Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование взаимодействия противоопухолевого соединения митоксантрона с ДНК

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование взаимодействия противоопухолевого соединения митоксантрона с ДНК"

од

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА

, п ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

/ 2 ДЕК

на иранах рукописи УДК 577.323.-13

КЛЗАРЯН РУЗЛННЛ СУРЕНОВНЛ

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО СОВДГНЕНИЯ ШГГОКСЛНТРОНА С ДНК Ч. 00.02-Биофизнка

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук ЕРЕВАН - 1997 « МГЧЙ-П №{НГЪ ЬО. 'М^ПМд-зиЪЪиЬЦРиГПМЛОШ-'Ъ

ЬРЬЧиъп "ШХЧЦиЪ <ииш.иигчгь

ИМЧ 577.323.41

аиаигоис ппкоилл.и ипьгьх-ь <и»тпьап1-&шзкъ итмлапмп-апко ит^гишиъзрпъг- ФШииааьяпмо-зсп; ПЮПМГЬЦШ1РШ>ГЭ-ЗПКЬС ГЛ/Г<>-!'1 ипцьчпмь

Ч-. (10.02 - иьъии№2№и 1)Ь0ишрш0ш1)шС ч(1«1П1РЯ10иир11 риЦОш&пф q}lшul^lшQ шии1|1бш0|! Ьш^йшй шигЬвЦ1[игшп1р,|и1С

иьигио-ьг

ЫЧяи.Ги- 1997

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультет Ереванского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор физико-матемагических наук профессор С. Г. АРУТЮНЯН

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор П.О.ВАРДЕВАНЯН кандидат физико-математических iiayi А. Г. ГАБРИЕЛЯН

Ведущая организация:

Республиканский научный центр Радиационной медицины и ожогов Минздрава РА.

Защита состоится "12, "^¿¿¿.а <¿1997 г. ii/fr 'часои на заседали! Специализированного Совета 051 при Ереванском государствснпои университете (375049, Ереван, ул. Алека Манукнна 1, ЕрГУ, биологически) факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванской государственного университета. Автореферат разослан " (О 1997 г.

Ученый секретарь Специализированного

Совета, кандидат биологических наук QLvitt> С.Л. ГОНЯН

ОБШДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одна in основных задач современной молекулярной иофизики состоит н выяснении характера взаимодействия лекарственных уединений с нуклеиновыми кислотами, так как многие лекарстепные репараты, проникая в клетку, связываются в основном с нуклеиновыми «слотами, чем и обусловлен п.ч терапевтический эффект. Этой проблеме освящено огромное количество работ, однако, задача все еще остается ктуальной, в связи с синтезом все новых и новых биологически активных эедииений.

Чтобы понять к какому нарушению функций ДНК может приводит!) лмилексообразование лекарственных соединении с нуклеиновыми кислотами, еобходимо знать не только характер связывания, по и выяснить возможные зменения is структуре ДНК вследствие взаимодействия и определить зменение термодинамических параметров при связывании. Исследование $аимодействия фармакологически активных соединений с нуклеиновыми ислотами актуально еще н тем, что анализ полученных данных позволит пределить пути улучшения лекарственных препаратов, и, и частности, 1тираковых соединений, способных эффективнее связываться с уклеиновыми кислотами, а также понять молекулярный механизм воздействия ^следованных соединении.

Франк-Каменецким, Гурскчм, Карапетяпом, Waring и т.д. (спериментальпо и теоретически подробно исследованы комплексы уклеиновых кислот с шперкалягорами и неингеркаляторами и получены :новные закономерности, характеризующие их взаимодействия. Однако, >авпительно недавно был синтезирован новый класс противоопухолевых »единений, которые содержат плоские никлы (способные интеркалироваться) длинные заряженные алифатические хвосты (способные электростатически 1аимодействовать с фосфатными остатками нуклеиновых кислот). Физико-шические свойства комплексов таких соединений с правоспиральными и :воспирапьными формами двусгшралышх нуклеиновых кислот выполнены wn и Бабаяном. Из анализа литературных данных следует, что рмостабнльность комплексов ДНК с митоксантроном исследовано

недостаточно, а при малых концентрациях митоксантрона, когда одна молекул; митоксантрона связывается примерно с 100 и более парами оснований ДНК совершенно не исследовано. Одновременно, не выяснено, наблюдается Л1 избирательность при взаимодействии митоксантрона с ДНК опухоли.

