Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Кооперативные превращения нуклеиновых кислот в комплексе с противоопухолевыми препаратами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Кооперативные превращения нуклеиновых кислот в комплексе с противоопухолевыми препаратами"

¡' I о им

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РА ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

на прамх рукописи УДК 577.323.43

СНГРЯН ЛКОП ЕГОРОВИЧ

КООПЕРАТИВНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ В КОМПЛЕКСЕ С ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМИ

ПРЕПАРАТАМИ.

Я 00.02 - Биофизика АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата физико-математических паук

ЕРЕВАН 1997

цргапназиь и т^пгазцъ ъшииоирпнэзпк, ьоьчиьь т^Эи^иЪ чииишцрцъ

¿Ьпш<)р!1 ^ршфибрт] Ш^П- 577.323.43

иъо-рзаъ ьапгь

|^и№ъишэ-пкььрь ^и^ипнтпьйшзм, иъиапь©-зпьъъьрг>

ЧПи^ЬЬ^иЪЬРЬ ^ПП^ЬРиБЬЧ. ФШииРкПМГЬЬРС

О: 00.02. - иьбиш^фф!{ш ЗфцрЦшйшрЪЗшифЦшЦшй д/иппщшййЬр/] рЫ/йшдпф дршш^шй шитрЛиИ/] ¡¡ш^ЛиО шшЬвшфтитр^О

иьаии<№Р ЬРЬЧи'Ь-1997

Работа выполнена на кафедре молекулярной физики физического факультет Ереванского государственного университета.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук профессор Ю.С. БАБАЯН

Официальные оппоненты:

доктор физико-математических наук, профессор В.И. ИВАНОВ доктор биологических наук, профессор П.О.ВАРДЕВАНЯН

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии НАН Республики Армения

Защита состоится

"Л"

¿¿^¿7131997

Л °°

в /у часов

на заседаии

Специализированного Совета 051 при Ереванском государственном университет (375049, Ереван, ул. Алека Манукяна 1, ЕрГУ, биологический факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ереванско1 государственного университета. Автореферат разослан " ¿¿/0491997 г.

Ученый секретарь Специализированного _ ^__

Совета, кандидат биологических наук СЛ. ГОНЯН

Общая характеристик;} работы

Актуальность проблемы. Исследование кооператинных переходои 'клеиновых кислот и комплексе с различными фармакологически активными единениями является одним из наиболее важных задач и молекулярной юфизике, так как многие соединения, проникая в клетку, связываются и ионном с нуклеиновыми кислотами, чем и обусловлено их влияние на ганизм. Чтобы понять к какому нарушению функций ДНК может приводить мплексообразование лекарственных соединений с нуклеиновыми кислотами, обходимо знать не только характер связывания, но и выяснить возможные менения в структуре ДНК вследствие взаимодействия и определить изменения рмодинамических параметров. Следовательно, вследствие

мплексообразования нуклеиновых кислот с билогически активными ществами должна изменяться конформация нуклеиновых кислот, ¡следование конформациоиного состояния комплексов фармакологически гивных соединений с нуклеиновыми кислотами актуально еще и тем, что ализ полученных данных позволит также определить и пути улучшения дарственных препаратов, понять молекулярный механизм их действия, шснениго вохможных конформационных переходов п ДНК. при связывании с ¡личными биологически активными соединениями, в том числе и отивоопухолевыми соединениями, посвящено огромное количество :периментальных и теоретических ' работ. В этих работах подробно :ледованы конформацин ДНК и РНК, выяснены закономерности нформационных переходов и влияние различных факторов на кооперативные гвращения. Однако, сравнительно недавно был синтезирован новый класс этивоопухолевых соединений, которые связываются с ДНК геркаляционным способом и одновременно могут электростатически имодействовагь с отрицательно заряженными фосфатными группами, имерами таких противоопухолевых соединений могут служить митоксантрон аметантрон. Конформация и возможные конформационные переходы шоспиральных и левоспиральных ДНК и РНК в комплексе с такими динениями почти не исследованы.

