Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Химико-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Голова, Юлия Борисовна

1. Введение.

2. Синтетические олигодезоксирибонуклеотиды и искусственные генетические структуры (Литературный обзор)

3. Химико-ферментативный синтез модельного гена каяьцитонина человека

Обсуждение результатов)

4. Материалы и методы

Экспериментальная часть)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Химико-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека"

Достижения последнего десятилетия в молекулярной биологии и биоорганической хиглии служат наглядным примером плодотворного сотрудничества исследователей, работающих в этих областях современного естествознания. Все более широкое использование в разнообразных биологических исследованиях находят синтетические олигодезоксирибонуклеотиды. В свою очередь, успехи кооперации химии и биологии стимулируют работы в области направленного химического синтеза фрагментов ДЕЖ /1-6/.Развитие техники рекомбинантных ЩК позволило конструировать генетические системы, способные функционировать в клетках прокариот и эукариот. Эти возможности используют ДО1Я получения организмов, обладающих новыгли свойства^ли, например, штаммов кишечной палочки, синтезирующих эутсяриотические белки. Более широко одна из основных задач генетической инженерии состоит в создании новой технологии, так называемой, биотехнологии производства полезных белков из вдикроорганизмов.Среди белковых продуктов,-представляющих большой интерес, следует выделить пептидные и полипептидные гормоны. До недавнего времени их выделяли, как правило, из органов животных, если гормон не обладал выраженной видовой специфичностью. Сравнительно короткие пептидные гормоны получают также химическим синтезом. Однако такой способ малорентабелен для молекул, состоящих уже из нескольких десятков звеньев, главным образом, из-за трудностей очистки от примесей. Наиболее перспективным оказалось использование клеток микроорганизмов для производства продуктов белковой природы путем введения в их геном и экспрессии чужеродных генов. Существенный вклад в решение этой задачи вносит направленный хтшческий синтез фраплентов ДНК. Успехи в развитии синтеза олигодезоксирибощгклеотидов позволили получить гены ряда пептидов и белков. В ре--6 зультате экспрессии этих генов получены соматостатин, инсулин, интерферон и др. /2,136,137,139,153/.К числу важнейших пептидных гормонов принадлежит кальцитонин. BtviecTe с паратироидным гордоном и витамином Д он осзпцествляет регуляцию метаболизма кальция и неорганического фосфата в организме.Основная физиологическая функция кальцитонина заключается в предотвращении гиперкальцемии, потенциально возможной при постзшлении в организм кальция, ингибировании скелетной ресорбщи и стшлуляции переноса кальция из крови в костную ткань Д69,186/.Цель данной диссертационной работы - химшсо-ферментативный синтез модельного гена кальцитонина человека. Настоящая работа составляет часть исследований, проводтлых в отделе генетической инженерии 1МБ АН СССР, по изучению экспрессии генов пептидных гормонов в прои эуЕсариотических системах. - 7 -• СИН1ЕТИЧЕС1ШЕ ОЖГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТЩЩ И ИСКУССТВЕННЫЕ IMETIHEGKHE СТЕТКТУй! (ЛИТЕРАТУРНШ4 ОБЗОР) Современное состояние нутслеотидного синтеза, его успехи и проблемы широко представлены в обзорах Отсуки, Ита15уры, Шабаровой и др. /1-5/. Б данном обзоре предпринята попытка обобщить наиболее интересные результаты работ по синтезу олигодезоксирибонуклеотидов за последние 3-4 года, которые, по нашему 1\шению, отражают общие тенденции его развития. Основное вншлание будет уделено следзпощшл этапам синтеза: а) получению защищенных нуклеозидов; б) получению мононуклеотидов; в) синтезу олигонуЕслеотидов.Второй раздел обзора посвящен использованию синтетических фрагментов ДЕЖ в конструировании искусственных генетических стрзгктур.Эта область применения синтетических олигонуклеотидов, являясь одной из наиболее важных, охватывает широкий круг возможных вариантов их приложения в биологических исследованиях. Подробные сведения о разнообразном использовании синтетических олигощгклеотидов в молекулярной биологии и генетической инженерии имеются в обзорах /2,3, 6-8/.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Голова, Юлия Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован метод получения N -защищенных нуклеозидов с использованием "временных" триметилсилильных защитных групп.