Цель и задачи исследования. Детальное исследование взаимодействт митоксантрона с ДНК нормы и опухоли саркомы 45 с определение», параметров характеризующих связывание и термостабильность комплексов.

В задачи работы входило: С помощью оптических методов и микрокалориметрии:

- исследовать природу взаимодействия митоксантрона с двуспираль-пыми ДНК и с опухолевой ДНК, при различных ионных силах и температурах.

- исследовать плавление комплексов митоксантрона с ДНК нормальны? и опухолевых трансформированных клеток в широком интервале концентращн митоксантрона.

Научное значение и новизна. В диссертации исследован характер взаимодействия митоксантрона и зависимости от ионной силы раствора I температуры и определены термодинамические величины связывания методов спектрофотометрии. Продемонстрирована разница в величина? термодинамических параметров при шггеркаляции соединений с большим г боковыми группами и без них, и проанализирована причина этих различий.

- впервые экспериментально обнаружено и теоретически обоснованно, что при малых концентрациях митоксантрона (г<0,01) уменьшении температуры плавления ДНК сопутствует увеличение энтальпии плавления.

-обнаружено, что при связывании митоксантрона с ДНК нормальных и опухолевых трансформированных клеток наблюдается некоторая избирательность взаимодействий митоксантрона с ними - связывание сильнее с опухолевыми ДНК.

Практическая цениость. Полученные результаты могут быть применены I различных областях молекулярной биологии и медицины. Прежде всего, они представляют интерес для химиотерапии опухолей, при разработке новы* эффективных противоопухолевых соединений и в поиске оптимальных путей

направленного спите ta биологически акшвпых соединений н экспресс -¡ниш и Ja их молекулярного депежия.

Результаты район,i используются в лекционных курсах по структуре нуклеиновых кислот и Ереванском госупинерситете и могут быть рекомендованы ;им учебных заведении, гле есть специализации по биофизике и молекулярной биологии.

Апробация работы н публикации. Матералы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции но "Спектроскопии биополимеров" (Харьков,I9N4,1991), па международном симпозиуме "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Дубна, 1997), на научной конференции, посвяшсшюи 30-ти лепно основания отделения биофизики ЕГУ (Ереван, 1996).

Основные результаты опубликованы в 5 статьях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав, выводов и списка литературы (104 ссылки). Она содержит 90 страниц, в том числе 15 рисунков и 2 таблиц.

Содержание работы

13 первой главе приводятся данные о «информационных переходах в двуспиральпых нуклеиновых кислотах, влиянию различных фармакологически активных соединении на B-Z и В-А равновесия и рассматривается механизмы шаимодеиствия фармаколошчеекп активных соединении с нуклеиновыми кислотами.

Во второй главе приводятся описание материалов и методики исследований. Были использованы следующие препараты нуклеиновых кислот: ДНК тимуса теленка ("sigma"), печени крысы, саркомы 45 (были выделены в ИТОХ HAH PA), nojin|d(A-T)| и no.>ni|d(!-C)] '("P.L. Biochemicals"). Все фирменные препараты нуклеиновых кислот использованы без дополнительной очистки. Молекулярная масса ДНК печени крысы и саркомы 45 порядка I07 дальтон. Для этих ДНК отношение Л2ы1/Лт лежало между 1,8-1,9, а А260/А2„г между 2,2-2,4. Содержание бедка п РНК в указанных ДНК меньше 1,5%.

Концентрация использованных нуклеиновых кислот была определена использованием следующих коэффициентов икетипкции, и М 'см"1: ДНК

тимуса теленка (e;(Jl)=655ü), ДНК печени крысы (с2Ы1=6500), поли((1(А-Т)| (c:5J=66üO) и поли |d(I-C)| (к,5,=6900).

Исследования проводились: и полном растворе, содержащем 0,1 М NaCL, 0,01 М Трис, 0,5м М ЭДТА, рН 7,4 (буфсрА); O.OIMNaCL, 1м М Трис, 0,5 м М ЭДТА рН 7,4 (буфер Б). Трис, ЭДТА, NaCL-riperiaparbi фирмы "serva". рН-метре рН-673. Значение рН определяли при 25°С.