Цель и задачи исследования. Исследование конформациоиного состояния слеиновых кислот в комплексе с противоопухолевыми соединениями

з

митоксантрон и аметантрон и выяснение влияния нового алкилирующе препарата имидазен на ДНК. В задачи диссертации входило:

- при помощи спектров кругового дихроизма исследовать возможш конформационные изменения ДНК и РНК при связывании с митоксантроном аметантроном;

- взаимодействие митоксантрона и аметантрона с правоспиральными (В и А) левоспиральными (Z) нуклеиновыми кислотами, влияние исследуем! соединений на B-+Z равновесие;

- изучение влияния in vivo и in vitro алкилирующего противоопухолево соединения имидазена на ДНК.

Научная новизна.

- впервые исследований взаимодействие митоксантрона и аметантрона леноспиральной Z-формой ДНК, реализуемой в концентрированном раство NaCl. Показано, что исследуемые соединил не связываются с Z-ДНК. Oí затрудняют, но не ингибируют B->Z переход.

- показано, что характер взаимодействия митоксантрона и аметантрона с В-ДЬ сильно зависит от ионной силы раствора. В физиологическом раство взаимодействие носит в основном интеркалирующнй характер, одновремен длинные боковые алифатические группы электростатически взаимодействую' отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК.

- судя по относительному изменению дихроичного поглощения для тр исследованных полинуклеотидов с чередующейся поледовательност] оснований наблюдается следующая закономерность в характере изменен геометрии пар оснований вследвие взаимодействия с митоксантроном аметантроном:

GOIOAT

- при малых ионных силах (/КОЛ) митоксантрон и аметантрон взаимодейству с ДНК и РНК по крайней мере двумя различными способами. Судя относительному изменению дихроичного поглощения для трех комплекс полинуклеотидов с митоксантроном наблюдается следующая закономерности способности изменять геометрию пар оснований при взаимодействии с одн молекулой митоксантрона или аметантрона:

GC>AT>IC

- предложен метод исследования влияния фармакологически активы соединении с ДНК при помощи дифференциальных кривых плавления,

зменению кривой плавления ДНК.. Однако, очень часто, на кривых планления собенности первичной и вторично» структуры ДНК проявляются слабо, [оэтому, целесобразно переходить к дифференциальным кривым плавления 1КП), в которых даже незначительные изменения кривой плавления ^являются в виде пикой. ДКП были получены путем численного 4фференциирования нормированных кривых плавления. Программа 1фференцииропания предназначена для получения сглаженной ^нормированной, сглаженной нормированной кривой плавления и ее первой эоизводной.

В данной работе ДК.П применяется для исследования влияния Филирующего противоопухолевого препарата имидазена на структуру ДНК 1ухоли саркомы 45.

Третья глава посвящена влиянию митоксантрона и аметантрона на ометрии спирали ДНК и РНК, исследованию их взаимодействия с воспиралыюй г-ДНК, влиянию на равновесие.

Изменение геометрии В-формы ДНК вследствие взаимодействия с ютивоопухолевыми соединениями митоксантрона и аметантрона.

Рассмотрено взаимодействие митоксантрона и аметантрона с ДНК по рактеру изменения спектров КД » буфере А, при ионной силе р=0.11. Как 1ло показано в работах Ю.С. Бабаяна, митоксантрон и аметантром в буфере А аимодействуют с ДНК предпочтительно интернирующим способом, хпериментально получили, что с упиличением концентрации митоксантрона и постоянной концентрации ДНК изменяется КД спектр (рис. 1).

Рис.1. Изменение спектрон КД полн|(3(Л-Т)] при спяэыштии с митокейнтроном: а-С„=4.0*10"5М в буфере А при 3-х концентрациях митоксантрона Со/Ср=0 (1),0.13 (2), и 0.22 (3): 6- СР=2.7М0'5М в буфере С при 4-х концентрациях митоксантрона С„/Ср=0 (0,0.12 (2), 0.27 (3) и 0.3 (4).

Это свидетельствует о том, что вследствие взаимодействия митоксантроном геометрия спирали ДНК изменяется, так как митоксантрон ] является оптически активным и не становится таким и вследствие связывания ДНК. Для характеристики степени изменения геометрии спирали исследова! поведение относительного изменения дихроичного поглощения в максиму! (Де<")/Де(0)) в зависимости от относительной концентрации митоксантрона и. аметантрона в растворе (С„/Ср).