2. Установлены оптимальные условия синтеза ди- и тринуклео-тидных блоков фосфотриэфирным методом в растворе.

3. Синтезированы шестнадцать олигодезоксирибонуклеотидов -фрагментов модельного гена.

4. Поэтапной ферментативной сшивкой синтезированных олигонуклеотидов с помощью ДНК-лигазы Т4 получен модельный ген кальцитонина человека (НО пар нуклеотидов), структура которого доказана методом химической модификации по Максаму-Гилберту.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Голова, Юлия Борисовна, Москва

1. Aniarnath V., Bx-oom A.D. Chemical synthesis of oligonucleotides.Chem. Reviews, 1977,, v.77, 2, p. 183-217. 5.1takura K. Chemical synthesis of genes. - Trends in Biochem. Sci. 1982, V. 7, 12, p. 442-444.

2. Davies J.E., Gassen H.G. Synthetic gene fragments in geneticengineering - the renaissance of chemistry in molecular biology.Ange-w. Chem. Int. Ed. Engl., 1983, v. 22, p. 13-31.

3. Y/engenmayer P. Synthesis of peptide hormones using recombinantD M techniques. - Angev. Chem. Int. Ed. Engl., 1983, v. 22, 11, p.'842-859.

4. Smith M, Application of synthetic oligonucleotides to problemsin molecular biology. - ITucl. Acids Res. Simp, Ser., 1980, 7, p. 387-395.

5. Letsinger R.L., Limsford W.B. Synthesis of Thymidine oligonucleotides by phosphite triester intermediates. - J. Amer. Chem. Soc. 1976, V. 98, 12, p. 3655-3661.

6. Balgobin IT., Josephson S. The 2-phenylsulfonylcarbonyl (PSEC)group for the protection of the hydroxyl fiinction. - Tetr. Lett., 1981, V. 22, 37, 3667-3670.

7. Igolen J,, Morin Ch. Rapid synthesis of protected 2'-deoxycytidine derivatives. - J. Org. Chem., 1980, v. 45, 23, p. 4802-4804.

8. Schneigerwind R.G.K., Ugi I. Die 2,2,2-triciilor-t-butyloxycar-bonyl gruppe, eine neve H-shutzgruppe fur oligonucleotidsyntbesen. - Tetrahedron, 1983, v. 39, 13, P. 2207-2210.

9. Watcins B.E., Rapoport H, Synthesis of benzyl and benzyloxycarbonyl base-blocked 2'-deoxyribonucleosides. - J.Org.Chem., 1982, V. 47, 23, p. 4471-4477.

10. Sekine M., Matsuzaki J., Hata T. A new type of protection modefor the guanine residue by using 1,2-diisobutyryloxyethylene group. - Tetr. Lett., 1982, v. 23, 50, p. 5287-5290.

11. Kume A., Sekie M., Hata Q?. Phtaloyl group: a new amino protecting group of deoxyadenosine in oligonucleotide synthesis. - Tetr. 1.tt., 1982, V. 23, 42, p. 43б5-43б8.

12. McBride L.J., Caruthers Ы.Н. N (H-methyl-2-py?olidine amidine)deoxyadenosine - a new deoxynucleoside protecting group. - Tetr. 1.tt., 1983, V. 24, 29, p. 2953-2956.

13. Hiramelsbach P., Pfleiderer W. The use of the p-nitrophenylethozycarbonyl group for amino protection in cytidine and adenosine chemistry. - Tetr. Lett., 1983, v. 24, 34, p. 3583-3586.

14. Jones S.S., Reese СВ., Sibanda S., Ubasav/a A. The protectionof uracyl and guanine residues in oligonucleotide synthesis. Tetr. Lett., 1981, v. 22, 47, p. 4755-4758.

15. Dascalov H.P., Sekine M., Hata T. Hew guanosine derivatives:- 107 facile О -phosphorylation, thiophosphorylation, sulfonylation and silylation of guanosine derivatives. - Tetr. Lett., 1980, V. 21, 40, p. 3899-3901.

16. Reese СВ., Titmas R.C, Yan L, Oximate ion promoted unblockingof oligonucleotide phosphotriester intermediates. - Tetr. Lett., 1978, V. 30, p. 2727-2730.

17. Trichtinger Т., Charubala R., Pfleiderer W. Synthesis of 0p-nitrophenylethyl guanosine and 2'-deoxyguanosine derivatives. Tetr. Lett., 1983, v. 24, 7, p. 711-714.

18. Gaffney B.L,, Jones R.A. A new strategy for the protection ofdeoxyguanosine during oligonucleotide synthesis. - Tetr. Lett., - 108 19S2, V. 23, 22, p. 2257-2260.

19. Gaffney B.L,, Jones R.A. Synthesis of 0-6-alkylated deoxyguanosine nucleotides. - Tetr. Lett., 1982, v. 23,22, p. 2253-2256.

20. Рш^хардт. Растворители в органической химии, М.: 1шлия,1973, стр. 137-138.

21. PfleidererV/., Uhlmann Е., Gharubala R. Plockerzi В., SilherG., Varma R.S. Resent progress in oligonucleotide synthesis. ITucl. Acids Res. Symp. Ser., 1980, 7, p. 61-71.

22. Himmelsbach P., Pfleiderer W. Bis-(p-nitrophenylethyl)-phosphoromonochloridate, a new versatile phosphor^lating agent. Tetr. Lett., 1982, v. 23, 46, p. 4793-4796.

23. Uhlmann E., Pfleiderer W. IJew improvements in oligonucleotidesynthesis by use of the p-nitrophenylethyl phosphate blocking group and its deprotection by DBU or DBH, - Tetr. Lett., 1980, V. 21, p. 1181-1184.

24. Uhlmann E., Pfleiderer W. nucleotide,ZIV^^.SubstituAtephenylathyl-grtjppen. ITe^ we schutzgruppen fur oligonucleotidsynthesen nach dem phosphrsauretrie Acta, 1981, V. 64, 5, p. 1688-1703. ster-verfahren. - Helv. Chim. - iuy

25. Kras2e-wski A., Stawinski I. Phosphoryl tris-triazole - a newphosphorylating reagent. - Tetr. Lett., 1980, v. 21, 30, p. 29352936.

26. Marugg J.E,, McLaughlin L.W,, Piel H,, Tromp M., van der MarelG.A,, van Boom J.H. Polymer supported D M synthesis using hydroxybenzotriazole activated phosphotriester intermediates. - Tetr. 1.tt., 1983, V. 24, 37, p. 3989-3992,

27. Letsinger R.L,, Finnan I,L,, Heavner G,A,, Lunsford W,B, Phosphite coupling procedure for generating intemucleotide links, - J, Amer, Chem, Soc, 1975, v, 97, 11, p. 3278-3279.

28. Letsinger R.L., Groody E.P., kanaka T. Use of trichlormethylethyl as a protecting group and tributylphosphine as a deprotecting agent in oligonucleotide synthesis. - J. Amer, Chem. Soc, 1982, V. 104, p. 6805-6808.

29. Beaucage S.L. A simple and efficient preparation of deoxynucleoside phosphoramidites in situ. - Tetr, Lett., 1984, v. 25, 4, p. 375-378.

30. Adams S.P., Kavka K.S., Wykes E.J., Holder S.B,, GalluppiG.R. Hindered dialkylamino nucleoside phosphite reagents in the synthesis of two DNA 51-mers. - J. Amer, Chem. Soc, 1983, v. 105, - Ill— p. 661-663.

31. Beaucage S.L», Caruthers M.H. Deoxynucleoside phosphoramidites- a new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis. - Tetr. Lett., 1981, v. 22, 20, p. 1859-1S62.

32. Miyoshi K., Miyoshi Т., Hozumi T.,Itakura K.Solid-phase synthesis of polynucleotides. II. Synthesis of polythymidylic acids by the block coupling phosphotriester method. - Nucl. Acids Res.j 1980, V. 8, 22, p. 5473-5489.

33. Miyoshi K., Huang Т., Itakura K. Solid-phase synthesis of polynucleotides. III. Synthesis of polynucleotides with defined sequences by the block coupling phosphotriester method. - Nucl. Acids Res., 1980, v, 8, 22, p. 5491-5505.

34. Miyoshi K., Arentzen R., Huang Т., Itakura. Solid-phase synthesis of polynucleotides.IV.Usage of polystyrene resin for the synthesis of polydeoxyribonucleotides by the phosphotriester method. - ITucl. Acids Res., 1980, v. 8, 22, p. 5507-5517.

35. Efimov V.A., Reverdatto S.V., Chakhmakhcheva O.G. Arylsulfonylchlorides in the presence of N-methylimidazol as efficient condencing reagents in phosphotriester oligonucleotide synthesis. - Tetr. Lett., 1982, v. 23, 9, p. 961-964.

36. Efimov V.A,, Reverdatto S.V., Ghalchmakhcheva O.G. Hew effective method for the synthesis of oligonucleotides via phosphotriester intermediates. - Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, 21, p. 6675-6694.

37. Katagiri N., Itakiora K., Narang S.A. The use of arylsulfonyltriazoles for the synthesis of oligonucleotides by the rtiester approach. - J. Amer. Chem. Soc., 1975, v. 97, 25, p. 7332-7337.

38. Seth A.K., Jay E. A study of the efficiency and the problemof sulfonation of several condencing reagents and their mechanisms for the chemical synthesis of deoxyoligoribonucleotides. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, 22, p.5445-5459.

39. Sadana K.L., Hruska P.E., Loewen P.O. A simplified strategy- 114 for the synthesis of dideoxyribonucleotide blocks. - Tetr.Lett., 1981, V. 22, 35, p. 3367-3370.

40. Stawinski J., Hoziimi Т., Bahl СР., \Yu R. Arylsulfonyltetrazoles, new coupling reagents and further improvements in the triester method for the synthesis of deoxyribooligonucleotides. Nucl. Acids Res., 1977, v. 4, 2, p. 353-371.

41. Gait M.J., PopovS.G. Comparision of rates of phosphotriesterformation and sulfonation by coupling agents in oligodeoxyribonucleotide synthesis by phosphotriester method. - Tetr. Lett., 1980, V. 21, p.2841-2842.

42. Ito H., Ike J., Ikuta S., Itakura K, Solid phase synthesisof polynucleotides.VI.Further studies on polystyrene copolymers for the solid support. - Nucl. Acids Res., 1982, v. 10, 5, p. 1765-1769.

43. Belagaje R., Brush Ch.K. Polymer supported synthesis of oligonucleotides by the phosphotriester method, - Nucl. Acids Res., 1982, V. 10, 20, p. 6295-6303.

44. Каюшин А.Л., Берлин Ю.А., Колосов М.Н. Нуклеофильныи катализмежнуклеотидной конденсации в фосфотриэфирном синтезе олигонузслеотидов. - Биоорг. химия, 1982, т. 8, 5, стр. 660-666.

45. Добрынин В.Н., Быстров Н.С, Чернов Б.К., Северцова И.В.,Колосов М.Н. Нуклеофильныи катализ реахщий фосфорилирования фосфотриазолида1ли в триэфирном синтезе олигонуклеотидов. - Биоорг. хиьшя, 1979, т. 5, 8, стр. I254-I256.

46. Вгока Ch., Hozymi Т., Arentzen R., Itakura К. Simplificationin the synthesis of short oligonucleotide blocks. - Uucl. Acids Res., 1980, V. 8, 22, p. 5461-5471.

47. I.Ефимов В.А., Бурякова А.А., Ревердатто СВ., Чашахчева О.Г.Применение N-метилшлидазольного фосфотриэфирного метода для получения олигощгклеотидов, полезных при изучении рекомбинантных ДНК. - Биоорг. химия, 1983, т. 9, 10, стр. I367-I38I.

48. Овчинников Ю.А., Ефимов В.А., Чахглахчева О.Г.Химико-ферментативный синтез и клонирование гена проинсулина человека. - Докл. АН СССР, 1983, т. 270, 3, стр. 743-747.

49. Dorman М.А., Noble S.A., McBride L.J., Caruthers М.Н. Synthesis of oligodeoxynucleotides and oligodeoxyribonucleotide ana- 117 logs using phosphamidite intermediates. - Tetrahedron, 1984, V, 40, 1, p. 95-102.

50. Chow P., Kempe Т., Palm G. Synthesis of oligodeoxyribonucleotides on silica gel support. - Nucl. Acids Res., 1982, v. 9, 12, p. 2807-2817.

51. Gait M.J., Singh M., Sheppard R.C. Rapid synthesis of oligodeoxyribonucleotides.IV.Improved solid phase synthesis ofoligodeoxyribonucleotides through phosphotriester intermediates. Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, 5, p. 1081-1096.

52. Горн В.В., Зарытова В.Ф., Ярмолинская Е.В. Полуавтоматический синтез твердофазный триэфирный синтез олигодезоксирибонуклеотидов с активацией фосфатного коглпонента на полшлерном носителе. - Биоорг. хмшя, 1983, т. 9, II, стр. I5II-I5I7.

53. Rosenthal А., Cech D. Triester-festphasensjoithese von oligodeoxyribonucleotiden an polystyren-teflon tragem. - Tetr. Lett., 1983, V. 24, 16, p. 1691-1694. - 118

54. Crea R., Horn T. Synthesis of oligonucleotides on celluloseby a phosphotriester method. - Nucl, Acids Res., 1980, v. 8, 10, p. 2331-2348.

55. Prank R., Heikens V/., Heisterberg-Moutsis G., Blocker H.B.A new general approach for the simultaneuos chemical synthesis of large numbers of oligonucleotides: segmental solid support, - Nucl. Acids Res., 1983, v. 11, 13, p. 4365-4377.

56. Matthes H.V.D., Zenke W.M., Grimdstrom Т., Staub A., V/intzerith M., Chambon P. Simultaneous rapid chemical synthesis of over one hundred oligonucleotides on a microscale. - The EMBO J,, 1984, V. 3, 4, p. 801-805.

57. Kohli v., Balland A,, Wintzerith M., Sauerwald R., Staub A.,1.cocq J,P. Silica gel: improved support for the solid-phase phosphotriester synthesis of oligonucleotides. - ITucl, Acids Res., 1982, v. 10, 22, p. 7439-7448.

58. Matteucci M.D., Caruthers M.H. The synthesis of oligodeoxyribopyrimidines on a polymer support. - Tetr. Lett., 1980, v. 21, 8 p. 719-722.

59. Seliger H., Scalfi G., Eisenbeiss P. An improved syringe technique for the preparation of oligonucleotides of defined sequence. - Tetr. Lett,, 1983, v. 24, 45, p. 4963-4966.

60. Alvarado-Urbina G., Sathe G.M., Liu W.-Gh., Gillen M.P., DuckP.D., Bender R., Ogilvie K.K. Automated synthesis of gene fragments. - Science, 1981, v. 214, p. 270-274.

61. Koater Н,, Stumpe A,, Wolter A. Polymer support oligonucleotide synthesis 13: rapid and efficient synthesis of oligodeoxynucleotides on porous glass support using triester approach. Tetr. Lett., 1983, v. 24, 8, p. 747-750.

62. Elmhlad A,, Josephson S., Palin G. Synthesis of mixed oligodeoxyribonusleotides following the solid phase method, - Wucl. Acids Res., 1982, v. 10, 10, p. .3291-3301.

63. Ike Y., Ikuta S., Sato M., Huang Т., Itakura K. Solid phasesynthesis of polynucleotides.VIII.Synthesis of mixed oligodeoxyribonucleotides Ъу the phosphotriester solid phase method. Uucl. Acids Res., 1983, v. 11, 2, p. 447-488.

64. Дэвени Т., Гергей Я. Аглинокислоты, пептиды и белки, М.: Rtap,1976, стр. 35-36.

65. Liepnieks J.J., Light A. The preparation and properties ofbovine enterokinase, - J. Biol. Chem., 1979, v. 254, 5, p. 16771683.

66. Belaga3e R.M., Mayne N.G., Van Prank R.M., Rutter W.J. Synthesis of enterokinase linker usful for genetic engineering, DM, 1984, V. 3, 1, p. 120.

67. Shine J., Petter I., Lan bl.C.J., Roberts J.L., Baxter J.D.Expression of cloned &-endorphin gene sequences by Escherichia coli. - nature, 1980, v. 285, p. 456-461.

68. Crea R., Kraszev/ski A., Hirose Т., Itakura K. Chemical synthesis of genes for human insulin. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1978, V. 75, 12, p. 5765-5769.

69. Edge M.D., Greene A.R., Heathcliffe G.R., Meacock P.A., SchuchW., Scanlon D.B., Atcinson T.C., Hewton C.R., Markham A.P. Total synthesis of a human leukocyte interferon sene, - Natiire, - 122 1981, V. 292, p. 756-762.

70. Grantham R., Gautier G,, Gouy M. Codon frequencies confirmconindividual genes confirm consistene choices of degenerate bases according to genome type. - Nucl. Acids Res., 1980, v. 8, 9, p. 1893-1912.

71. Hitzeraan R.A., Hagie E.H., Levine D.V., Goeddel D.V., Ammerer G., Hall B.D. Expression of a human gene for interferon in yeast. - Nature, 1981, v. 293, 5835, p. 717-722.

72. Stepien P.P., Brousseau R., V/u R., Narang S.A., Thomas D.Y.Synthesis of a human insulin gene. VI. Expression of the synthetic proinsulin gene in yeast. - Gene, 1983, v. 24, p. 289-297.

73. Nakamura K., lilasui J., Inouye M. Use of a lac promoter-ope- 123 rator fragment as a transcriptional control sv/itch for expression of the constitutive Ipp gene in Escherichia coli. - J. Molec. Appl. Genetics, 1982, v. 1, 4, p. 289-299.

74. Grey M.R,, Golot H.V., Gauvente L,, Roshash M. Open readingframe cloning: identification, cloning and expression of open reading frame DNA. - Proc. ITatl. Acad. Sci. USA, 1982, v. 79, 21, p. 6598-6602.

75. Lathe R., Balland A., Kohli V., Lecocq J.P. Fusion of restriction termini using synthetic adaptor oligonucleotides. - Gene, 1982, V. 20, 2, p. 187-195.

76. Mc Intyre I. The action and control of the calcium-regulating- 125 hormones. - J. Endocrinol. Invest., 1978, v,1, p. 277-284.

77. Neher R., Riniker В., Rittel V/., Zuber H. Menschliches calcitonin. III. Structur von calcitonin M und D -^. - Helv. Chim. Acta, 1968, V. 51,p. 1900-1905.

78. Craig R.K., Hall L., Edbrooke M.R., Allison J., Maclntyre I.Partial nucleotide sequence of human calcitonin precursor mRITA identifies flanking cryptic peptides. - Nature, 1982, v. 295, 5847, p. 345-346.

79. Dietrich P.M., Rittel V/. Antigenic sites of sinthetic humancalcitonin M. - ITature, 1970, v. 225, p. 75-76.

80. Gross E. The cyanogen bromide reaction. - In: Methods Enthymology.N.y.: Acad.Press,1967, v. 11, p. 238-255.

81. Maxam A.M., Gilbert \V. Sequencing end-labeled DNA with basespecific chemical cleavages. - In: Methods En .ymology.N.Y.: Acad. Press, 1980, v. 65,p. 499-560.

82. Maniatis Т., Pritsh E.P., Sambrook J. Molectilar cloning, 1Т.У.Cold Spring Harbor, 1982,p. 104-106.

83. McDonnel M.W,, Simon M.N., Studier P.W. Analysis of restriction fragments of T7 Ш А and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. - J. Molec. Biol., 1977, V. 110, 1, p. 119-146.

84. Laskey R.A., Mills A.D. Enhanced autoradiographic detectionof -^ T» and I using intensifying screens and hypersensitized film. - FEBS Lett., 1977, v. 82, 2, p. 314-316.

85. Maxam A.M., Gilbert W. A new method for sequencing DITA.Proc. natl. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, 2, p. 560-564.

86. Sutcliffe J.G. pBR 322 restriction map derived from the D Msize markers sequence: accurate D M size markers up to 4361 nucleotide pairs long, - Nucl. Acids Res., 1978, v. 5, S, p. 2721-2728.

87. Mandecki W., Boiling T.J., Powell B.S., Mollison K.W., CarterG.W., Pox J.L. Chemical synthesis of the C5ot gene and its expression in E.coli. - DM, 1984, v. 3, 1, p. 121.

88. Sood A.K., llarang S.A. A rapid and convenient synthesis ofpoiy-thymidylic acid by the modified triester approach. - Hucl. Acids Res., 1977, v.4, 8, p. 2757-2765.

89. Уайт A., Хендлер Ф., Смит Э., Хжлл P., Леман И. Основы биохимии, М.: Мир, I98I, т.З, стр. I570-I574.

90. Добрынин В.Н., Коробко В.Г., Северцова И.В., Быстров Н.С,Болдырева Е.Ф., Чернов Б.К., Колосов М.Н. Синтез олиго- ж полинуклеотидов.XXII.Синтез олигодезоксинутслеотидов, содержащих сайты рестриктаз EcoRl и ^отН! .