В работе был использован фармакологически актиииое соединение митоксантрон (МХ) ("Farmitalia"). Концентрация митоксантрона была определена спектрометрически: e66S=20900 М"' см"'.

Спектры поглощения и кривые плавления реализованы на спектрофотометрах " Сагу-219" (США) и "Unicam SP - К000" (Англия).

Теплоту перехода спираль-клубок определяли на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре " ДАСМ-1М" (СССР).

Построение дифференциальных кривых плавления. Поскольку на кривых плавления, полученных снектрофотометрически, особенности первичной структуры ДНК проявляются слабо, был осуществлен переход к дифференциальным кривым плавления (ДКП). ДКП были получены путем численного дифференцирования нормированных кривых плавления. В данной работе ДКП применяется для исследования влияния митоксантрона на нуклеотидные пары ДНК.

В третьей главе рассматриваются термодинамика, структура и природа взаимодействия митоксантрона с днусппралышмп ДНК.

Исследование взаимодействия митоксантрона с ДНК по характеру изменении спектров поглощения в видимой области спектра.

Исследовано взаимодействия МХ с ДНК тимуса теленка в буфере А при комнатной температуре. Как следует из рис. 1, при постоянной концентрации МХ с увеличением содержания ДНК в растворе наблюдается гипохромизм и смещение максимума поглощения при 665 им в сторону длинных волн. При этом имеется четко выраженная изобестическан точка при 676 им. Следовательно, и исследуемых условиях (при лонмой силе fj =0,11 и температуре 30 °С) МХ взаимодействует с ДНК тимуса теленка одним способом. При -некоторых значениях СР/С0 ( где СР- концентрация ДНК в расчете на пару оснований, а С0- концентрация МХ в растворе) прекращается

б

[аньисГшк'с изменение спектров жнлошеппя - нее молекулы МХ находятся в читанном состоянии. Олновремепно исследовался характер изменения щектрон поглощения при взаимодействии МХ с ДНК при сравнительно малой 10ни011 силе (буфер 13).

Как показывают экспсрпмеш алыше данные при ионной силе ^=0,011, 1ри постоянной концентрации МХ с увеличением содержания ДНК и растворе :пектры поглощения изменяются, причем при лих ионных силах никаких акономерностей в изменении спектров не наблюдаются: в указанных условиях кнможны одновременно, по крайней мере, два различных способа тыимодействня молекул МХ с ДИК. Следовтелыю, уже из рассмотрения пектров поглощения следует, что характер взаимодействия МХ с ДНК зависит >т ионном силы раствора. Исследовалась также тепловая денатурация :омплексов ДНК с МХ в буферах Л и Б по изменению поглощения при 260 им.

рис. 2 приведены кривые плавления поли |с!(А-Т)], полученные при некоторых концентрациях МХ. Как видно из рис.2, связывание приводит к величепию термосгабилыюсги поли|с1(А-Т)|, причем характер изменения 'юрмы кривой плавления комплексов в зависимости от концентрации МХ шличен при различных ионных силах раствора.

рис. I Изменение спектров

поглощения митоксаптрона при связывании с ДНК тимуса теленка в буфере А при 30"С. В процессе титрования концентрация митоксаптрона остается постоянной (С„=4,Ы0'М). Концентрация ДНК в расчете на пару оснований равна: СР=1,35-1(Г5М (!); 2,9-10"'М (2); 4,6-10 5М (3) и 9-10"5М (4); 5-

спектр поглощения чистого мптоксантрона.

600

640

680 Я . нп

рис.2 Кривые плавления поли(с1(А-Т)1 и комплексе с митоксаптроном.

а.- и буфере А при концентрациях митоксантрона: С„/СР=0 (1), 0,09 (2), 0,16 (3) и 0,32 (4).

Ь - и буфере Б при концентрациях митоксаитрона: С„/С,,=0 (1), 0,025 (2), 0,08 (3), 0,2 (4) и 0,38 (5)

Как следует из рис.2, форма кривых плавления комплексом поли|с1(А-Т)| МХ при /1=0.11 не меняется с увеличением числа связанных с ДНК молекул МХ, а происходит смешение кривых плавлении и сторону высоких температур, при почти неизменном интервале плавления. При //=0,011 двухфазные кривые плавления наблюдаются при концентрациях лигандов,меньших стехиометрическая.