С увеличением числа молекул митоксантрона, приходящихся на па оснований ДНК, т.е. С</Ср, вначале величина Дб(")/Де(0) увеличивается линейно, потом, при сравнительно больших СУСР стремится к насыщению, что видно рис. 2, где приведены зависимости относительного изменения Детм концентрации митоксантрона для различных ДНК. Величина Де(м)/Де<0) увеличением CJCSI слабо изменяется для ДНК М. Ьуяос^Мсш и сильно - д поли[с1(0-Т)]-поли[с1(А-С)]. Судя по относительному изменению величины I для трех исследованых случаев наблюдается следующая закономерность характере изменения геометрии пар оснований вследствие взаимодействия митоксантроном:

СС>1С>АТ

Такие же результаты получены и при исследовании взаимодействия аметантро с ДНК.

Исследовались также зависимости Д£<м)/Де<0> от С0/СР, вычисленные максимуме и минимуме спектров КД для комплексов митоксантрона аметантрона с поли[с1(0-С)], чтобы получить информацию об относительн эффективности изменения геометрии спирали ДНК, когда связываетс соответственно, одинаковое количество молекул митоксантрона и аметантронг парами оснований ДНК (рис. 3). Получено, что для обоих комплекс увеличение числа молекул лиганда, связанных с парами оснований, приводит увеличению Де,,з<м)/Де,7!"'>, причем для комплексов с аметантроном п сравнительно малых значениях С0/Ср линейность относительного изменен спектров КД нарушается, т.е. изменение геометрии спирали становится мег выраженным.

Такая же картина наблюдается и для относительного изменения миниму дихроичного поглощения. Следовательно, связывание одной молеку. аметантрона приводит к более сильному изменению геометрии спирали, ч связывание митоксантрона.

з

2

3

Agi'

<V Cp

Рис.2. Занисимость относительного изменении AemnlOT концентрации митоксантрона: 1-поли|с!(0-Т)| * поли[<3(А-С)| (Л™=280нм), 2- поли|<3(С-С)] (Лт,,=273нм), 3- !io;m[d(I-C)I а„.,=264нм), 4- поли|с!(Л-Т)| (А„„=278им) и S- M.Lys. (А„„=270нм).

изменения максимума (а) и минимума (б) дихроичного поглощения полн[й(0-С)| от концентрации лекарственных соединений: 1-аметантрон,

2-митоксантрон.

Рис.3. Записимость относительного

Рассмотрено также влияние температуры на характер изменения величины е<муДе<о) при нзаимолействии митоксантрона и аметантрона с ДНК. [сследовалось дихроичное поглощение при 270 нм при нзаимолействии итоксантрона с ДНК М. Ьузос^Шсия при температурах 30" и 50° С. Величина и2Пм/&е21„(0) изменяется более сильно при взаимодействии при 30° С. [сследовалось также взаимодействие митоксантрона и аметантрона с ДНК и уфере Б при ионной силе ¿¿=0.011. Показано (рис. 1,6), что увеличение числа олекул митоксантрона, связанных с парами оснований, приводит к изменению тектров КД, причем при ¿1=0.011 митоксантрон взаимодействует с ДНК по райней мере двумя различными способами. Из зависимости Де<м)/Де"" от СуС,, чя комплексов ДНК - митоксантрон следует, что с увеличением С0/Ср зеличивается Де<м,/Де,0\ причем не линейно, как это наблюдается при нтеркаляционном связывании, а более круто (рис. 4). При сравнительно мыл их значениях С,,/Ср величина Де стремится к насыщению. Для комплексов >ех исследованных полинуклеотидов с митоксантроном наблюдается следующая 1кономерность в способности изменять геометрию пар оснований п шисимости от последовательности оснований при взаимодействии с одной олекулой митоксантрона:

GC>IC>AT

Эта закономерность отличается от аналогичной, полученной при ^=0.011.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что по характе| изменения спектров КД при взаимодействии можно судить о степени изменен! геометрии пар оснований ДНК при связывании митоксантрона и аметантрона ДНК. Согласно экспериментальным данным, если происходит толы интеркаляционное взаимодействие митоксантрона или аметантрона с ДНК, т зависимость Де'"УДб(0) от С0/Ср - линейная в начальной стадии. По наклону этс кривой можно судить о степени изменения геометрии спирали при образован« комплекса с лигандом. Согласно экспериментальным данным (рис. 2 наибольшее изменение геометрии спирали наблюдается для комплекс поли[б(С-Т)]-поли[с1(А-С)] с митоксантроном или аметантроном. Наличие двч различных способов связывания приводит к тому, что дихроичное поглощенг увеличивается более круто.

Взаимодействие митоксантрона и аметантрона с Z-формой ДНК, и влияние на B^Z переход в молекулах ноди[с1(С-С)|, стимулированный NaCl. Молекулы поли[с1(0-С)] полностью переходят в Z-форму, когда концентраци NaCl больше, чем 2.5 М [Röhl, 1972).

В то же время, если все центры связывания полимера занят интеркаляторами, то B^Z переход не наблюдается при увеличени концентрации NaCl. Поэтому исследовалось связывание митоксантрона аметантрона с поли[с1(0-С)], когда полимер находится в B-форме и в Z-форм« стимулированной 3.1М NaCl. На рис 5. показаны спектры КД поли[<3(С-С)] буфере А, где полимер находится в B-форме, и при добавлении в буферны раствор ЗМ NaCl, где полимер находится в Z-форме. Во всех растворах добавле митоксантрон. Из рис. 5 видно, что добавление митоксантрона в раствор, гд полимер находится в B-форме, приводит к изменению спектров КД. А когд митоксантрон добавляется в раствор, где поли[с1(0-С)] находится в Z-форме, т

а У АС"

Ср

Рис.4. Зависимость относительного изменения Де^от концентрации митоксантрона:

1- поли[с)(0-С)1 (Л-т.х=273нм),

2- поли[с)(А-Т)] (Ат„=278нм),

3- поли[с)(1-С)] (Л„„=264нм).

зпектры КД изменений не претерпевают, что можно объяснить отсутствием связывания. Отметим, что концентрация митохсантрона почти достаточна для насыщения всех центров связывания. Спектры КД указанных растворов были ;няты через каждый час, чтобы выяснить кинетику закономерностей. Однако, 1,аже через сутки после добавления митоксантрона в спектрах КД заметных «менеиий не наблюдается.

220 250 280 310 2М 250 кп

Рис.5. Спектры КД n<MH[d(G-C)] (с=5.0!*)0 5 М/Р) и буфере Л при различных концентрациях соли митоксанрона при 25 "С.-, а - 0.1 М N;iCl и митоксантрон при D/P=0 (1), 0.15 (2) и 2 (3). ,6-3.1 М NaCi при любых концентрациях митоксантрона. D -конценрация митоксантрона, Р -концентрация фосфатных групп поли1<3(С-С)|.

Аналогичные результаты были показаны и для комплексов поли1с1(С-С)| с метантроном. Как следует из рнс.5б, независимо от концентрации итоксантрона, поли[с1(С-С)] н растворе, содержащем 3.1 М №С1, находится в ,-форме. Предполагается, что митоксантрон и аметантрон также заимодействуют с 7-ДНК по механизму, предложенному в работе [КоЫ,1972|. Согласно этой работе, связывание лиганда приводит к локальному изменению онформации полимера из левоспиральной и правоспиральную, вследствие чего, эгда не все цецтры связывания заняты, полимер распадается на право- и ■дюспиралыше участки. Однако, этому мешает большая ионная сила раствора !=3.1 М №С1). Поэтому исследованы спектры КД ДНК М. Ьу$осЗе1к11сих, зторая всегда находится в правоепиральной форме, при добавлении в раствор НК митоксантрона и аметантрона при ^=3.1 М ЫаС1. Как показывают КД 1ектры этих растворов, с увеличением концентрации митоксантрона 1блюдаются некоторые изменения в спектрах КД, обусловленные аимодейстпием ДНК с митоксантроном. На основании вышесказанного, жчина наблюдаемого постоянства спектров КД 2-формы ДНК при ■бавленнии митоксантрона (рис.56) обусловлена левоспиральностыо 1нформации молекул поли[с!(С-С)| и особенностью взаимодействия тгоксантрона с Z-ДHK.. Исследовалась также кинетика перехода в

>лекулах поли[с)(0-С)1 в комплексе с митоксантроном и аметантроном.

Исследовались спектры КД комплексов через 40 мин после добавления буферный раствор полимера, содержащий митоксантрон или аметантрон nj одинаковых концентрациях (одна молекула л и ганда на 2 пары оснований), 3 NaCl и кинетика B->Z перехода в аналогичных условиях.

На рис.6 приведены исследованные спектры КД, на том же рисун приведены для сравнения также эти же зависимости и для комплексов поли(с1(< С)] с этидиум бромидом и для чистого поли[с!(С-С)]. В присутствии этиди; бромида изменение дихроичного поглощения при 295 нм (<5(Де235)), котор характеризует B->Z переход, мало во времени (рис.бб), что и следовало ожидат основываясь на результаты работы Пола. При D/P =0.25, когда не все цент] связывания насыщены, полимер распадается на левоспиральные правоспиральные участки. Суммарный спектр КД через 40 мин. пос добавления соли показан на рис.бб. Спектры КД комплекса mum[d(G-C этидиум бромид

Я, им

Рис.6, а - спектры КД поли[<)(С-С)] (с=5.01*10"! М/Р) (1) и комплексов с митоксантроном (2), аметантроном (3) и этидиюм бромидом (4) в буфере через 40 мин после добавления 3 М при 25 °< Для всех комплексов 0/Р=0.25. б - характер изменения дихроичного поглощения П| 295 нм во времени при переходе для тех же растворов.

имеют несколько иную форму, что обусловлено присутствием этидиум броми так как этидиум бромид оптически активен и имеет дихроичное поглощение 1 области активности ДНК, и вне ее. Как видно из рис.ба, при связывал митоксантрона и аметантрона затруднен В->2 переход, стимулированный N¿1 Через 40 мин. после добавления ЗМ №С1 в буфере раствора, содержаи комплексы поли[с1(0-С)] - МХ и поли[ё(С-С)] - АМ спектры КД по амплит немного отличаются от КД спектров г-ДНК без лиганда. Уже через час по добавления соли, спектры совпадают (кривые 1-3 рис.ба). Получеш результаты не меняются, если все исследования провести и при больи

мпературах. При О/Р =5, когда почти нее центры снизывания полимера заняты, >щие закономерности наблюдаемого Вперехода сохраняются. Как видно из 1С.66, скорости перехода в начальной стадии не одинаковы для

;следованных систем. В комплексе с митоксантроном В-»2 переход легче уществляется, чем в комплексе с аметаптроном. Но оба случая более грудняют переход, чем в случае чистого полимера.

Исходя из вышеизложенного, можно придти к заключению, что ггоксантрон и аметантрон затрудняют В->2 переход, стимулированный №С1-( в молекулах поли[<1(0-С)1, они не ингибируют данный переход, как это оисходит в присутствии этидиум бромида. Это говорит о том, что характеры ммодействия митоксантрона и аметантроиа с ДНК в какой-то мере пичаются.

Взаимодействие митоксантрона и аметантрона с А-формой.

Известно, что ДНК находится в А-форме в водио-этанолном растворе ванов, 1973). Взаимодействие фармакологически активных соединений с ДНК юдно-этанолном растворе сильно отличается от их взаимодействия в водной :де. Поэтому, чтобы исследовать интекаляционное взаимо-действие токсантрона и аметантрона с А-формой и возможные конформационные гвращения нуклеиновых кислот при связывании, мы исследовали имодействие исследуемых соединений с двуспиральиыми синтетическими К, которые, как известно (Иванов, 1973) в физиологическом растворе '.одятся в А-форме, параметре, которые не сильно отличаются от 'тветствующих параметров для А-формы ДНК.

Изменения в спектрах КД при пзаимодействии митоксантрона и ггантрона с двуспиральными полирибонуклеотидами полиА-поли11, подиС-1и1 и полиЬполиС аналогичны изменениям н спектрах КД при имодействии данных соединений с ДНК. Как показывают экспериментальные ные, полученные при //=0.11 и 30 °С, с увеличением концентрации •оксантрона или аметантрона при постоянной концентрации ирибонуклеотидов, заметных изменений в спектрах КД не наблюдается. При ной силе ^=0.011 картина меняется. В этом случае при добавлении оксантрона или аметантроиа спектры КД изменяются, причем произвольным азом.

Наблюдается избирательность связывания митоксантрона с различными опуклеотидными парами. По величине изменения геометрии А-формы

вследствие взаимодействия с митоксантроном при р=0.011, рибонуклеотидны пары можно расположить в ряд:

Четвертая глава посвящена влиянию имидазена на ДНК печени здоровы крыс и ДНК опухоли саркомы 45 in viro и in vitro. Расматривается также влияни имидазена при сочетанном применении с де РНК.

Влияние имидазена на ДНК in vitro.

К раствору ДНК добавили имидазен в различных концентрациях (10~'-105 смесь инкубировали при комнатной температуре 18-20 ч, после чего исследовал ДНК. 105М - это предельная концентрация для спектрофотометрически исследований.

Для выяснения способности имидазена взаимодействовать с азотистым основаниями находящимися как в спиральном, так и в клубкообразно состоянии, были исследованы дифференциальные спектры. Дифференциальны спектры сливали в четырех кюветах при температурах 30 и 75° С в буферах А и при концентрациях имидазена 2-Ю'6 и 8-10"6М, в интервале длин волн 225-800 нь Эксперементы показывают, что почти не наблюдается отклонение от нуле во линии. Поэтому, можно утверждать, что имидазен не влияет на электронны спектр азотистых оснований, а следовательно, не взаимодействует иуклеотидиыми парами ДНК.

Были получены также дифференциальные кривые плавления (ДКП) ДН: выделенной из печени здоровых крыс и опухоли саркомы 45 опухоленосящи крыс в присутствии 8-10"6М имидазена (рис. 7).

Как показывают экспериментальные данные, температура (Тга) и интервал ( Д1 плавления ДНК опухоли саркомы 45 под действием 8-10"6М имидазет увеличиваются соответственно на 0.5 и 0.3°, однако все еще остаютс

GC>IC>AU

Рис.7. Дифференциальные кривые плавления ДНК. печени и саркомы 45 при действии имидазен in vitro. 1 - печень здоровых крыс; 2 - саркомы 45; 3 - саркомы 45 при действии 8*10"' М имидазена in vitro.

'в т;с

гачительно меньше, чем у ДНК лечени здоровых крыс. На ДКП (рис. 7) тактически сохраняются псе низкотемпературные особенности ДНК опухоли.

ДКП ДНК опухоли лишь немного ( ~ 0.5") смещается и сторону ДКП ДНК ;чени здоровых крыс. Под действием имидазена in vitro не меняются и фаметры плавления ДНК печени. Можно предположить, что небольшие (менения в параметрах плавления и ДКП ДНК опухоли саркомы 45 под ^действием имидазена in vitro обусловлены влиянием имидазена на структуру и юйства гидратной воды ДНК. Приведенные данные показывают, что под йствием имидазена in vitro характерные особенности ДНК опухоли саркомы 45 ;таются почти неизменными. Следовательно, влияние имидазена на ДНК 1ухоли саркомы 45 in vitro обусловлено не непосредственным взоимодейстнием щдазена с опухолевой ДНК, а избирательно действующим на ДНК опухоли ;ким-то промежуточным механизмом.

Влияние имидазена на ДНК in vivo.

В опытах использовали ДНК, выделенную из печени здоровых крыс и |ухоли саркомы 45. Вводили в организм имидазен и дрожжевую РНК [утрибрюшинно в изотоническом растворе хлорида натрия. Суммарная доза ставляла для РНК - 100 мг/кг, имидазена - 60 мг/кг, как при раздельном, так и вместном применении. Имидазен вводили в течении 8 дней, имидазен в четапии с РНК - через день.

работах Бабаяна показано, что при помощи ДКП можно отличить ДНК ухоли саркомы 45 (оДНК) от ДНК, выделенных из печени здоровых крыс ДНК). Было показано, что ДКП оДНК смещены относительно ДКП зДНК в эрону низких температур и на ДКП зДНК появляются дополнительные пики в ласти 54-61° С, которые отсутствуют для зДНК. Не углубляясь в природу разопания особенностей на ДКП оДНК, исследовано влияние имидазена и (идазена в сочетании с двуспиралышй РНК на структуру оДНК, исходя из эактера изменения ДКП оДНК под действием этих соединений с новременным сравнениям с ДКП зДНК.

Как показывают экспериментальные данные, под действием только, идазена и имидазена в сочетании с РНК потчти исчезают характерные для НК низкотемпературные пики в области 54-62°С и ДКП оДНК по виду иближается к таковой для зДНК, однако вся кривая все еще остается ещенной в сторону низких температур по сравнению с ДКП зДНК

(для имидазена на ~ 1, а в сочетании с РНК на ~ 0.5 град). Несовпадение ДКГ оДНК под действием только имидазена и в сочетании с дсРНК, указывает н; присутствие в молекулах оДНК под действием указанных препаратов участков -различными структурными особенностями.

Одновременно, под действием имидазена изменяются также параметр! плавления (Тгп и ДТ), приближаясь к соответсевующим параметрам зДНК.

Таким образом, при помощи ДКП и параметров плавления можно судит об эффективности влияния фармакологически активных соединений н структуру ДНК на молекулярном уровне.

ВЫВОДЫ.

1. Впервые исследовано взаимодействие противоопухолевых антибиотико митоксантрона и аметентрона с левоспиральной 2-формой ДНК, реализуемо в поли[с!(С-С)] в концентрированных растворах №С1. Показано, чт исследуемые соединения не связываются с левоспиральной 2-формой. Он затрудняют, но не ингибируют Ъ-Ъ переход, как это происходит дл классических интеркаляторов [1].

2. При помощи спектров кругового дихроизма показано, что характе взаимодействия митоксантрона и аметантрона с В-формой ДНК сильн зависит от ионной силы раствора. В физиологическом раствор взаимодействие носит в основном интеркалирующий характер, одновременн длинные боковые алифатические группы электростатически взаимодействуй: с отрицательно заряженными фосфатными гркппами ДНК. При малы ионных силах (/¿<0.1) [2] митоксантрон и аметантрон взаимодействуют с ДН и РНК по крайней мере двумя различными способами. Наблюдаете следующая закономерность в способности изменять геометрию пар основани при взаимодействии с одной молекулой митоксантрона: при р=0.1 вСМОАТ.

3. Показано, что характер взаимодействия митоксантрона и аметентрона с / формой мало отличается от связывания с В-формой, несмотря на то, чт геометрии спиралей существенно отличаются друг от друга.

4. Впервые экспериментально исследовано влияние противоопухолево! соединения имидазена на ДНК. При помощи дифференциальных кривь плавления выяснено влияние имидазена на структуру ДНК опухоли сарком

45 опухолекосящих крыс и ДНК печени здоровых крыс in vitro и in vivo. Показано, что имидазен и сочетании с дс РНК лучше восстановливает характеристики ДНК опухоли саркомы 45. Вопреки экспериментально наблюдаемой избирательности влияния этих соединении на клеточном уровне показано, что не наблюдается избирательность влияния этих соединений на ДНК опухоли и нормы [3].

Предложен метод исследования влияния фармакологически активных соединений с ДНК при помощи дифференциальных кривых плавления [4].

Основные публикации по теме диссертации.

Казарян P.C., Снгрян А.Е., Сукиасяп Г.Ц., Согомонян J1.P., Бабаян Ю.С. "Влияние митоксантрона и аметантрона на B->Z переход" \\ Материалы нучной конференции посвященной 30-летию основания отдела биофизики биологического факультета ЕГУ, Ереван, 1996 г., ст. 44-45. Бабаян Ю.С., Снгрян А.Е., Казарян P.C., Аветисян М.Г., Согомонян J1.P. "Исследование взаимодействия противоопухолевых соединений митоксантрона и аметантрона с ДНК по характеру изменения спектров кругоаого дихроизма" \\ Биофизика, 1997 г.,(принято п печать). Бабаян Ю.С., Худавердян Н.В., Снгрян А.Е., Гарибян Д.В., Даниелян И.С. "Влияние имидазена п сочетании с РНК на структуру ДНК саркомы 45" \\ Биофизика, 1997 г. ,т. 42, №1, ст.125-12К.

Бабаян B.C., Снгрян А.Е., Казарян P.C., Худавердян Н.В., Арутюпян С.Г. "Особешшости плавления комплексов ДНК с митоксантроиам при малых концентрациях" \\ Международный симпозиюм под эгидой ЮНЕСКО "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии", Москва, Дубна, 1997 г., ст. 13-14.

ШЛРЗИЪ <ШШй bo-noh "bniljLb[it¡mppmQhp]i hujljuininnuipuijliG iS]uugnipjniûGbpli hhm lirn5u]^bpuûhpfi linniqhpunnliil фп^ишрЦппЗСЬр

<ujQqniguij]iQ piunbp' t-l/ß-, fVoia-, шр U (Suifu iquipmjp, IpiQ^npúuigtmü uiGgnuíGb] СфтпришйтрпА, uiühinuiGinpnG, [n5]uiwqbQ:

<aijuiGti t, np hiuiîiupjiu рп[пр huilpunumLgpuij|iG CtliuignipjniGühpp ршфшСдЬ1п4 p$>[v фп^шдцпиЗ Ьй *УЫЭ--}1 hbin, npni{ b ujuijiîiuGiui[np^uô t lipiuGg hujl{ujnmnigpu]j|i uil¡wtvi(nipjmGp: "ЬЬрЦиушдфий iu2tuuiuiuiüpnu3 пшппШилфрЦ^ t GniljLbjiGuippn hiul[Lumnntgpuij[iG iî[iuignipjiuG (iî{iinnpuuiGwpnG b uiiShwuiGinpnG) IjniSimbpuGbpm ^штшрфщ linniqbpmmfii| ljnG.1>npiSuig{mG фп^ш^ЬрцтИЬрц: Uliuitfuiiiiuûui niuiuúGuiujipilbi t ЬшйЬйштшршр фдррЬри QUU "Ьтрр opquiGmljUiG pfiüJiujj tiGuin¡iinniuinní utiGpbqilm& luSJuirnqbG hiuliiumnnigpuijliG tffiiugnipjiuG uiqqbgnipjniû uLupljntfuj 45 mnrugpt'â l* штщр lunQbinGbpli цшргфд шй^шшфид 'Vbíc>-fi i[pui, tpuinuip^u t Uqpuiljiugiupjniû iiijri CJuugnipjuiCi IjifittjiljailjiuQ oqwuiqnpôiïuiG hûiupuiilnpnipjui ijhpiuphpjiui;

U2[uLumuiGpntií gnijg t трфи&, np ¿Gnphjiil шффшифЦ bpljuip IjrvrviïGujjtvû fuiSphji umljiujnipjuiG ü¡iinnpuiuGinpnú-'¥U0" b шйЬтшйтрпО-ПЛЛЭ- lpiiîui[bpuGbp[i linG^npiSujjf] huiinlinipjmQühpQ tuiu¡hu тшррЬрфий Ьй rpuuiulpuG fiDinhplpu|jiumnp)i hiuiiiup rjjiuiiln opJiGuiju^nipjmGübptig: ЛЬитййипфрф^ t uxjri lîtiwgnipjniGGbpfi фп[ишд1}Ьдтр.)П1й[1 фп]ии1шрлцр1щ]10 liumnigt[uiôp niGbgnq ujn[}i[dG-dC] щпДОпйцЬт^иф hbin b B-» ljnG!¡>npúuijtiQ uiGgnuSûbpli uinuiûûQiuhuiwlpiipjniiiGbpi] iSJimnpuiuGmpnGfi b luübmuiGwpnG Gbplpujnipjuníp:

Smjg t mpijuji), np i5fimnpuujGinpnG|i b unîbmuiiuipnQQ ¿bG uipqUpulinuJ B-»Z uiGgnuS| ¿Giujuiö tiuujbu rjuiGquiribgûniiî bG: В- b A-ljnG.^npüiuglimGbpli hbin lïfiwnpuuiûinpnC фп^и^Ьдтрзшй duiúuiGuilj 1фтфн\5 bG hunSiupjui Gnijü opJiúui¿u^mpjmGúbp[;:

<bmuiqmnnipjniQGbpQ gnijg bG imjbk np {iú¡iqiuqbGQ шйСф2ш1)шй ¿{i фп{иищг)п1 0-"Ыд--]1 htm: in vivo hhmiuqnumipjniGGbp|i ctuníuiGiuli umuigijbi t, np [ití[iriujqbG uiqr}Ugnipjuiü тш1) ишр^пйш 45 ninnigpjig iuGs>uimi[uic> 1-X>19--|i ^шптдЦшйрр pGnipuiqpn щшршйЬтрЬрс línmbünuí Ьй umnr\$> uinGbmji uuipi)¡ig шйдштфий 1-"Ыг>-hiutíoiuiunnuiufuLuG ujmpmübmpbptiG: Ьйршцрфш! t, np IjniíimbpuGhpti Ьшцйшй гфЗ>ЬрЬСд[ш Ipipbpji nuimCtôiuutipnipjiuG i5¡i§ngnil Ъйшрш1[пр t uiutpqiupiuGUi hiuliuinmnigpuijf i5[iuignipjm.GQbp¡i mqi)bgnipjuiG tfnibliniiuijtiG iSbiumüJiqüübpp: