роста свиньи олиго-нуклеотиды ХП и ХУШ замшены на ХШ и XIX соответственно. Структурная и генноинженерная части этой работы выполнены i в отделе генетической инженерии ИМБ.АН СССР в группе П.М.Рубцова.

Л-

J

15 30 мин 10 20 .мин

Рис.6 Выделение и очистка 19-членного фрагмента гена аир (УШ): а-анионообменная ВЭ&Х реакционной смеси; б-обращеннсфазо-вая ВЭЖХ выделенного продукта.

ческих работ количествах, он обладает рядом недостатков. Один из них - продолжительный реакционный цикл (35 - 40 мин),- можно компенсировать, проводя одновременно сборку 2-3 последовательностей. Другая проблема связана с низким по сравнению с ожидаемым выходом олигомеров. Так, например, блоки 1-Х были получены в количестве 1,5-3,5 O.E., исходя из I мкМ нуклеозидполимеров.

Контролируя процесо элонгации нуклеотидных цепей, мы обратили внимание на тот факт, что первая конденсация всегда проходила малоэффективно, лишь на 40-60$. Далее постадийный выход стабилизировался и приближался к уровню 90-95$. Очевидно, что решение проблемы "первого шага" значительно повысило бы возможности метода, В процессе оптимизации стадии конденсации нами установлено, что увеличение результирующей концентрации Р-комдонента с 0,05 до 0,2 М или его избытка, а также продолжительности реакции до 4060 мин не только не повышает выход целевых олигомеров, но часто приводит к его уменьшению. Неудачйой оказалась'попытка увеличить эффективность первой конденсации! используя мономернне Р-компонен-ты 8. Вероятно, наблюдаемый эффект обусловлен отдельными свойства-

ми полимерной матрицы. С другой стороны, он может зависеть от геометрических и/или структурных параметров якорной группы. Частично такая версия нашла подтверждение в ряде публикаций.

Чтобы выяснить, какие из указанных выше факторов влияют на ход олигонуклеотидного синтеза, был проведен модельный эксперимент. В условиях стандартного реакционного цикла в одном масштабе получали пентануклеотид тсоат по схеме: 1+2+2.-В качестве носителей использовали две группы полимеров. Первую составляли нуклеозидполи-

меры За-г. где В= Тй, на основе сукцинильных эфаров, которые име-

, р

.ли примерно одинаковую нагрузку 3-концевого нуклеозида на М матрицы и различные поры, см. таблицу 2, №№1-4. Во вторую вошли носители На.б и 12 с различной пористостью и удельной нагрузкой ТЬ, характеризующиеся удлиненными якорными группами. Синтез линкерных

ть ссьг) • тк

МЛгО-у^ СИТ,О

Го V

На.б 1улнАЛ/уМллс«; а-ЗООА. О А о

6-1500 А _

Рис.7

групп нуклеоэидполимеров II и 12 осуществляли с помощью стандартных приемов пептидной химии.

^ и

Н^^СРв

12

а Нуклзозид-полимер Размер П°РА Удельная поверхн.. м'/г Нагруг мкМ/г ка з-т* мкМ/м~

I За 368 64,1 65,0 1,01

2 36 729 33,9 30,3 0,91

3 Зв 1471 .18,3 20,6 1,13

4 Зг 2023 13,7 13,1 0,95

5 На 368 64,1 52,0 0,81

6 Пб 1471 •18,3 21,7 1,19

7 12 368 64,1 . 24,5 0,38

100

I " 2 (реакционные циклы)

Таблица 2.Характеристика нуклеозидполиме- Рис.7 Зависимость эффек-ров. тивности конденсации от

свойств нуклеозидполиме-ров.

Результаты синтезов пентануклеотида tcgat, контроль за ходом которых осуществляли как описано выше, представлены в виде графика на рис.7.Для нуклеозидполимеров Эа-г с сукцинилыюй якорной группой эффективность первой конденсации была низкой и составляла 45-61$ (кривые 1-4). Причем в указанных пределах наблюдается зависимость выхода от размера пор носителя с максимумом в районе 700-1500 1.