Связывание МХ с ДНК может осуществляться кнтеркаляции ароматических колец и за счет электростатического взаимодействия отрицательно заряженных фосфатных групп с ЫН- группами МХ, которые при нейтральных рН заряжаются положительно.

Определение параметров, характеризующих связывание митоксаитрона с

ДНК.

Константа связывания и стехиометрия насыщения комплекса МХ с ДНК рассчитаны из спектров спектрофотометрического титрования. Для рассчета из спектрофотометрических кривых титрования (рис.1), но формулам (1) и (2) определяли концентрации свободного (С,) и связанного (Сь) МХ и была построена изотерма адсорбции в координатах Скетчарда.

1ем

при помощи

Со

(!)

= ^O ~ С f (2)

1десь Л, и Ah-iionioiHeHiie при 665 им свободного и связанного MX, Л-юглошенпе при промежуточных концентрациях MX. Ah была определена из инейноп экстраполяции А от 1/С,. при 1/С,. —> 0.

Как следует из рис.3, связывание MX с двуспиральпыми ДНК арактеризуется нелинейной изотермой адсорбции, которая хорошо щисываетси теоретической зависимое!ыо (3) для некооперативного снизывания шапдов на юмонолнмере.

Г ,, Г 1 - 11 «Г -1

- = Кх(1-П*Г)«[-] (->)

Сг 1 - (и - 1) »г

де г = С|,/С,., К- константа связывания MX, п- параметр, характеризующий техиометрто комплекса иолимер-лш апд, при насыщении и равной числу нар ¡снований полимера, занимаемых одной связанной молекулой л и ганда.

Значения параметров К и п, для комплекса MX с природными и :интетическими ДНК при разных температурах, рассчитанные по формуле (3), фиведены в табл. 1. Как следует из табл. 1. дли комплексов MX ДНК п=2-3. Толученпое значение п-числа пар основании, занимаемых одной связанной .шлекулой MX совпадает с и для других соединений, взаимодействующих с IHK по иитеркаляционному механизму (Гурский, Бабаян, Lown). Как следует 13 табл.1, наблюдается избирательность связывания исследуемого соединения : различными нуклеотидными парами.

Изотермы связывания, построенные с помощью спектрофотометричеекого титровании митокеаптрона с ДНК тимуса теленка в буфере Л при WC'(I), 40"С (2), 50"С (3) и 60"С (4). Сплошная липни- теоретическая кривая проведенная через

зкепери ментальные точки

удовлетворяющая уравнению (3).

0,12 Q.2 0,28 ,

Используя знамение К, можно найти изменение свободной энергии Гиббса ДС при связывании по формуле

ДС=-ЯТ-1пК (4)

где К- газовая постоянная, Т- абсолютная температура. Изменение энтальпш (ДН) при связывании МХ с ДНК было определено из анализа Вант-Гофф; зависимости К. от температуры.

Согласно формуле (5), тангенс угла наклона кривой 1пК в зависимости от 1/7 дает величину -ДН/Я , если зависимость линейная.

Как показывают расчеты, для обоих исследованных комплексов ДН =-(10±2)ккал/моль. Зная ДС и ДН, можно оценить изменение энтропии (5) при связывании по формуле (6)

ДС - дН ...

Д<г --Сб)

Т

Рассчеты показывают, что величина ДЙ положительна, и составляет соответственно 17 ± 2 и 12 ± 2 ккал/моль град, для комплекса МХ с ДНК тимуса теленка.

Т а б л и ц а I

Термодинамические параметры связывания митоксантрона с ДНК. при некоторых температурах в буфере А.

тгаднк Г,с к( 10'5),М'' ДС КК'"/моль п

тимус теленка 30 5,8±0,4 8,1±0,2 2,4±0,2

40 2,5±0,5 7,9±0,2 2,6±0,2

50 1,8±0,5 7,8±0,2 2,4±0,2

60 1,3±0,5 7,8±0,3 2,4±0,2

поли[с1(А-Т)| 30 2,3±0,4 7,9±0,2 2,4±0,2

ю

ТермостаСпиьиость комплекса ДПК-митоксашпрои. Как было показано I! пред идущем маршрафс, характер взаимодействия мптоксаптропа с пра1!0снир;и1ы1ыми ЛПК зависит от ионной силы распюра, причем, можно считать, что при /*=0,11 взаимодейст пне носит иитсркалирующий характер. При таком взаимодействии с увеличением числа итеркалировапных молекул мптоксаптропа, увеличиваемся температура плавления Т,„ ДНК; кривые плавления почти параллельно сдвигаются в сторону высоких температур.

