Конструирование модельных генов и исследование механизмов их экспрессии в про- и эукариотических системах

Ривкин, Марк Иосифович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование модельных генов и исследование механизмов их экспрессии в про- и эукариотических системах
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование модельных генов и исследование механизмов их экспрессии в про- и эукариотических системах"

РТ6 Р0&СИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

и Ь1;> СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи УДК: 577.216.6.7.+577.21Т.52.56+577.218

РИВКИН Марк Иосифович

КОНСТРУИРОВАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ И ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ИХ ЭКСПРЕССИИ В ПРО- И ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

Специальность - 03.00.25 клеточная биология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Новосибирск -1994-

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

И.Ф.Жимулэв,

Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

доктор биологических наук, чл.-корр.РАН В;В.Власов,

Институт биоорганической химии СО РАН, г.Новосибирск

доктор биологических наук С.Н.Загребельный, Институт биохимии СО АМН, г.Новосибирск

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики, г.Москва

Защита состоится " ^" 1994 г. на_

заседании специализированного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук ( Д-002.11.01 ) при Институте цитологии и генетики со РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, г.Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики

Диссертация в форме научного доклада разослана " 1994г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук А.Д.Груздев

Актуальность проблемы. Процесс реализации генетической информации - от наиболее общих механизмов репликации, транскрипции и трансляции до механизмов, управляющих экспрессией индивидуальных генов - в течение многих лет находится в центре внимания современной молекулярной биологии и генетики. Достижения последнего времени в изучении этих механизмов в значительной мере были обусловлены и еще в течение длительного времени будут определятся успехами генетической инженерии. Генно-иняе-нерные подхода впервые открыли перед экспериментаторами возможности создания новых генетических программ с заданными комбинациями природных и искусственных функциональных элементов, что позволило сконструировать "чистые'', лишенные "скрытой" информации, модели для структурно-функциональных исследований отдельных генов и сложных генных комплексов. Одним из первых принципиальных выводов, полученных с помощью этого подхода, было то, что, несмотря на интенсивое. изучение, до сих пор не удалось сформулировать принципы построения эффективно транслируемой мРНК, то есть, выявить функциональные элементы, контролирующие эффективность ее трансляции. Принято

считать, что факторами, определяющими эффективность трансляции бактериальной мРНК являются последовательность нуклеотидов и вторичная структура РНК в районе рибосомсвязывающего сайта (RBS), (Gren, 1984, Stanssens et al., 1985), a в полицистронных оперонах структура межцистронного сопряжения (Schoner et al., 1984). Точечные замены в этой области могут изменять транслируемость мРНК на 1-2 порядка. Известно, что в высокоэкспрессируемых мРНК бактерий, дрожжей ' и других организмов, используются исключительно кодоны, соответсвующие мажорным фракциям в спектрах изоакцепторных тРНК ( Grosjean and Fiers, 1982). По-видимому, это является одним из путей регуляции активности генов на уровне трансляции. Ряд данных свидетельствует- в пользу того, что транслируемость мРНК бактерий (Williams et al., 1988, Brlnkman et al., 1989) и растений (Perlak et al., 1990), существенно зависит от стратегии использования кодонов. Однако, на основании этих многочисленных и, часто, противоречивых экспериментальных данных в настоящее время не удается прогнозировать транслируемость мРНК по ее первичной структуре и

конструировать мРНК с заданным уровнем трансляции. В настоящей работе автором предложены принципиально новые генно-инженерные модели и подходы к их конструированию; эти модели использованы для изучения механизмов трансляции в - бактериальной и растительной системах. С другой стороны, они позволяют не только получать фундаментальную информацию о механизмах генной экспрессии, но и направленно изменять наследственные свойства как прокариотических, так и эукариотических организмов. Возможность направленного переноса и стабильной интеграции в геном растений генов, кодирующих хозяйственно ценные признаки, открыла новые перспективы в селекции растений. В настоящее время проводятся полевые испытания трансгенных растений устойчивых к вирусам и насекомым-вредителям. Химико-ферментативный синтез дает возможность конструировать гены, максимально адаптированные к механизмам экспрессии организма-хозяина и, таким образом, является важнейшим инструментом для создания трансгенных организмов.

Настоящая работа частично посвящена разработке подходов к созданию продуцентов ß-интерферона человека, используемого при лечении некоторых вирусных и онкологических заболеваний.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в создании подходов и конструировании модельных генов для изучения функциональных сигналов трансляции мРНК, а также в конструировании бактерий и растенийv продуцирующих ß-интерферон человека. В задачи исследования входило:

1. Разработка стратегии ферментативной сборки генов из синтетических олигонуклеотидов, сборка функционально активных генов ангиотензина I и ß-интерферона человека.

2. Выделение гена ß-интерферона из геномного банка человека, анализ влияния структуры кодирующей части гена на уровень его экспрессии в клетках E.colt.

3. изучение влияния структуры гибридного сайта связывания рибосомы на экспрессию модельных генов в составе моно- и бицистронных оперонов.

4. Конструирование стабильного экспрессируюцего вектора с сильными промоторами бактериофага X и продуцента ß-интерферона на его основе.

5. Анализ экспрессии бицистронного оперона в растительной

клетке.

6. Получение трансгенных растений, экспре ссирующих ß-интерферон человека, и изучение его влияния на устойчивость этих растений к вирусу. •

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые

детально изучены свойства тиоаналогов нуклеиновых кислот с p-S-C(5') связями. Установлено, что они могут слузеть субстратами ферментов обмена нуклеиновых кислот и обладают рядом уникальных свойств, делающих их полезными инструментами изучения механизмов ферментативных реакций. Впервые химико-ферментативным синтезом получен ген, содержащей эти. тиоаналоги.

Разработан новый подход к ферментативной сборке генов из синтетических олигонуклеотидов и с его помощью впервые сконструирован активный ген р-интерфарона человека; суть предложенного комплексного подхода защищена авторскими свидетельствами.

• Предложена корректная модель для изучения влияния контекста на транслируемость мРНК E.colt. Впервые показано, что ^кластеризованные редкие кодоны понижают уровень трансляции.

На основании собственных данных по трансляции модельных моно- и бвдисгронных оперонов, а также ' литературных данных сформулированы и экспериментально проверены принципы конструирования оптимального рибосомсвязывающего сайта мРНК E.colt. Предложен новый подход к структурно-функциональному анализу мекцистронного сопряжения в полицистрошшх мРНК.

Сконструированы два типа новых экспрессирующих векторов E.colt, содержащие тандемно расположенные сильные регулируемые промоторы бактериофага А.: векторы прямой экспрессии и векторы для каскадной регуляции. Продемонстрирован высокий уровень экспрессии модельного гена в составе вектора прямой экспрессии его высокая стабильность в неселективных условиях. Базовые элементы этого вектора использованы при конструировании бактериального продуцента фрагмента Кленова ДНК- полимеразы I. Приоритеты на этот вектор и на продуцент годтвервдены авторскими свидетельствами.

Впервые получены трансгенные растения табака и люцерны, в

геном которых интегрирован ген р-интерферона человека и, таким образом, заложены основы для конструирования растений, устойчивых к широкому спектру фитовирусов. Установлено, что растения стабильно наследуют внесенный "ген и продуцируют интерферон. Установлено, что белок p-интерферон созревает из предшественника и влияет на восприимчивость трансгенных растений к заражению вирусами. Подобные исследования проводятся в настоящее время на картофеле. Апробация работы. Основные результаты работы представлялись на различных отечественных и и международных конференциях и рабочих совещаниях, в том числе на Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия", (Пущино, 1980), на VI двустороннем симпозиуме СССР-Франция "Структура белков и нуклеиновых кислот" (Цхалтубо, 1982), на Всесоюзных конференциях "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1984, 1986, 1990), на XVI Конференции ФЕБО (Москва, 1984), на X Всесоюзном совещании "Проблемы переноса генетической информации" (Пущино, 1985), на V Съезде ВОГиС (Москва, 1987), на VIII Международном вирусологическом конгрессе (Берлин, 1990), на I и II Мевдународных симпозиумах "Новейшие направления биотехнологии растений" (Пущино, 1991, 1992).

I. РАЗРАБОТКА СТРАТЕГИИ СБОРКИ ГЕНОВ ИЗ СИНТЕТИЧЕСКИХ

ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ.

Эксперименты, описанные в этом разделе, выполнены в период I978-1984 гг., когда основные стратегии конструирования искусственных генов только разрабатывались. К тому времени были опубликованы единичные работы, описывающие химико-ферментативный синтез генов и методы синтеза и ферментативной сборки были технически очень слокны и трудоемки (Khorana et al., 1968, Edge et al., 1981). Вставал вопрос о разработке альтернативных подходов к этой проблеме. Мы предложили два оригинальных подхода. Первый состоит в использовании вместо синтетических олигонуклеотидов с природной фосфодиэфирной связью их аналогов: олигонуклеотидов с p-s-C(5') связью. Второй подход комплексный, основная его идея состоит в разработке и использовании методов сборки протяженных одноцепочечных фрагментов ДНК из синтетических олигонуклеотидов.

I.I.Синтетические аналоги нуклеиновых кислот с p-S-C(5') связями как альтернативный путь конструирования генов. Тиофосфатные аналоги нуклеиновых кислот привлекли нааз внимание по нескольким причинам. Во-первых, замена атома кислорода на атом серы в 5' пологэнии дезоксиркбозы приводит лишь к минимальным изменениям структуры (Stuets and Scheit, 1975). Во-вторых, эти аналоги способны комплементарно взаимодействовать как друг с другом, так и с олигонуклэотидакз с природными мекнуклеотиднши связши (Kress et al., 1975). В-третьих, Кумарев и др. (1931, 1982) разработали комплекс эффективных методов синтеза этих аналогов. Кроме того большая устойчивость к ферментативное гидролизу и доступность этих соединений делает их весьма перспективными заменителями синтетических олигонуклеотидов.

Мы поставили перед собой задачу: изучить биохимические свойства этих аналогов и оценить перспективы их использования для конструирования искусственных генов. IЛ.I Устойчивость к нуклеазному гидролизу.

Устойчивость аналогов этого типа к нуклеазам уке отмечалась ранее (Chladek and Nagyvary., 1972). Мы исследовали, в основном, ферменты, применяемые в генетической инженерии, и количественно охарактеризовали свойства аналогов (табл.1). Таблица I. Сравнение начальных скоростей гидролиза (V111)

нонатимидилата (dTp)gdT и его аналога (dlps)gdl

Фермент V111 (dips )gdl ■ ч Vm (dTp)gdü

ДНК-полимераза I E.colt (экзонуклеазная акт-ть) Фосфодиэстераза змеиного яда Нуклеаза SI ДНК-полимераза фага Т4 (экзонуклеазная акт-ть) 0,1 0,2 0,02 , ; 2-ю-5

Наибольшая разница в скоростях наблюдается для ДНК-полимеразы фага Т4-, обладающей самой высокой удельной

активностью по экзонуклеазе. Фосфодиэстераза, как и предполагалось, оказалась умеренно чувствительной к изменениям структуры, что позволило в дальнейшем использовать ее для анализа последовательности аналогов. . I.I.2. Матричные ферменты.

Способность аналогов служить матрицами для РНК-полимеразы E.calt проверяли на тиооктануклеотиде di(Tps)3Cpg(Tps)3i и тиододекануклеотиде d[GpsTps(Срз)2Aps(Tps)7. В качестве затравок использовали г(рА)3 и статистический набор риботринуклеотидов, соответственно. Показано, что аналоги стимулируют включение меченого АТФ в кислотонерастворимую фракцию в реакционных смесях, содержащих РНК- полимеразу и набор необходимых для транскрипции компонентов. На этом основании был сделан вывод, что РНК-полимераза способна транскрибировать тиоаналоги.

Тиоаналоги оказались эффективными праймерами в реакции, катализируемой ДНК-полимеразой фага Т4. Сравнение начальных скоростей реакции репликации поли-сЦА) в присутствии (dlp)12dl и его тиоаналога в качестве праймеров показало, . что олигонуклеотид с природными межнуклеотидными связями лишь в два раза более эффективен, чем тиоолигонуклеотид. Возможным объяснением этого отличия является разная стабильность комплексов сравниваемых олигонуклеотидов с поли-й(А): темпретуры плавления комплексов (dIp)12dT - поли-й(А) и (dlps)12(il - поли-й(А) равны 46° и 22°, соответственно.

Способность ДНК-полимеразы I E.colt и ДНК-полимеразы фага Т4 проводить синтез ДНК на тиоолигонуклеотидной матрице изучали на примере репарирущей репликации pCpsCpsApsTps(Cps(Tps)g(Срз)2Aps(Tps)gG (I) в присутствий затравки декадезоксирибонуклеотида pCpApApApTpGpGpApApA (II). В контрольном эксперименте в качестве матрицы использовали олигонуклеотид (III) с природными межнуклеотидными связями и последовательностью оснований, идентичной тиоаналогу (I).

Электрофоретический анализ продуктов реакции* показал, что в присутствии аналога (I) затравка удлиняется лишь на два нуклеотидных звена (рис. 1а). Дальнейшего удлинения не происходит даже через 30 часов , в то время как в контроле с олигонуклеотидом (III) репликация завершается в течение одного

часа. Последовательность нуклеотидов продукта удлинения затравки на матрице (I) оказалзсь (САААТ)ССАААК! (рис. 16), т.е., репликация проходит правильно, хотя и не до конца.

РисЛ. Репликация тиофосфатного аналога олигонуклеотида ДНК-голимеразой I Е.cetl. (а) - гель-электрофорез продуктов реакции, дорожки I и 2 - достройка затравки II на олигонуклео-тиде III, дорожки 4 и 5 -достройка затравки на матрице аналоге, дорожка 3 - исходная затравка II; (б) - нуклеотидная карта продукта удлинения затравки на матрице - аналоге.

В отличие от ДНК-полимеразы I E.coll ДНК-полимераза фага Т4 не катализировала присоединение нуклеотидов к 3'-концу затравки.

Таким образом, тиоаналоги могут служить матрицами для ДНК-полимеразы I, хотя и менее эффективными, чем природные матрицы 1.1.3. Полинуклеотидкиназа и полинуклеотидлигаза фага Т4.

Полинуклеотидцсиназа в стандартных условиях фосформирует аналог го 5'-концевой гидроксильной груше, причем начальные скорости фосфорилирования (dTp)12® и его тиоаналога отличаются незначительно.

Субстратные свойства аналогов по отношению к полинулеотидлигазэ изучали на синтетических олигонуклеотидах, составляющих ген ангиотензина I. Анализ всех возможных вариантов сшивки проведен на тиоаналогах олигонунлеотидов В, г D, Е и F. Проверка стабильности комплексов с помощью плавления показала, что гибридный комплекс В . - Ед значительно менее стабилен, чем нормальный комплекс В - Ег. а комплекс Вд - Ед, гораздо менее стабилен чем комплекс В - Ев. Исследованы три варианта реакций с участием тиоолигонуклеотидов,

катализируемых полинуклеотидлигазой. Первый вариант тноолигонуклеотида как сшиваемые компоненты, второй вариант -ТЕОолйгонуклеотида в качестве матриц, третий вариант - сшивка ровных концов. Начальные скорости * реакций сшивок олнгонуклетидов Б и Е, Вд и Е, Б и Ед на олигонуклеотидб В в качестве матрицы (первый вариант) оказались близки, в то время как скорость сшивки В8 и Е3 была в 5 раз ниже, чем Б и Е (рис. 2). Во втором варианте скорость сшивки олигонуклеотидов А и В на В0 оказалась в 300 раз ниш, чем на Б, а олягонуклеотида А и Вд вообще не сшивались на В3. В третьем варианте олягонуклеотида не сшивались, когда хотя бы одним из компонентов был тиоолигонуклеотид. Т.о., аналоги сшиваются достаточно эффективно только в том случае, когда матрицей служит олигонуклеотид с природной мекнуклеотцдной связью. В комплексах этого типа, по-видимому, матричный олигонуклеотид корректирует неоптимальную для сшивки стереоимическую ориентацию участвующих в реакции З'-гидроксильной и

1.1.4. Клонирование синтетического гена ангиотензина I человека и его гиоаналога.

Свойства тиоаналогов позволили предположить, что они могут быть использованы для конструирования искусственных генов. Для проверки этого предположения были сконструированы два варианта гена, кодирующего гормон ангиотензин I. Первый вариант -контроль - был собран из синтетических олигонуклеотидов с природными межнуклеотидными связями (рис.3), во втором варианте олигонуклеотид Б был заменен на тиоаналог Б3.

На первом этапе фосфорилированные по 5'- концам олягонуклеотида А, В, С, В(В8) и Е соединяли в двуспиральный

аналогов олигонуклеотидов (обозначения на рис.3) полинуклеотид-лигазой фага Т4. В и Е (о-о), Б и Е3 (-), В8 и Е (х-х), Б3 и Еа

(о-в). Абсцисса - время в час, ордината - содержание устойчивого к фосфатазе меченого фосфата.

32-членный полинуклеотид с помощью ДНК-лигазы фага Т4. К очищенному дуплексу А-Е, структура которого была подтверждена методом Максама- Гилберта, с помощью ДНК-лигазы присоединяли олигонуклеотид А. Продукт обрабатывали рестриктазой EcoRI н очищенный двуспиральный полинуклеотид встраивали в плазмидный и фаговый векторы.

F А В F

TGMTTCATGGACCGTGTTTACATCCATCCTTTCCATTTGTGAATTCA ACTTAAGTACGrGGCAGAAATGTAGGTAGGAAAGGTAAACACTTAAGT F С D(DS) Е

Рис 3. Структура синтетического гена, кодирующего гормон ангиотензин I. А - D - синтетические олигонуклеотиды, Ds -олигонуклеотид с p-S-C(5') связями.

Для клонирования синтетических генов была сконструировала плазмида pMRI, содержащая фрагмент гена р-галактозидазы. Контрольный ген, не содержащий тиоолигонуклеотид, встраивает в эту плазмиду и фаг Xplac5-1 (Pourcel et al., 1979) н клонировали. Отбирали'гибридные клоны и проверяли способность клеток, синтезировать ангиотензин. Радаоиммуноанализ клеточЕНХ лизатов, показал, что содержание иммунореактивного материала в лизатах нескольких клонов достоверно выше, чем в контроле. Причем его содержание в клетках, инфицированных фагом, в среднем, на порядок выше, чем в клетках, содержащих гибридам плазмиды. Вазопрвссорную активность одного из таких лизатов, тестировали на лабораторных крысах. Препарат давал ярко выраженную вазопрессорную реакцию, в то время как в контроле эффекта не наблюдалось.

Ген, содержащий олигонуклеотид Dg собирали и встраивали в плазмидный и фаговый векторы также, как описано выше. Однако, в этом случае нам не удалось обнаружить ни одного гибридного клона. Более того, при анализе ДНК, фенотшшчески гибридных фаговых клонов, были обнаружены делеции, затрагивающие ген галактозидазы. По-видимому, двуспиральные структуры, образованные тиоаналогом, опознаются репарирувдими системами клетки как дефектные и удаляются вместе с прилежащими районами ДНК.

Таким образом, мы выяснили, что тиоаналоги непригодны для конструирования генов. Однако, уникальное сочетание свойств делает их перспективными инструментами для изучения механизмов

реакций, катализируемых ферментами обмена нуклеиновых -кислот. Эти аналоги, вероятно, могут найти широкое практическое применение, например, как затравки в полимеразной цепной реакции (РСИ) или в качестве эффективных ингибиторов размножения вирусов (2атесп1к ег а1., 1991, Кнорре и др.,1991).

Ген ангиотензина I человека, синтезированный в процессе этой работы, может стать основой для конструирования промышленного продуцента этого гормона. 1.2. Ферментативная сборка и клонирование гена Р-интерферона человека.

1.2.1. Разработка__схемы сборки протяженных одяоцепочечных

фрагментов ДНК.

■Главной " целью при разработке стратегии ферментативной сборки было создание общей схемы этого процесса и максимальная его стандартизация. Суть подхода состояла в следующем. Двуспиральный полинуклеотид, который предстояло синтезировать, разбивался произвольно на олигонуклеотиды стандартной длины, которые должны были синтезироваться химически. Существенным моментом разрабатываемого подхода было то, что синтетические олигонуклеоты должны содержать 3'-концевой фосфатный остаток. Этот остаток служит блокирующей группой, препятствующей образованию побочных незапланированных продуктов при ферментативном лигировании, что и позволяет разбивать фрагмент на олигонуклеотиды произвольно. Фосфатная группа может быть удалена полинуклеотидкиназой при рН 5. С помощью этого же фермента при рН 7",5, там, где это необходимо, можно ввести фосфатную группу в 5'-положение, не удаляя аналогичную группу с 3*-конца.

ДНК-лягаза

5 Рис.4. Принципиальная

, схема сборки одноце-

а >' - 1

__—,.--почечных полинуклеоти-

. д0В из синтетических

1 ' олигонуклеотидов.

1Денатурарупиа гелъ-алехтра{орвэ

и, гро-агогр^и (•) - 3'- ИЛИ 5'-КОН-

___' . цевые фосфатные остатки.

Таким образом, согласно предлагаемому подходу (рис. 4),

соседние олигонуклеотидц одной из цепей объединяются в группы по 3 и обрабатывются ДНК-лигазой в присутствии двух стыкующихся олигонуклеотидов комплементарной цепи - "штифтов". При этом первый олигонуклеотид дефосфорилируется, второй дефосфорилируется и кинируется, а третий только кинируется. Этот прием практически полностью исключает возможность образования продуктов "неправильного" лигирования, а получаемый одноцепочечвнй фрагмент с 5'-концевой гидроксильной и 3'-концевой фосфатной группой может быть использован в следующих циклах по аналогичной схеме.

Далее мы попытались выяснить, являются ли

олигодезоксирибонуклеотиды субстратами для З'-яуклеотидазной активности и существенно ли зависит скорость удаления 3'-концевого фосфатного остатка от рН. Оказалось, что олигодезоксирибонуклеотиды, так же как и олигорибонуклеотиды, . являются субстратами для З'-нуклеотидазной активности. З'-нуклеотидаза оказалась активной в довольно широком диапазоне рН, и снижалась только при повышении рН до 10 -10.2. Варьируя дозу* фермента, концентрацию неорганического фосфата и время реакции нам удалось подобрать условия получения олигонуклеотидов с 5' - и 3*-концевыми фосфатными остатками. Этот подход был реализован при сборке фрагмента В, а также частично использовался при сборке других фрагментов гена р-интерферона человека из синтетических олигонуклеотидов.

Структура гена p-интерферона и схема его сборки приведены на рисунках 5 и 6.

1.2.2. Сборка фрагмента В гена 3-интерферона - усовершенствованный метод синтеза протяженных фрагментов ДНК.

Сборка фрагментов ДНК из синтетических олигонуклеотидов обычно проводится через образование двуспиральной структуры с "никами", которые репариуются затем ДНК-лигазой. Мы . решили выяснить насколько существенно влияет на " этот процесс совершенство структуры дуплекса, т.е., с какой эффективностью • будут репарироваться "ники", если дуплекс будет несовершенным, а короткие двуспиральные участки будут образованы небольшими олигонуклеотидами, перекрывающими места стыковки соседних одноцепочечных полинуклеотидов. С этой целью была проведена оценка выхода лигирования фрагмента длиной 108 нуклеотидов при

разных вариантах заполнения олигонкулеотидами комплементарной

цзш.

-а-- ' ■-4-------«-- I --—в-

---♦--11--.-г-.-13----15--

теаств I д * я I

АСА^1»Ц»ЦССАТАС№АААСТ«АС«АСТССТСТЦТТТдтаАС«ТС0га

» И I а Ж I Г А I У I О Вг ><|?0«КХ«ХТХ111.А|; вштоЬтвсААААитсттт^Атт^с&аий^т^гпгаАт^

ЬтА1САТ^А(йЙиССА?^ААААСТОТТСЛОЛАаАА^

в Ь Ж«ГТОК1Ь Я Т Ь I А К В *ЗНСА»»1Т*Т11' САКТвШМТТАЯАЙотСС^

в«А4АЛТТЖАА1А11АССАОСАТААвАСОТААТМАПТТСвА1ТТСТСА10АйАОТиСАСйОАСС¥ЫТААСААОСАСААСТТТАО

---4(-—-4«--50-——-52-

' 1 > ■ I > • I ь I ■ еТОСетААСТТИАСТТСАИААЛОТСТТАСТООТТАССТОСвТААСЯА^

САСОСАГМААААТОААОТАА1ИССАЫАТйАССАА»1)ОАС«иЯ(иТССТЛО --54-—I—--55-—'

Рис.Б. Нуклеотидная последовательность синтетического гена р -ннгерферона человека. Стрелки и цифры - олигонуклеотида, синтезированные химически, цифры в скобках -олигонуклеотида не вшэдщиэ (круглые) или вошедшие не полностью (квадратные) в структуру гена. * - нуклеотидаые замены относительно структуры природного гена. Цифры справа - порядковые номера аминокислот в структуре зрелого р-интерферона.

Фрагмент В гена р-интерферона человека, кодирующий аминокислоты с 73 по 102 был разбит на 12-членные и один 14-чденный олигонуклеотида (рис.7). Они были сшиты с помощью ДНК-лигазы в одноцепочечные полинуклеотиды длиной 50 и 36 звеньев (I, 1а, II, III, рис. 7). Полинуклеотиды I, II и III, длиной 36 звеньев, были использованы как модельные для проверки предложенного нами принципа сборки одноцепочечных фрагментов.

В I варианте полинуклеотиды I - III обрабатывались ДНК-лигазой в присутствии только "стыкующих"

додекануклеотидов, а во II - в присутствии дополнительных додекануклеотидов. Оказалось, что продукт длиной 108 получается и в I и во II вариантах, хотя выход повышался с I до 12% при заполнении нижней цепи без промежутков. Аналогичные результаты были получены нами при лигировании 144-звенного полинуклеотида из четырех 36-звенных на трех (I вариант, с

— т»"Г "^Г""* »* I » **

4. Н«Х, Я1>л

» г« м » я х * ** м

Рис.6. Схема сборки и клонирования отдельных блоков (А -Д) и полного гена ^-интерферона. Точками обозначены 3'- или 5'-концевые фосфатные остатка, промежутками) и семи (II вариант) додекануклеотвдах. Выход продукта составлял при'этом 0.1 и 2%, соответственно, и был вполне достаточен для разработанного метода клонирования одноцепочечных ДНК или сборки по схеме (рис.7). Таким образом мы показали, что для ферментативной сборки длинных одноцепочечных фрагментов не требуется полный набор олигонуклеотидов комплементарной цепи, что позволяет существенно сократить объем работы по химическому синтезу.

122-звеншй одноцепочечный полинуклеотид собирали из 50-звенного и двух 36-звенных (рис.7). Этот полинуклеотид использовали далее в качестве матрицы для достройки комплементарной цепи ДНК-полимеразой I. Полученный двуспиральный фрагмент имел длину 122/116 нуклеотвдов, соответствующую ожидаемой, и содержал сайты расщепления для рестриктаз ЕсоЫ и TaqI на концах в соответствии с запланированной структурой. Фрагмент длиной 95/93, полученный после обработки полинуклеоивда 122/116 ЕсоМ и Тш}1 клонировали в рВН322 по сайтам ЕсоШ и С1а1. Гибридные клоны отбирали по фенотипу (Тс8 и Арг) и гибридизацией с мечеными олигонуклеотидами. Рестрикционным анализом и определением последовательности обеих цепей был отобран клон, структура вставки в котором соотвествовала запланированной.

DSSStO»«*!

Г7 W--1 -»W- 3 -И*—- 5 •-

I f AAt TfiA CAT 1С*ЧСТ TCT ACT 001 'ТОО AXT ОАО ACT 36

Рис.7. Структура и схема сборки фрагмента В синтетического гена ß-интерферона. Арабскими цифрами обозначены исходные олигонуклеотиды, римскими - промежуточные продукты. Рис.8. Анализ продуктов ферментативной сборки фрагмента В. (а)

- гель электрофорез продуктов лигирования полинуклеотидов (I)

- (III) на олигонуклеотидах (6),(12); (6),(8),(10),(12) (дор. I и 2); (б) - выделение фрагмента (IV) (дор.2), маркер -дор.1; (в) - гель-электрофорез продуктов обработки фрагмен- та (V) рестриктазами Taql (дор.1)ЕсоН1 (дор.З), исходный дуплекс(дор.2), маркер (дор.4).

Получаемые этим методом одноцепочечные полинуклеотиды могут быть непосредственно использованы для клонирования. И что особенно важно, в данном варианте происходит дополнительное очищение синтетических фрагментов, поскольку химические модификации препятствуют работе ДНК-полимеразы (Ide et al., 1985).

1.2.3. Сборка и клонирование фрагментов А, Б, Г и Д.

Фрагменты А, Б, Г и Д (рис. 6) собраны из олигонуклеотидов длиной от 7 до 30 звеньев различными методами, на деталях ко-

торых ш останавливаться не будем, с использованием подходов, описанных вше. Цепи фрагментов Б и Д собирали раздельно, очищали препаративным гель-электрофорезом, сбалансированные смеси двух цешй отжигали и клонировали в плазмиде pBR322.

ОтоЕзенные цепи фрагмента Д соединяли с фрагментами Clal-BanflI-4012 и ClaI-EcoRII-105 вектора рВН 322 и трансформировали в компетентные клетки E.coli НВ101. Рекомбинантные клоны со вставкой идентифицировали гибридизацией колоний. Около 90% клонов оказались гибридными по этому тесту. Рестрикционным анализом и секвенированием вставок был найден клон с запланированной структурой встроенного фрагмента.' Цепи фрагмента Б отжигали и лигировали с EcoRI - Pstl фрагментом плаз-да pBR 327 и лигазной смесью трансформировали клетки E.coli JC5183. При скрининге меченым зондом 97Ж колоний оказались гибридными. Плазмидная ДНК трех гибридных клонов была проанализирована. Оказалось, что все три клона несут EcoRI - Pstl вставку нужных размеров. Анализ последовательности ее ДНК в одном из клонов подтвердил ее правильность.

Фрагменты А и Г собирали из попарно отожженных соседних олигонуклеотидных блоков и клонировали.

Фрагмент А и очищенный гель-электрофорезом большой Pstl -EcoRI фрагмент плазмиды pBR 327 обрабатывали ДНК-лигазой и смесью трансформировали клетки E.coli JC 5183. Скрининг проводили параллельной гибридизацией колоний с шестью мечеными олигонуклоотидами. Около 70% полученных клонов гибридизовалось с зондами. Плазмидная ДНК двух гибридных клонов была выделена и проанализирована рестрикцией и секвенированием вставок. Оказалось, что в положении.55 ДНК вставки одного из клонов пара G:C заменена на C:G. Секвенированние соответвтвующих олигонуклеотидов не выявило каких-либо замен, структуры синтезировааных олигинуклвотидов полностью соответсвовали запланированным. Во втором клоне структура ДНК вставки соответствовала запланированной за исключением замены G:C -пары на Т:А в третьем положении кодона лизина N32, что, однако, не меняло смысла этого кодона.

К очищенному гель-электрофорезом фрагменту Г добавляли фрагменты ClaI-BamHI-4012 и BamHI-EcoRII-221 плазмиды pBR 322, обрабатывали ДНК-лигазой и этой смесью трансформировали клетки

E.coli JC5183. Выход рекомбинантов был необычно низок, удалось обнаружить лишь три клона из 900, гибридизущихся на все три зонда. Выделенная плазмидная ДНК из двух гибридных клонов полностью соответствовала запланированной последовательностьи фрагмента Г.

1.2.4.Сборка полного гена и анализ его экспрессии

Сборку гена проводили в несколько этапов (рис.6). На I этапе соединяли фрагменты Г и Д. С этой целью плазмиды, несущие фрагменты Г и Д (pIFN-G и pIFN-D), пропускали через штамм E.coli В834 для снятия метилирования по EcoRII сайту. Плазмиду pIFN-G обрабатывали рестриктазами EcoRI и EcoRII,а из плазмид pIFN-D EcoRII и BamHI препаративным

гель-электрофорезом выделяли фрагменты 150 и 80 пар нуклеотидов, соответственно. Выделенные фрагменты смешивали с EcoRI-BamHI-3987 фрагментом плазмиды pBR322, обрабатавали ДНК-лигазой и трансформировали в В.coll JC5183. Гибридные клоны с нужной вставкой отбирали гибридизацией колоний' с мечеными олигонуклеотидами из двух блоков и анализировали рестрикцией и гель- электрофорезом. Правильность стыковки блоков была подтверждена секвенированием клонированного фрагмента. Подобный анализ проводили на этапе присоединения очередного фрагмента.

На II этапе фрагмент ГД соединяли с фрагментом В. Из плазмиды pIFN-V выделяли фрагмент EcoRI-TaqI-95 пар нуклеотидов, а из плазмиды pIFN-GD фрагмент TaqI-BamHI-194. Оба фрагмента соединяли с EcoRI-BaniHI-3987 фрагментом плазмиды pBR322 и клонировали. Выход трансформантов, гибридизущихся с двумя зондами, составил 40%.

На III этапе фрагмент ВГД соединяли с А и Б фрагментами. HlndlII-Pstl фрагмент pIFN-A длиной 170 пар нуклеотидов, Pstl-Hlnfl фрагмент плазмиды pIPN-G длиной 74 пары и Hinfl-BamHI фрагмент плазмиды pEFN-VGD, длиной 281 пара, соединяли с HlnüIII-BamHI фрагментом плазмиды pBR32T и клонировали.

Для проверки функцинальной активности полный ген после подтверждения структуры переносился в экспрессирунщий вектор pSKlac95-1 (Серпинский и др., 1982), содержащий элементы управления транскрипцией и трансляцией 1ас-оперона. Гибридная плазмида вводилась в E.coli JMI03 штамм - суперпродуцент

lac-penpeccopa. В результате обработки изопропилтиогалактозидом - индуктором 1ас-оперона - скорость роста клеток, несущих гибридную плазмиду, снижалась по сравнению с неиндуцированннми клетками и клетками, содержащими вектор без встройки. Это служило косвенным свидетельством того, что в клетках синтезируется р-интерферон, так как известно, что синтез этого бежа вызывает замедление или полную остановку роста клеток E.colt (Remaut et. al., 1983.) Грубый экстракт индуцированных клеток был проверен на наличие противовирусной активности по подавлению цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на $ибробласты человека. Контролем служили идентично приготовленные экстракты клеток E.colt JM103, несущие вектор без встройки. Результаты двух независимых измерений показали, что экстракты клеток с гибридной плазмидой pSK-IFN дают выражений защитный эффект. По приблизительной оценке количество продуцируемого интерферона составляло 105-106 е.а. на литр бактериальной культуры.

2. ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА УРОВЕНЬ ПРОДУКТИВНОСТИ МОДЕЛЬНЫХ ГЕНОВ В

E.COII.

Среди множества факторов, влияющих на уровень экспрессии введенных генов в бактериальной системе основными, несомненно, являются эффективность его транскрипции и эффективность трансляции его мРНК.

Для обеспечения транскрипции встроенного гена в состав клонирующих векторов вводят промоторы - фрагменты геномов бактерифагов или бактерий, содержащие всю необходимую информацию для инициации транскрипции. Промоторы различаются по способности инициировать транскрипцию и, следовательно, имеют разную продуктивность или силу. Активность некоторых промоторов регулируется по операторному механизму и использование таких промоторов в экспрессиругацих векторах представляет особый интерес, так как позволяет регулировать экспрессию введенного гена с помощью физических или химических факиоров. В главе 2.1 описана серия таких векторов, несущих тандем сильных регулируемых промоторов бактериофага X.

Известно, что в высокоэкспрессируемых мРНК бактерий, дрожжей, используются, в основном, кодоны, соответствующие мажорным фракциям в спектрах изоакцепторных тРНК. Прямые

эксшршэнты, исследующие зависимость эффективности трансляции hFHK от набора кодонов очень немногочисленна, так как очень трудоемки, и не всегда однозначно интерпретируемы. В главе 2.2 описаны результаты наших исследований о влиянии редких кодонов на трансляцию мРНК в клетках E.colt.

Основным функциональным элементом, определяющим эффективность трансляции бактериальной мРНК является сайт связывания с рибосомой (RBS), в состав которого входят последовательность Шайн-Далгарно (SD), инициирующий кодон, а такие частично структурная часть гена н 5' нетранслируемая область (Shine, Dalgarno, 1974). Определяющими в этой структуре являются последовательность нуклвотидов в SD-сайте, комплементарная 3' концу I6S рРНК, вторичная структура РНК в районе RBS, а такка длина и структура нуклеотидного фрагмента швду SD и инициирующим кодоном (Stanssens et al., 1985). Точечные замены в этой области изменяют эксперссию на 1-2 порядка. В главе 2.3 приведены данные анализа зависимости экспрессии гена p-интерферона от структуры RBS в составе моно-н бицистронных оперонов.

2.1. Конструирование вкспрессирующих векторов, содержащих

сильные промоторы рд и рь бактериофага к. 2.1.1.Конструирование векторов для прямой и каскадной регуляции экспрессии встроенных генов.

В это разделе кратко описано конструирование двух типов векторов. Векторы первого типа несут тандемно расположенные промоторы рд и р£ и ген термолабильного репрессора бактериофага к и предназначены для прямой индукции. Вектор второго типа является производным от первого и позволяет осуществлять каскадную индукцию генов, контролирумых 1ас-промотором.

Фрагменты ДНК, несущие pR-CI и pL области получали из ДНК бактериофага \CIgg7 после промежуточного клонирования EcoRI-BamHI-4670 фрагмента этой ДНК в плазмиде pBR327. Фрагменты BspRI-BglII-243 и BglII-ClaI-1138, несущие промотор р^ и рд—CI, соответственно, вырезали из субклонированной ДНК и сшивали с ДНК плазмиды pBR327, обработанной, последователно, EcoRI, фрагментом Кленова и Clal. Смесью трансформировали E.colt JC5183 и отбирали трансформантов устойчивых к

ампициллину и фагу при 30°, но чувствительных к этсц? фагу при 42°. В результате был найден клон, содерзе^йЗ плазмиду с огидаемыи взаимным распологением сайтов Рв1;1, С1а1, BgШ, Н1П(П11 и ЕсоНГ (рЕСР4, рис. 9а).

Для получения илазмида рСР2, содержащей блок р^-р^-01 в противоположной ориентации ДНК рЕСР4 обрабатыаш, последовательно, Рзг1, ДНК-полимеразой фага Т4 п ЕсоШ. Очищенный фрагмент длиной 1400 н.п. сшивали с Есо1И-ВатН1-375 фрагментом ДНК плазмиды рБК327 и с большим фрагментом этой ю плазмиды, обработанной ЕсоШ, ДНК поликеразой I, а затза ВаиН1. После трансформации отбирали клоны, устойчивые к ампициллину и тетрациклину и иммунные к к фзгу \.1г ПРЛ При рестрикционном анализе плазмидаых ДНК отдельных клонов была найдена ДНК с оявдаекнм взаимным расшюжением сайтов ЕсоЯГ, В81П, ВапЯ1 и НШсЦИ (рис. 9а).

In»«

Рис.9. Схемы конструирования плазмид рЕСР4., рСР2 (а) и рС119 (б).

Вектор для непрямой (каскадной) индукции получали клонированием структурной части гена белка-репрессора 1 в плазмиде рСР2. Для этого EcoRI-EcoRI-1700 фрагмент ДНК плазмиды рМС9 (Calos et al., 1983), содержащий ген t, встраивали в EcoRI сайт плазмиды рСР2 и полученной смесью трансформировали клетки E.coll CSH36 (F'lac), конститутивные по синтезу ферментов 1ас-оперона (1~) ( Миллер, 1976). Отбирали трансформантов, устойчивых к ампициллину и имепцих

фенотип Lac" при 42° и Lac4 при 30°. Карта плазмидной ДНК одного из клонов с таким фенотипом, обозначенного рС119, приведен на рис. 96.

Полученные векторы могут быть использованы для прямой (рЕСР4, рСР2) или непрямой (рС119) индукции экспрессии клонированных генов. Все эти векторы несут тандем сильных промоторов pR и pL фага х, работа которых регулируется термочувствительным репрессором CIg57. Известно, что при 30° этот белок полностью блокирует оба промотора, а при 42° блок снимается благодаря инактивации репрессора.

Векторы рЕСР4 и РСР2 имеют ряд преимуществ перед сконструированными ранее аналогичными векторами. Описанные конструкции имеют в своем составе ген CIq57 и не требуют использования в качестве бактерии-хозяина специально сконструированных лизогенных штаммов ( Remaut е.а.,1983). Интактность генов устойчивости к антибиотикам (ампициллину у рЕСР4, тетрациклину и ампициллину у рСР2) упрощает, по сравнению с аналигичным вектором pMY12-6 (Shlrakawa et al., 1984) отбор трансформантов. Тандем промоторов способен, по-видимому, обеспечить более высокий уровень транскрипции, чем промотор рй в плазмидах рСЕП9 (Кравченко и др.,1985) и pDIA5500 (Leplatols et al.,1983).

Плазмида рС119 несет ген lad в качестве экспрессируемого гена в векторе рСР2. При температуре 42° белок CI неактивен и не препятствует экспрессии гена 1, который блокирует транскрипцию генов, управляемых lac промотором. Понижение температуры до 30° восстанавливает активность белка CI, транскрипция 1-гена прекращается и начинается транскрипция генов, управляемых lac промотором. Так происходит непрямая (каскадная) регуляция активности этих' генов. Удобство такой системы регуляции состоит в том что таким образом можно унифицировать управление различными промоторно-операторными блоками, клонируя аналогичным образом гены других белков-репре ссоров.

Таким образом, была сконструирована серия плазмидных экспрессирующих векторов, несущих тандем сильных регулируемых промоторов. Базовые элементы плазмида рЕСР4 были использованы при конструировании штамма-продуцента фрагмента Кленова.

Полученные конструкции и штаммы защищены авторсшга свидетельствами и внедрены на НПО "Виолар". 2.1.2. Изучение влияния ориентации тандема сильных, промоторов на экспрессии клонированных генов.

Зкспрессирувдие векторы с сильными промоторакя, сконструированные на основе нлаэмиды pBR322 оказываются нестабильными. Для изучения этой проблемы, а также с целью оптимизации сконструированных нами векторов прямой экспрессия по продуцентности и стабильности, было предпринято исследование экспрессии модельного полусинтетического гена (З-галактозвдазы (lac z) E.colt в составе плазмид рОР2 и рЕСР4. Плазмида pZblal была получена клонированием EcoRI-EcoRI фрагмента ДНК pDSZ2, содержащего полусинтетический ген lac z шесте с сигналом инициации трансляции, в плазмидэ рЕСРД. Плазмида pZtet3, несущая блок Cl-p^-p^-lac z в противоположной ориентации, была получена клонированием EcoRl-SalGI фрагмента плазкида pbZ4, содержащего тот ке ген lac z, что и в предыдущем случае, с.тем жэ сигналом инициация трансляции. Карты полученных плазмид приведены на рисунке 10. Плазмады pZblal и pZtet3 представляют собой удобную модель для изучения влияния ориентации сильного промотора на уровень экспрессии клонированного в этих плазмидах гена lac z.

карты a1 и

pZtet3.

На рисунке II приведены кривые накопления р-галактозидазн в клетках E.colt CSH 36 (F~), трансформированных плазмидами pZblal и pZtet3 и выращенных при 42°С. Уровень синтеза р-гала-ктозидазы в штаммах CS36-pZbla1 и CS36-pZtet3 при выращивании при 30° в течении 5 часов не изменялся и составлял 80-100 единиц активности. В противоположность этому, уже через 30 мин инкубации клеток с илазмидами pZtet3 и pZblal при 42°С проис-

ходит резкое увеличение синтеза фермента и к 5 часам достигает величины 18700 и 28100 ед.активности, соответственно.

, Рис.11. Кинетика накопления р-галактозидазы в клетках E.coll CSH36 (Р~), несущих плазмида pLZ4-95 (1), pZblal (2) и pZtet3 (3). В плазмиде pLZ4-95 ген р- галактозидазы находится под- управлением промотора

Таким образом, сравнение уровней экспрессии модельного гена в составе плазмид pZtet3 и pZblal позволяет заключить, что ориентация сильных'промоторов в сторону гена bla более предпочтительна, так как' обеспечивает 4 почти двукратное повышение синтеза р-галактозидазы по сравнению с противоположной ориентацией. Следовательно, принципиальная схема плазмида рЕСР4 может быть рекомендована как основа для конструирования экспрессирующих векторов с сильными промоторами. Эффективность сконструированных векторов оказалась значительно более высокой, чем у аналогичных конструкций Shlrakawa и др. (1984) в плазмиде pBR322.

Для оценки стабильности плазмид аликвоты клеток CSH36(pZtet3) и CSH36(pZblal) после 5 час выращивания в среде с ампициллином при 42° высевали на селективные чашки, содержащие ампициллин и хромогенный субстрат (3-галактозидазы X-gal и определяли число жизнеспособных клеток каждого типа и их фенотип. Все проверенные клоны имели фенотип lacZ4". Следовательно, полученные конструкции стабильны и в условиях индукции не утрачивают экспреесируемого гена, что наблюдалось в случае аналогичной системы на основе плазмида pBR322 (Leplatols and Danchln, 1983).

В то же время бактериальные клетки в неселективных условиях теряют плазмиду рЕСР4 с довольно высокой частотой (рис. 12), что существенно снижает технологические характеристики вектора. С целью стабилизации наследования вектора в него введена последовательность par из плазмида ОоШ. Фрагмент,

содержащий раг-сайт, получали из плазмиды pKS490 (Summer and Sherratt, 1984). Фрагмент встраивали в плазмиду рЕСР4, обработанную, последовательно, SalGI, фрагментом Кленова и BaHI и клонировали. Из клонов, устойчивых к ампициллину, но чувствительных к тетрациклину, выделяли плазмидную ДНК. Растрикциокный анализ подтвердил наличие в рекомбинантных плазмидах фрагментов ДНК, соответствующих рЕСР4 и раг-фрагменту. Таким образом получена плазмида рЕСР4-раг.

Последующий анализ показал, что рЕСР4-раг при 42° наследуется более чем в ГО раз стабильнее, чем рЕСР4 (рис. 12). Использование плазмиды рЕСР4-раг в биотехнологических целях позволит существенно увеличить выход продуктов, а ■ таю» снизить их себестоимость, т.к. отпадает необходимость использования ампициллина для стабилизации подготовке посевного материала и последующем штамма-продуцента.

плазмид при культивировании

Рис.12. Сравнение стабильности наследования плазмид рЕСР4 И рЕСР4 par при выращивании в не-селективннх а*р,ят УСЛОВИЯХ.

2.2. Влияние контекста мРНК на трансляцию генов в E.C0U.

При оценке влияния редких кодонов на экспрессию генов в E.colt трудно отделить вклад истинной эффективности элонгации от эффектов инициации трансляции, стабильности мРНК и свойств белкового продукта (стабильности, изменения ферментативной активности и т.д.). Известно, что' первые 15-30 нуклеотидных остатков за AUG кодоном существенно влияют на процесс инициации, так как входят в состав, рибосомсвязывающего сайта (RBS). Поэтому прямое сравнение эффективностей трансляции генов, отличающихся этими частями структуры представляется, некорректным для оценки роли редких кодонов (Williams et al., 1984, Porter et al., 1986, looman et al., 198T).

Мы предложили модель, лишенную этих недостатков ' и

позволяющую однозначно интерпретировать полученные данные. Суть ее состоит в том, что сравниваться должны гены, кодирующие один в тот же белок, различающиеся набором кодонов и имеющие идентичные последовательности BBS, включая начало кодирующей части.

Синтетический ген ß-интерферона содержал только кодоны, встречапциеся в высокоэкспрессируеыых генах и соответствующе иахоршш фракциям в спектрах изоакцепторных тРНК. • Хромосомный ген ß-интерферона, содержащий редко используемые в шсокоэкспрессируемых генах кодоны, был выделен методом рекомбинационной селекции (Seed, 1984) из созданного наш геномного банка человека в векторе Charon 4А. В качестве реконбинационного зонда мы использовали клонированный нами синтетический полинуклеотид длиной 93 нуклеотидных пары, представляпций собой фрагмент структурного гена ß-интерферона. ДНК одного из рекомбинантных клонов - PiHuIP21 - давала картину рестрикции, совпадающую с рестрикционной картой в районе гена ß-интерферона (Ohno and Tanlguchl, 1981). Ген, выделенный из этого рекомбинантного клона, был реконструирован таким образом, что последовательность, кодирующая транзиентный пептид и первые восемь аминокислот, была заменена на фрагмент синтетического гена. Структура полученного гена была подтверждена секвестрованием.

Для упрощения последующего анализа мы сконструировали ген гибридного белка ß-интерферон - ß-галактозидаза, в котором 138 кодон синтетического гена ß-интерферона был в рамке присоединен к 5* концу полусинтетического гена ß-галактозидазы Е.соИ. Это давало возможность тестировать конструкции измеряя ферментативную активность галактозидазы. Специальная проверка показала, что трансляция инициируется только на 5' конце гибридной матрицы и, т.о., все изменения в активности галактозидазы могут быть обусловлены только изменениями структуры в этой области. Ген перенасели в плазмиду pSKlac95 под контроль 1ас-промотора (плазмида рШ). Фрагмент EcoRI-Pstl реконструированного природного гена был перенесен в плазмиду рШ взамен соответствующего фрагмента синтетического гена (pLF2) (рис.13). Гибридные гены в плазмадах рГ1 и р?2 тещ идентичные RBS, кодируют идентичные белки' и отличаются

только последовательностями ыезду 8 и 53 кодониш. В атом фрагменте структуры природного гена содерзится три редких аргиниковых кодона (AGA/AGG) и лейцнновне кодонн ÜUG и CUA, соответствуйте минорным тРНК.

1 - ATOAKlXCUCnfiSrP^iTC^CJUieiiWJlQCAltTTTCUJTQriAOJUCCTCCMtW

S - lUlCiTAlTCGTCOICTTOlATAWCTCMlJLlOACCeTATimCliTCACiTCCCTCAeCjlCJLrTAJU • ...... «

J - CUTnJULTQQOiCSC'nCAAIJLTTCCCtCUGHCASliTauCTTtOACATCCCTCACCASAltAAQ

Рис 13. схемы плазмид рЬР1 и pLF2, несущих генн гибридных белков ß-интерферон-р-галактозидаза. Приведены фрагменты последовательностей синтетического (S) и природного (N) генов интерферона, вошедшие в структуру гибридных генов. Отличия в структурах помечены звездочкаш, подчеркнуты "редкие** для E.coll кодоны в гене с природной структурой.

Обе конструкции вводили в клетки E.coll ВШ71-18 и замеряли активность ß-галактозидазы после индукции изопропилтиогалакто-зидом (табл. 2, рис. 14).

Таблица 2. Скорость накопления ß-галактозидазы

Дифференциальная скорость Уровень ß-галактозидазы

синтеза ß-галактозидазы в стационарной фазе роста

(ед.акт./мл/мин.)

pLF1 (1РЯ) .31,4 i 5,1 7530 i 640

pLF2 <IFn) 10,0 í 2,2 3120 ± 510

Углы наклонов и уровни плато кривых на рис.14 отличаются в 2,5 раза. Этот эффект можно объяснить несколькими причинами: а) разными уровнями мРНК, б) разной стабильностью мРНК, в), разной скоростью элонгации. Сравнение функциональной стабильности (Kepes, 1963) и равновесных концентраций мРНК показало, что конструкции pLFt и pLF2 не отличаются по этим параметрам. Т.о., наиболее вероятной причиной является различие в скоростях элонгации на фрагментах двух вариантов генов.

Согласно гипотезе Váreme и Lazdunskl (1986) на скорость

s*-

""мин.

элонгации могут влиять только кластеры редких кодонов в высокотранскрибируемых генах. Наши данные свидетельствуют о существенной задержке трансляции на некластеризованных редких кодонах в гене с умеренной экспрессией. Вероятнее всего, наблюдаемый аффект объясняется локальной концентрацией редких кодонов, а не их общим содержанием как предположили Вг1пктапп И др. (1989).

Рис.14. Скорость накопления ß-галактозидазы в клетках В.coll CSH36 (¿lac pro), несущих плазмида pLF1 (S ) и pLF2 (M).

2.3. Изучение влияния структуры последовательности SD-AUG на экспрессию синтетического гена ß-интерферона.

Факторами, вносящими основной вклад в инициацию трансляции мРНК у E.coll считаются первичная и вторичная структуры мРНК в районе рибосомсвязывающего сайта (Stanssens et al., 1985). Сложность функционального анализа этого района состоит в том, что в большинстве случаев не удается достаточно четко отделить эффекты первичной структуры этой области, от эффектов структур более высоких порядков, так как даже точечные замены часто приводят к существенным изменениям конформадай (Мшзоп et al., 1984).

. Выла поставлена задача выяснить, как влияет структура последовательности SD-AUG на эффективность инициации трансляции синтетического гена. При этом мы планировали сконструировать модели, у которых вклад вторичной структуры был бы минимален. Были проанализированы два типа таких моделей: моноцистронная и бицистронная. 2.3.1.

Конструкции этой серии были . спланированы таким образом, чтобы предсказанные с помощью компьютера/вторичные структуры в районе RBS практически не отличались у разных вариантов.

На рисунке 15 приведены схемы конструирования и результаты сравнения эффективности разных по структуре последовательностей SD в составе плазмиды рерР. Ген ¡З-интерфэрона был перенесен в вектор рСР2 (рсрз) и FstI-FstI-1450 фрагмент этой конструкции был соединен с PstI-Pst-6200 фрагментом плазмиды рЬ?1, несущей ген гибридного бежа. В полученную плазмиду pC(3F по сайту EcoRI перед AUG кодоном введены синтетические олигонуклеотиды, структура которых соответствует последовательностям SD

выскоэкспрессируемых генов E.colt: белка оболочки бактериофага RI7 (варианты 1,2 и 3) и omp F (варианты 4, 5). Варианты различаются структурами и длинами последовательностей, комплементарных I6S рРНК: от трех остатков в исходной конструкции до 9 остатков в варианте 2.

С' а«5«*аС.гАЛ?ТСАТСАСА ... CAC?cTctg ... ' Ecoftl Fiii

\?«tl(6200) / ^ У

«(450) N

p-v ал

Активность S-галактозвдазы по Миллеру (1972) х I0"3 / 0 (вез вставки) 4,11 ± 0,32 ц I aaUACGACGTtt 10,13 t 0,41 ' 2 aatTAAGGAGGTtt 13,95 ± 1,32 ч з aattAGGAGCTttg 12,83 ± 0,8S

4 aattGAGGgtaat 8,97 * 0,48

5 aattGAGGgtaatg 9,54 ± 0,32 S aattaaacctcct 3,29 ± 0,25

Рис.15. Схема конструирования плазмиды рС(ЗР и результаты сравнения эффективности разных БВ последовательностей, введенных в эту плазмиду перед геном гибридного белка.

Можно видеть (рис. 15), что эффективность инициации существенно зависит от структуры ЭБ, причем зависимость эта имеет, по-видимому, сложный характер. Вариант 0 - исходная конструкция без встроенного олигонуклеотида, в которой трансляция инициируется, вероятнее всего, на случайно возникшем при конструировании ББ йСА. Уровень продукции этого варианта лишь не намного выше, чем в варианте 6, использованном нами в качестве контроля и содержащем олигонуклотид I е обратном направлении. В варианте 6 ББ скорее всего экранирован комплементарным взаимодействием со

встроенным олигонуклеотидом и, т.о., эта конструкция дает истинный фоновый уровень трансляции "без SD" в этом районе.

Вариант 2, имеющий наибольшую длину последовательности, комплементарной 3' концу I6S рРНК (9 нуклеотидов), инициируются с самой высокой эффективностью. Уменьшение размера комплементарной'области на 2 нуклеотида (вариант I) приводит к заметному снижению уровня синтеза продукта. Такие эффекты, как прэполагается, имеют место при иеоптнмальном расстоянии между SD и AUG (Munson et al., 1934). Действительно, хотя в наших моделях это расстояние лежит в оптимальном диапазоне, добавка остатка G в эту структуру повышает эффективность инициации (вариант 3). В следующих двух вариантах (4 и 5) структура изменена довольно существенно: уменьшена до 4 нуклеотидов SD последовательность и увеличено расстояние SD-AOG. Однако, это лишь незначительно повлияло на эффективность инициации (вариант I но сравнению с 4 и 5).

Полученные данные позволяют сделать вывод, что размер SD, хотя и влияет на эффективность инициации трансляции, величина эффекта существенно меньше той, что принято относить к ковформационнй структуре района SD-AUG. Размер SD, вероятно, должен быть оптимален для того, чтобы, с одной стороны, обеспечить достаточно прочное и точное взаимодействие мРНК с рибосомой, а с другой - не препятствовать продвижению мРНК при переходе к элонгации (Ейгевтапп et al., 1986). Небольшой размах изменений эффективности инициации при изменении структур! в районе между SD и AUG в наших экспериментах свидетельствует, на наш взгляд, о том, что сама по себе последовательность в этой области не столь важна. Более существенным, видимо, является низкое содержание G и С. 2.3.2 Анализ бицистронного варианта.

В этой части работы мы ставили перед собой следующие задачи: I) изучить, как влияет структура межцистронной области и, в особенности, положение терминирующего кодона в этой структуре, на трансляцию второго цистрона в бицистронном опероне; 2) выйснить, какова роль размера и структуры проксимального цистрона; 3) на ¿сновании полученных данных сконструировать бактериальный продуцет (5-интерферона.

Конструирование.и.анализ проводили аналогично тому как

описано в разделе 2.3.1 (рис. 16). Конструкции этой серии дают Сицистронную мРНК. Первый цистрон - небольшой фрагмент триптофанового оперона Е.соП, содержащий б'-нетранслируемую область и фрагмент последовательности, кодирующей первые II аминокислот лидерного пептида. В такой структуре инициация может происходить параллельно на обоих трансляционных стартах, а на втором цистроне возможна также и реинициация.

Видно (рис. 16, левый столбец), что здесь, как и в случае моноцистронных матриц, конкретная структура ББ-сайта мало влияет на эффективность инициации и/или реинициации трансляции. Важно, по-видимому, само наличие такой структуры, что видно из сравнения продуктивностей конструкций I и 3 с конструкциями 6-8.

. . . .АСТАСТАСССААСТТСАССТАААААСССТАТССАСААТСАААОСААТТТТССПСТСААЛСаТГССТИ- 50 -_-ААТТСАТССАС.....

вдошь/юо©

ПОГ^С=АШУ{ОСТЬ КтлОТКГ.СЗ Э СЗЛАСГЛ ЭО - АТС

Х.еоИ КС 106 т г. со11 сгн зб

( 5и" ) ( ги II )

Цьег ___ (И А1ТГАС0АССГГТ»>исАТ0»8С е.г • 0,4 16, и 2 0.6

ОсЬг* г« ■ЦГГАА^С.'.С^ТТТа^ гсАТСакс 9.« Г 0,9 10,« I 1,3

Агйег __| 1и ААТгТсСАССТГГСа« С «С А ТС ««С 7,7 ^ 0,9 15,8 : 1,0

АлЬвГ 1 ^A^nC)^GC¿t^Jt.TлЛtte/^TCлte г о.з а,б ; о,1

___ ААТТАЛАССТССТмИсАТСввс 1.5 * 0,2 1,1 ^ о,ог

Ое^т«

1АТТАЛАССГ1СС,ГААГГАААССТССТа»г1СА'Г0»вС 0,3 г он о,т. •г о.г

»и ХДТТСАААССТСЙТв»г<сАТСввС 3.7 г о.з 3.0 1 0,4

Рис ЛВ. Схема плязмид и результаты анализа влияния структуры мбжцистронного сопряжения на эффективность реинициации трансляции..

Для изучения влияния стуктуры мекцистронного сопряжения, в частности, взаимного расположения стоп-кодона проксимального цистрона и SD-сайта дистального цистрона на уровень экспрессии последнего, мы предложили новый, более корректный подход. Суть его заключается в следующем: конструируются мекцистронные сопряжения, содержащие два разных стоп-кодона в сравниваемых позициях. Сравнивая эффективности сопряжения трансляции в супрессорных и бессупрессорных штаммэх можно делать вывода об эффекте стоп-кодона. Следует подчеркнуть, что в данном подходе последовательности нуклеотидов в BBS сравниваемых конструкциях идентичны. Большинство известных данных получены с помощь® введения точечных мутаций, делеций или инсерций в район BBS, что затрудняет их однозначную интерпретацию.• Конструкции, приведенные на рисунке 16 полностью удовлетворяют требованиям предложенной нами модели. Мы сравнивали уровни экспрессии модельного гена в этих конструкциях в супрэссорном штамме CSH36 (SuII) и в несупрессорном (Su°) штамме MCI06I. В штамме CSH36 глутаминовая тРНК супрессирует стоп-кодон UAG, поэтому в конструкциях I и III трансляция первого цистрона терминируется на втором несупрессируемом кодоне, расположенном посла SD-сайта. Как видно из таблицы, конструкции I и III с супрессируемым кодовом UAG в штамме CSH36 дают уровень экспрессии в два раза выше, чем в несупрессорном штамма. В конструкциях II и IV, в которых перед SD-сайтом второго цистрона стоит несупрессируемый терминирующий кодон (UAA или UGA), уровни экспрессии были одинаковы в двух штаммах. Таким образом, в данной конструкции положение терминирующего кодона первого цистрона после SD-сайта второго цистрона является оптимальным для эффективной экспрессии второго цистрона.

Однако, этим результатам можно дать и другое объяснение. При небольшом, как в нашем случае, размере первого цистрона терминировавшая рибосома может экранировать район инициации в первом цистроне. В этом случае даже такие небольшие продвижения рибосомы вдоль мРНК, как в конструкциях I и III, могли бы снимать блок инициации.

Для проверки этого предположения мы сконструировали плазмиду p38I-F, в которой фрагмент триптофанового оперона был заменен на фрагмент ДНК бактериофага MI3, содержащий промотор

и часть структурного гена VIII, кодирующую первые 56 аминокислот. Оказалось, что уровень экспрессии этой конструкции в супрессорном штамме в 2,5 раза выше, чем в несупрэссорном. На наш взгляд, это однозначно доказывает, что при достаточно длинном лидерном цистроне оптимальным является проксимальное по отношению к SD-сайту положение стоп-кодона.

Основываясь на полученных наш данных мы сформулировали принципы конструирования продуцентов и проверили их на наши моделях. Зкспрессируемый ген в виде бицистронного огорона встраивается под транскрипционное управление сильных регулируемых промоторов в плазмиду со стабильной конструкцией и стабильным наследованием. Бицистронная конструкция должна содержать зкспрессируемый ген, перекодированный в высокочастотные кодоны E.colt, в качестве дастального гена, н какой- либо природный или искусственный ген с эффективной инициацией трансляции в качестве проксимального. Межцнстронное сопряжение при достаточно протяженном проксимальном гене должно быть таким, чтобы терминирующий кодон первого гена распологался выше SD второго. Мы сконструировали такую плазмиду, встроив дуплицированный ген ^-интерферона в плазмиду рЕСР4-раг (pcpD) и проверили ее продуктивность (рис. 17). Видно, что в клетках, несущих плазмиду pCpD, после индукции появляется белок с электрофоретической подвижностью н антигенными свойствами р-интерферона. Сканирование гелей показало, что количество этого белка после 5 часов индукции составляет 3-5% от суммарного клеточного белка. Такая конструкция может стать основой для промышленного продуцента р-интерферона.

3. ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ С ГЕНОМ р-ИНГЕРФЕРОНА: ПРОДУКЦИЯ БЕЛКА И МОДИФИКАЦИЯ ПРИРОДНОМ СИСТЕМЫ АНТИВИРУСНОЙ ЗАЩИТЫ.

Бактериальные штаммы-продуценты сконструированные генно-инженерными .методами представлялись до недавнего времени наиболее перспективными источниками получения интерферонов. Однако, бактериальная система экспрессии неспособна "правильно" укладывать и процессировать белки эукариот (Conradt et al.,1987). "Неправильная" укладка и отсутствие гликозильного остатка для белков, в норме гликозилированных, делают бактериальные продукты иммуногенными и могут изменять

такие их характеристики как фармакокинетшса, клиренс и тканевое распределение (Cummlng, 1991). Продуценты на основе дрожжей (Carter et al., 1987) и трансгенных насекомых (Smith et al.., 1983), дают гликозилированный и, по-видимому, "правильно" уложенный белок. Однако в обеих системах синтезируются гликопротеины с гликозильными остатками простого типа,' что изменяет их фармакологические характеристики. Яолыаую роль в этом, по- видимому, играют маннозныё рецепторы макрофагов и природные лектины. Культуры трансгенных клеток млекопитающих и трансгенные животные дают белки идентичные природным по всем параметрам и этот подход используется в настоящее время наиболее широко. Однако эта технология требует тщательного контроля за "биологическими загрязнениями" (например, онкогены, вирусы и др.).

Рис.17. Схема экспрессирующэй плазмиды (а) и результаты тестирования р-интерферона в грубых лизатах клеток E.coli K8Q2, несущих эту плазмиду; (б) - гель, окрашенный Кумасси голубым, (в) - белковый блоттинг с моноклоналъными антителами к р-интерферону.

Механизмы посттрансляционного процеосинга у млекопитающих и у высших растений, по-видимому, сходны. Системы, осуществляющие М-гликозилирование белков, хотя и не идентичны,

но также, по-видимому, очень сходны: обе дают гликозидные остатки сложного типа. Важно подчеркнуть, что вероятность "биологических загрязнений" в случав трансгвнных растений или трансгенных культур клеток растений ничтожно мала.

Таким образом, трансгенные растения могут оказаться, вполне конкурентноспособными продуцентами р-интерферона.

С другой стороны, оказалось, что обработка человеческими интерферонами всех трех подклассов - а,р и 7 -подавляет развитие вируса табачной мозаики (ВТМ) на протопластах и растениях табака (Orchansky et al., 1982, Vicente et al., 1987). Изменение восприимчивости к ВТМ наблюдалось у трансгенных растений табака, несущих ген а-интерферона человека (Смирнов и др., 1990).

p-интерферон имеет наибольшую из всех подклассов гомологию с природным антивирусным фактором растений, так как в геноме табака обнаружен ген, гомологичный гену р-интерферона человека, и соответствующая ему мРНК, инду цирукца я с я при вирусной инфекции. Более того, в табаке обнаружены гликопротеиды, специфически взаимодействующие с антителами к р-интерферону человека и обладаюцие антивирусной активностью (Edelbaum et al., 1990).

Исходя из этих данных мы решили сконструировать трансгенные растения, продуцирующие р-интерферон, и исследовать свойства продукте, а также восприимчивость таких растений к вирусам. 3.1. Экспрессирующие конструкции с геном р-интерферона.

Известно, что уровень экспрессии трансгенов в растениях очень невысок и лишь в одном случае он был около 1% от суммарного клеточного белка (Van Der Elzen et al., 1991). Мы попытались разработать подход, который позволил бы тестировать продукцию трансгена просто и с высокой чувствительностью. С этой целью на основе коинтегративного экспрессирупцего вектора pGSH160 (Deblalre et al., 1987) были сконструированы плазмида pG42BE и pG11F (рис. 18). Плазмида pG42BE содержит синтетический ген р-интерферона в составе бицистронного оперона с геном р-галактозидазы E.colt. В штазмиду pG11F встроен ген гибридного белка р-интерферон-р-галактозидвза и, таким образом, эта плазмида отличается от pG42BE только делецией небольшого фрагмента гена интерферона вместе с

pGSH 160

терминирующим кодоном (см. раздел 2.2). Конструкции помещены под транскрипционный контроль промотора 2' из Тр области плазмиды pTiAch5 и имеют идентичные нуклеотидные последовательности в области инициация трансляции гена р-интерферона.

Анализ продуктов транзиентной экспрессии этих плазмид в протопластах табака (рис. 19) показал, что продукт с электрофоретической подвижностью ß-галактозидазы E.colt появляется в экстрактах протопластов, трансформированных плазмидами pG42BE и pG11У, и отсутствует в ковтролях. Плазмида pG11F дает дополнительный продукт, соответствующий по подвижности гибридному белку. Эти данные служат подтверждением

того, что-в растительной системе трансляции, так же как и в животной, возможно считывание двух белков с одной мРНК. В данном случае вероятнее всего работает механизм "сканирования с подтеканием" (leaky scanning), доказанный для многих мРНК млекопитающих (Kozak, 1989). Мы •заключили, поскольку конструкции pG42BE и pG11F практически идентичны, а в плазмиде pG11F трансляционный старт проксимального гена ß-интерферона - активен, он будет также активен в плазмиде pG42BE. Далее мы предположили, что соотношение белковых продуктов проксимального и дисталь-ного генов в pG42BE, определяемого согласно модели Козак (Kozak, 1989) структурой стартов трансляции, будет постоянно и будет соответствовать тому, что наблюдалось для плазмиды pG11F. В таком случае окажется возможным оценивать экспрессию гена ß-штерферона в трансген-

Рис.18. Схемы конструирования плазмид pG42BE и pG11F.

ных растениях, несущих конструкцию pG42BE по активности р-галактозидазы.

■it*.

J-gal_ ,

s.ooli i

•я-

У*

Рис.19. Тестирование р-галактозидазы в протопластах табака, трансформированных плазмидами pG42BE и pG11F. 3.2. Трансгенные растения.

Плазмида pG42BE перенесена в A.ttmefaalena GV2260 (pGV2260), структура коинтеграта pGV2260::pG42BE подтверздена блот-гиОридизацией и одним из клонов инфицированы листовые диски табака сорта Petit Havana SR1. Регенерацию и селэкцию трансформированных растений проводили на среде MS, содержащей канамицин (10О мг/л). Из более чем 30 стеблевых проростков получено 5 укоренившихся трансгенных растений, устойчивых к канямицину и дававших положительный сигнал в НРТ-тестэ.

При анализе экстрактов методом белкового блоттинга в одном из растений были обнаружены белки, перекрестно реагирующие с моноклональннми антителами к p-интерферону (рис. 20). Оказалось, что перекрестно реагирующий материал дает

игл г*

- ,<*■ S <» v" о-1 S

l, .... ■ Рис. 20.. Определение

'I р-интерферона в транс-

i генных растениях, несу-

И : щих конструкцию pG42BE.

__ IFN - маркер, интерфе-

_ рон, синтезированный в

Ш —. E.coli.

нисколько регулярно расположенных полос при гель-электрофорезе, что связано, по-видимому, с убиквитинилировянивм (ttershko and Ciechanover, 1986). Активность р-галактозидазы E.coli в этом растении не обнаружена. Бактериальная р-гялактозидаза была найдена в растении N2 (рис. 21), однако, этот признак не наследовался:

V5S,

семенное потомство этого растения оказалось HPT - gal".

10 i 1 2 3 4

Г' . '

Рис.21. Определение бактериальной р-галактозидазы в трансганных растениях, несущих конструкцию pG42BE. E.coll -маркер, р-галактозидаза E.coll.

Подобные эффекты наблюдались ранее ( например, Budar et al., 1986, Deroles и Gardner, 1988) и объясняются, вероятно, инактивацией трансгена в результате мутации, рекомбинации или метилирования или встройкой трансгена в локусы, необходимые для развития гамет или прорастания семян. Растение было размножено с помощью листовых дисков. Все полученные регенеранты были gal4'. Методом Саузерн-блоттинга для некоторых из них показано, что перенесенная конструкция интегрирована в геном. Согласно оценке, сделанной исходя из активности бактериальной р-галактозидазы, содержание p-интерферона должно было составить около 0,1 нг на миллиграмм экстрагируемого белка, что на порядок ниже чувствительности теста: 1-2 нг/мг белка. Тест на устойчивость этих растений к ВТМ не выявил отличий от контроля.

Таким образом, во-первых, бицистронные конструкции экспрессируются в трансгенных растениях и могут быть использованы для оценки продукции проксимального гена, хотя -ген р-галактозидазы, по-видимому, неоптимален в качестве дистального гена. В настоящее время мы сконструировали и проводим исследования серии бицистронных конструкций с геном бактериальной p-глюкуронидазы, различающихся контекстами AUG кодонов проксимального и дистального генов. Во-вторых, р-интерферон, экспрессирукщийся вV растениях этой серии, модифицирован и не дает антивирусного эффекта.

Мы предположили, что отсутствие . антивирусного, эффекта связано с чеоптимальной для проявления функции субклеточной

локализацией белка. Действительно, в модельных экспериментах Sela и др. (1987) антивирусный эффект интерферона наблюдался при введении его в культуральнузо среду для культивированая протопластов, в то время как при внутриклеточной продукции интерферона эффект отсутствовал (De Zoeten et al., 1988). Ш решили сконструировать трансгенные растения, в которых интерферон секретирвался бы в меаклеточное пространство. Этот подход имеет еще одно преимущество важное для конструирования продуцента: белковый продукт выводится таким образом из под контроля внутриклеточного убиквитинилирования.

С этой целью в плазмиду pGSH'60 была перенесена структурная часть природного гена р-интерферона, выделенного из геномного банка человека. Ген содержит последовательность, кодирующую собственный транзиентный пептид, который обеспечивает экспорт белка из клеток организма-хозяина. Было, однако, неясно способен ли этот пептид функционировать в растительной клэтке.

Полученная плазмида pG21 перенесена в A.twsefaciens GV2260 (pGV2260), структура коинтеграта pGV2260::pG21 подтверждена Олот- гибридизацией и одним из клонов трансформированы листовые диски табака. Регенерацию и селекцию трансформантов проводили как описано выше. Характер наследования перенесенной конструкции анализировали по расщеплению маркерного гена NPT в потомстве от самоопыления и анализирующего скрещивания. В данном случае этот анализ служил одним из доказательств стабильной интеграции конструкции и использован для оценки числя активных копий трансгена в геноме. Из II проанализированных растений 7 дают расщепление NPT+: NPT" 3:1 и 1:1 в потомстве от самоопыления и анализирующем скрещивании, соответственно и, таким образом, содержат по одной активной копии трансгена. Два растения несут по две копии, одно более двух активных копий трансгена. В потомстве одного из растений не обнаружено ни одного растения, устойчивого к канамицину. По-видимому, встроенный ген в потомстве этого растения инактивирован по одному из механизмов, обсуждавшихся выше.

В дальнейшем проверялись растения с одной активной копией трансгяна. Саузерн-блоттинг геномной ДНК подтвердил, что перенесенные конструкции интегрированы в геном в неперестроенном виде. Белковым блоттингом в экстрактах этих

растений удалось зарегистрировать белок, перекрестно реагирующий с антителами к (3-интерферону. Важно подчеркнуть, что по электрофоретической подвижности этот белок соотвествует процессированному р-интерфэрону (рис.22). Эти данные позволяют думать, что ^-интерферон в наших трансгенных растениях секре-тируется. Его содержание составляет около О,Б нг/г ткани; количество его уменьшается у потомков F1 и во втором поколении он, практически, не регистрируется нашим методом.

S £ S S

1 i s s I 2

А i * *

с«*-**»* " '"* ' '

Рис.22. Определение р-интерферона в трансгенных растениях-регенерантах (А) и их потомках первого поколения (В), несущих конструкцию pG21. E.coli - маркер, интерферон в E.coli; К -контроль, экстракта ^трансформированных растений. 3.3. Устойчивость трансгенных растений к вирусной инфекции.

Полученные трансгенные растения были проанализированы на устойчивость к заражению ВТМ. С этой целью растения табака 3-х недельного возраста заражали ВТМ (концентрация вируса 0,05 мкг/мл). Устойчивость оценивали по времени появления симптомов (мозаика на листьях) или по накоплению вируса в листьях, оцениваемому титрованием на растениях Nicot tema tabacm. Kant I nc.

Тестирование двух исходных регенврантов показало, что количество титруемого вируса в одном из них в течение трех недель после заражения было на порядок меньше, чем в контроле. В другом растении накопление ВТМ происходило с некоторой задержкой, хотя в дальнейшем татры вируса в контроле и опыте выравнивались. Возможно, наблюдаемая задержка накопления вируса связана с экспрессией перенесенного гена. С другой стороны, растения, проявляющие задержку развития инфекции, могут быть сомаклональными вариантами, полученными при культивировании в условиях In vitro. Поэтому последующий анализ проводили сравнивая по устойчивости к вирусу НРТ+ и

NPT- сегреганты отдельных линий, полученные самоопылением исходных трансгенных растений.

При сравнении времени появления симптомов у ЯРТ+ и НРТ" сег-регантов оказалось, что у растений НРТ+ развитие симптомов задержано по сравнению с растениями NPT-. Наблюдаемая задержка, вероятнее всего, связана с индукцией механизмов протововирус-ной защиты, вызываемой накоплением в растительных клетках (З-ин-терферона (рис.23).

i .

и а

S а>

ig H

со о

Р. СО

СО Q,

со м

5 10 15 20

Ели ПССЛО ШИЁЛКЩВ

5 10 15 20 Дни поело пвфокция

Рис.23. Гистограммы времени появления симптомов вирусного заражения у интяктных (А) и трансгенных (Б) растений табака линий 21/2, 21/7, 21/8 и 21/9.

Особую важность представляло получение хозяйственно-ценных растений, устойчивых к вирусам. Мы выбрали для этой цели люцерну, так как ее урожаи заметно страдают от вирусных поражений (30-50Х -ные потери). Ген p-интерферона в составе плазмида pG21 был агроинфекцией перенесен в растения люцерны (Medtcago varia Mart клон F868, клон любезно предоставлен А.В.Мезенцевым). У устойчивых к канамицину и зкспрессирующих бактериальную неомжщнфосфотрансферазу растений-регенерантов был изучен характер наследования внесенной конструкции и отобрано несколько линий, стабильно наследующих признак NPT+ в первом и втором поколениях от самоопыления регенерантов. У самоопыленного потомства первого поколения 10 трансгенных растений оценена устойчивость к ВМЛ.

С этой Целью по 20 канамицинустойчивнх растений трехнедельного возраста заражали ШЛ (концентрация вируса 5 мкг/мл). Вирусоустойчивость оценивали по двум критернням: а) времени появления симптомов (мозаика на листьях) и б) накоплению вируса в листьях, оцениваемому методом сэндвич-варианта дамуноферментного анализа. Проведено двухкратное тестирование анализируемых растений: первый опыт в

20-

вине-июле и второй - в сентябре-октябре. Результаты летнего эксперимента показали, что растения можно разделить на две группы : линии, проявляющие симптомы инфекции, на уровне контроля (линии 2, 8, 9, 15, 18, 20, 24) и линии с задержкой развития ВМЛ (линии 1, 3, 12, 22) (рис. 24-1-1). С этими данными хорошо согласуются результаты выборочного анализа накопления ВМЛ в инфицированных растениях: вирус медленнее накапливается в растениях именно тех линий, у которых обнаружена задержка развития симптомов,(рис. 24-1-2).

Рис.24. Гистограммы времени появления симптомов (I) и типичные кривые накопления ВМЛ (2) характерные для трансгенных линий люцерны 2, 8, 9, 15, 20, 24 и контроля (А) и линий I, 3, 12, 22 (В), I- лето, II - осень

Повторное тестирование показало, что по времени появления симптомов и скорости накопления ВМЛ линии первой группы ведут себя сходным образом в летнем и в осеннем экспериментах. Однако среди растений второй группы, показавших задержку развития симптомов в условиях летнего эксперимента, обнаружена весьма значительная вариабельность в реакции на заражение ВМЯ. Часть растений этих линий, как и в первом опыте, оказалась более устойчивой к ВМЛ, однако другая часть, напротив, более восприимчивой. Этот результат также подтвержден данными количественного определения вируса с помощью иммуноферментного анализа (рис. 24-11).

Приведенные данные свидетельствуют о том, • что ген р-интерферона, экспрессирующийся в растении, значительно

изменяет его реакцию на вирусную атаку. Однако степень кзмекегшя и еЭ направленность ионет, вероятно, зависеть от условзгЛ окружающей среды (тезшература, влажность, время года и др.). Воамокно, что это связано с тем, что (З-интерферон влияет на репродукщпо тшруса опосредованно, через изменение эндогенного уровня фптогормошв. Показано, что аппликация а-кнтерферона изменяет баланс фитогормонов в растениях табака (Тзльянсютй М.Э. и др., 1987) Возможно такге, что физиологическое состояние и, в частности, гормональный статус растения могут влиять на экспрессию гена ^-интерферона. Известно, что двунаправленный промотор 1'-?.' пз TR области плазмиды pTtAch5, использовавшийся в наших конструкциях, не является конститутивны?.!. Показано, что транскрипция с этого промотора тканеспэцифячна и индуцируется при раневых • повреждениях примерно в 20 раз (Teerl et al., 1989). Вполне вероятно, что активность этого промотора зависит п от гормонального баланса, связанного, в свою очередь, с условиями окружающей среды или сезоном года. В настоящее время эти проблемы интенсивно изучаются и представляется вполне вероятным, что полученная информация внесет вклад в понимание молекулярных механизмов ответа растений на вирусную инфекцию.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В ходе работы были сконструированы модели и изучено влияние ряда параметров структуры мРНК на эффективность ее трансляции б бактериальной системе.

Известно, что синонимические кодоны используются в разных мРНК с разной частотой: б мРНК высокоэкспрессирупцихся генов испольяуттоя лишь те кодонн, которые соответсвуют мажорным фракциям в спектрах изоакцепторных тРНК. Эта неравномерность ткестко поддерживается отбором, так как мутационный процесс должен приводить к выравниванию этих частот. Возможно, что отбор тягам образом направлен на сохранение на необходимом уровне экспрессии определенных генов, однако это утверждение верно лишь в том случае, если транслируемостъ мРНК зависит от использования кодонов. Экспериментальные данные по этой проблеме очень немногочисленны и противоречивы.

Мы показали, что неклаетеризованные редкие кодоны влияют на уровень трансляции модельной матрицы, что свидетельствует в

пользу того, что неравномерность использования кодонов является механизмом активной модуляции уровня экспрессии генов. Этот результат имеет также важное практическое значение, так как должен учитываться при конструировании высокоэкпрессируемых генов.

Механизм реинициации трансляции, изученный в нашей работе, является основным механизмом, с помощью которого поддерживается баланс белков, считанных с полицкстронной мРБК. Эффективность трансляционного сопряжения зависит от нескольких параметров структуры межцистронной области, основным из которых является взаимное расположение стоп- кодона проксимального цистрона и SD-сайта дистального цистрона. Этот механизм ввиду его большого значения для понимания процесса трансляции интенсивно изучается с помощью введения точечных мутаций, делеций или инсерций в межцистронную область. Такой подход затрудняет однозначную интерпретацию результатов, так как вносимые изменения сами по себе активно влияют на реинициацию.

Мы предложили новый, более корректный подход, суть которого заключается в том, что идентичные по структуре межцистронные сопряжения сравниваются в супрессорном и бессупрессорном штаммах. Мы показали, что положение терминирующего кодона лидирующего цистрона в межгенной области и размер лидирующего цистрона являются взаимосвязанными факторами, влияющими на эффективность реинициации. При коротком лидирующем цистрона (соизмеримом с размером рибосомы) трансляция на втором цистроне инициируется более эффективно, если терминирующий кодон расположен между SD и AUG. Если же лидирущий цистрон большой, оптимальным для реинициации оказывается проксимальное по отношению к последовательности SD-AUG положение стоп-кодона. Дальнейшее исследование сопряженной трансляции позволит понять тонкие механизмы реинициации и создать на их основе высокоэффективные экспрессирующие векторы бактерий. На основе проведенных нами исследований была сконструирована плазмида,которая может стать основой для создания бактериального продуцента ß-интерферона человека.

Исследована трансляция модельного бицистронного гена в растительной системе. Показана экспрессия дистального гена при

функционально активном старта трансляции проксимального. Это, насколько нам известно, первый результат, полученный на искусственной модели в растениях и не связанный с механизмами трансляции полицистронных РНК в клетках, зараженных фитовирусами. Дальнейшие д-этальные исследования, проводимые нами в настоящее время, позволят выяснить насколько эти механизмы сходны у растений и других эукариот.

Полученные в ходе нашей работы трансгенные растения табака и люцерны, в геном которых -интегрирован ген р-интерферона, являются перспективными моделями для изучения механизмов защиты растений от вирусной 1шфекции ir*-,.потенциальными продуцентами p-штерферона для медицины. Мы показали, что p-интерферон, синтезирующийся в таких растениях, созревает из предшественника и меняет реакцию растений на заражение вирусом: часть трансгенных растений дает задержку развития инфекции. Предложенный нами принцип может, стать основой для получения хозяйственно ценных растений, устойчивых к вирусной инфекции.

ВЫВОДИ

1. Установлено, что синтетические аналоги олигонуклеотидов • с p-S-C(5') связями являются субстратами основных ферментов нуклеотидного обмена. Они а) более устойчивы, чем олигонуклеотиды с природной фосфодиэфирной связью, к экзо-и эндонуклеолитическому гидролизу; б) могут служить прайшрами и матрицами для . ДНК-полимеразы I E.coll. в) фосфоршшруются полинуклетидкиназой и сшиваются полинуклеотидлигазой фага Т4.

2. Синтетический ген гормона ангиотензина I экспрессирован в клетках E.colI в составе плазмидного и фагового векторов; продукт экспрессии имеет вазопрессорную активность. Собранный из синтетических олигонуклеотидов аналог гена ангитензина-, в состав которого включен тиоолигонуклеотид с p-S-c(5') связями неактивен In vivo.

3. Разработан комплексный подход к ферментативной сборке протяженных фрагментов ДНК из синтетических олигонуклеотидов, включающий ферментативную сборку и клонирование одноцепочечных полинуклеотидов. С пбмощью этого подхода собран из синтетических олигонуклеотидов и

экспресирован в E.coll ген p-интврферона человека, показано, что продукт экспрессии биологически активен.

4. Сконструированы корректные модели для а) . изучения влияния структуры кодирующей части мРШ и б) структуры межцистронного сопряжения в бицистронной мРНК на эффективность их трансляции. Суть, первой модели состоит в том, что различия в структурах сравниваемых мРНК не затрагивают сайт связывания с рибосомами. Вторая модель позволяет сравнивать альтернативные позиции терминирующего кодона в менцистронной области по их влиянию на

' эффективность трансляции дистального цистрона с помощь» одной конструкции, т.е., без изменения структуры межцистронного сопряжения.

5. Установлено, что некластеризованные "редкие" для В. col i кодоны снижают транслируемость мРНК; показано, что эффективность трансляции дистального цистрона в бицистронной конструкции зависит от а) положения терминирующего кодона проксимального цистрона в структуре рибосомсвязываидего сайта дистального цистрона. и б) размера проксимального цистрона

6. Сконструирована серия плазмядных экспрессирущих векторов E.coll, содержащих тандемно расположенные сильные терморегулируемые промоторы бактериофага X и ген белка репрессора; сконструирован и использован для продукции p-интерферона стабильный экспрессирующий вектор с оптимальным направлением транскрипции.

7. На искусственной бицистронной модели обнаружено, что в растительной системе трансляции, также как и в животной, возможно считывание нескольких белков с одной мРНК. Показана экспрессия дистального гена при функционально активном старте трансляции проксимального в протопластах и трансгенном растении табака.

8. Впервые получены трансгенные растения табака и люцерны, в геном которых интегрированы синтетический или структурная часть природного гена p-интерфэрона человека; установлено стабильное наследование и расщепление внесенного признака в потомстве, показана продукция р-интерферона трансгенными растениями. Обнаружено, что p-интерферон продукт

экспрессии природного гена - процесснруется в клетках растений. Установлено, что продуцирующийся в растениях интерферон влияет на реакцию растений на вирусную инфекцию; выявлена задержка накопления вируса у части трансгенных растений.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Kumarev V.P., Rivkln M.I., Bogachev V.S., Baranova L.V., Merkulov V.M., Rybakov V.N. Molecular cloning of synthetic angiotensin I gene In E.coll. A route to physiologically active hormone. FEBS Letters, 1980, v.114, N 2, p.273-277.

2. Кумарев В.П., Ривкин M.И., Богачев B.C., Баранова Л.В., Меркулов В.Н.Рыбаков. Получение физиологически активного горяона ангиотензина I- продукта экспрессии синтетического гена. Докл. АН СССР, 1980 , 252, N. 6, с. I506-I5I0.

3. Кумарев В.П., Ривкин М.И., Баранова Л.В.,Богачев B.C., Меркулов В.М., Рыбаков В.Н. Клонирование синтетического гена ангиотензина Г - метод получения физиологически активного гормона. В сб. "Успехи теоретической и прикладной генетики", ИЦиГ СОАН СССР, Новосибирск, 1982, с. 21-23.

4. Кумарев В.П., Ривкин М.И., Богачев B.C..Баранова Л.В., Меркулов В.М. Получение физиологически активного гормона ангиотензина I - продукта экспрессии синтетического гена в клетках E.coll. Тезисы Всесоюзной конференции "Генетическая инженерия", Пущино, 1980, с. 60.

5. Рыбаков В.Н., Ривкин М.И., Богачев B.C., Кумарев В.П. Сшивка аналогов олигонуклеотидов с p-S-C(5')-связями голинуклеотидлигазой фага Т4. Биорганическая химия, 1981, т.З, N 9, с.Т423-1425.

6. Rlbakov V.N., Rivkln M.I., Kumarev V.P. Some substrate properties of analogues of ollgothymldilates with p-S-C(5') bonds. Nucl. Acids Ees., 1981, v.9, N 1, p. 189-201.

7. Кумарев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова Л.В., Ривкин М.И., Рыбаков В.Н. Тиофосфатнне аналоги нуклеиновых кислот. II. Синтез и свойства 5'-S-тиофосфатных аналогов олигодезоксирйбонуклеотидов. Биоорг. химия, 1982, т.8, N' II, с.1525-1534.

8. Кумарев В.П., Богачев B.C., Кобзев В.Ф., Баранова Л.В., Ривкин М.И., Рыбаков R.H. Синтез и свойства 5'-s-тиофосфатных

аналогов олигодезоксинуклеотдов. В сб. "Успехи теоретической и прикладной генетики", ИЦиГ СОАН СССР, Новосибирск, 1982, с. 23-27.

9. Рыбаков И.Н., Ривкин М.И., Богачев B.C., Кумарев В.П. 5'-S-тиофосфатнке аналоги олигодеьоксирибонуклеотидов: субстратные свойства и перспективы использования в молекулярной биологии. В сб. "Успехи теоретической и прикладной генетики", ИЦиГ СО АН СССР, Новосибирск, 1982, С.27-29.

10. Потапов В.А..Рыбаков В.Н..Богачев В.С.,Ривкин М.И..Кумарев В.П. Репарирующая репликация Б'-з-тиофосфатного аналога гексадекадезоксинуклеоотида, катализируемая

ДНК-полимеразой I E.colt. Биоорг. химия, 1983, т.9, N 7, с. 954-957.

11. Амирханов Н.В., Кузнеделов К. Д., Ривкин М.И., Кумарев В.П. Клонирование одноцепочечных синтетических ДНК. Биоорг. химия, 1985, т. II, N 9, с. 1283-1285.

12. Рыбаков В.Н., Ривкин М.И., Кумарев В.П., Богачев B.C. Определение первичной структуры аналогов олигодезоксирибонуклеотидов • с р- S-(5')-связями. Биоорг. ХИМИЯ, 1985, т.II, N 12, С. I688-I689.

13. Кузнеделов К.Д., Ривкин М.И., Кумарев В.П., Кравченко В.В. Исследование влияния ориентации сильного промотора на уровень экспрессии генов, клонированных в плазмиде pBR327. Докл. АН СССР, 1986, т.286, N 4, с. I0I2-I0I5.

14 Кобец М.Л., Ривкин М.И., Кузнеделов К.Д., Кумарев В.П. Плазмида с гибридным геном ß-галактозидазы и синтетическим геном ß-интерферона человека. Тезисы докладов X Всесоюзного совещания "Проблемы переноса генетической информации", Пущино, 1985, с. 150- 151.

15. Ривкин М.И., Кузнеделов К.Д. Клонироввание и экспрессия модельного полусинтетического гена ß-I-интерферона в E.coli. Тезисы Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", 1986, Пущино, с. 24.

16. Кумарев В.П., Ривкин М.И., Амирханов Н.В., Баранова Л.В., Богачев B.C., Кобец М.Л., Ошевский С.И., Обухова Л.В., Рыбаков В.Н., Кузнеделов К., Вершинина С.И., Гулевич В.В. Химико-ферментативный синтез и клонирование биологически

активного гена ß-интерферона человека. Докл. АН СССР, 1986, 7.?,90, N I, с.244-248.

1?. Ривкта М.Й., Кузнеделов К.Д., Кумарев В.П. Анализ фрагментов геномной ДНК человека, гомологичной гену ß-интерферона. Тезисы V Съезда ВОГиС, 1987, Москва, т.1, с.236.

18. КобецМ.Л., Ривкин М.И., Вогачев B.C., Кумарев В.П. .Усовершенствованный химико-ферментативный метод синтеза протяженных фрагментов ДНК. Биоорг. химия, 1988, т.14, N- I, с.43-47.

19. Кямялетдинова U.A., Сагитов Ш.З., Набиуллина P.P., Ривкин М.И., Чураев Р.Н. Плазвддный вектор с каскадной регуляцией экспрессии генов Докл. АН СССР, 1990, т. 313, N 4, с. 980-982 .

20. Дейнеко Е.В.,Ривкин М.И.,Комарова М.Л..Вершинин A.B.,Шумный В.К. Создание трансгенных растений люцерны методом кокультивирования "листовых дисков" с A.tumefaciens. В сб. "Генетика культурных растений", Новосибирск, 1991, с. 6-12.

21. Кочетов A.B., Ривкин М.И., Дейнеко Е.В., Шумный В.К. Отимизяция трансляции генов в трансгенных растениях: создание мо-далъных Сицистронных оггеронов. В сб. "Генетические основы признаков продуктивности растений", Новосибирск, ИЦиГ, 1992, с. П-1Т.

2?. Дейнеко Е.В., Ривкин- М.И., Комарова М.Л., Вершинин A.B., Шумный В.К. Генетическая трансформация люцерны с использованием Ti-плазмидной системы. Докл. АН СССР, 1991, т. ЗТ9, MR, С. Т473- Т476.

23. Ривкин М.Я., Дейнеко Е.В., Комарова М.Л., Кочетов A.B., Шумный В. К. Оценка виру соус,тойчивости трансгенннх растений табака и люцерны, несущих ген ß-интерферона человека. Доклады РАН, ТЭЭЯ, т. 331, N5, С. 652-654

24. Ривкин М.И., Кобец М.Л.,Кочетов A.B., Мендель P.P. Модельные конструкции для изучения трансляции полицистронных mrHK ряотетай. Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии", Пущино, ТЭЭО, с. 17-18.

?г>. RivKlr. Т., Leisner Н.М., Sehl smarm J.M., Mendel R.R. Human ^-interferon in transgenic tobacco. Abstracts of the vill International Congress of Virology, Berlin, 1990, p.457.

26. Rivfcin «.I.Talyansky M.R. Kendel R.R., Leiser R.M.,

Shimmy V.K. Transgenic tobacco and. alfalfa plants bearing human beta-interferon gene: analysis of inheritance, transferred, genes expression and resistance to viruses. Symposium "Trends in Plant Biotechnology", Puschlno, 1991, p. 141.

27. Rlvkln M.I., Kochetov A.V., Deyneko E.V., Komarova M.L., Shumny V.K. A study of model bicistronic operons integrated Into alfalfa genome. Symposium "Trends in Plant Biotechnology", Puschlno, 1991, p. 142.

28. Кумарев В.П., Богачев B.C., Баранова 1.В., Кобзев В.Ф., Ривкин М.И. Олигодезоксинуклеотиды, проявляющие матричные свойства в РНК-полимеразной системе из E.colt. Авторское свидетельство Ы 899571.

29. Кумарев В.П., Богачев B.C., Баранова Л.В., Ривкин М.И. Способ получения полидезоксинуклеотидов. Авторское свидетельство N 925964

, - 30. Кравченко В.В., Петренко Л.А., Дегтярев С.Х., Нетесова Н.А.,Ривкин М.И.,Кузнеделов К.Д. Рекомбнантная гоизмидная ДНК ;рСЖ10, кодирующая синтез фрагмента Кленова ДНК-полимеразы . I EicoU и способ ее конструирования. Авторское свидетельство N 1392094.

• ,31. Кумарев В.П., Ривкин М.И., Амирханов Н.В., Баранова •Л.В., Богачев B.C., Кобец М.Л., Ошевский С.И., Обухова Л.В., '.Рыбаков В.Н,, Кузнеделов К.Д., Вершинина С.И., Гулевич В.В. • Способ'получения искусственного гена ¡3-интерферона человека. Авторское'свидетельство N I3620I6.

32. Кумарев В.П., Ривкин М.И., Амирханов Н.В., Баранова Л.В.;/Богачев B.C. Кобец М.Л., Ошевский С.И., Обухова Л.В., •'Рыбаков ВЛ1.),/Кузнеделов К.Д., Вершинина С.И., Гулевич В.В. Способ получения полипептида с активностью р-штарферока. Авторское свидетельство N I3620I7.

33..Колот.М.Н.', Хмель И.А., Ривкин М.И., Кузнеделов К.Д. Векторная плазмида рЕСРДраг и способ ее конструирования. Авторское.свидетельство N 1482200.

Информация о работе

Ривкин, Марк Иосифович
доктора биологических наук
Новосибирск, 1994
ВАК 03.00.25

Автореферат

Похожие работы