При переходе к нуклеозидполимерам с удлиненной якорной группой (кривые 5-7) выход первой конденсации резко возрастал до 9095$ и практически не зависел от удельной нагрузки 3-концевого нук-р

леозида на м матрицы и ее пористости. Поскольку максимальный выход в последней серии соответствовал полимеру 12 с наиболее длинным спейсером, можно предположить, что именно его геометрические параметры имеют принципиальное значение для эффективного протекания первого реакционного цикла. В пользу такого вывода свидетельст- • вуют последние литературные данные и результаты модельного синтеза с использованием коммерческих cpg/loitgchain, pieroa (кривая

8), 24.

Таким образом, решив проблему "первого шага" нам удалось увеличить эффективность блочного фосфатного метода. Так, например, олигонуклеотиды aattcggatgttcccc и tagggctgatc , синтезированные в масштабе 0,5 мкМ на носителях Па и 12, были выделены в количестве 6,4 и 5,2 О.Е.

Ш. Фосфамидитный синтез.

В рамках этой методологии рассматриваются два способа построения нуклеотидных цепей, а именно: традиционный мономерный и разработанный нами блочный.

Мономерный' вариант.

В качестве Р-компонэнтов использовали фосфамидатн с метальной 13 и цианэтильной 14 защитами. Их получали известными метода-га , характеризовали спектрами 31р яМР.в сочетании с ВЭНХ,см.рис.8.

oTp-Ofi л

22 R=Me

14 R=(CH2)2GU

1 3~~TS"

мин мин 4 8 мин

Рис.8 ВЗКХ анализ фосфамидитов 13 (а,б) и 14 (в,г). КолонкаHucleo-sil 018 4 х 125 мм» изократическое элшрование водным 'ацето-нитрилом (75$) со скоростью потока 0,6 мл/мин.

Для олыгонуклеотидного синтеза использовали установку, описание которой приведено на стр.5. Растворы Р-компонента и тетразола перед конденсацией смешивали в шприце и наносили на осушенную аргоном смолу. Последовательность операций реакционного цикла и условия их проведения подбирали в процесса получения олигомеров XI-XXII, составляющих фрагменты генов гормонов роста крупного рогатого скота и свиньи, см. рис.5, стр.8. Основное внимание было уделено стадии конденсации.

Синтез проводили на носителях различной пористости , снабженных оукцинильной якорной группой За-г и удлиненными спейсерами 12 в масштабе 0.5 мкМ. При соотношении ОН-компонент:Р-компонент: тетразол, 1:10:25 высокий выход реакции конденсации в ацетонитри-ле (98-93$) достигался за 1,5-5 мин в зависимости от результирующей концентрации и типа фосфамидита, см. таблицу 4.

Из сравнения хроматографических профилей рис.9а,б и данных, представленных в табл.4 видно, что эффективность синтеза практи - • чески одинакова при использования ашдитов с метальной и иданэтиль-ной Р-защитами. Обращает на себя внимание и тот факт, что здесь от-

Таблица1 3. Реакционный цикл фосфамидитного синтеза олигонуклеотидов

Операция Реагент Продолжительность, мин

I. Детритшшрование 3,% дихлоруксусная кислота в

дихлорэтане 0,5

2.Промывка Дихлорэтан 0,5

3.Промывка Ацетокитрил 0,5

4.Конденсация 4 13 или 14 +0,4М тетразол 1,5-5,0.

б.Кепирование Ас20 + н:ш> в диоксане 0,5

6.Окисление 0,Ш 1'2, тетрагидрофуран-пи-

ридин-вода 0,5

7.Промывка Дихлорэтан 0,5

Таблица 4. Условия и результаты синтеза фрагментов санов гормонов роста крупного рогатого скота и „свиньи.

Олигомер Полимер Р-компонент Время кон- Средн.выход Выход олигомера1

№ число основан. тип размер пор тип М денсации на стадий*

■ А м мин и О.Е.