При малых конпешраииих мптоксаптропа, когда одна молекула приходится примерно на 100 пар оепоавнпй ДНК, при практической неизменности Т,„, кривая перехода слегка уширяется, что соответствует дестабилизации АТ и стабилизации ГЦ-пар. Дальнейшее увеличение концентрации мптоксаптропа, как и следовало ожидать, приводит к увеличению Т,„.

При малых ионных силах, когда отрицательно заряженные фосфатные группы ДНК не полностью экранированы, в ДНК появляется возможность электростатического взаимодействии. Помимо иптеркаляции колец, определенный вклад в связывание дает и электростатическое взаимодействие боковых групп мптоксаптропа. На рис.4 показаны кривые плавления ДНК тимуса теленка в буфере Б (/;=0,011) при различных концентрациях мптоксаптропа. Как следует из рис. 4, при добавлении мптоксаптропа, в соотношении порядка 1:100 пар оснований ДНК происходит дестабилизация АТ- богатых участков и стабилизация ГЦ- богатых участков, вследствие чего, уменьшается Т,„ ДНК н увеличивается АТ. Дальнейшее увеличение концентрации мптоксаптропа приводит к увеличению Т,„.

рис.4 Кривые плавления ДНК тимуса теленка в

митоксантроном в

буфере Б при концентрациях: Со/Сг~0 (1); 0,008(2); 0,012 (3) и 0,026 (4).

комплексе

с

к

к

¡а й

Следовательно, независимо от 1101111011 силы раствора при сравнительно малых концентрациях митоксантрона связывание приводит к дестабилизации АТ- и стабилизации ГЦ- пар (рис. 4), однако при малых ионных силах 'лог эффект выражен сильнее. На рис. 5 показана зависимость Тш от концентрации митоксантрона. Как следует из рис. 5 при сравнительно малых концентрациях митоксантрона С0/СР < 0,01, происходит дестабилизация ДНК; Т„, для ДНК тимуса теленка уменьшается более чем на 2°. Дальнейшее увеличение концентрации митоксантрона приводит к стабилизации ДНК (увеличению Т,„). В указанной на рис. 5 области концентрации митоксантрона особенности в поведении <5(ЛТ) не наблюдается: ДТ монотонно увеличивается с увеличением Со/С,,. Следует отметить, что в буфере А (р=0,11) для Т,„ аналогичная зависимость не наблюдается. На рис. 5 приведена также кривая для ДНК опухоли саркомы 45. Как следует из рис. 5, для ДНК опухоли эффект уменьшения Т,„ выражен сильнее. Вполне вероятно, что это обусловлено наличием в ДНК опухоли "дефектных" участков, которые облегчают раскручивание несвязанных пар оснований. Итак, несмотря на то, что интеркаляцнонное и электростатическое взаимодействия приводят к

Я1'

сс

6?

рие.з

Зависимость температуры

плавлении ДНК тимуса теленка (I) и ДНК саркомы 45

(2)

относительной концентрации митоксаитроиа буфереБ.

от

к

стабилизации связанных пар основании, мы наблюдаем уменьшение Т,„ и увеличение ЛТ при связывании одной молекулы митоксантрона примерно с 100 и более парами основании ДНК. Для определения роли энергии межмолекулирпых взаимодепепшп и лом эффекте были проведены калориметрические исследования.

При помощи дифференциальной сканирующей микрокалориметрии была определена зависимой ь энтальпии плавления (ДН) от концентрации митоксантрона (таблица 2) комплексов, для которых наблюдается уменьшение Т„, при увеличении С„/С,.. Микрокалоримезрическое измерение проводилось для комплексов ДНК опухоли саркомы 45 с митоксантроном, для которой! наблюдается более сил:.нос уменьшение Т,„ (рис. 5). Как следует из таблицы, ДН почти монотонно увеличивается с увеличением относительной концентрации митоксантрона. Следовательно, в указанной области концентраций митоксантрона, уменьшению Т,„ сопутствует увеличение ДН.

