Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях"

Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт _биологической промышленности_

На правах рукописи

УДК 619: 576. 852. 17

РГЬ ОД 2 5 ДЕК 2000

Гуннн Максим Александрович

Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии н на микроносителях

03. 00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Щелково - 2000

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности

Научные руководители:

член-корреспондент РАСХН, доктор ветеринарных наук, профессор

доктор биологических наук

А.Я.Самуйленко Е.А.Рубан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук доктор ветеринарных наук, профессор

М.А.Сидоров

В.А.Лукнна

Ведущее учреждение - Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко

Защита диссертации состоится ^ декабря 2000 года в часов на заседании специализированного совета К 120. 17. 01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности по адресу: 141142, Московская обл., Щелковский район, п/о Кашинцево, ВНИТИБП.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан ¿1 ноября 2000 года.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время культуры животных ^пользуются для прогаводства ряда ценных продуктов, в том числе вакцин, фотеолитического фермента урокиназы, моноклональных антител и интер-|)еронов. С помощью культур животных клеток можно также получать лим-|юкины (белки, оказывающие регуляторный эффект на иммунного систему), шогие ферменты, факторы роста, факторы свертывания крови и гормоны.

Культивирование клеток животных является крайне важным и слож-1ым процессом. Из-за повышенной чувствительности клеток животных к тешним условиям необходимо рассмотреть комплекс физиологических характеристик и особых специфических требований к питательной среде для их :ультивирования, проблему культивирования клеток животных в биореакто->ах, особые требования к конструкции биореактора и ведению процесса ;ультивирования.

Хотя при проектировании биореакторов определяющим фактором читается влияние механических сил на культуры клеток животных, до сих юр не проводилось систематического изучения влияния механического воз-(ействия на жизнеспособность, рост и морфологию клеток с тем, чтобы ре-ультаты этих исследований были бы положены в основу инжснерно-ехнических расчетов. Вместо этого были предложены конструкции аппара-ов и конкретные формы биокатализаторов, обеспечивающие повышение ко рост и роста клеток, достижение более высокой плотности клеток в куль-уре и более высокого продукта процесса с участием клеток животных. Хотя т базе такого чисто эмпирического подхода достигнуты значительные успе-;и, тем не менее, очевидно, что выяснение закономерностей кинетики роста леток животных и их технологических характеристик позволит добиться :ще более существенного прогресса.

Перечисленные выше проблемы требуют исследования процессов культивирования в биореакторе клеток животных в суспензии и на микроносителях.

Цели и задачи исследований. Целью исследований явилось изучение выживаемости клеток животных в суспензии и на микроносителях при культивировании в биореакторах для оптимизации их конструкции и режимов культивирования.

Научная новизна. В результате проведенной работы с использованием современных методов исследований:

-рассмотрены модели суспензионного культивирования клеток животных;

- теоретически обосновано и практически подтверждено наличие гипотетического объема гибели клеток в биореакторе с аэрацией и перемешиванием;

- разработана схема цикла клеточного деления, учитывающая гибель клеток в биореакторе, при гидродинамическом воздействии в процессе культивирования;

- изучено влияние механического перемешивания (напряжение сдвига, скорость сдвига) на жизнеспособность клеток в биореакторе;

- исследовано влияние аэрации на гибель клеток;

- исследовано влияние концентрации сыворотки в культуральной жидкости на гидродинамические условия культивирования клеток животных в биореакторе;

- исследовано влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на гидродинамические условия культивирования клеток животных в биореакторе;

- исследовано влияние гидродинамических условий на процесс культивирования клеток животных на микроносителях.

Практическая значимость. В результате проведенной работы сформированы основные требования к культивированию клеток животных в ореакторе по следующим основным показателям:

- теоретически обосновано и практически подтверждено понятие "ги-тетического объема гибели клеток" для оценки и оптимизации конструк-вных соотношений биореактора и режимов его работы при культивирова-и клеток животных;

- определены тип биореактора и основные геометрические соотноше-я для суспензионного культивирования с учетом режимов аэрации и пере-шивания;

- определены тип биореактора и основные геометрические соотноше-я для культивирования на микроносителях с учетом режимов аэрации и ремегаивания;

- определены режимы суспензионного культивирования и культиви-вания на микроносителях клеток животных с учетом концентрации сыво-гки в культуральной жидкости;

- определены режимы суспензионного культивирования и культиви-вания на микроносителях клеток животных с учетом концентрации по-эхностно-актшшых веществ (ПАВ) в культуральной жидкости.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссер-пш доложены:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной -летию института "Научные основы производства ветеринарных биологи-жих препаратов" 8-9 июня 2000 г., Щелково 2000.

- на Международной научно-практической конференщш "Диагности-профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооан-

шонозными болезнями животных" 15-16 августа 2000г. г. Покров 2000.

- на Семинаре-Презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология - 2000" 25 - 27 сентября 2000 г., Пущино - на Оке, 2000.

Основпые положения диссертации, выносимые на защиту:

- понятие "гипотетического объема гибели клеток" как критерий для оценки и оптимизации биореакторов и режимов их работы;

- выбор биореактора и оптимизация режимов аэрации и перемешивания при глубинном культивировании клеток животных;

- выбор биореактора и оптимизация режимов аэрации и перемешивания при культивировании клеток животных на микроносителях;

- выбор биореактора и оптимизация режимов глубинного культивирования и культивирования на микроносителях в зависимости от концентрации сыворотки и ПАВ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список отечественной и зарубежной литературы 154 наименований. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами, 17 рисунками, приложения.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Культивирование клеток животных в суспензии и на микроносителях осуществлялось в лабораторных биореакторах с механическим перемешиванием и аэрацией, барботажных биореакторах колонного типа, эрлифтных биореакторах и спиннерных флаконах.

Обработка экспериментальных данных проводилась с использованием стандартных статистических методов (метод наименьших квадратов, линейная и нелинейная регрессия и корреляция).

Для практического подтверждения «гипотетической теории объема ибели клеток» при аэрации использовались клеточная линия ВНК 21/13 при ультивировании в барботажном биореакторе колонного типа емкостью 1500 ш и клеток Vero в эр лифтном биореакторе емкостью 1000 мл при различ-ой интенсивности аэрации (скорости движения газового потока) и соотно-юнии высоты биореактора и его диаметра. Экспериментальные биореакторы вмещались в водяную баню для поддержания температуры культивирова-ия в пределах 37±0,5°С. Аэрация осуществлялась смесью газов (воздух + 5% Юг) для поддержания рН в пределах 7,2±0,1 ед. рН, контрольная культура бъемом 250 мл3 инкубировалась в статическом состоянии в С02 - инкубато-е. Питательная среда состояла из сред Dmem и Ham's F12 в соотношени 1:1 добавлением 1%сыворотки новорожденного теленка и 100 мГ л"3 канами-даа.

Контрольные пробы (около 1 мл3) брались каждые полчаса. К пробе обавлялся голубой трипан (в концентрации 0,1%) для определения содержания мертвых клеток и затем с использованием светового микроскопА(уве-ичение 400х) производился подсчет жизнеспособных клеток.

Для исследования влияния перемешиваний на гибель клеток при сус-ензионном культивировании использовался 500 мл3 градуированный ци-индр (спиннер), снабженный турбинной мешалкой диаметром 2 см. В цн-индр помещалось 225 мл3 культуры клеток ВНК 21/13, который закрывался ластиковой крышкой для подачи над поверхностью культуралыгой жидко-ги газовой смеси (воздух + 5% С02) для поддержания рН на уровне ,2±0,1 ед.рН . Цилиндр помещался в водяную баню для поддержания темпе-атуры в пределах 37±0,5°С. Контрольная культура объемом 100 мл3 инкуби-овапась в статическом положении в СОг - инкубаторе. Питательная среда о стояла из сред Dmem и Ham's F12 в соотношении 1:1 с добавлением 1% ыворотки новорожденного теленка и 100 мг л"3 канамицина. Контрольные робы (около 1 мл3 ) отбирались каждые полчаса. К пробе добавлялся голу-

бой трипан (0,1%) для определения содержания мертвых клеток и затем с использованием светового микроскопа (400х) производился подсчет жизнеспособных клеток.

Влияние концентрации сыворотки на гидродинамическине условия культивирования клеток исследовалось при механическом перемешивании и аэрации в биореакгоре емкостью 1000 л3 при культивировании трансформированных клеток лимфоцитов телят. Использовалась питатеьная среда Dublecco с добавлением 5% инакшвированной с помощью тепловой обработки эмбриональной бычьей сыворотки и 14000 ед/л неомицина и 75000 ед/л стрептомицина. Скорость перемешивания составляла 60 об/мин. Контролировалась рН на уровне 7,2±0,1 ед. рН, температура 37±0,5°С, парциальное давление растворенного кислорода (р02) равное 50±10% нас. РН и р02 поддерживались подачей в биореактор смеси воздуха, N2, 02 и С02 над поверхностью культуральной жидкости при культивировании в биореакторе с механическим перемешиванием или непосредственно в эрлифтном биореакторе Пробы отбирались каждый час в количестве 2 мл3 . Для определения количества жизнеспособных и погибших клеток к пробе добавлялся 0,1% голубого трипана и производился подсчет с использованием светового микроскопа (400х).

Влияние ПАВ, в частности силиконового пеногасителя «Пропинол Б-400» исследовалось в биореакторе емкостью 1000 мл3 час'1 при использовании односоплового барботера и рабочего объема культуральной жидкости ровного 500 мл3. Для проведения экспериментов использовались клеточные линии ВНК21/13 и Vero. Питательная среда состояла из сред Dmem и Ham's F12 в соотношении 1:1с добавлением 1% сыворотки новорожденного теленка и 100 мГ л '3 канамицина. Условия выращивания: температура 37±0,5°С, рН=7,2±0,1 ед. рН, р02 на уровне 60±10%нас. с аэрацией смеси воздуха и 5%

со2.

Пробы отбирались каждый час в количестве 2 мл3 Определение количества мертвых и жизнеспособных клеток осуществлялось добавлением к пробе 0,1% голубого трипана и подсчет производился с использованием светового микроскопа (400х).

Исследовалась гибель первично-трипсинизироватшх клеток ФЭП, ФЭК и клеток ПЕрививаемой линии, выращиваемых на микроносителях "С}1о(1ех-3" при их концентрации 2,5 г л"3. Культивирование осуществлялось в эрлифтном биореакторе емкостью 500 см3, с рабочим объемом 250 мл3. Культивирование проводилось при 37±0,5°С, рН=7,2+0,1 ед. рН, р02 -60%нас±10%. В качестве питательной среды использовалась модифицированная среда ПиЫессо с добавлением неомицина1400 ед. л"3 и 7500 ед. л"3 стрептомицина и инакгивироваиной при температуре 56°С в течении 30 мин. сыворотки зародыша теленка. Смесь воздух и С02 продувалась над поверхностью культивированной жидкости дважды в сутки для поддержания рН на уровне 7,0+0,1 ед. рН и растворенного кислорода (р02) около нуля. После того, когда микроносители были полностью покрыты клетками (через 95 часов культивирования) их использовали в экспериментах с напряжением сдвига. Концентрация прикрепленных к микроносителям клеток определялась их инкубированием с раствором кристаллической синьки (1 г л'3) в лимонной кислоте (0,1 М). Ошибка определения количества клеток составляла ±5%. Концентрация жизнеспособных и погибших клеток определялась при окрашивании пробы суспензии голубым трипаном(1%) с использованием светового микроскопа (400х). Лактат-дегидрогиназная активность(ЬОН) определялась ферментным методом.

2.2. Результаты исследований

Модели культивирования клеток животных. Усредненные свойства популяции клеток являются результатом оценки случайных свойств от-

дельных клеток в популяции. Описание этих усредненных свойств требует разработки моделей и количественной оценки физиологического статуса отдельных клеток. Неструктуированные сегрегированные модели, состоящие из отдельных клеток, являются наиболее применимыми и достаточно специфическими по используемым их характеристикам, выраженным через сухой вес или концентрацию.

Хорошее совпадение было получено между экспериментально полученной зависимостью спектра объемов клеток ВНК 21/13 и рассчитанные с помощью модели, как это показано на рис. 1. Хорошее совпадение было также получено и в том случае, когда общая скорость роста клеток пропорциональна их объему или, другими словами, когда объем клеток возрастает экспоненциально.

я№/п(У.)

Рис. 1. Сравнительные данные спектра . объемов, рассчитаные на компьютере по принятой модели экспериментальными результатами для клеток ВНК 21/13.

Фазы развитии популяции клеток. Популяция клеток животных может находиться в различных фазах их развития как показано на рис.2.

Рис. 2. Фазы развития популяции клеток животных. Gia. Gm, S, СЬ, M, Л, В, С, Со, Q, О, D - изображение различных субпопуляцнй или фаз, которые проходит популяция клеток животных. Темными стрелками показаны изменения во всех фазах в субпопуляции. Xjj - отображает скорость перехода от популяции i к j (сек '); no(to)/No (сек"') - число разрушенных клеток возраста, to(S), п0 (1о) (кл сек"1) образующие из общего числа подвергшихся апоптозу клеток N0(ioi.). Это количество остается постоянным п фазе гибели после отсчета значения времени to

Клеточный цикл. Находясь в первой фазе, связанной с пролиферацией или циклом (С), клетка может быть также задержана в фазе покоя Q и может рассматриваться как ислролите-РМРОВЛНнайили не прошедшая цикл. Иногда в фазе G существует точка, называемая точкой разрешения, где клетка несомненно перейдет п фазу S и полностью в другой цикл или перейдет в фазу покоя Q. Задержка клеток в фазе Q можег быть вызвана влиянием ряда факторов, среди которых можно отмстить истощение питательной среды, введение ингибиторов, присутствие или отсутствие специфических факторов роста и контактное ингибирование.

Гибель клеток при апоптозе н некрозе. Гибель клеток при механическом воздействии происходит по двум основным причинам, которые имеют значимое различие - некроз и апоптоз.

Некроз - это быстрый и одновременный процесс в основном вызываемый стрессовыми условиями^такимн,, как большие гидродинамические воздействия или внезапной добавление в среду высокотоксичных компонентов, когда у клетки нет времени для приспособления к стрессовым условиям. Некроз может распространяться во всех субпопуляциях, которые были описаны ранее. Апоптоз - процесс, который поддерживается в основном при незначительных уровнях стресса, таких как низкий уровень сдвига, истощение питательных веществ или медленное выведение продуктов метаболизма, когда клетки имеют время отреагировать на стрессовые условия. Апоптоз как процесс, требует времени и в конечном счете приводит клетку к гибели (О), через вторичный некроз. Так как клетки подвергнутые апогггозу имеют очень ярко выраженные физиологические характеристики, то они составляют отдельную субпопуляцию (О). Клетки могут входить в состояние апоптоза во всех ранее описанных фазах. Однако при определенных условиях и изучении клеточных линий, клетки могут становиться склонными к апоптозу непосредственно в определенной фазе.

2.2.2. Гипотетический объем гибели клеток

С использованием сегрегированной модели и модели клеточного цикла предложена модель «гипотетического объема гибели клеток» в эрлифтом и барботажном биореакторе колонного типа. Модель включает в себя описание кинетики гибели клеток первого порядка и гипотетический объем гибели клеток от некроза, связанный с каждым воздушным пузырьком во время их движения в эрлифте и колонне при котором все клетки погибают. Эти результаты можно выразить в виде следующего уравнения константы гибели первого порядка, кс1 (сек*1):

Кл = 24Р Ук . Р Ук' ,

я2 с1ь3 ОЯ2Н V (1)

где Р - это скорость газа при аэрации (м3 сек'1); О - диаметр биореактора (м); Н - высота биореактора (м); <Иъ - размер пузырька; У^ ~ гипотетический объем гибели (м!) и V - объем биореактора ь(=

«Гипотетический объем гибели клеток» определяется объемом, связанным с воздушным пузырьком и периодом его «жизненного цикла», где происходи! гибель клеток, и в общем виде может быть представлен следующей зависимостью

Ук — ^погибших^Сх пузырька* (2)

где Ицогивших - количество погибших клеток на один пузырек (кл/пузырек);

Сх" „утырьт- концентрация жизнеспособных клеток (кл/м3).

В общем, количество погибших клеток на пузырек, находящихся в биореакторе, и, следовательно, величина гипотетического объема гибели клеток будет определяться рядом факторов, зависящих от механизма, являющегося причиной гибели клеток. Например, срезывающие силы, связанные с явлением гибели клеток в отношении неустойчивых клеток, вероятно, играют важную роль. Увеличение гидродинамических сил и числа клеток с ускоренной продолжительность жизни является причиной гибели большого числа клеток на один пузырек в реакционной камере, что в конечном итоге приводит к более высокому гипотетическому объему. В дополнение, обогащение клеток в зоне, где срезающие силы достаточны для повреждения клеток, также влияет на гипотетический объем гибели. Если местная концентрация клеток в зоне выше основной концентрации, то погибнет большее количество клеток, что приведет к увеличению «гипотетического объема гибели клеток». Обогащение производится за счет адсорбции клеток воздушными пузырьками. Адсорбция клеток пузырьками зависит от наличия защитных

добавок, как силикон и сыворотка, а также от свойств клетки, таких, как состав мембраны, наличие клеточных органелл, размер и форм«: клетки.

Эта «гипотетическая теория объема гибели клеток» подтверждается при определении констант гибели клеток в зависимости от механического перемешивания, аэрации, содержания сыворотки, ПАВ и при культивировании на микроносителях на примерах двух различных клеточных линий ВНК-21/13 в барботажных колоннах и Vero в эРлифтных биореакгорах с различной скоростью движения газового потока (аэрации), высотой биореактора и его диаметра, которые будут рассмотрены в следующих разделах диссертации.

2.2.3. Влияние механического перемешивания и аэрации на гибель клеток в биореакторе

Наиболее удобным методом снабжения культуры клеток кислородом является аэрация. В барботажных колоннах и эрлифтных биореакторах аэрация также используется и для дополнительного перемешивания культураль-ной жидкости.

Влияние аэрации можно разделить на влияние самих перемешиваемых потоков среды и поверхности раздела фаз газ-жидкость. Основные потоки перемешивания создаются за счет поднятия газовых пузырьков. Кроме влияния потоков при перемешивании, образование поверхности контакта газ-жидкость и ее разрушение происходит в процессе образования пузырька при дисперг ировании газа и, соответственно, при переходе пузырька в поток жидкости. Также, разрушение пузырька происходит при образовании пены.

Установлена корреляция между разрушением клетки и следующими тремя воздействиями: скорость сдвига, напряжение сдвига и уменьшение величины турбулентных пульсаций. Если величина турбулентных пульсаций равна или меньше размера клеток, то происходит повреждение клетки. В случае культур микроорганизмов этот эффект несравненно меньше, чем его воздействие на суспензию клеток или повреждение прикрепленных к по-

верхности клеток, что приводит к их гибели. Независимо от природы воздействий, которые возникают при барботажпой аэрации и приводят к разрушению клетки, которые ответственны за повреждение, необходимо определить каждое из них. Гибель клетки может быть описана кинетическим уравнением первого порядка, аналогично уравнения роста клеток.

Три процесса могут быть рассмотрены при аэрации: образование пузырька в барботере; движение пузырька через культуральную жидкость; разрушение пузырька на поверхности культуры.

Всплывание пузырька. Скорость всплывания (подъема) пузырька, \'ь (м сек"') также определяет силу столкновения с клеткой, но принималась постоянной (0,25 м сек"1), внутри диапазона обычно используемых размеров пузырька. Размер пузырька является параметром, который играет определенную роль как при случайных столкновениях его с клеткой, так в величине силы столкновения, но до настоящего времени еще не известно как точно они связаны (объем, поверхность контакта и т.д.) и мы считаем, что их значения зависят от диаметра пузырька

Для постоянного размера пузырька:

ёСху/си = - к2 Р/О г2 Сху, (3)

где к2 - также константа пропорциональности (м"') и Вг- диаметр биореактора (м).

Динамика разрыва пузырька была изучена и ее различные стадии показаны на рис.3. В общем, когда пузырек доходит до поверхности, он частично выходит за пределы жидкости и образуется тонкая пленка, отделяющая воздух внутри пузырька от воздуха над поверхностью(рис. 3 а). В зависимости от условий среды эта тонкая пленка может быстро высохнуть и порваться или может стать устойчивой (стабилизироваться), в результате пузырек остается на поверхности долгое время. Если пленка разрывается, то образуется тороидальное кольцо (рис.3 Ь).

Если это кольцо достигнет края полости, то жидкость проникает в эту полость (рис. 3 с) до тех пор, пока не достигнет дна полости, где образуется два «потока»: 1) направлен вверх от поверхности газового раствора, 2) направлен вниз, в раствор под полостью пузырька (рис. 3 с!).

Предполагаем, что жидкостный слой, окружающий полость пузырька перед разрывом, образует «гипотетический объем гибели клеток». Считаем, что более высокфконцентрация клеток в верхнем «потоке» может быть объяснена, если концсшграция адсорбируемых пузырьком клеток в 2 раза превышает базовую.

псрхппП "иоК)К"

м''р\ шнкоМ тропдшп.пос ф

ппСпкп кольцо

1. Л

(./" -и у- 7 Г Г

■ КИШС1Г.

шп.чц-ш.пая среди

му ii.ipi.Ka

т

мижНнй

Рис. 3. Динамика разрыва пузырька

В экспериментах использовались пузырьки диаметром более 4 мм. Однако силы столкновения при подъеме пузырька являются результатом силы, с которой пузырек газа проникает в поверхность потока жидкости и силы, которяя способствует лопаныо пузырьков. Исследовали влияние на эти обе силы размера пузырька и скорости его подъема. Конечная скорость пузырька зависит от ею размера и не зависит от высоты биореактора. На силы, связанные с контактом пузырька с поверхностью потока жидкости и его раз-

эушением влияют вязкость жидкости и ее поверхностное натяжение, кото-эые постоянны для данной системы. Таким образом, сила разрушения пу-шрька зависит только от его размера.

Конструкция барботера. Если гибель клетки зависит от конструкции эарботера - это является также мгновешгым процессом. Скорость гибели снетки пропорциональна частоте столкновений и силе столкновешм. В этом ;лучае удельная скорость гибели клетки будет возрастать с увеличением ко-тачества сопел, т.е. при увеличении поверхности контакта фаз. Считан при этом, что общая скорость газового потока, размер пузырьков, их внешний щаметр и объем культуры остается постоянными.

Подъем пузырька. Если гибель клетки происходит при подъеме пу-»ырька на поверхность жидкости, этот процесс будегт мгновенным.

Клеточные повреждения были изучены по уменьшению количества кизнеспособных клеток ВПК 21/13 при суспензионном культивировании. Скорость гибели клеток описывалась уравнением первого порядка для кон-кнтрации клеток. Константа К] гибели оценивалась с помощью линейной агрессии. Пример такой оценки приведен на рис. 4.

Гибель клеток в основном происходит при образовании пузырьков на зарботере. В этом случае ожидалось, что основная потеря жизнеспособности слеток вызывается силой, связанной с образованием пузырьков, т.е. скоростью аза, выходящего из сопла. Были проведены две серии экспериментов, в ко-орых скорость выхода газа изменяласьспомощью использования различного соличества сопел от одного до четырех при постоянном расходе газа. Ре-|ультаты этих экспериментов приведены на рис. 5. Из этих данных следует, 1ТО при различных расходах газа (3,6 и 7,2 дм'час"1) число сопел не оказываю значимого влияния на скорость гибели клеток.

0,0

1,0

2,0 Часы

3,0

4,С

Рис.4. Оценка константы удельной скорости гибели клеток, кё. Параметры ксЗ определяется по углу наклона линии, выражающей концентрацию жизнеспособных клеток.

о га

■о £

£ 0,5-

Число сопел

Рис. 5. Влияние скорости выхода газа из барботера на удельную скорость гибели клеток. Скорость выхода газа изменялась посредством использования различного от одного до четырех количеств сопел, с постоянным расходом газа.

Полученные результаты показывают, что различные размеры образовавшихся пузырьков являются следствием скоростей их формирования. При низкой скорости потока газа через сопло, образуются меньшие по размеру пузырьки, обладающие более высокой частотой образования, и следовательно, вызывающие более высокую скорость гибели клеток. Однако, по истечению периода времени поверхность контакта жидкость-газ и объем пузырьков возрастает, что может нейтрализовать этот эффект.

Связь между расходом газа и диаметром пузырьков приведена в таблице 1.

Таблица 1

Влияние расхода газа на средний диаметр пузырька

Расход газа (дм3час') Диаметр пузырька, Стандартное отклоне-

(10'3м) ние (Ю"3м)

2 4,3 0,4

4 4,5 0,2

6 4,5 0,4

8 5,0 0,4

10 5,8 0,9

12 6,8 0,8

14 7,2 1,2

Основной причиной гибели клеток является разрушение пузырьков на поверхности раздела фаз газ-жидкость.

Были проведены опыты, в которых изменялись диаметр колонны, збъем культуральной жидкости, расход газа и число сопел, и результаты скорости гибели клеток, построенные в зависимости от расхода газа на единицу >бъема культуральной жидкости, приведены на рис. 6.

1,6 П

1,41,2-

0,40,20 -

0

50

100

150

т(11час)

Рис. 6. Зависимость удельной скорости гибели клеток от расхода газа на единицу

Независимые экспериментальные данные, полученные при различных расходах газа и имеющие различные обозначения, были зафиксированы при соблюдении условий, приведены в таблице 2

Изменение скорости выходящего газа оказывает влияние только на размер пузырьков, и не оказывает существенного влияния на скорость гибели клеток. Поэтому, можно отметить, что гибель клеток не вызывается расположением барботера. Однако одно предостережение можно сделать: если скорость выходящего газа или силы образования пузырьков будут выше уровня, ограничивающего возможность гибели клеток при всех условиях работы невозможно точно определить, была ли гибель клетки вызвана изменением скорости выходящего газа. Скорость образования и размер пузырьков (14) с диаметром от 2 до 6 мм не оказывает влияния на скорость гибели клеток, и конструкция реактора может быть оптимизирована с помощью проек тирования аэратора, который барботирует мелкие пузырьки. Мелкие пузырьки

объема культуральной жидкости

Таблица 2

Условия проведения экспериментов по данным рис. 7

Символ Расход газа, (дм3час"') Объем среды, (м3) Высота столба, (см) Диаметр колонны, (см)

Д 2 80 12 2,9

2 40 8 2,5

о 3,7" 80 12 2,9

V 5,5 40 8 2,5

0 7,2™ 80 12 2,9

□ 4,0-8,0 80 12 2,9

□ 8 60-190 8-25 3,1

• 8 73-195 21 2,1-3,4

ж 9 60-160 8-21 3,1

хх - средняя скорость гибели клеток на рис.12, при использовании от одного до четырех сопел. Сплошная линия получена с использованием метода линейной регрессии; пунктирная линия показывает зону 95% вероятности регрессии.

имеют большую поверхность контакта в системе газ-жидкость по сравнению с крупными пузырьками, что приводит к повышению коэффициента массо-переноса кислорода единицей объема газа. Однако снижение размера пузырьков возможно только до величины 2 мм.

2.2.4. Исследование влияния концентрации сыворотки в культуралыгон жидкости на гидродинамические условия культивирования клеток животных в бпореакторе

Изучалось влияние концентрации сыворотки на жизнеспособность клеток. Трансформированные клетки лимфоцитов телят культивировались для определения влияния концентрации сыворотки на действие гидродинамического напряжения сдвига на клетки. Влияние напряжения сдвига на клетки возрастает со снижением концентрации сыворотки. Было установлено, что

защитный механизм эффекта влияния сыворотки имеет как физическую, так и физиологическую природу.

Эксперименты проводились с клетками с гарантией, что физиологическое состояние клеток, использованных в различных опытах, было приблизительно одинаковым. В первой культуре уменьшалось количество жизнеспособных клеток (табл.3), когда концентрация сыворотки снижалась с 5% до 3% и далее до 2%.

Таблица 3

Количество жизнеспособных клеток при различных концентрациях сыворотки

Сыворотка Время Числовое обо- Количество жизнеспособ-

(%) (час) значение точек ных клеток (1012 кл м3)

1 5 170 7 5,5±1,0

3 50 4 4,5±1,1

2 170 5 3,5±0,8

и 2 10 3 3,5 ±0,3

1 5 2 2,2 ±0,2

0,5 2 1 1,7 ±0,1

Следует учитывать, что концентрация сыворотки изменялась практически мгновенно при непосредственной замене питательной среды. Для того, чтобы быстрее достигнуть установившихся гидродинамических условий во вторичной культуре, часть содержимого биореактора, включая и клетки, отбирается и добавляется новая среда с другой концентрацией сыворотки, вызывая тем самым внезапное и быстрое изменение ее концентрации.

Кроме того, регистрируя значительные понижения концентрации жизнеспособных клеток при установившихся гидродинамических условиях, установлено снижение числа жизнеспособных клеток, отмеченное при переходе от 2% концентрации сыворотки до 1% и далее соответственно до 0,5%. (Таблица 3, рис. 7).

Рис.7. Число жизнеспособных клеток (О), выживаемость (□) культуры 1. Числа на рисунке относятся к изменениям параметров культивирования. 1: Начальный расход питательной среды. 2: Недостаток расхода мощности. 3: Изменения концентрации сыворотки

от 2% до 1% 4: Увеличение концентрации глюкозы и уровень образования лактата. 5.: Изменение концентрации сыворотки от 1% до 0,5% 6: Изменение концентрации от 0,5% до 1%.7. Снижение концентрации до 0,5%. Пики на рисунке свидетельствуют об изменении содержимого биореактора, включая клетки при замене среды.

Защитный эффекг против действия гидродинамических сил на клетки имеет физическую и физиологическую природу. Сделана попытка экспериментально разделить физический и физиологический эффект защитного действия сыворотки. Изменения в гипотетическом объеме гибели клеток приведены на рис.8, которые вызваны действиями обоих эффектов.

0,012 0,010 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000

Рис.8. Гипотетический объем гибели клеток Укв зависимости от концентрации сывороток. Ук' - концентрация клеток, взятая из культуры с установившимся состоянием, культура 1 (и) и культура 11 (□). Ук' - концентрация клеток, взятая из установившегося со-стояония при концентрации клеток, равной 0,5% и воздействии гидродинамического напряжения сдвига, после достижения заданной концентрации сыворотки (о). Значения рассчитаны при 95% уровне значимости. Число данных, обозначенных через цифры, соответствует следующим значениям концентрации сыворотки: 5 (■ 5%), 10 (и , 3%), 18 (и ,2%), 14 (о , 2%), 30 (о ,1%), 21 (□ ,0,5%) и 2 (о).

Это явление может быть объяснено через физическое действие, и в то же время присутствие сыворотки вызывает и определенный физиологический эффект, а так как клетки взяты из установившегося гидродинамического состояния, то, следовательно, они имеют время для адаптации их физиологии к изменению концентрации сыворотки.

Достаточно полно можно объяснить эффект влияния сыворотки с помощью двух механизмов: (1) физический механизм, срабатывающий мгновенно после добавления сыворотки; (2) физиологический механизм, для проявления которого необходимо время.

Концентрация сыворотки (%)

Защитное действие сыворотки связано с изменением прочности мембраны, что связано с облегчением переноса через мембрану хлорестирола или аналогичных веществ мембраны, и таким образом, понижает влияние гидродинамического напряжения сдвига. С другой стороны, возможно, что клетки защищаются от гидродинамических воздействий, при образовании устойчивой пены, которая не контактирует с клетками. Третий возможный механизм - что величина гидродинамической силы изменяется при действии сыворотки посредством увеличения вязкости. Так как влияние сыворотки на вязкость питательной среды незначительно, то увеличение вязкости может быть одним из возможных механизмов защиты. Физиологический механизм может включать собственно изменение в клеточном скелете, плазматической мембране или других клеточных частях и органеллл*.

Минимально требуемая высота аппарата для культивировшшя клеток в эрлифте будет зависеть от используемого расхода газа и также от используемой концентрации сыворотки. Снижение концентрации сыворотки будет делать клетки более чувствительными к гидродинамическому напряжению сдвига, и в этом случае требуется большая минимальная высота эрлифта.

2.2.5. Влияние ПАВ в культуральпон жидкости на гидродинамические условия культивирования клеток животпых в биореакторе

Исследовалось влияние поверхностно-активного вещества (ПАВ), в частности «Пропинол Б-400», используемого в качестве силиконового пеногаси-теля при глубинном суспензионном культивировании клеточных линий ВПК 21/13 и Vero. Различные концентрации «Прошшола Б-400» были проверены на эффективность защиты клеток от действия гидродшгамических сил, возникающих при аэрации и перемешивании в биореакторе.

Результаты исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4

Влияние пеногасителя на диаметр пузырьков воздуха

«Пропинол Б-400» Диаметр пузырьков Стандартное отклонение

(г.дм3) (103 м) (103 м)

- 5,8 0,9

0,1 5,9 0,7

0,4 5,5 0,7

0,7 4,9 0,4

1,0 4,9 0,3

Расход воздуха через односопловый барботер соствлял 10" дм /час"

При использовании концентрации «Пропинола Б-400» менее 0,1 г.дм3 не отмечено его влияние на размеры пузырьков, но все же происходит защита клеток при барботаже и на основании этого можно отметить, что защитное действие «Пропинола Б-400» связано не только с размерами пузырьков. Возникает вопрос, связанный с механизмом защитного действия пропинола, или это уменьшение поверхностного натяжения и, следовательно, сил, связанных с разрушением пузырьков путем образования защитных пленок вокруг пузырьков, или воздействие на сами клетки образованием защитного слоя или защитной зоны вокруг них.

Как показано в таблице 5, некоторый защитный эффект пропинола был обнаружен как и при эксперименте с барботированием. Эти результаты показывают, что «Пропинол Б-400» воздействует непосредственно на клетку, а не на поверхность раздела фаз «пузырек-жидкость». Различные концентрации пропинола были проверены на эффективность. Результаты исследований приведены на рис.9

Из приведенных на рис.9 данных следует, что «Пропинол Б-400» обладает большим защитным эффектом; при концентрации 0,1 г л"1. Значение К<1

снижается от 1,1 до 0,4 час'1 и далее понижается до 0,05 час при ко!щен-трации пропинола равной 1 г л'1.

Таблица 5

Влияние «Пропинола Б-400» на коэффициент гибели клеток

под действием гидродинамических сил, возникающих _при разрушении пузырьков_

«Пропинол Б-400» К, 95% интервал

Концентрация, (час1) вероятности

(гл3) (час"1)

0 2 1,2

1 0,03 0,08

1,0-

"о"

га у

Е 0,5 -

"О

0,0

0 0,5 1

Пропинол Б-400(г/л)

Рис.9. Защитное действие «Пропинола Б-400» при барботаже.

Защитное действие ПАВ от гидродинамического напряжения сдвига при барботировании также эффективно как и при перемешивании и предла-

гается в качестве основного метода при масштабировании процесса выращивания культур клеток животных.

2.2.6. Исследование влияния гидродинамических условий на процесс культнвировапия клеток на микроносителях.

Гибель первично-трипсшшзированных клеток ФЭП, ФЭК и клеток перевиваемой линии ПТ80, выращиваемых на микроносителях Cytodex - 3 изучалась в зависимости от расхода газа в небольшом эрлифтном реакторе. Гибель клеток может быть описана уравнением кинетики гибели первого порядка. Константа скорости гибели клеток первого порядка рассчитывалась но сравнению количества жизнеспособных клеток, увеличению количества мертвых клеток и пропорционального линейного возрастания лактат-дегидрогиназной LDH- активности в зависимости от расхода газа, при наличии «специфического объема гибели клеток», равного 2,10"3м'3 жидкости на м"3 воздушных пузырьков.

В работе, в основном, исследовалась проблема слияния и накопления микроносителей на поверхности раздела фаз «газ-питательная среда», также и при применении пеногасителя, что позволило изучить влияние аэрации на культивирование с использованием микроносителей. Проводилось изучение процесса гибели клеток в эрлифтных биореакторах и барботажных колошах в зависимости от параметров культивирования и геометрических соотноше-шш биореактора, величины газового потока, высоты и диаметра биореактора для того, чтобы свести к минимуму гибель клеток в этих биореакторах и оптимизировать их конструкцию.

На рис. 11 приведены три типичные кривые роста клеток перевиваемой линии ПТ80; клеток ФЭП и ФЭК на микроносителях Cytodex-3 (2,5 г дм"3). При построении зависимости логарифма концентрации жизнеспособных клеток относительно времени, удельная скорость роста клеток может быть опре-

делена по наклону линии среднеквадратичного отклонения в точке измерения при экспоненциальной фазе роста. Отделенная таким образом средняя удельная скорость роста в экспоненциальной фазе была равна 0,025 час"1 и конечная плотность клеток составила 1,5 106 кл см'3.

Живые клетки (1012 кл м"3)

Рис. 10. Кривая роста клеток линии 1ГГ80, ФЭП и ФЭК на микроносителях Су1о-Зех-З (2,5 г дм'3). Различные символы обозначают различные культуры клеток, выращи-гаемые при одинаковых условиях глубинного кльтивирования.

Числа, приведенные в скобках, в первом сголбе данных, указывают на шличество измерений, проведенных для глубинной культуры, из которой 5ыла взята проба.

На рис 11 показаны значения ЬЭН-активности и количество жизне-;иособных, погибших и общее количество клеток в зависимости от времени требываипя в эрлифтном реакторе..

К-во клеток МП12 Кп-м"3!

2

1.5 1

05

LDH-активность

2.5 3"

Воемя (час)

К-во клеток МП12 Кп-м~3\ 2

LDH-активность МП5

б

К-во клеток LDH-активность

(1012 Кл м"3) (105 U m"1)

Рис. 11 .Число жизнеспособных, мертвых и общее количество клеток и LDH-активностей в экспериментах по напряжению сдвига при скоростях газового потока, равных 0,7 10"6 mW (А), 5,0. 10^ м3 сек' (В) и 8,4 10"6 м3 сек ' (С). ( ) - общее количество клеток, (X) - жизнеспособные клетки, (О) - мертвые клетки, (□ ) - LDH-активность

На рис. 12 приведена зависимость 1ЛЗН-активности от концентрации погибших клеток при суспензионном культивировании в опытах с напряжением сдвига. Линия регрессии проведена на уровне 95% значимости. Все клетки в суспегоии были мертвыми и в то же время мы пренебрегли количеством клеток, все еще прикрепленных к микроносителям.

с. 6,0 -

л

5 5,0 -

0

1 4,0-ш

* 3,0 - о

S О ft _ .

0,0 ^

о

0,5

1

1,5

Погибшие клетки(кл/м)

Рис. 12. LDH-активности (□), линия регрессии (сплошная линия) при 95% уровне пачимости (пунктирная линия) в зависимости от концентрации погибших клеток при icex экспериментах с напряжением с д пита.

Модель гипотетического объема гибели клеток использована для они-:ания гибели клеток Vero, иммобилизованных на микроносителях Cytodex-3 i небольшом эрлнфтном реакторе в зависимости от скорости газа. При построении зависимости конст анты гибели клеток первого порядка от скорости азового потока, гипотетический специфический объем гибели клеток может ¡ыть рассчитан по углу наклона среднеквадратичной линии регрессии для iccx трех методов рассчста. Линии, показанные на рис. И , построены на ос-юве данных по общему содержанию жизнеспособных клеток. Объем проб в (азличных экспериментах по гидродинамическому напряжению сдвига варь-фовал от 43 до 52 см3 и средний объем пробы во всех опытах составил 48 м1, и эта величина была использована для подстановки в уравнение. По-кольку не существует значимой разницы между константами гибели клеток [ля всех трех методов определения, поэтому нет значимой разницы и в вели-шне специфического гипотетического объема гибели клеток для тех же ме-

тодов определения. Средняя величина специфического гипотетического объема гибели клеток равна 2,0-0,2 103.

Суммируя изложенное, можно отметить, что гибель клеток на микроносителях СуЬёех меньше в небольшом эрлифтном реакторе, которая может быть описана уравнением кинетики гибели первого порядка и она пропорциональна линейной скорости газового потока. Эксперименты по выращиванию клеток на микроносителях Су1ос1ех-3 были проведены в двух повтор-ностях. Константы гибели клеток, полученные для 50 и 95 часов роста культуры приведены на рис. и таблице 6.

Таблица 6

Константы гибели клеток первого порядка при 95% доверительном интервале значимости, определенные по уменьшению количества жизнеспособных клеток, выращиваемых на микроносителях СуШскх-З

Опыт Р (1<Г*м3 сек1) V (10"6 м3) К<ь (50 час) (Ю-6 сек1) Ка„ (95 час) Ю-6 сек'1)

С>1оёех (5 г дм ~3) 5,0 47,7 17,5-5,6 15,1-2,7

СуЮёех (5 г дм -3) 5,8 47,8 14,8-10,0 14,4-5,7

СуЮёех Расход (4А) (2,5 г дм'3) 5,1 48,3 (-) 22,3-9,1

Су1о(1ех Расход (4В) (2,5 г дм "3) 5,1 49,9 (-) 22,2-8,7

Клетки на микроносителях в эрлифте могут разрушаться под действи-м гидродинамических сил при столкновении самих микроносителей. При 1азмерах микроносителей, используемых в данной работе, равных 0,005, гибель клеток, вызванная столкновением микроносителей, была незначитель-юй. Прочность прикрепления клеток будет зависеть от линии клеток, вида шкроносителя, фазы роста культуры, состава питательной среды, и количе-тва клеток, прикрепленных на микроносителе. Связи клеток с микроносите-ями могут быть более прочными, что вызовет снижение влияния напряже-[ия сдвига. Таким образом, некоторые клетки могут защищать соседние от оздействия напряжения сдвига. В дополнение, гидродинамические силы, оздействующие на клетку, могут также воздействовать на соседние клетки ли непосредственно, или через межклеточные контакты.

Подобно суспензионным клеткам, гибель клеток на микроносителях ;о действием гидродинамических сил возможна в трех зонах в эрлифтном еакторе:

(1) - в области барботера, где образуются пузырьки;

(2) - в расширяющейся и сужающейся секции, где возникают гидродинамические силы при всплывании пузырьков и поднятии жидкостного потока;

(3) - на поверхности разрыва пузырьков.

В области барботера клетки разрушаются, если они имеют контакт с новь образующимися пузырьками, у которых еще не сформирована поверх-ость. Клетки на микроносителях разрушаются, если они вступают в контакт пузырьками. Так как часть используемых микроносителей в основном порыта клетками, возможно, что часть клеток на поверхности микроносителя дсорбируется пузырьком воздуха.

С другой стороны, поверхность контакта пузырек-микроноситель бу-ет тем больше, чем выше поверхностное натяжение пузырька. В случае сус-ензионного культивирования показано, что скорость гибели клеток пропор-

ционапьна высоте реактора и что гибель клеток происходит в области изменения скорости воздушных пузырьков или потока жидкости. Однако в случае использования достаточно большого микроносителя 200 ¡дм по сравнению с суспензией клеток (20 рм), скорость движения клеток на микроносителях в жидкости при опытах в ламинарном движении потока будет значительно выше, чем скорость в жидкости только суспензии клеток при опытах в стационарном режиме.

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведенной работы с использованием моделей кинетики скорости роста клетки получены упрощенные описания физиологического состояния и биохимического состава клеток животных на примере ВНК 21/13 с учетом фаз развития популяции клеток и их гибели в процессах апоп-тоза и некроза. Для описания процесса гибели клеток животных в биореакторах и количественной оценки гидродинамических напряжений, вызванных механическим перемешиванием и аэрацией теоретически обосновано и практически подтверждено существование "гипотетического объема гибели клеток". Получена зависимость "гипотетического объема гибели клеток" ог механического перемешивания (скорость сдвига, напряжение сдвига), интенсивности аэрации, величины пузырьков, вида биореактора и его конструктивных особенностей (эрлифт, барбогажная колонна, высота, диаметр) и коэффициента скорости гибели.

Эта теория также нашла подтверждение при культивировании первично-трипсинизированных клеток ФЭП, ФЭК на микроносителях "Су1о(1сх-3". Показано, что скорость гибели пропорциональна скорости движения газового пузырька, а следовательно, конструктивным особенностям барботера, расходу воздуха на аэрацию, виду и геометрическому соотношению биореактора.

"Гипотетический объем гибели клеток" определяется объемом, связанным с воздушным пузырьком в период его жизненного цикла. В общем слу-

чае количество погибших клеток на пузырек, находящийся в биореакторе и, следовательно, величина "гипотетического объема гибели" будет определяться рядом факторов, зависящих от механизма, являющегося причиной гибели клеток. Например, срезывающие силы, связанные с явле1шем гибели в отношении неустойчивых (с укороченной продолжительностью жизни) клеток, вероятно, играют важную роль. Увеличение гидродинамических напряжений и числа клеток с укороченной продолжительностью жгони являются причиной гибели большего числа клеток на один пузырек в биореакторе, что в конечном итоге приводит к более высокому гипотетическому объему гибели. В дополнение, концентрирование клеток в зоне аэрации, где напряжение и скорость сдвига достаточны для повреждения клеток, также влияет на "гипотетический объем гибели клеток". Концентрирование происходит за счет адсорбции клеток воздушными пузырьками. Адсорбция клеток пузырьками зависит от наличия зшцитных добавок, таких как ПАВ (силиконовый пенога-ситель) и сыворотка, а также от свойств клетки, таких, как свойства мембраны, наличие клеточной органеллы, размер и форма клетки.

Местная концентрация клеток может быть также и ниже основной концентрации. Показано, что сыворотка оказывает как быстродействующие защитные влияния,так и медленнодействующие (дни). Быстродействующее влияние проявляется в предотвращении адсорбции клеток воздушными пузырьками, что приводит к уменьшению концентрации клеток в зоне гибели и, следовательно, к уменьшению гипотетического объема гибели. Медленнодействующий эффект сказывается на изменении в физиологии клетки. Это может привести к сокращешпо продолжительности жизни клетки или повлиять на процесс адсорбции клеток воздушными пузырьками вследствие изменения свойств мембраны, оба эти фактора приводят к уменьшению числа погибших клеток на 1 пузырек в биореакторе и, след овательно, к уменьшению "гипотетического объема гибели". Гипотетический объем гибели уменьшается с уменьшением удельной скорости роста при культивировании. Однако,

уменьшение скорости сопровождается многими другими изменениями, например, уменьшением максимальной скорости роста (вперед), изменением распределения клеток по разным фазам клеточного цикла, увеличениоджоро-сти гибели при периодическом культивировании и увеличешкмколичества фракций клеток погибших от апоптоза. Вследствии наличия большого количества изменений, происходящих одновременно с клетками при культивировании иногда трудно отнести изменение гипотетического объема гибели клеток к одному из этих факторов.

Конструкция биореакторов и режимы аэрации и перемешивания должны быть направлены на то, чтобы максимально сократить число погибших клеток.

Процесс создания оптимальной конструкции для эрлифтного биореактора аналогичен конструировании барботажных биореакторов колонного типа. Вследствие того, что скорость гибели клеток, вызванной барботировани-ем пропорциональна количеству образованных пузырьков, оптимальная конструкция должна обеспечить перенос максимального количества кислорода от каждого пузырька. Количество кислорода, перенесенного в пузырек может быть увеличено путем возрастания времени пребывания пузырька в культу-ральной жидкости, увеличением поверхности контакта фаз (газ-жидкость) и увеличением концентрации кислорода внутри пузырька. Возрастания времени пребывания можно добиться путем увеличения высоты биореактора или снижении скорости поднятия пузырьков (аэрации). Увеличение поверхности контакта фаз можно получить уменьшением диаметра пузырька.

Так как скорость поднятия пузырьков и их размеры трудно контролировать, то оптимальными параметрами в этом отношении являются высота биореактора и концентрация кислорода внутри пузырьков. Лучше всего эти условия соблюдаются в биореакторах в виде барботажных колонн.

Поддержание низкой удельной скорости роста клеток также сокращает количество погибших клеток, вызванных аэрацией. Однако, уменьшение ги-

бели клеток от гидродинамических воздействий связано с появлением апоп-тических клеток при сокращении удельной скорости роста, что все-

гда влечет за собой увеличоте объема гибели апоптических клеток. Следовательно, лучше поддерживать удельную скорость роста клеток чуть выше критической скорости.

Правильно выбранная конструкция и тип биореакгора, режимы его работы (аэрация, перемешивание) может обеспечить сокращение объема гибели клеток под действием скорости и напряжения сдвига, не допустить явление апоптоза путем предотвращения развития неблагоприятных условий в куль-туральной жидкости. Особенно важными параметрами для оптимизации кон-струкщш биореакторов для культур клеток являются высота биореактора, конструкция барботера, содержание кислорода в воздушных пузырьках. Более того, добавление защитных сред (сыворотка, ПАВ) может резко сократить гибель клеток, вызванную гидродинамическими силами. Низкая удельная скорость роста может снизить чувствительность клеток к гидродинамическим воздействиям, при скорости роста клеток ниже критической. Клетки могут быть подвергнуты апоптозу, что приводит к увеличению объема гибели клеток.

4. ВЫВОДЫ

1. Выбраны модели культивирования клеток животных в суспензии и на микроносителях, определяющих их физиологическое состояние и биохимические свойства с учетом фаз развития клеточного цикла.

2. Теоретически обосновано и практически подтверждено наличие "гипо-тепгческого объема гибели клеток" при апоптозе и некрозе в биореакторе с аэрацией и перемешиванием.

3. Исследовано влияние механического перемешившшя и аэрации на гибель клеток в биореакторе. Показано, что основной причиной гибели клеток в биореакторе является величина турбулетных пульсаций при механическом

перемешивании, уровень аэрации, размер пузырьков и их разрушите на поверхности раздела фаз газ-жидкость.

4. Исследовано влияние концентрации сыворотки в кулътуральной жидкости и показано, что сыворотка в концентрации от 1 до 5% оказывает защитное действие от гидродинамических сил в биореакгоре и имеет физический и физиологический механизм действия на культуру клеток.

5. Исследовано влияние ПАВ (силиконовый пеногаситель "Пропинол Б-400) на гидродинамические условия культивирования клеток животных в биореакгоре. Рассмотрены теории гибели клеток при аэрации в присутствии ПАВ. Показано, что "Пропинол Б-400" даже при концентрации 0,1гдм3 обладает защитным эффектом.

6. Исследовано влияние гидродинамических условий на процесс культивирования клеток на микроносителях. Показано, что при культивировании на микроносителях гибель клеток происходит в области барботера, при всплы-вании пузырьков, их разрывша поверхности и при столкновении микроносителей.

7. На основании полученных данных культивирование клеток животных адаптированных к росту В суспензии рекомендуется осуществлять в барботажных реакторах колонного типа с соотношением высоты к диаметру не менее 10:1, размером пузырьков не более 4 мм и добавление сыворотки (более 2%) и ПАВ (до 0,1%).

9. Реакторы с механическим перемешиванием из-за значительного (до 40%) процента гибели клеток под действием гидродинамических сил не могут быть использованы для масштабирования процессов культивирования клеток животных в суспензии и на микроносителях.

10. Перспективным направлением продолжения данной работы является исследование жизнеспособности клеток в биореакторах хемостатного или турбодостатного режимов работы.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенной работы предложены:

1.Методика оценки биореакторов для суспензионного культивирования клеток животных, выбор их конструкционных параметров и режимов работы. Утверждена директором ВНИТИБП 2 ноября 2000 г.

2.Методика оценки биореакторов для культивирования клеток животных на микроносителях, выбор их конструкции и режимов работы. Утверждена директором ВНИТИБП 2 ноября 2000г.

6. СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Гунин М.А.. Некоторые проблемы глубинного культивирования животных клеток в биореакторах // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково - 2000 - с. 290-293;

2. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В.. Влияние интенсивности аэрации на гибель культуры клеток // Тезисы доклада на Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково-2000 - с. 295-297.

3. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В.. Гибель клеток при выращивании на микроносителях // Тезисы доклада на Всероссийской научно- практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково - 2000 - с. 297-298.

4. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В.. Гипотетическая теория объема гибели клеток в биореакторе // Тезисы доклада на Всероссийской научно-

практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково - 2000 - с. 299-300.

5. Гушш М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В.. Влияние пеногасителя на гибель клеток животных // Тезисы доклада нв Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково-2000 - с. 301-302.

6. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В.. Влияние концентрации сыворотки на жизнеспособность клеток животных при глубинном культивировании и их чувствительность к напряжению сдвига // Тезисы доклада на Всероссийской научно-практической конференции « Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково-2000 - с. 303-305.

7. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Гунин М.А., Самуйленко С.А.. Исследование гибели клеток в процессе аэрации при глубинном культивировании в биореакторе // Сборник статей Международной научно-практической конференции «Диагностика профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных» г. Покров - 2000 с. 199-202.

8. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я., Гунин М.А.. Гибель клеток при их выращивании на микроносигелях. // Тезисы доклада на международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология-2000."»Пущино-на Оке, 2000 с. 29-30.

9. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Гунин М.А.. Влияние концентрации сыворотки на жизнеспособность клеток животных при глубинном культивировании VI их чувствительность к напряжению сдвига. // Тезисы доклада на международном семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнология - 2000.» Пущино - на Оке, 2000

с. 65-66.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гунин, Максим Александрович

1. Введение

2.Обзор литературы

3. Собственные исследования

3.1. Материалы и методы

3.2. Результаты исследований

3.2.1. Экспериментальное подтверждение модели кинетики роста клеток

3.2.2. Гипотетический объем гибели клеток

3.2.3. Влияние механического перемешивания и аэрации на гибель клеток животных в биореакторе

3.2.4. Исследование влияния концентрации сыворотки в кулы уральной жидкости на гидродинамические условия культивирования клеток животных в биореакторе

3.2.5. Влияние поверхностно-активных веществ на гидродинамические условия культивирования клеток животных в биореакторах

3.2.6. Исследования влияния гидродинамических условий на процесс культивирования клеток животных на микроносителях

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях"

Актуальность проблемы. В настоящее время культуры клеток животных используются для производства ряда ценных продуктов, в том числе вакцин, протеолитического фермента урокиназы, моноклональных антител и интерферонов. С помощью культур клеток животных можно также получать лимфокины (белки, оказывающие регуляторный эффект на иммунную систему), многие ферменты, факторы роста, факторы свертывания крови и гормоны. Технология рекомбинантных ДНК позволяет получать некоторые из этих веществ и другими путями, и в то же время открывает новые перспективы для синтеза различных веществ с помощью культур клеток животных.

Культивирование клеток животных является крайне важным и сложным процессом. Из-за их повышенной чувствительности к внешним условиям необходимо рассмотреть комплекс физиологических характеристик и особых специфических требований к питательной среде для культивирования, проблем культивирования клеток животных в биореакгорах, особые требования к конструкции биореактора и ведению процесса культивирования.

Клетки животных не имеют типичных для микроорганизмов клеточных стенок, обеспечвдающих механическую прочность; кроме того, клетки животных обычно значительно крупнее клеток микроорганизмов. Поэтому на любое механическое воздействие на культуры клеток животных (перемешивание суспензии клеток или частиц носителей, содержащих клетки на поверхности или во всем объеме, с целью поддержания однородности реакционной массы или ускорения переноса кислорода к клеткам) должны налагаться определенные ограничения. Для культур клеток животных концентрация кислорода должна составлять приблизительно 25 - 40 % от концентрации кислорода в насыщенной воздухом системе, поэтому проектирование систем подачи кислорода в большой объем культуры клеток животных всегда представляет собой сложную инженерно-технологическую проблему. Жесткие требования, предъявляемые к насыщению системы кислородом, могут быть несколько смягчены благодаря низким скоростям роста и протеканию метаболических процессов в клетках.

Одной из основных проблем при культивировании клеток животных является стремление к достижению высокой продуктивности (концентрации), в то время как продуцирующие уровни клеток обычно характеризуются низкой концентрацией и плотностью жизнеспособных клеток, малой выживаемостью и значительной их гибелью. Основными способами для преодоления этих трудностей являются направленные генетические изменения клеток и оптимизация процесса культивирования. Эта стратегия является основой для увеличения удельной продуктивности, плотности и снижения количества погибших клеток. Случаи гибели клеток в биореакторах, которые объясняются высоким уровнем механического сдвига при перемешивании и неоптимальным составом среды, становятся основными проблемами при культивировании клеток животных. Гибель клеток может быть предотвращена той максимально допустимой высокой средней плотности клеток, которая необходима для получения достаточно высокой объемной продуктивности. Кроме того, гибель клеток приводит к выделению и освобождению клеточных и внутриклеточных ферментов подобных протеазам, ДНК и снижению концентрации моноклональных антител (МаЬв) в культуральной жидкости. Фрагменты клеток мешают процессу, так, например, они вызывают загрязнение фильтров и проб. В дальнейшем присутствие фрагментов клеток, и особенно ДНК, требует применения специальных методов и процессов очистки, чтобы достигнуть требуемой конечной чистоты продукта. И, наконец, освобожденные протеазы могут вызвать деградацию клеток, которые вместе с выделенными при процессах очистки продуктами могут оказать значительное влияние на конечное качество продукта.

Хотя при проектировании биореакторов определяющим фактором считается влияние механических сил на культуры клеток животных, до сих пор не проводилось систематического изучения влияния механического воздействия на гибель клеток с тем, чтобы результаты этих исследований были бы положены в основу научно обоснованных инженерно-технологических расчетов биореакторов и режимов их работы. Вместо этого было предложено большое количество конструкций аппаратов и конкретные формы биокатализаторов, обеспечивающие повышение скорости роста клеток для достижения их более высокой плотности в культуре и более высокого выхода продукта. Хотя на базе такого чисто эмпирического подхода достигнуты значительные успехи, тем не менее, очевидно, что выяснение закономерностей кинетики роста клеток животных в биореакторах и их технологических характеристик позволит добиться еще более существенного прогресса.

Перечисленные выше проблемы требуют исследования процессов гибели клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях.

Исследование гибели клеток животных при культивировании позволит сформулировать основные требования к конструкции биореакторов и технологическим режимам их работы.

Цели и задачи исследований. Целью исследований явилось изучение динамики гибели клеток животных в суспензии и на микроносителях при культивировании в биореакторах. Для достижения поставленных целей необходимо решить следующие задачи:

- рассчитать теоретически и экспериментально подтвердить гипотетический объем гибели клеток.

-изучить кинетику гибели клеток в зависимости от интенсивности аэрации и перемешивания при культивировании в биореакторах;

-определить влияние концентрации сыворотки на кинетику гибели клеток при суспензионном культивировании в биореакторах;

-исследовать влияние поверхностно-активных веществ (ПАВ) на кинетику гибели клеток в биореакторах;

-изучить динамику гибели клеток при культивировании на микроносителях типа Cytodex в зависимости от аэрации, перемешивания, концентрации сыворотки, концентрации ПАВ и концентрации микроносителей в единице рабочего объема.

Научная новизна. В результате проведенной работы с использованием современных методов исследований:

-теоретически рассчитано и практически подтверждено наличие гипотетического объема гибели клеток в биореакторе с аэрацией и перемешиванием;

-изучено влияние механического перемешивания и аэрации на процесс глубинного культивирования клеток ВНК 21/13 в биореакторах. Константа гибели составила от ОД до 1,4 .10"6 сек"1.;

-изучено влияние концентрации эмбриональной бычьей сыворотки на гидродинамические условия культивирования клеток ВНК 21/13 в биореакторах и получены константы гибели от 0,05 до 1,2.10"6 сек"1;

-исследовано влияние ПАВ на процесс культивирования клеток ВНК 21/13 и Vero в биореакторах и получены константы гибели от 0,03 до 2,0.10"6 сек -1;

- изучена динамика гибели клеток животных ФЭП, ФЭК, Vero при культивировании на микроносителях Cytodex -3 и получены константы гибели от 14,8 до 22,3 .10"6 сек "Л

Практическая значимость работы. В результате проведенной работы сформулированы основные требования к культивированию клеток животных в биореакторе по следующим основным показателям:

- теоретически обосновано и практически подтверждено понятие "гипотетического объема гибели клеток" для оценки и оптимизации конструктивных соотношений биореактора и режимов его работы при культивировании клеток животных;

- определены тип биореактора и основные геометрические соотношения для суспензионного культивирования с учетом режимов аэрации и перемешивания;

- определены тип биореактора и основные геометрические соотношения для культивирования на микроносителях с учетом режимов аэрации и перемешивания;

- определены режимы суспензионного культивирования и культивирования на микроносителях клеток животных с учетом концентрации сыворотки в культуральной жидкости;

- определены режимы суспензионного культивирования и культивирования на микроносителях клеток животных с учетом концентрации поверхностно-активных веществ (ПАВ) в культуральной жидкости.

Апробация полученных результатов. Основные положения диссертации доложены:

- на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию института "Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов" 8-9 июня 2000 г., Щежово 2000.

- на Международной научно-практической конференции "Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантро-понозными болезнями животных" 15-16 августа 2000г. г. Покров 2000.

-на Семинаре-Презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнология - 2000" 25 - 27 сентября 2000 г., Пущино - на Оке, 2000.

Публикации результатов исследований.

По материалам диссертации опубликовано 9 научных статей.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- понятие "гипотетического объема гибели клеток" как критерии для оценки гибели клеток при культивировании в биореакторах и режимов их работы;

- выбор биореактора и оптимизация режимов аэрации и перемешивания при глубинном культивировании клеток животных;

- выбор биореактора и оптимизация режимов аэрации и перемешивания при культивировании клеток животных на микроносителях;

- выбор биореактора и оптимизация режимов глубинного культивирования и культивирования на микроносителях в зависимости от концентрации сыворотки и ПАВ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список отечественной и зарубежной литературы 154 наименований. Материалы диссертации иллюстрированы 7 таблицами, 17 рисунками, приложения.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гунин, Максим Александрович

5. ВЫВОДЫ

1. Выбраны модели культивирования клеток животных ВПК 21/13, ФЭП, ФЭК, Vero в суспензии и на микроносителе Cytodex -3 в биореакторах, определяющие их физиологическое состояние и биохимические свойства с учетом фаз развития клеточного цикла.

2. Теоретически обосновано и практически подтверждено наличие "гипотетического объема гибели клеток" клеточных линий ВНК 21/13, ФЭП, ФЭК, Vero при апоптозе и некрозе в биореакторах с аэрацией и перемешиванием объемом 1000 и 1500 мл.

3. Исследовано влияние механического перемешивания и аэрации на гибель клеток в биореакторе. Рассчитаны константы гибели клеток ВНК 21/13 в зависимости от уровня аэрации, напряжения сдвига и скорости сдвига.

4. Показано, что основной причиной гибели клеток ВНК 21/13 в биореакторе является величина турбулетных пульсаций при механическом перемешивании, уровень аэрации, размер пузырьков и их разрушение на поверхности раздела фаз газ-жидкость.

5. Показано, что эмбриональная бычья сыворотка при концентрации до 5% и выше оказывает защитное действие на клетки животных от гидродинамических сил и имеет физические и физиологические механизмы действия на культуры клеток ВНК 21/13, ФЭП. ФЭК и Vero, а константы гибели в этих условиях минимальны.

6. Изучено влияние ПАВ (силиконовый пеногаситель "Пропинол Б-400) на гидродинамические условия культивирования клеток ВНК 21/13 и Vero биореакторе емкостью 1000 мл. Рассмотрены механизмы гибели клеток в присутствии ПАВ. Подтверждено, что ПАВ при концентрации 0,1мгдм"3 обладает выявленным защитным эффектом.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гунин, Максим Александрович, Щелково

1. Адаме Р. Методы культур клеток для биохимиков. М.: 1983. - 246 с.

2. Аиба Ш., Хемфри А., Миллис Н. Биохимическая технология и аппаратура. М.: Пищевая промышленность, 1975 - с.587.

3. Альберте Б., Брей Д., Льюнс Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки, т. 1. М.: Мир, 1986, -223с.

4. Андреева Л.Ф., Десницкий Л.Г., Дондуа Л.К., Букина Н.4. Клеточное размножение и процессы дифференциации. Л., Наука, 1983, - 248 с.

5. Аткинсон Б. Биохимические реакторы М.: Пищевая промышленность -1979,-280с.

6. Байбаков В.И. Биотехнология, №1, 1989, с.61-64.

7. Бейли Дж,, Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т1. — М.: Мир, 1989-692 с.

8. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, т.2, М.: Мир, 1989-590 с.

9. Биология клетки в культуре, под ред. A.C. Трошина. Л.: Наука, 1984 -279 с.

10. Биотехнология клеток животных, под ред. Р.Д.Спиера и Дж.Б.Гриффита, т.1 -М.: ВО «Агропромиздат», 1989. 365 с.

11. Биотехнология клеток животных, под ред. Р.Д. Спиера и Дж.Б.Гриффита., т.2. М.; ВО «Агропромиздат», 1989. - 518 с.

12. Гагинская Е Р.„ Калинина ЕЖ Прелептогенная конденсация хромосом в профазе мейоза. //В кн. «Генетика, биохимия и цитология мейоза» М.: Наука, 1992. - 97 с.

13. Голубев Д.В., Соминина A.A., Медведева М.Н. Руководство по применению клеточных культур в вирусологии. Л.: Медицина, 1976. - 224 с.

14. Гунин М., Рубан Е.А., Соловьев Б.В. Влияние интенсивности аэрации на гибель клеток. //Тезисы доклада на Всероссийской научно-практическойконференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково - 2000 - с.295-297.

15. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В. Гибель клеток при выращивании на микроносителях //Тезисы доклада на Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково-2000с. 297-298.

16. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В. Гипотетическая теория гибели клеток в биореакторе //Тезисы доклада на Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково 2000с.299-300.

17. Гунин М.А., Рубан Е.А., Соловьев Б.В. Влияние пеногасителя на гибель клеток животных //Тезисы доклада на Всероссийской научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» Щелково 2000 - с. 301-302.

18. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология, т.З. М.:Мир, 1982. -438 с.

19. Зенгбуш П. Молекулярная и клеточная биология, т.З. М.:Мир, 1982. -344с.

20. Итоги науки и техники. Серия «Микробиология», т. 14. Аппаратура для культурально-технологических процессов в микробиологии. М.: ВИНИТИ, 1984.-288 с.

21. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология», т. 8. Тканевые и клеточные культуры. М.: ВИНИТИ, 1979. - 189с.

22. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология», т. 19 Культура клеток в вирусологии. -М.: ВИНИТИТ, 1990.-254 с.

23. Итоги науки и техники. Серия «Вирусология», т.21. Культура клеток в производстве биопрепаратов. М.: ВИНИТИ, 1991. - 270 с.

24. Кафаров В.В., Винаров А.Ю., Гордеев Л.С. Моделирование биохимических реакторов. М.: Лесная промышленность, 1979 - 342 с.

25. Кислых В.И., Рамазаиов Ю.А., Майстренко В.Ф., Мертвецов Н.П. Вихревой биореактор «Биок». I. Опыт культивирования штамма Е. coli BL 21 (DE3) pZZSA, продуцирующего рекомбинантный антиогенин человека.// Биотехнология, № 4,2000 с. 72-79.

26. Круман И.И. Сыворотка и размножение клеток in vitro. Пущино, 1981. -51с.

27. Культивирование клеток животных и человека. 2-е Всесоюзное совещание. -Пущино, 1985, 184 с.

28. Ламберт Дж., Берг Дж.Р. Среды для выращивания клеток. Биотехнология клеток животных. -М., 1989, с. 98-138.

29. Лурия С., Дарнелл Дж. Общая вирусология. М., Мир. 1970. - 423 с.

30. Новохатский Л.М. Тканевые и клеточные культуры в вирусологии и молекулярной биологии. //В кн. Итоги науки и техники. Сер. «Вирусология». Т.8. М., 1979. - с.3-134.

31. Новохатский A.C., Михайлова Г.Р., Хижнякова Т.М. и др. Каталог перевиваемых линий. Ин-т вирусологии АМН СССР М., 1985. - 86 с.

32. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М.: Мир, 1978-331 с.

33. Пинаев Г.П., Кухарева Л.В., Дьяконов И.А. и др. Сб. Иммобилизирован-ные клетки в биотехнологии. Пущино, 1987. - с. 48-56.

34. Пинаев Г П Методы культивирования клеток Сб. Научные труды Ин-та цитологии АН СССР. Л.: Наука, 1988. - 319 с.

35. Пол Д. Культура клеток и ткани. М.: Медгиз, 1963. 347 с.

36. Рубан Е.А. Автоматизация процессов культивирования клеток животных в суспензии. Экспресс-информация. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. Щелково, №6, 1981. - с.4-6.

37. Рубан Е.А., Соколова Н.В. Использование турбинной самовсасывающей мешалки для глубинного культивирования на микроносителях. //Экспресс-информация. Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. М., № 5,1982. - с. 12 -15.

38. Рубан Е.А., Сазыкин Н Ю,. Зиновкин КВ., Пухова ILM , Соловьев Б В. Устройство для измерения заряда микроносителей. A.C.1398826, 1987.

39. Рубан Е.А., Соловьев Б.В., Самуйленко А.Я., Гунин М.А. Гибель клеток при их выращивании на мшфоносителях. // Тезисы доклада на международном семинаре-презентации инновакцинных научно-технических проектов «Биология 2000» Пущино- на Оке, 2000 - с.29-30.

40. Рубан Е.А. Биотехнология производства препаратов для защиты животных //Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук, №1, 1999 -с.67-70.

41. Самуйленко А. Я. Перспективы научно-технического развития производства биологических препаратов. //Тезисы докладов Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». М., 1991. - с. 6-7.

42. Сергеев В.А. Репродукция и выращивание вирусов животных. М.: Колос, 1976. - 303 с.

43. Соловьев Б.В., Хорьков И.А., Писеева Г.П., Карпук В.А., Батуханов А.Б., Рубан Е.А., Абрамов А.Б., Назаркина Н.И. Культивирование клеток линии ПТ-80 в ферментере с автоматизированной системой управления технологическим процессом. //Тезисы докладов. Ш

44. Всесоюзной конференции «Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов». М., 1987. - с. 1213.

45. Тарасов BJBL Управляемое культивирование и непрерывное культивирование вирусов и клеток позвоночных. //Итоги науки и техники. ВИНИТИ, сер. «Микробиология», 4, 1975, с. 152-207.

46. Танцуиз М. Питательные среды при культивировании тканей. Тампакуц-сицу капусан косо Protein, Nuclek Acid and Tnsyme, 33, №11,1988, с. 1829.

47. Феннер Ф., Мак-Ослен Б., Миме С., Сэмбрук Дж., Уайт Д. Биология вирусов животных, т.1. М.: Мир, 1977. - 447 с.

48. Хагивара X. //Био индастри, 4, № 8,1987. с.622-631.

49. Царева А.А., Исаенко JI.A., Немцов Ю.В. и др. Каталог перевиваемости культур клеток, т. 1-4. ВНИИ мол.биол.//. Деп. ВИНИТИ 29.01.88, с.865-1388.

50. Wberts В.,Bray D., Lewis J., Raff М., Roberts К., Watson J.D., Molecular Biology of the Cell Garlang Publishing, New York, 1983 p. 120.

51. Al-Rubeai, Emery A.N., Mechanisms and kinetics of monoclonal antibody and secretion in synchronous and asynchronous hybridoma cell culture. // J. Biotech-nol. 1990,16-p. 67-86.

52. Al-Rubeai, Singh R.R., Goldman M. N., Emery A.N., Death mechanisms of animal cells in condition of intensive agitation // Biotechnol. Bioeng., 1994, 45 -p. 463-472.

53. Animal cell culture SERC funds research with five companies //Lab.Pract, 36, № 7,1997.-p.5

54. Aunins J.G., Grougham M.S., Wang D.I. C.etat. //Biotechnolog. And Bioeng. Syph. № 17,1986, pp. 699-723.

55. Bach B.R Method and apparatus for growth cell in vitro. Endotronics. Ins. Пат. США, № 737515Б 1987.

56. Bell S.L., Bebbington C., Scott F., Wardell J.N., Spier R.E., Bushell M.E., Sanders P.G. Genetic engineering of hybridoms glutamine metabolism // Enzyme. Microbiolm. Technol, 1996, 17-p. 98-106.

57. Bibila T.A., Flickinger M.C. A model of intraorganelle monoclonal antibody transport and secretion in mouse hibridoma cells.// Biotechnoll. Bioeng, 1991, p. 767-780.

58. Banes A. Biocompatidble polyorganosilloxane compasition for cell culture apparatus: Пат.США, № 4789601,1988.

59. Bartal A.H. Apparatus for enhancing cell growth, preservation and transport. Пат.США, № 4734313,1988.

60. Blenca. Н/ BTF Biotech-Forum, 5, № 1,1988, p. 6-10.

61. Bols N.C., Scharer J.M., Philips H.A. et.at.//Biotechnol.Adv.,6, № 2, 1988. -pp. 169-182.

62. Bulter M.//Biochem.Eng.Biotechnol, 56, № 8, 1987, pp.346-349/

63. Butter ML, Jenkins H J. //of Biotechnology, 12, 1989. pp. 97-110.

64. Cell culture substrares for inproved cell attachment //Bioprocess Technol., 10, № 8, 1988-P.7.

65. Chang Y. H., Grodzinsky A. J., Wang D.I.C. Nutrient enrichment and in situ Waste removal through electrical means for hybridoma Culture S.// Biotechnol. Bioeng, 1995, 47-p. 319-326.

66. Chang H.N., Kyung Y.S. //Biotechnol. And Bioeng., 29, № 5, 1987. 552-557.

67. Charlier G., Wellemans G.,Lale Л. et.al. //Arch. Exp. Veterinarmed. 38, № 6, 1984,-pp. 894-899.

68. Chister К. A., Hawkins R. E., Clinical issue in antibody design.// Tib. Tech., 1995, 13-p. 294-310.

69. Chisti M.Y., Airliff bioreactors. Elsever Science Publishers LTD, New Jork, 1989-h. 120.

70. Clark J.M., Gebb C., Hirtenstein V.D., Develop //Biol.Stand.,50,1982. Pp. 8191.

71. Couture M. L., Heath C.A. Relationship between loss of heavy chains and the appearance of nonproducting hybridomas.// Biotechnol. Bioeng. 1995, 47 p. 270275.

72. Cotter T.G., Al-Rubeai M, Cell death (apoptosis) in cell culture system //Tib.Tech., 13-1995-p. 150-155.

73. Culture plate //Amer.Biotechnol. Lab, 6, № 8A., 1988. p.46.

74. Cunningham D.D. Proteases as growth factors. // In "Tissue growth factors". Ed.R.Baserga,Berlin etc., 1981. pp.229-248.

75. Davis S.G. Biphasid media culture apparatus, Gibco Div. Mogul. Corp. Пат. CILIA № 460895 , № 432848, 1987.

76. De Bruyne N.A. Magnetic stirrer apparatus with quided, folating stirrer. Toche Corp. Пат. США № 4665377, 1984.

77. Duval D., Demangel C., Munier-Jolain K., Miossec S., Geahel I. Factors controlling cell proliferation and antibody production in mouse hybridoma cells.// Biotechn. Bioeng. 1991, 38 p. 561-570.

78. Feder J. Meth.// Enzymol, vol. 135, Acad. Press, 1987. p. 383-399.

79. Frame K.K., Hu W.S. Cell volume maasurment as an estimation of mammalian cell biomas.// Biotechn. Bioeng. 1990,36 p. 191-197.

80. Frame K.K., Hu W.S. Composison of rowth Kinetic of producing and nonpro-ducing hybridoma cells in batch culture. // Eny. Microb. Technoll., 1995, 13 p. 690-696.

81. Frame K.K., Hu W.S. Kinetic study of hybridoma cell growth in continiaus culture.///Biotechn. Bioeng. 1994, 38-p. 1020-1028.

82. Frame K.K., Hu W S, Behaior of producers and compazision to nonprodusers// Biotechn. Bioeng. 1995,42-p. 1011-1118.

83. Freed J.,J., Howard S.D., Bluett A.C.Sci.Rept. (1984-1985) //Fox Chase Cancer Centlns.Cancer Res, 13th Sci.Rept.Amer.Oncol.Hosp. and Sci. Rept. Philadil-phia, Pa.Plenum Prass, 1986. pp. 285-286.

84. Fyass K., Bakke O., Zevine D.W. Growfh of hydridoma cell under confitions of medium stress. // Proc. 4th Eur.Congr.Biotechnol.,Amsterdam, vol.3, 1987. -p.589.

85. Gebimer R.G., Tolbert W.R. Cell culture filtere apparatus and method. Monsanto Co: Пат. США № 825716 1987.

86. Golstein P., Ojcius D. M, Yong J.D.E. Cell death mechanisms in the immune system.//Immunol. Rev., 1993, 121 p. 29-65.

87. Grabner R., Paul E.L. Motionless mixer as cell culture propagator, Merk and Co., Inc., Rahway, N.Y. Пат. США № 4415670, 1983.

88. Grifliths J.B., Cameron D. R., Loody D. R. J. // Inf. Diseases, N 6, 1981. p. 331-338.

89. Ham R.G.Survival and growth requirements of nontransformed cells /Лп.Tissue growth factors. Ed.R. Baserga, Berlin etc, 1981. pp. 13-88.

90. Ham R.G. Clonal growth of mammalin cells in a chemically defined synthetie medium.//Proc.Natl.Acad.Sci.USA,53,1965.-pp.288-293.

91. Hayflick L, Moorhead P.S. The serial cultivation diploid cell strains. //Exp.Cell Res., 25, 1961.-p.585.

92. Hiller G.W., Aeschlimann, Clark D. S., Blanch H.V. A kinetic analysis of hybridoma growth and metabolism in suspension culture on serum free medium. // Biotechnol. Bioeng., 1995, 23 - p. 167-182.

93. Heath C., Belfort G. Adv.//Biochem.Eng.Biotechnol., 34, 1987, pp. 1-31

94. Henderson T.M. Class-surfase micrjcarrier for anchorage-dependent cell cultivation. KMS Fusion, Inc. Пат.США № 4661407,1985.

95. Henzler HL X, Kouling D. J. Oxygenation of cell cultures. // Bioproc, Eng., 1993,9-61-75.

96. Hu W.S., Dodge T.C., Fraim K.K., et.at. //Develop. Biol.Standart, 66, 1987. -pp. 279-300.

97. Jauregui H.O., MeMillan P.N., Driscoll J. et.at. //In vitro, 22, № 1, 1986. -pp. 13-22.

98. Katinger H. //Develop. Biol.Standart., 66, 1987. pp. 195-209.

99. Keilman M.R., Symbl R.P. Plastic roller bottle for suspension culture. Bax-mer Trevenol. Lab. Пат.№940889б ОБА, 1988.

100. Kingsley R.J., Bernhardt A.M., Wilber K.M. et.at. //In vitro, 23, № 4 1987 -pp. 297-302.

101. Kwansiowski W.s Holl H. Verahren zur Herstellung pH-Wert stabiler Kulturmedien. Патент ГДР № 2803083, 1989.

102. Lazar A., Silberstein L., Reuveny S., et.at. //Develor. Biol.Standard., 1, Jsfe 4, 1988.-pp. 331-337.

103. Loretu K., Blenden D.C., Abstr. Annu. Meet //Amer. Soc. Microbiol., 86th Annu. Meet.,Washington, 1986. -p.340.

104. Lwoff A., Tournier P. The classification of viruses. //Annu.Rev. Microbiol, 30, 1966.-p.45.

105. Loroby D., Crifiths IB.// Cytotechnology, 1, N 4,1988. -p.339-346.

106. Lu GJLy Thompson B.C., Gray M R. Physical modeling of animal cell in suspension culture.//Biotechn. Bioeng., 1996,40, 1277-1281.

107. MacLeod A. J., Dickson L.H. Develop //Biol.Standard., 50, 1982. p.361.

108. Majak R.A. //J.Cell.Biol., 105, № 1, 1987. -pp. 465-471.

109. Mark U., Tretzer J. Verfahren und Vorrichtung zum Kultivberen von tierischen Zellen: Akzo GmbH. Заявка ФРГ № 36338915,1988.

110. Meldrum A. //Chem.Eng., Ш 441,1987. -pp.28-31.

111. Methods for preparation of media, supplements and substrate for serum-free animal cell culture //Ed. Barkes D.H., New York: Alan R. Liss, 1984-1986.

112. Mizrachi A., Lazer A. //CytotechoL, 1, № 3, 1988. pp. 199-214.

113. Moore G.E., Gemer R.E., Franklin H.A. Culture of normal human leucocytes. JAMA //J.Am.Med. Assoc., 199, 1997. pp.519-524.

114. Muller L., Wolfgang G.K., Belter A. Anordnung for das dreidimensionole Machstrum ferischer und menschicher Zellen. Muller Lierheim K.G. Biol. Laboratorium 8033 Planneg. Заявка № 3,35304406 ФРГ, 1987.

115. Nilsson К. Trands //Biotechnol., №3, 1987 -pp.74-78.

116. Noser P., Limant A. //LCell Biol. Suppl., 42, №15,1986 -p.10.

117. Padien P., Chessebeuf-Padien M.Eur/ //J.Cell Biol. Suppl., 42, №5, p.6.

118. Pardee A.B. Molecular mechanisms of the "Cell Growth" in concer. (C., Nicolim, ed) Plerum, New York, 1981. pp.673-714.

119. Pastan I.H. Wilingham M.C. Peceptor-mediated endocytosis of hormones in cultured cells. //Annu. Rev. Physiol., vol.13,1981.pp.239-350.

120. Papoustsaks E.T. Fluid mechanical damage of animal cells in bioreactors. // Tib Tech, 1996,9, p. 427-373.

121. Paul J. Cell and tissue culture. // Ed. Pollak R„ N.Y. 1995, p. 301-305.

122. Peitricciant J.C., Vaccines 85: Mol. And Chem. Basis Resist. Parasitic., Bact. and Viral Diseases. Cold Spring Harbor, TSlew York, 1985. pp. - 383-385. Cold Spring Harbor lab., 1975. -p.864.

123. Pollack R.EE., Hough P.V.C. The cell surfase and malignant transformation Aun. Rev. Ved.s 25,1974. -pp.431-446.

124. Rebsamen E., Coldinger W. Scheiter W. Et.al. //Develop.Biol.Stan-dard.,66, 1987. -pp.273-377.

125. Roels S.A. Energetic and kinetics in biotechnology Elsevier Biomedical Press, Amsterdam, 1993, 33 - p. 724-773.

126. Ross R. The platelet-derived factor, // In: Tissue growth factors Ed. R. Baserga. Berlin etc.,1981. pp. 133-160.

127. Saha S.N., Sen A.K. Indian //Vet J., 64, № 6,1987. -pp.541-545.

128. Schneider X //GenetEng.New, № 5,1987. p.l 6Д0; JNs 1, 1988.-p. 14,29.

129. Schwartz K.A., Zu G., Trosbo J.E. et.al.//Almer J.Hematol., 17, № 1., 1984. -pp.23-27.

130. Shihar A., Reuveny E. Adv. //Biochem. Eng. Biotechnol., 34, 1987. pp, 3335.

131. Shinje K., Toshihiro A. Tureo M. Fermeter Kohen Co. Патент № 521083, 1985.

132. Skirvin R.M., Chu M.C., Mann et.al. Plant Cell Repts., 5, № 4, 1986. -pp.282-294.

133. Smith J.C., Stiles C.D. Cytoplasmic transfer of the mitogentc response to platelet derived growth factor. //Proc. NatAcad.Sci.USA, vol.78, 1981. pp. 4363-4367.

134. Solomons G.L. Materials and Methods in Fermentation Academic Press, London and New York, 1969 - 340c.

135. Spier R.E. The economic Implication of ammal cell biotechnology //8th Int.Biotechnol. Symp., Paris, Proc., vol.l, Paris, 1989.-pp.205-215.

136. Spiral attachment //Lab.Pract., 37, № 11,1988. p.39.

137. Swift H. Quantitative aspects of nuclear nucleoproteins //Int. Rev. Cytol., vol.2.1953.-P.1.

138. Tissue culture of epithelial cells Ed. Taub M., New York, London. Plenum Press, 1995. -p.228.

139. TMG report on serum-free media and flavour and fragrans chemicals //Biotechnol. Bui., 7, № 2, 1988. pp. 5-6.

140. Tolhert W.R.,Prior P. Adv.Res.Anim. Cell Technol //Proc.NATO Adv.Res. Workshop. Brussels. 1987, Dordrecht, 1989. pp. 119-145.

141. Tolbert W.R., Schoenfeld R.A. Levis C., Feder J. Large-scale mammalian cell culture; design and use of an economacal bath suspension system //Biotechn. Bi-eng., vol. XXIV, № 7,1983. Pp. 1670-1679.118

142. Torado G J. De Larco XE., Fryling C.M Asrcome growth factor and other transforming peptides produced by human cells: interaction with membrane receptor.// Fed. Proc., vol. 41,1982. p. 2996-3003.

143. Tremblay M., de Perrier M., Chavarie С., Archambault J. Fed batch culture cells. //Bioroc. Eng., 1996, 9 - p. 13-21.

144. Veber P., Kuniak J., Scanto J. et.al Sposob pestovania buniek in vitro na cellulozovych micronosicoch. A.C. ЧССР, № 230757, 1986.

145. Vernyr С., Imbenotte S. Cell Biol //Int.Repts, 12, № 2,1988. -pp.l 15-122.

146. Whitcutt M.,J., Adler K.B., Wu R //In vitro, 24, № 5,1988. pp.420-425.

147. Yokogawa Y., Tamaguchi K., Yamamoto S. et.al. Proc. //Int. Symp. Growth and Differ. Cells Defined Environ. Fukuoka, Tokio. Kodansha, 1985. pp. 43-46.

148. Zoletto R. Proc. And Exploit. Exist. And New Animal Cell Substrat //Proc. Joint ESACT/IABS Meet., Gardone Rivera, 1984, Basel: S.Karger, 1985. -pp. 178-182.

149. Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности

150. Утверждаю: екторлВНИ и ТИБП1. А.Я.Самуйленко02» ноября 2000 г.

151. Методика оценки биореакторов для суспензионного культивирования клеток животных, выбор их конструктивных параметров и режимов работы1. Щёлково 20001. Общие предпосылки

152. Действительная или кажущаяся скорость роста является суммой всех составляющих наследственного роста и гибели клеток. Гибель клеток вызывается рядом причин, которые могут быть поделены на три категории:

153. Лимитирование или наличие токсичных продуктов;

154. Гидродинамическое воздействие;

155. Запрограммированная гибель клеток исходя из того факта, что даже при поддержании оптимальных условий роста, некоторое небольшое количество клеток всегда погибает.

156. Гибель клетки происходит по двум основным причинам, которые имеют значимое различие некроз и апоптоз.

157. Гибель клеток может быть вызвана гидродинамическими силами, которые могут быть спровоцированы механическим перемешиванием и барбо-тированием. Процесс барботирования является необходимым для снабжения культуры достаточным количеством кислорода.

158. Установлена корреляция между разрушением клетки и следующими тремя воздействиями: скорость сдвига и уменьшение величины турбулентных пульсаций.

159. Гидродинамическая энергия складывается из энергии отдельных пульсации в возрастающую энергию всего объема жидкости.

160. Гидродинамическая обстановка и величины пульсации определяются через критерий Рейнолода для механических мешалок равна:1. Кем= РП(1м2, (3)и

161. Процесс повреждения клеток можно последовательно описать при использовании модели турбулентных пульсации.

162. Схемы биореакторов с механическим перемешиванием сверхмалых объемов (до 1 г) и промышленных биореакторов с механическим перемешиванием и аэрацией и биореактора типа барботажной колонны приведены на рис. 3, 4, 5 и 6.

163. Рис£ Биореактор с механическим перемешиванием и аэрацией.