XI 15 36 729 13 0,05 2,0 98,5 12,1

хп ч 36 .729 13 0,02 5,0 98,0 13,4

хш 17 Зв 1471 14 0,10 1,5 99,1 14,3

НУ 15 Нб 1471 13 0,02 5,0 98,9 15,7

и 16 12 368 13 0,02 5,0 97,7 12,3

ш 17 Зв 1471 14 0,05 3,0 99,0 11,2

ОТ1 17 Зв 1471 14 0,05 3,0 99,5 16,0

ш 17 36 729 14 0,10 1,5 98,9 15,8

нх 17 36 729 13 0,05 2,0 99,3 11,4

хх 15 Зв 1471 14 0,05 3,0 9Э,5 12,1

ш 16. 36 729 13 0,02 5,0 98,9 11,8

Ш1 15 36 729 13 0,05 2,0 98,3 13,9

"определен фотометрически по количеству штг -катиона

**

После анионообмонной и обращеннофазовой ВЗЕК

Стадии да блокирования для синтеза на основе мономеров Ц}: I -*-2 -»3. В случае использования фосфамидитов 14: 2 -*-3 I - тиофенол + триэтилаг.ин + диоксан, 1:1:2 2-25% ашшак, 6и °С, 8 часов 3 - 80$ уксусная кислота, 20 мин

сутствует заметное влияние пористости носителя и геометрических параметров якорной группы ка результирующий выход олигонуклеоти-дов.

В заключение необходимо отметить, что эффективность реакции конденсации и синтеза в целом не снижается, если использовать растворы Р-компонентов в дихлорэтане. Применение дихлорэтана дай всех промывок и на стадии копирования позволило унифицировать

I ' Г N -

15

30

15

30

15

30

(мин)

Рис.9 Анионообменкая ВЭЖХ реакционных смесей синтеза олигонук-леотидов ХШ (а), ХУ (б), XXI (в).

реакционный цикл. В качестве примера на рис.Эв приведен хромато-

графический профиль выделения олигомера XXI, полученного в таких

условиях.

Блочный вариант.

При поиске возможных путей повышения эффективности неавтоматического фосфамидитного синтеза очевидным кажется переход от мономерной стратегии построения цепей к блочной.

Разработанная нами стратегия синтеза фосфамидитных димеров основана на реакции триэфирной конденсации фосфодиэфиров 8 с различными гидроксильными компонентами.

Метод А

РМТ-Ст. о

Ь'

\ъ>

Аг О' 4О"

О-Р'-О

но

ь

ОЙ

мэтг

ВИТ.О^ о

ь'

Ру

15атб а.к=рэЕс блг=5ввмз

\ъ>

0.р,0 ь,

СаР

ИеО 18

Й

ОН

НеОа

Ше

СИТгО-уД^'

А-О'^О

17

ШгО

л е»

0-р,0 п-

МеО' -Ол^О-^

20

иМТгОт. о

ъ'

он

ь'

V

■Ач

ЛгО'^Олп^

оГр^ОМе

12 V

Аг - 4-хлорфенил

phg.ro

В качестве гидроксилышх компонентов сначала использовали Заблокированные нуклеозиды 15а,б (метод А, рио.Ю). Среди обширного набора 3-защнт мы выбрали 2-фенилсульфоналэтилкарбонильнуи (рже) и трет-бутилдимвтилсилильнуи (твпмз), способные избирательно удаляться в составе даме ров 16а.(5 по различным механизмам. Конденсацию проводили в пиридине при соотношении реагентов Р-компо-нент § :ОН-ксмпонент:мэнт = 1,1:1,0:2,2. Выход защищенных продуктов, выделенных хроматографией на сшшкагеле, составлял 8595$. Обработка соединений 166 тетра-буталаммонийфторидом в тетра-гидрофуране приводила к дануклеозидам 17 со свободной . 2Ё-0Н-функ-

Согласно литературным данным рзвс-защита удаляется трлэтил-

амином в пиридине за 20 часов, а водно-органическими растворами аммиака или К2С0д ъа 1-7 мин. Мы применили более удобный способ снятия этой защиты, а именно, безводным трет-бутиламином в пиридине за 5-7 мин.

Динуклеозиды с метальной межнуклеотидной защитой получали переэтерификацией соединений 17 в метаноле в присутствии 10 эквивалентов фтористого цезия. По данным ВЭКХ анализа количественная замена 4-хлорфенильной группы на метальную происходит за 60-90 мин. Аналогичная переэтерификация Зчгвгай-блокированных динуклео-зидов 166,но в присутствии 15-20 эквивалентов СвР,сопровождалась одновременным удалением З-защитной группы (показано впервые) с образованием димера 18. Это превращение можно осуществить поэтапно: обработка 10 эквивалентами Се!1 в метаноле приводит к интерме-диату с 3-блокированной группой (на рис.10 не указан), которую можно удалить обычным образом или дополнительным избытком сэВ.

- Наиболее информативным методом доказательства строения ди-нуклеозидов 17 и 18-оказалась масс-спектрометрия вторичных ионов (рав-метод). Все масс-спектры исследованных соединений содержали пики (М+Н)+ ионов, пути фрагментации которых позволяют однозначно установить последовательность оснований в синтезированных продуктах.

Фосфамидитные блоки 19 и 20 с межнуклеотидной 4-хлорфениль-ной и метильной защитами получали фосфитилированием динуклеози-дов 17 и 18 метилбис(и ,н-диизопропил)фосфамидитом в присутствии диизопропиламмо1шевой соли тетразола. После экстракционной обработки реакционных смесей продукты высаживали в гексан при -709С. Выход фосфамидитов 19, 22 составлял 85-91%. Полученные соединения обладали высокой степенью чистоты, о чем свидетельствуют их хроматографические профили (рис.II) я 31Р ШР спектры (рис.12).

I? -ЙЬ1

ДМТгО

(Ъ

МеО

>-Ч-0->

Я4

Щ-

~в—¡пг

■эт (м.д.)

Рис.12 ° Р ЯМР спектр в дейтеро-

ацетонитриле при 40,5 МГц.

~ГО 20 мин

Рис.II ВЭЖХ анализ. Колонка гогЪахСв «л*2я>мм, градиент ацетонитрила в воде.

С практической точки зрения ключевые синтоны 17 удобно получать в одну стадию, если " в реакцию с Р-компонентами 8

вводить нуклеозиды 5 со.'свободными гидроксильными группами (ме-/

тод Б, рис.13). Принимая во внимание, что в этом случае конденсация может протекать неоднозначно, были подобраны условия, когда выходы соединений 17 составляли 80-90?, а 3-3-изомеров 21 не превышали 55?. При этом они легко отделялись от целевых продуктов в процессе выделения адсорбционной.хроматографией на силикагеле, ■

Чтобы достоверно убедиться в отсутствии примесей изомеров, динуклеозиды 17 деблокировали, выделяли анионообменной хроматографией на пЕАЕ-сорбента и подвергали затем ферментативному гидролизу "фосфодиэстеразой змеиного яда (\rpDE). По данным ВЭЖХ анализа . в каждом из рассмотренных случаев перевар ферментом протекал исчерпывающе с образованием соответствующих нукяеозид-б^пфосфатов и нуклеозидовв соотношении 1:£Окончательно отсутствие примесей, содержащих неприродную межнуклеотидную связь, доказывали непосредственно встречным синтезом. Сначала получали полностью защищенные димеры с З-З^-фосфотриэфирной связью 22.Послэ. деблокирования соеда-

ХНГг

N

о-Яо

ОАг V

22

(ШМТг

г. Ас ОН

ш

то [он N Я

имто,

МБНТ.Ру

НО.

23

ДОПО

Метод Б О

N

Ьа

I

¡г >н

1

I г АсОМ

Р

И>-Р -о-{

ОАг

/

ОН

ИМГгО

ЛНТгО \

18

0

-р-о- +

Ойг

0

-О-Р-О 10Н

ои^

но

\]

в! он

5

21

МБИТ, "Ру

МеОН, Се 7 -

ОМе

(¡РОгЫРМП»>Ог

Ьу

е*

ШгО

о

0-Р-о ОАгМ

он

17

N

20

о

0-Р-о ОНе\

т1

0-Й

-ОМе

ИМГгО

N

О

"й-р-О

Ьо-Р-0Ме' N4

19^

Рис.13

нения 23 выделяли в гомогенном состоянии. Их строение доказывали . ферментативным гидролизом фосфодиэстеразои селе зенки и по устойчивости к действию таоЕ. Сравнивая хроматографические профили каждой пары деблокированных изомеров, мы убедились, что целевые продукты не содержат неприродных компонентов, т.к. последние в ионообменном и обращеннофазовом режимах ВЭЖХ имеют различное время удерживания с 3-5^фосфодиэфирами.

Переэтерификация у атома фосфора метанолом в присутствии СвР приводила к соединениям 18 с выходом 71-82$ в расчете на исходные Р-компоненты 8. Они оказались полностью идентичными динуклеозидам,

Б

у

полученным по методу А. Их превращение в фосфамидиты 19 и 20 осуществляли как описано выше, см. стр.16.

Наращивание олигонуклеотидной цепи блоками 19 и 20 проводили в условиях реакционного цикла, описанного для мономерного варианта (табл.3) с незначительными методическими отличиями. Перед конденсацией высушенные навески Р-компонентов разбавляли фиксированным объемом 0,4 М тетразола в ацетонитриле, затем смесь вносили вреактор . При результирующей концентрации фосфамидита 0,05 М конденсация проходила за 5 мин с выходом, превышающим 99$.

Наглядно преимущества блочной стратегии по сравнению с мономерной иллюстрируют результаты синтезов 17-мера ХП, см. рис.14.

(мин)

Рис.14 Анионообменная ВЭЖХ реакционных смесей синтеза олигомера ХП после их обзссоливания на ОБАЕ-сорбенте: а-синтез не основе мономеров 13, б - с использованием блоков 20, а - дилеров 19.

Для дамеров с метальной межнуклеотидной защитой ВЭЖХ профиль реакционной смеси представлен единственным пиком целевого продукта (рис.146), тогда как в мономерном варианте (рисЛ4а) явно выражены пики промежуточных фрагментов. Поэтому наряду с сокращением времзнных затрат использование блоков приводит к существенному повышению выхода целевых олигонуклеотидов. Последнее обстоятельство позволило уменьшить масштаб синтеза в пять раз с 0,5 до 0,1 миМ.

-- 20 - '

(сравни табл.4 и табл.5), как, например, в случае синтеза 37-меров ХХУ и ХХУ1, составляющих ген 2,5 а РНК ветвящего фермента из мышцы кролика.

Представлялось целесообразным на примере гептадекалуклеотида ХП сопоставить эффективность синтеза на основе двух типов блоков - с ме-тильной и 4-хлорфекильной межнуклеотидными защитами Срис.14в). При использовании последних реакционная смесь содержала незначительное количество укороченных фрагментов, что можно объяснить неспецифическими разрывами олигонуклеотндной цепи при аммонолизе по межнуклеотид-ным фосфатным группам,.несущим арильную защиту. Однако.и в этом случае выход олигомара был ваша по сравнению с мономерным синтезом.

Таблица 5. Условия и результаты блочного фосфамидитного синтеза. -

№ Олигонуклеотид Полимер Масштаб , МКМ Р-ком-понент Выход, О.Е.

хе АастАтатстстлтстс 36 0(5. 20 37,4

хп АОСТАТвТСТСТАТСТа 36 0,6 19 "' 25,2

ххи! ААИССАХАСАОСССйСТСТОСОАССОтеСТААТй Зв 0,1 20 8Д

хну ОАгссотгАасАсастсасАОАсссаасгатАгсо 0,1 . 19 6,9

хху иТТСОаГАТОТССаОССА&АСОСтеОСАСОАТСТАС 0,1 20 ■• 9,7

ххп ЗАТССТАОАТСаТОССАССОТСТССССССАСА'ГАССО 0,1 20 7,8

Выводы.