Этот, на первый взгляд, неожиданным результат может быть объяснен на качественном уровне следующим образом. Из общего определения температуры перехода Т„=ДН/Д5, если энтропию спирального состояния, считать не зависящей от взаимодействия с лигандом (для таких малых концентраций, как С0/С,, < 0,01), то уменьшение Т,„ с увеличением АН можно объяснить только за счет увеличения 'энтропии клубкообразного состояния за счет взаимодействия с мтоксантропом. Этот эффект увеличения энтропии возможно обусловлен тем, что нптеркалирующий митоксантроп может вступать в электростатическое взаимодействие с фосфатными группами ДНК. своей хвостовой частью, 'несущей положительный заряд. При денатурации, стекипт взаимодействия ароматической части митоксантрона разрушается, хотя элекфостатическая связь с фосфатными группами сохраняется. Мы предполагаем, что дополнительной свободой вращения присоединенного к скелету ДНК митоксантрона и обеспечивается такое увеличение энтропии денатурированною состояния комплекса, что при увеличении ДН, Т,„ тем не менее уменьшается. По видимому при увеличении концентрации лиганда межлигапдпые взаимодействия ограничивают эту свободу вращения, что может привести к росту Т,„ только за счет роста ДН.

Т а б л и ц а 2

Зависимость энтальпии плавления ДНК опухоли саркомы 45 от концентрации мигоксаптропа в буфере Б.

Относительная концентрация мигоксантрона О/с, 0 0,0012 0,0025 0,005 0,01

Энтальпия плавления (ДН , дж/г) 48,3±2,0 48,3±2,0 50,5±2,0 53,4±2,0 54,5±2.0

В пользу нашего предположения говорят результаты по взаимодействию этидиум бромида, у которого отсутствует такая хвостовая часть. Детальные исследования (Карапетян, Вардеванян) в широкой, в том числе и малой концентрационной области не обнаруживают наблюдаемого нами эффекта.

Четвертая глава посвещепа исследованию особенности взаимодействия митомишпроии с ДНК опухоли саркомы 45. Взаимодействие МХ с опухолевой ДНК (оДНК) исследовано при помощи сиектрофотометрического титрования. На рис. 6 показаны спектры поглощения МХ в буфере А при увеличении концентрации оДНК. Как следует из рис. 6 с увеличением концентрации оДНК наблюдается гипохромизм и длинноволновое смещение, по не обнаруживается характерная для всех спектров изобестическая точка, как это наблюдается при взаимодействии МХ с нативпой ДНК. Следовательно, МХ при ионной силе ^=0,11 взаимодействует с оДНК по крайней мере двумя различными способами. Определены параметры (К и п), характеризующие одновременное взаимодействие МХ с обоими центрами связывания оДНК. Как следует из рис.6, с увеличением концентрации оД^К СР/С0<2,5, наблюдается изобестическая точка. Изотерма адсорбции была построена с использованием только таких кривых титрования, для которых наблюдается изобестическая точка. Для указанных спектров значение поглощения при насыщении всех центров связывания <>ДНК было определено при помощи линейной экстраполяции поглощения оДНК было определено при помощи

линейной зкстраноляпии поиютеиня при 665нм коиш 1/СР-»0 и построена изотерма связывания с использованием формул (I) п (2).

А

0/37 005

0,03

рис.6 Изменение спектров поглощения митоксантрона при связывании с ДНК саркомы 45 и буфере А при 30°С. 13 процессе

титрования концентрация митоксантрона ■ остается

постоянной (С„=8,1 Ю-'М (2) и СР=3,9 10"4М(3).

630 650 670 1

/., нм

Расчеты показали, что для комплексов МХ с ()ДНК К з З-Ю6М 1 и 11=2,4 + 0,2.

Константа связывания МХ с СДНК почти на порядок больше, чем для ДНК нормы; стехиометрия насыщения н пределах ошибки измерения п остается постоянной.

Используя значение К, можно найти изменение свободной энергии Гиббса при связывпии но формуле (4), что составляет Дв = -7,8ккал/моль для комплексом ДИК МХ и ЛО = -1)ккал/моль для комплексов оДНК МХ. Возможная причина наблюдаемого отличия в значениях К обусловлена, скорее всею, структурными особенностями опухолевых ДНК.

Следовательно, наличие н опухолевых ДНК "дефектных участков" приводит к тому, что увеличивается ее энергия связывания с МХ.

ВЫВОДЫ

I. Иссдедонано связывание противоопухолевого антибиотика митоксантрона с двуспиральпыми ДНК. при ионной силе 0,11 М п 0,011М №С1 в интервале

температур 30-60" С методами микрокалориметрии и епектрофотометрии. Исследования показали, что при 0,11 М №С1 митоксантром взаимодействует с ДНК одним способом. Для лих условий по данным спектрофотометрического титрования построены изотермы связывания митоксантрона с ДНК в координтах Скэтчарда. Расчеты показали, что стехиометрия насыщения составляет одну молекулу митоксантрона на 2-3 пар оснований ДНК. Наблюдается зависимость константы связывания от содержания СС-пар.

2. Впервые экспериментально показано, что при связывании митоксантрона с двуспиральными ДНК, помимо интеркаляции колец, определенный вклад в связывание дает и электростатическое пзоимодействие боковых групп митоксантрона.

3. Впервые исследовано взаимодействие митоксантрона с ДНК при малых заполнениях. Показано, что при 0,011 М №С1 зависимость температуры (Тт) плавления от концентрации митоксантрона проходит через минимум, уменьшение Тт наблюдается в облости, где одна молекула митоксантрона приходится на 100 пар оснований ДНК. Для ДНК, выделенной из опухоли саркомы 45,' наблюдается более глубокий минимум. В указанной области концентрации митоксантрона энтальпия плавления комплексов линейно увеличивается с увеличением концентрации митоксантрона. Наблюдаемое явление качественно объясняется увеличением энтропии клубкообразного состояния ДНК — лиганд комплекса за счет дополнительной свободы вращения л и ганда.

4. Исследовано взаимодействие противоопухолевого антибиотика митоксантрона с ДНК опухоли саркомы 45. Показано, что взаимодействие митоксантрона с ДНК опухоли саркомы 45 отличается от его взаимодействия с ДНК печени здоровых крыс. Расчеты показали, что стехиометрия насыщения для обоих ДНК составляет одну молекулу митоксантрона приблизительно на 2,5 пары пуклеотидов ДНК с константой связывания к=4-105 М 1 (при связывании митоксантрона с ДНК печени) а к=3-10(' М"1 (при связывании с ДНК опухоли). Показано, что в опухолевых ДНК наблюдается тенденция к более сильному связыванию.

5. По характеру изменения пила дифференциальной кривой плавления предложен способ исследовании избирательности действия соединений па нуклеотидпые пары ДНК.

Основные публикации но теме диссертации

1. Казарян P.C., Асланян 13.М., Бабаян 10.С., Аслапяп Л.Л. "Влияние противоопухолевых препаратов алкилируюшего типа на структуру опухолевой (саркома45) ДНК" Спектр. Биополпмеров-V. Харьков,-19X4, с. 9-10

2. Казарин P.C., Бабаян Ю.С. Аветисян М.Г. "Исследование изменения геометрии ДНК вследствие взаимодействия с противоопухолевыми соединениями митоксантропа и аметантроиа" Спектроскопия биополимеров-7. Харьков,-1991, с. 20-21.

3. Казарян P.C., Бабаян Ю.С., Худавердян Н.В., Арутюпян С.Г. "Особенности плавления комплексов ДНК с митоксантропом при малых концентрациях" Междунар. Спмпоз. под эгидой ЮНЕСКО "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии Москва, Дубна, 1997", с. 13-14.

4. Казарян Р.С.,Оганпесян С.С., Арутюпян С.Г., Бабаян Ю.С., Худавердян Н.В. "Связывание противоопухолевых антибиотиков митоксантропа и аметантроиа с двуспиральными полирибоиуклеотидами" ДАН HAH РА,-1997, N2, у.91, с. 43-48.