1. На основе активированных эфиров 3-модифицированных нуклеозидов и

о

стеклянных шариков с контролируемым размером пор (от 400 А до 2000 А) получены нуклеозидполимеры с различными геометрическими параметрами якорной группы.

2. С помощью усовершенствованных методов синтезированы -16 динуклео-тидных фосфат-фосфатных блоков.

3. Известными приемами получены 3-^фосфамидиты кг0-защищенных 2-де-зоксинуклеозидов с метилыюй и 2-цианэтильной защитами на атоме РШ).

4. В результате исследования всех операций элонгации олигонуклео-тидной цепи на твердой фазе в неавтоматическом режима разработаны оптимальные реакционные цщиш для блочного фосфатного, мономерного и блочного фосфамидитного методов синтеза.

5. Разработано два новых подхода и получены полные банки фосфат-фосфитных димеров с 4-хлорфенильной и метильной межнуклёотидны-ми защитными группами, применение которых позволило существенно повысить эффективность олигонуклеотидного синтеза на твердой фазе.

6. Показано, что эффективность блочного фосфатного синтеза значительно зависит от геометрических параметров якорной группы и, в меньшей степени, от размеров пор носителя.

7. Осуществлен синтез 26 олигодезоксирибонуклеотидов, составлявших, структурную часть гена атриального натриуретического фактора человека, фрагментов генов гормонов роста крупного рогатого скота и свиньи, ген 2,-5 s РНК ¿етвящего фермента из мышцы кролика.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1Лернов Б.К., Голова Ю.Б., Позмогова Г.Е., Баев АД. Твердофазный 'синтез олигодезоксирибонуклеотидов с применением фосфамидитных динуклеотидных блоков. - Доклады АН СССР, 1986, т. 291,5, стр. II3I-II34.

2. Жвирблис Г.С., Горбулев В.Г., 1^бцов П.М,, Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Позмогова Г.Е., Скрябин К.Г., Баев A.A. Генетическая инженерия пептидных гормонов. Ш.Клонирование кДНК гормона роста свиньи и конструирование гена для экспрессии гормона в бактериях - Молекулярная биология, т. 22, вып.1, стр.145-150, 1988.

3. Позмогова Г.Е., Голова Ю.Б. Блочный фосфамидитный синтез олигодезоксирибонуклеотидов. Тезисы докладов, Рига, 1987, стр.91.

Молодежная конференция "Синтез и исследование биологически активных соединений'.'

4. Позмогова Г.Е. Синтез олигонуклеотидов на твердой фазе в неавтоматическом режиме с использованием фосфатных и фосфамидитных димерных блоков. Синтез генов пептидных гормонов.-Тезисы докладов, 1988, Варна. Международная молодежная конференция по генетике.

5. Рубцов П.М., Горбулев В.Г., Квирблис Г.С., Чернов Б.К., Голова Ю.Б., Позмогова Г.Е., Свердлова П.С., Чупеева В.В., Скрябин К.Г. Баев A.A. Гормоны сельскохозяйственных животных - Тезисы докладов, 1986, Пущино. Всесоюзная конференция "Новые направления биотехнологии". . _

6. Рубцов П.М., Горбулев В.Г., Чернов Б.К., Батчикова Н.В., Голова Ю.Б., Квирблис Г.С., Позмогова Г.Е.,' Свердлова П.С., Чупеева В.В., Скрябин К.Г., Баев А.А.-. - Клонирование и экспрессия

в Esoherihia coli генов, кодирующих пептидные. гормоны.-Тезисы докладов, 1986, Москва. 8 Двусторонний симпозиум СССР-Франция "Молекулярная биология белков и нуклеиновых кислот".

Т20934 от Ю/Х1-88г.Зак. 1608р.Тир.IOO.Тип.В/О "Знание"