5. Казарян P.C., Бабаян Ю.С., Карапетян Л.Г., Худавердян Н.В. "Особенности плавления комплексов ДНК с митоксантропом при малых концентрациях" Биофизика,-1997, -т.42. N2, с. 367-371.

luiquipjuiG fkuqiuGGui UniphGJi <uilpunmnigpuijliü úlnugnipjniü i5[nnnpuiuümpnú¡i ifm)uiuqi]bgnipjuiû niumúluuuJipnuÍQ Tbiö--]i ¿¡П[Ы)П1[]1 htm

ЩГФПФИаЬГ

<iuGqmgiujliG piunbp' 'Vliíd-, lífiinnpuuiGmpnG, l]iuu{ü°iuG pbpiSni]Jiúiutí{iliujliujG UjuipuitSbmpbp, liiuupîuiû (íqnpbpti:

"ЬЬр11Ш|шу11ш0 iu2fuuiuuulipniiS niunii5ûuiu]ipilhL t hiuliiunumigpiujliG tffiuignipjmü' 15|ш1пришйшрпйр ^ínfumqilbympjniGp l)pl]üuili]i ujuipni.puij]iG ТЫЭ-ф htm 30-50 "С jbpú'uiuinjiiíujüiujpü uitipnijpniOl, 0,1 M U 0,011 M NaCl ]müuiliu)ü nidbpli цЬцршй:

U.2luminiuûpniù gnijg t inpiluiîr, np 0,1 M NaCl [шОшЦшй nict[i цЬцрпиЗ, ü|imnpumQinpnüß itintuuiciiyuú t *VL»I3--Ji libin ií[iuijü liûmbpliunjiug[mG ùbtumûliqiîn^: U]iuictiuû'iuGiuli, iSJimnpuiuümpnü|i bplpup linqCiGuijliG [uiîpbpp tibljmpiuumium|iljnpbû фпршщгрий Ы1 П-Ъ/а-ф ршдшишфий i]igj}iui|npil"JÖ .1>1Ш.1>Ш1П1и)[Ш fuüpbpji hbin:

МшицЗшй |iqnphpiïhp|i iS¡i2ngni{, npn^ijbL t 1[шиц5шй liuiumuunniG¡} U tüblj Ijmojni] llhüuipnü¡iü puidpü pQljGnri qnijq h¡iC¡pbp¡i pIuIq: önijg t uipiJbL, np GinjQ iquijúuiüübpniiS C¡|uimpuuiüm¡müii U uuipljmSiu 45 mnmgpjig uiGgiumiluiö 'Vlilö--ji IpiCiunhpuGhpli рЬрйпгфйш-dïil|uifyujG щшршйЬтрЬрр iniuppbpi[nnS hü шпп1\§ hjmui|mírpGbpJig uiGgiuu^iufr П-ЪЭ--)) Цпй'и][ЬрийЬр11 Ьшй'шщшшши^шС ициршйЬтрЬррд: Uiupliniiiu 45 nmnigp¡ig ui(¡2uiuu{ui0 О-Ъ0"-11 huitfuip гфт1[Ь[ t шфзф nidbq IjiuupSuiQ mbûi}bûg]iuj:

ШчлиСШилфрфз^ t 'УЫЭЧфтпришйтрпй linüuubpulibpji jbpiîmlimjniGnipjmGp lijiumpuuiGmpnGfi linGghüuipuig|iuij[i juijû in|ipnijpiuii: íinyg t mpiJhL, np СфтприиШтргШр фпрр Ipiügbüinpuigliuiühpli qbuipiuii (bpp i5bl) iï|iuinpiuuûinpnG)i йгцЬ^пщ фп[ишдгрш5 t ""УЫЭ-ф 100 U шфзф qmjq h¡iüpbp]i hhui) lîfiinnpuiuGinpnûli ЬшршрЬрш^шО linûgbûuipmgjimjpg huipíuiü jbpCiiuumfiiuiQli IjiufutfuiG Ijnpíi uißgGmii t i5fiG}iúni.i5nil: 1)шрЦпйш 45 шлтдррд шй§штфи& 'УЬЭ'ф huiúuip фтфий t ш^Ьф ]unp üjiüpúniü: Х^фид linügbQinpmgtttuj[i mlipmjpniiî hm^ïoiG tüpuiia¡limj¡i mßß qöuijtiG b 1 гфиифий ^bGnü'bGJi npuiljuiliuiG puiguiinpnipjmGQ: Ьйршг^рфий t, np uijG uiGiSfiguiliuiGnpbG uinG^nnï t tffimnpuuiGinpnGfi pGmpnquiliiuG huilpunuinigpuij|iü luljinl^ntpjiuG hbm: